(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu xác định kháng sinh meropenem bằng phương pháp quang học sử dụng dung dịch nano vàng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN THỊ HÀ THU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG LUẬN V

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HÀ THU

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội –Năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- NGUYỄN THỊ HÀ THU

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số : 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội –Năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai đã giao đề tài, truyền thụ cho em nhiều kiến thức và tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Em cũng xin trận trọng cảm ơn các anh chị và các bạn Phòng Thử nghiệm Công ty Cổ phần Chứng nhận và Giám định Vinacert đã giúp đỡ tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này

1-Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Hóa học, đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Hóa Phân tích lòng tri ân sâu sắc.

Luận văn được hoàn thành với sự hỗ trợ một phần từ đề tài 104.04-2017.12 của Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

Học viên cao học

Nguyễn Thị Hà Thu

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về kháng sinh 1

1.2 Đại cương về nhóm kháng sinh carbapenem 2

1.2.1 Cấu trúc hóa học 2

1.2.2 Cơ chế tác dụng 3

1.2.3 Phổ tác dụng của carbapenem 3

1.2.4 Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem 4

1.3 Meropenem 5

1.3.1 Cấu trúc hóa học 5

1.3.2 Dược lý và cơ chế tác dụng 6

1.4 Các phương pháp xác định meropenem 9

1.4.1 Phương pháp sắc ký 9

1.4.2 Phương pháp điện hóa 11

1.4.3 Phương pháp điện di mao quản 11

1.5 Giới thiệu về vật liệu vàng nano và ứng dụng 15

1.5.1 Vật liệu vàng nano 15

1.5.2 Tính chất quang của hạt nano vàng 16

1.5.3 Công nghệ sản xuất hạt nano vàng 20

1.5.4 Ứng dụng của hạt nano vàng 23

CHƯƠNG II-THỰC NGHIỆM 28

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 28

2.1.1 Mục tiêu 28

2.1.2 Đối tượng 28

2.1.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 29

2.2.1 Hóa chất 29

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp chế tạo hạt nano vàng 30

2.3.2 Phương pháp hấp thụ phân tử UV-Vis xác định hàm lượng meropenem sử dụng hạt nano vàng 31

2.3.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM 32

2.3.4 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 33

2.4 Quy trình thực nghiệm 34

2.4.1 Chuẩn bị tổng hợp dung dịch nano vàng 34

2.4.2 Tối ưu hóa điều kiện phân tích 35

2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 35

2.4.4 Định lượng meropenem trong mẫu thực tế 36

CHƯƠNG III-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Khảo sát đặc trưng của dung dịch nano vàng 39

3.1.1 Khảo sát hình thái bề mặt qua ảnh TEM 39

3.1.2 Khảo sát đặc tính hấp thụ cộng hưởng bề mặt bằng phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 40

3.2 Khảo sát các điều kiện xác định meropenem bằng dung dịch nano vàng 41

3.2.1 Ảnh hưởng của pH 42

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl 43

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng 44

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian 45

3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ meropenem 46

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích xác định meropenem bằng dung dịch nano vàng 48

3.3.1 Xác định khoảng tuyến tính 48

3.3.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn 49

3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 50

3.3.4.Xác định độ đúng và độ lặp lại 51

3.4 Ứng dụng xác định meropenem trong mẫu thực tế 53

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu 53

3.4.2.Đánh giá phương pháp phân tích trên nền mẫu thuốc 55

3.5 Ứng dụng xác định mẫu thực tế 56

KẾT LUẬN 60

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 67

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định meropenem

Bảng 1.3 Kích cỡ các hạt nano vàng sử dụng hiện nay

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của hạt nano vàng trong phân tích

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Danh mục thuốc tiêm chứa meropenem được sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3.1 Ảnh hưởng của pH đến tỉ lệ độ hấp thụ quang

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến tỉ lệ độ hấp thụ quang

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs đến tỉ lệ độ hấp thụ quang Bảng 3.4 Nồng độ meropenem và tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520

Bảng 3.5 Giới hạn phát hiện của một số phương pháp xác định meropenem Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của đường và Na2CO3 đến tỉ lệ độ hấp thụ

quang Bảng 3.8 Độ lặp lại trên nền mẫu thuốc trong ngày và khác ngày

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng trên nền mẫu thuốc

Bảng 3.10 Kết quả phân tích meropenem trong một số mẫu dược phẩm

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem

Hình 1.2 Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem

Hình 1.3 Màu sắc của các keo vàng nano theo kích thước hạt

Hình 1.4 Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt

Hình 1.5 Hiện tượng SPR của nano vàng dạng cầu

Hình 1.6 Sự phân bố điện tích trên một thanh nano dưới kích thước của ánh sáng tới Hình 2.1 Phương pháp Turkevick tổng hợp hạt nano vàng

Hình 2.2 Cơ chế phát triển mầm của phương pháp Turkevick

Hình 2.3 Cơ chế của phương pháp xác định meropenem sử dụng nano vàng

Hình 2.4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua TEM Hình 3.1 Dung dịch nano vàng ở điều kiện thường (màu đỏ) và khi có mặt meropenem

(màu xanh)

Hình 3.2 Hình thái hạt nano vàng thông qua ảnh TEM

Hình 3.3 Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng khi có mặt meropenem

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ meropenem

Hình 3.9 Biểu đồ sự phụ thuộc giữa nồng độ meropenem và độ hấp thụ quang

Hình 3.10 Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính xác định meropenem

Hình 3.11 Đường chuẩn xác định meropenem

Hình 3.12 Phổ hấp thụ UV-Vis của một số mẫu thuốc chứa meropenem

Hình 3.13 So sánh tương quan giữa hai phương pháp HPLC-DAD và UV-Vis

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức Association of Official Analytical Communities

CZE Điện di mao quản vùng Capillary Electropherosis Zone

EMA Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu Âu European Medicines Agency

FDA Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ Food and Drug Administration

HILIC Sắc ký lỏng tương tác thân nước Hydrophilic interaction liquid chromatography HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography

HPLC-UV Sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò UV Chromatography- Ultraviolet High Performance Liquid

LC-MS/MS Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần Liquid Chromatography tandem mass spectrometry

LOQ Giới hạn định lượng Limit of Quantification SPR Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt Surface plasmon resonance SWV Von-ampe sóng vuông Square wave voltammetry TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua Transmission electron microscopy UHPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Ultra Performance Liquid Chromatography

Trước tình trạng này, nhiều cơ sở y tế đã đưa các nhóm kháng sinh phổ kháng khuẩn mạnh như carbapenem vào để chữa trị cho bệnh nhân có các triệu chứng kháng kháng sinh quá mạnh, trong đó meropenem được sử dụng nhiều nhất vì có phổ tác dụng rộng [47]

Meropenem hiệu quả trong điều trị một loạt các nhiễm trùng gây ra bởi trực khuẩn Gram âm và Gram dương, các mầm bệnh hiếu khí mẫn cảm với thuốc Meropenem hoạt động bằng cách liên kết với các protein và phá vỡ sự toàn vẹn và thống nhất của thành

tế bào vi khuẩn Meropenem được tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch và đã cho hiệu quả lâm sàng trong điều trị một loạt các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do vi khuẩn như viêm phổi, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng ổ bụng, viêm phổi…[21] Ngoài ra meropenem

là kháng sinh thuộc nhóm carbapenem duy nhất được chấp thuận sử dụng để điều trị viêm màng não do ít gây nguy cơ động kinh và an toàn cho phụ nữ có thai [18]

Được coi là một trong các loại kháng sinh mạnh nhất hiện nay, việc định lượng meropenem trong dược phẩm và dịch sinh học của bệnh nhân nhằm đánh giá hiệu quả điều trị bệnh vì thế rất quan trọng Hiện nay các phương pháp phổ biến để xác định hàm lượng meropenem như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [21,18,19], phương pháp điện di mao quản [33,26] , phương pháp điện hóa[13] v.v đều có chung một số nhược điểm như thiết bị, hóa chất đắt tiền, vận hành phức tạp, do đó việc phát triển một phương pháp phân tích mới có độ nhạy và độ chính xác cao nhưng lại đơn

giản và có chi phí thấp là hết sức cần thiết

Nhận thấy dung dịch nano vàng có hiệu ứng plasmon bề mặt (SPR) với khả năng thay đổi màu sắc từ đỏ sang xanh khi có mặt meropenem, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu xác định kháng sinh meropenem bằng phương pháp quang học sử dụng dung dịch nano vàng”

Phương pháp này sẽ được áp dụng để phân tích hàm lượng meropenem trong một

số mẫu dược phẩm hiện có trên thị trường

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về kháng sinh

Sự ra đời của kháng sinh là một thành tựu lớn của thế kỷ 20, giúp giảm thiểu đáng

kể tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do nhiễm khuẩn, đặc biệt đối với Việt Nam, với đặc trưng khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật Đây là nhóm thuốc quan trọng vì bệnh lý về nhiễm khuẩn nằm trong tốp những bệnh đứng đầu về tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong [6]

Kháng sinh (antibiotics) được định nghĩa: “là những chất kháng khuẩn (antibacterial substaces) đươc tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes) có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác”.

Hiện nay, từ kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn

gốc tổng hợp như các sulfonamide và quinolon [2]

Các nhóm kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học thành các nhóm như sau:

Bảng 1.1.Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Các penicilin Các cephalosorin Các beta-lactam khác Carbapenem Monobactam Các chất ức chế beta-lactamase

7

Peptid

Glycopeptid Polypetid Lipopeptid

Các fluoroquinolon: Thế hệ 2,3,4

9

Các nhóm kháng sinh khác Sulfonamid

Oxazolidinon 5-nitroimidazol

1.2 Đại cương về nhóm kháng sinh carbapenem

Nghiên cứu biến đổi cấu trúc hóa học của peniciline và celphalosporin đã tạo thành một nhóm kháng sinh beta-lactam mới, có phổ kháng khuẩn rộng, kháng β-lactamase đặc biệt của vi khuẩn Gram âm, tác dụng mạnh trên trực khuẩn mủ xanh Nhóm kháng sinh này bao gồm: imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, lần lượt được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn đưa vào sử dụng vào các năm 1985,1996,2001 và 2007 Imipenem và meropenem có phổ hoạt động rộng nhất

chống lại hầu hết các chủng Pseudomonas và các chủng β-lactamase; ertapenem và

doripenem có hoạt phổ hẹp hơn các carbapenem khác trên P.aeruginosa và Acinetobacter [1,9,10]

Các kháng sinh nhóm này có vai trò nhất định trong điều trị bao vây cũng như điều trị theo mục tiêu những trường hợp nhiễm khuẩn nặng nghi ngờ do vi khuẩn đa kháng sinh, đặc biệt là những trường hợp đa đề kháng có liên quan đến trực khuẩn gram âm hoặc trong trường hợp các phác đồ điều trị kháng sinh khác không còn hiệu quả [45]

1.2.1 Cấu trúc hóa học

Carbapenem thuộc nhóm β-lactamase bán tổng hợp, cấu trúc phân tử khác các kháng sinh peniciline ở chỗ một nguyên tử cacbon thay thế cho nguyên tử lưu huỳnh trong cấu trúc vòng thiazollidin và có liên kết đôi giữa C-2 và C-3, ngoài ra carbapenem

có thêm nhóm ethylhydroxyl liên kết với vòng beta-lactam, còn ở nhóm penicillin là nhóm acylamino [13]

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem

1.2.2 Cơ chế tác dụng

Carbapenem có cơ chế tác dụng chung của kháng sinh họ β-lactamase Chúng tiêu diệt vi khuẩn bằng cách gắn PBPs (penicillin binding proteins) làm ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn và gián đoạn quá trình sinh tổng hợp thành tế bào vi khuẩn do đó vi khuẩn không có thành tế bào che chở sẽ bị tiêu diệt Những protein này thực tế là các enzyme tham gia vào quá trình tạo liên kết chéo peptidoglycan-thành phần chính của vách tế bào vi khuẩn Mỗi carbapenem có ái lực đặc biệt với một nhóm PBPs khác nhau, vì vậy tác dụng của mỗi loại là khác nhau và khác với các β-lactamase khác [10, 25,49] Vì vậy, thuốc có phổ kháng khuẩn rộng và không bị kháng chéo với các thuốc khác trong nhóm β-lactamase [14]

1.2.3 Phổ tác dụng của carbapenem

Carbapenem là nhóm kháng sinh phổ rộng, có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm hiếu khí và kị khí, bền với các vi khuẩn sinh β-lactamase [49] Các

thuốc trong nhóm carbapenem có phổ tác dụng tương tự nhau

Tất cả các thuốc trong nhóm đều tác dụng tốt trên cầu khuẩn Gram dương, có tác dụng kém trên MRSA (Methine- resistant Staphylococcal aureus hay tụ cầu vàng kháng Methiciline) và tràng cầu khuẩn (enterococcal infections) bởi khả năng đề kháng nội tại của các loài vi khuẩn này

Trên vi khuẩn hiếu khí Gram âm: carbapenem thể hiện hoạt lực in vitro mạnh, tất

cả các kháng sinh trong nhóm đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên các vi khuẩn Gram âm [6]

Các thuốc thuộc nhóm kháng sinh carbapenem cũng có tác dụng khá tốt trên các vi khuẩn kị khí và không có tác dụng với các vi khuẩn không điển hình, vì những loài vi khuẩn này không có thành tế bào (vốn là đích tác động của kháng sinh carbapenem)

1.2.4 Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem

Trước tình hình vi khuẩn đa đề kháng như hiện nay, carbapenem là nhóm kháng sinh được ưu tiên lựa chọn trong điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm sinh β-lactamase phổ rộng, vi khuẩn Gram âm đa kháng, các nhiễm khuẩn nặng và trong các trường hợp sốt giảm bạch cầu trung tính [9]

Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh tại bệnh viện Bạch Mai trong giai đoạn 2012-2016 cho thấy từ năm 2012, số liều xác định trong ngày DDD (Defined Dose Daily) trong 100 ngày nằm viện của kháng sinh carbapenem tăng dần trong 5 năm, đạt mức gấp đôi vào năm 2016 [7] Trong đó meropenem là hoạt chất được sử dụng nhiều nhất, sau đó đến imipenem, ertapenem, nguyên nhân có thể do ưu điểm về hiệu quả cũng như độ an toàn của thuốc này trong lâm sàng Đồng thời, một phân tích về các kết quả nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra tỷ lệ đáp ứng lâm sàng, đáp ứng vi sinh của nhóm dùng meropenem cao hơn nhóm dùng imipenem trong khi tỷ lệ gặp biến cố bất lợi của nhóm sử dụng meropenem lại thấp hơn đáng kể

Năm 2016 Doripenem được đưa vào sử dụng với số liều DDD/100 ngày nằm viện thấp nhất Kết quả phân tích tiêu thụ của từng đơn vị điều trị trong bệnh viện cho thấy, nhóm kháng sinh này được sử dụng rộng rãi ở tất cả các Khoa lâm sàng, Trung tâm

hoặc Viện Ba đơn vị có lượng tiêu thụ vượt trên 10 DDD/100 ngày nằm viện bao gồm Khoa hồi sức tích cực, Trung tâm hô hấp và khoa truyền nhiễm [7]

Theo báo cáo của Nguyễn Thị Lệ Minh, tại khoa Hồi sức tích cực, Truyền nhiễm

và Huyết học, tỷ lệ giảm nhạy cảm của các chủng vi khuẩn phân lập đạt mức 64% với imipenem và 62% với meropenem vào năm 2011 [7]

1.3 Meropenem

1.3.1 Cấu trúc hóa học

Meropenem (tên 3-yl]sulfanyl-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]-4-methyl-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid) là một axit hữu cơ có công thức phân tử là 𝐶15𝐻25𝑁3𝑂5𝑆, M=383,46 g/mol [37] Meropenem có 𝑝𝑘𝑎1 = 2,9 và 𝑝𝑘𝑎2 = 7,4 Meropenem có chứa nhóm thio

IUPAC:(4R,5S,6S)-3-[(3S,5S)-5-(dimethylcarbamoyl)pyrrolidin-có ái lực mạnh với kim loại như vàng, IUPAC:(4R,5S,6S)-3-[(3S,5S)-5-(dimethylcarbamoyl)pyrrolidin-có thể hình thành liên kết S-Au thông qua liên kết cộng hóa trị Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem được cho trong Hình 1.2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem

Meropem thuộc họ kháng sinh β-lactamase, không ổn định về mặt vật lý và hóa học Cấu trúc phân tử của meropenem có vòng β-lactam dễ bị mở vòng bởi nhiều tác nhân như axit-base, ion kim loại, tác nhân oxy hóa và thậm chí là các dung môi như

nước, ancol Meropenem có điểm sôi 627oC, điểm nóng chảy 191-201oC Độ ổn định ở nhiệt độ phòng (khoảng thời gian sự phân hủy dưới 10%) của meropenem là 9h, các dung dịch chuẩn và mẫu trong các nghiên cứu sau khi pha có thể ổn định trong khoảng 24h khi bảo quản trong tủ lạnh (4oC) Meropenem thường tồn tại dưới dạng bột tinh thể màu trắng đến vàng nhẹ, tan trong nước, methanol, thực tế không tan trong ethanol 95%

1.3.2.2 Cơ chế tác dụng

Thuốc có tác dụng diệt khuẩn thông qua sự ức chế sinh tổng hợp vách tế bào bằng cách thấm qua thành tế bào của hầu hết vi khuẩn Gram âm và Gram dương, gắn vào các protein liên kết penicillin (PBP) và làm bất hoạt các protein này Thuốc có ái lực mạnh

nhất với PBP 2,3 và 4 của Escherichia và Pseudomanas aeruginosa, PBP 1,2 và 4 của Staphylococcus aureus

1.3.2.3 Phổ kháng khuẩn

Phổ kháng khuẩn của meropenem tương tự imipenem bao gồm hầu hết các vi khuẩn Gram dương, Gram âm và một số vi khuẩn kỵ khí Tuy nhiên tác dụng của meropenem

có phần mạnh hơn imipenem trên Enterbacteriaceae và có phần kém hơn imipenem

trên vi khuẩn Gram dương Nồng độ diệt khuẩn điển hình gấp một hoặc hai lần nồng

độ kìm khuẩn, ngoại lệ với Listeria monocytogenes, nồng độ diệt khuẩn chưa được xác

định Meropenem bền vững với nhiều loại β-lactamase phổ rộng; nhưng không bền với tác dụng thủy phân của metallo-beta lactamase [3]

Meropenem có phổ hoạt tính in vitro và trên lâm sàng với các vi khuẩn sau đây:

Vi khuẩn Gram dương và hiếu khí không bắt buộc: Streptococcus pneumonia (chủng nhạy cảm penicillin), S.pyogenes, S agalactiae, Staphylococcus aureus (kể cả

các chủng tiết β-lactamase, không bao gồm các chủng kháng oxacilin/methicillin),

Enterococcus faecalis (không bao gồm chủng kháng vancomycin) và S.viridans

Vi khuẩn Gram âm hiếu khí và hiếu khí không bắt buộc: Escherichia coli, Haemophilus ifnluenzae (kể cả chủng tiết β-lactamase), Klebsiealla pneumonia, Neisseria meningitides, Proteus mirabilis và Pseudomonas aeruginosa

Các vi khuẩn kị khí: Bacteroides fragilis, B thetaiotaomicron và Peptostreptococcus

Kháng chéo có thể xảy ra giữa meropenem và các kháng sinh carbapenem khác Cơ chế kháng thuốc có thể là: Giảm tính thấm của màng ngoài vi khuẩn gram âm( do giảm sản xuất porin); giảm ái lực đối với PBP; tăng vận chuyển tích cực thuốc ra ngoài tế bào vi khuẩn; sản xuất β-lactamase có thể thủy phân các carbapenem Không có kháng chéo giữa meropenem và các kháng sinh họ quinolone, aminosid, macrolid và tetracyclin Tuy nhiên, một số chủng vi khuẩn có thể kháng nhiều hơn một nhóm kháng sinh do cơ chế giảm tính thấm màng tế bào và tăng vận chuyển thuốc ra ngoài

1.3.2.4 Dược động học

Hấp thu: Meropenem được sử dụng thông qua đường tiêm tĩnh mạch, không hấp

thu qua đường uống Sau khi tiêm tĩnh mạch 0,5g và 1g meropenem trong 5 phút, nồng

độ đỉnh trong huyết tương đo được lần lượt là 50 và 112 microgam/ml Nếu truyền trong

30 phút, nồng độ đỉnh thu được tương ứng là 23 và 49 mcirogram/ml [3,31]

Phân bố: Thuốc phân bố rộng rãi trong các tổ chức của cơ thể, bao gồm dịch não

tủy và mật, cơ, da, van tim, dịch phúc mạc, thể tích phân bố của người lớn 15-20 lit, trẻ

em 0,3-0,4 lit/kg Thuốc liên kết với protein huyết tương khoảng 2%

Chuyển hóa: Meropenem được chuyển hóa bởi phản ứng thủy phân vòng lactamase tạo thành chất không có hoạt tính Các thí nghiệm in vitro đã cho thấy

β-meropenem bền với enzyme DHP-1 so với imipenem vì vậy β-meropenem không cần dùng kèm chất ức chế DHP-1 [3]

Thải trừ: Thời gian bán thải trong huyết thanh của thuốc khoảng 1h, kéo dài hơn ở

người suy thận Độ thanh thải trung bình là 287 ml/phút với liều 250 mg và 205ml/phút với liều 2g Meropenem thải trừ chủ yếu nhờ bài tiết qua ống thận và lọc qua cầu thận Khoảng 70% liều dùng được tìm thấy ở dạng không đổi trong nước tiểu trong khoảng 12h Khoảng 2 % liều dùng thải trừ qua phân Thuốc có thể được loại trừ bởi thẩm tách máu [3]

1.3.2.5 Chỉ định

Meropenem được chỉ định cho các trường hợp nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn Gram âm và Gram dương nhạy cảm với thuốc ở người lớn và trẻ em từ 3 tháng tuổi trở lên Bao gồm:

 Viêm phổi (viêm phổi cộng đồng hoặc mắc phải tại bệnh viện)

 Nhiễm khuẩn đường tiết niệu có biến chứng

 Nhiễm khuẩn trong ổ bụng

 Nhiễm khuẩn phụ khoa, như niêm nội mạc tử cung và các bệnh lý viêm vùng chậu

 Viêm phế quản-phổi ở bệnh nhân xơ hang

 Nhiễm khuẩn trong và sau khi sinh

 Nhiễm khuẩn da và tổ chức dưới da có biến chứng

 Viêm màng não nhiễm khuẩn cấp tính, bệnh nhân sốt do giảm bạch cầu

 Nhiễm khuẩn huyết

Meropenem đơn hoặc phối hợp với các thuốc kháng khuẩn khác đã được chứng minh là hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn hỗn hợp Chưa có kinh nghiệm sử dụng thuốc ở trẻ em giảm bạch cầu trung tính hay suy giảm miễn dịch nguyên phát hoặc thứ phát

1.3.2.6 Tác dụng phụ của meropenem

Tác dụng phụ không mong muốn của meropenem thường gặp nhất là chứng rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, nôn và tiêu chảy Đôi khi xảy ra phản vệ, tăng bạch cầu ưa eosin,

nổi mề đay, viêm đại tràng Động kinh hoặc co giật có thể xảy ra, đặc biệt ở người bệnh

đã từng có tổn thương hệ thần kinh trung ương và/hoặc người suy thận

Phản ứng tại chỗ tiêm như đau hoặc viêm tĩnh mạch huyết khối có thể xả ra sau khi tiêm Người có bệnh dị ứng với những kháng sinh β-lactamase khác có thể có phản ứng mẫn cảm khi dùng meropenem

1.4 Các phương pháp xác định meropenem

1.4.1 Phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký là một trong các phương pháp phổ biến để xác định các chất

có hoạt tính sinh học Để xác định meropenem chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối với detector UV, DAD, hoặc MS,.v.v

Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV, Thomas Roth và nhóm cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định meropenem trong huyết tương [38] Meropenem được tách ra khỏi huyết tương bằng cách tủa protein bằng methanol, sau đó được tách trên cột SPE sử dụng metanol/nước (7:3, v/v) Pha động sử dụng đệm TRIS/HCl 100mM (pH 8,5) chứa 15% metanol Thể tích bơm mẫu 20µl Meropenem được phát hiện ở bước sóng 300nm Khoảng tuyến tính của meropenem trong phương pháp này từ 10mg/l đến 200mg/l Phương trình hồi quy tuyến tính có hệ

số r2 > 0,999 Đường cong hiệu chuẩn được xây dựng trong khoảng thời gian hơn 2 tuần

để xác định độ biến thiên của độ dốc đường chuẩn (slope) và hệ số chặn (intercept), kết quả độ biến thiên là 2% cho thấy độ ổn định và độ chính xác cao Giới hạn phát hiện của phương pháp trong huyết tương là 1,06 mg/l

Nhóm tác giả Liusheng Huang, Janus Haagensen, Davide Verotta, Patricia Lizak, Francesca Aweeka và Katherine Yang đã xây dựng thành công mô hình mô phỏng PK/PD cho nhiễm trùng qua màng sinh học và nghiên cứu tính ổn định của meropenem đồng thời phát triển và xác nhận meropenem trong vi khuẩn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ LC-MS/MS [24] Phương pháp LC-MS/MS có lợi thế là tính chọn lọc cao và thời gian phân tích ngắn, điều này đặc biệt có lợi cho các thuốc không ổn định như meropenem, chỉ ổn định trong vài giờ tại nhiệt độ phòng Thời

gian chạy trên mỗi mẫu là 6,6 phút Trên hệ thống API5000, sử dụng chuẩn nội ceftazidime và thời gian chạy được rút ngắn 1,4 phút 100µl dịch mẫu được trộn với dung dịch chuẩn nội ceftazidime, sau đó lọc Dịch lọc được bơm trực tiếp lên cột C18 (50x2, 1mm)

Đệm A: dung dịch NH4FA 10mM ở pH=4,0

Đệm B: MeCN trong 0,1% axit formic

Chương trình Gradient: 7% dung môi B (0-1 phút), từ 7-90% dung môi B (1-2,5 phút), 90% dung môi B ( 2,5-3,5 phút), 90% đến 7% dung môi B( 3,5-6 phút) và 7% dung môi

B ( 3,6-6,6 phút), rửa giải bằng amoni formate (10mM, pH=4) và acetonitrile (chứa 0,1% axit formic), tốc độ dòng 0,3ml/phút Khoảng tuyến tính xây dựng từ 50-25000 ng/ml, độ chính xác và phần trăm độ lệch chuẩn đều dưới 15% chứng tỏ phương pháp

có độ tin cậy cao, giới hạn định lượng của phương pháp là 50ng/ml

Trong các phương pháp sắc ký phổ biến hiện nay, sắc ký siêu hiệu năng (UHPLC) với detector mảng diode là một phương pháp ít tốn kém hơn khối phổ đồng thời cải thiện được độ phân giải, thông lượng và độ nhạy so với phương pháp HPLC-UV thông thường Dựa trên những ưu điểm đó, nhóm nghiên cứu của Gregori Casals đã xây dựng quy trình định lượng meropenem trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UHPLC sử dụng detector mảng diode [15] Pha động : dung dịch đệm chứa Na2HPO4.2H2O 0,1M, chỉnh pH=7 bằng H3PO4 85%, hòa trộn với methanol (chiếm 13% pha động) Tốc độ dòng 0,25ml/phút, nhiệt độ cột được đặt 30oC Hiệu quả của cột tách được theo dõi bằng một detector mảng diode trong khoảng 270-320nm, định lượng meropenem ở bước sóng 295nm Dung dịch làm việc được chuẩn bị bằng cách hòa tan dung dịch trung gian trong đệm MES (MES 1M, pH=6) và 20 µg/ml chuẩn nội ceftazidime Tương tự đối với dung dịch mẫu 100µl chuẩn nội (20 µg/ml) được thêm vào hỗn hợp chứa 100 µl đệm MES với 100 µl mẫu huyết tương Sau đó thêm 500

µl acetonitrile, ly tâm 13000 vòng trong 5 phút, phần dịch nổi phía trên được chuyển sang lọ thủy tinh hình nón và bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ ở 37oC Phần dư được hoàn nguyên trong 200 µl dung dịch đệm MES, ly tâm 1000 vòng trong 10 phút Chất

nổi trên bề mặt được chuyển sang vial thủy tinh, tiêm 7 µl vào cột Đường chuẩn được xây dựng từ 0,5-100 µg/ml Giới hạn dưới của định lượng là 0,5 µg/ml và giới hạn trên của định lượng là 100 µg/ml Độ lệch chuẩn tương đối không vượt quá 15%

Jens Martens Lobenhoffer và nhóm nghiên cứu của mình đã nghiên cứu ứng dụng phương pháp HILIC- khối phổ để định lượng meropenem trong huyết tương người [28] Chuẩn bị mẫu chỉ bao gồm thêm đệm, bổ sung chất nội chuẩn, kết tủa protein và ly tâm

Do đó thời gian phân tích rất nhanh, nhờ độ nhạy cao của khối phổ, có thể phân tích mẫu huyết tương thấp cỡ 10 μl Cột sắc ký Hypersil GOLD HILIC được áp dụng trong phương pháp là vật liệu trên nền silica với lớp phủ polyethylenimide, cho thời gian lưu của meropenem là 4,17 phút Khoảng nồng độ tuyến tính của meropenem thu được là khoảng 1 μg/ml – 50 μg/ml; hệ số tương quan R = 0.9997, giá trị LOQ là 1 μg/ml

1.4.2 Phương pháp điện hóa

Ali K.Attia và cộng sự đã phát triển và xây dựng phương pháp vonampe sóng vuông (SWV) sử dụng điện cực biến đổi hóa học để xác định nồng độ meropenem trong mẫu huyết tương [13] Điện cực biến đổi hóa học này được điều chế từ 15mg MWVNTs 3%, 485mg than chì, 0,3 ml dầu prafin Khi sử dụng điện cực làm việc này với điều kiện độ rộng xung 50ms, độ cao xung 25mV, tốc độ quét 50mVs, khoảng nồng độ tuyến tính thu được của meropenem nằm trong khoảng từ 2,5.10-8 mol/l đến 8,0.10-6 mol/l, giới hạn phát hiện (LOD) đạt 2,9.10-9 mol/l Với phương pháp này có thể xác định được đồng thời linezolid, meropenem, theophylline trong mẫu huyết tương Phương pháp này

đã được sử dụng để đo mẫu huyết tương của các tình nguyện viên sau khi sử dụng thuốc

60 phút, cho kết quả với độ lặp lại và độ chính xác cao, hàm lượng linezolid đạt 3,58.10-5 mol/l, meropenem: 2,83.10-5 mol/l, theophylline: 3,41.10-5 mol/l

1.4.3 Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản là một phương pháp mới để phân tích meropenem Phương pháp có ưu điểm hơn so với phương pháp sắc ký lỏng (LC) trong việc chuẩn bị mẫu Thông thường, để xác định meropenem trong huyết tương bằng LC đều phải kết tủa thành phần protein trước khi đo Hơn nữa, phương pháp này có độ lặp lại, độ nhạy

cao, lượng mẫu yêu cầu thấp với thời gian phân tích tương đối ngắn

Nhóm nghiên cứu của Yahya Mrestani thực hiện nghiên cứu ứng dụng phương pháp điện di mao quản có độ nhạy cao (CZE) sử dụng detector UV để xác định meropenem trong dung dịch nước và mẫu sinh học (nước tiểu, huyết tương) [33]

Khi xác định meropenem trong nước bằng cách sử dụng mao quản tiêu chuẩn và mao quản có độ nhạy cao, kết quả cho thấy rằng, việc sử dụng mao quản độ nhạy cao cải thiện giới hạn phát hiện khoảng 10 lần so với mao quản tiêu chuẩn

Với mẫu huyết tương, meropenem được xác định ở pH = 7,2 và được phân tích định lượng ở hai bước sóng là 200nm và 303nm Các thành phần của huyết tương hấp thụ

UV ở 200nm vì thế meropenem có thể được xác định trực tiếp ở bước sóng 303nm Để

đo meropenem trong huyết tương, các mẫu được pha loãng trong nước với tỉ lệ 1:4 Ở bước sóng này, kết quả của điện di đồ cho thấy meropenem được tách hoàn toàn ra khỏi các thành phần của huyết tương Khoảng tuyến tính của phương pháp từ 0,5-200µg/ml,giới hạn phát hiện trong huyết tương thông qua đo trực tiếp ở bước sóng 303nm là 4µg/ml, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian di chuyển là 5% và của vùng cực đại là 4% ở nồng độ 10µg/ml Đường chuẩn có phương trình tuyến tính (y = 10.1x + 20.1) với hệ số tương quan là 𝑅2 = 0,999 Độ thu hồi trung bình từ các mẫu là 98,6% (n = 4) ở nồng độ meropenem là 5 mg/ml và 97,8% (n = 4) ở nồng độ 50 mg ml so với các dung dịch chuẩn meropenem có nồng độ tương đương

Đối với mẫu nước tiểu, mẫu được pha loãng trực tiếp trong dung dịch đệm và được tiêm mà không cần chuẩn bị mẫu phức tạp Giới hạn phát hiện trong mẫu nước tiểu là 0,3µg/ml, độ lệch chuẩn tương đối là 2,0%

Toshihiro Kitahashi và Itaru Furuta đã phát triển phương pháp xác định meropenem trong huyết thanh bằng cách tiêm trực tiếp huyết thanh vào mao quản mà không cần các bước tiền xử lý [26] Meropenem được phát hiện ở bước sóng 297nm Dung dịch đệm được sử dụng là natritetraborate 25mM, NaOH 0,1M chứa natridodecyl sulphate 90mM, pH=10 Thời gian di chuyển của meropenem là 7,2 phút; LOD=2,0mg/l Độ lệch chuẩn tương đối giữa các ngày và độ chính xác lần lượt : 3,43-8,87 % và 4,28-

8,54% Hiệu suất thu hồi đạt 94-111% và 92-105%

Phương pháp cho phép phân tích nhanh chóng, kết quả đáng tin cậy và tính kinh tế cao, giảm lượng máu cần thu gom và giảm đáng kể chất thải lỏng phát sinh từ quá trình phân tích Hệ thống phân tích hoạt động dễ dàng vì được thực hiện hoàn toàn tự động, hầu như không có sự sai số giữa các phép đo vì không cần trải qua bước tiền xử lý mẫu Các phương pháp xác định meropenem cùng với các thông tin về điều kiện xử lý mẫu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện được cho trong Bảng 1.2

Bảng 1.2.Một số nghiên cứu xác định meropenem

10000 vòng/phút trong 4 phút Dịch sau ly tâm được bơm vào hệ LC-MS/MS

50-2500 ng/ml 15,2

ng/ml [24]

13000 vòng/phút trong 5 phút Dịch sau ly tâm được bay hơi đến khô bằng nito , phần dư được hoàn nguyên trong đệm MES, ly tâm

10000 vòng/phút trong 10 phút Dịch thu được bơm vào cột

15000 vòng/phút trong 5 phút, dịch sau ly tâm được hòa

2,5.10-8 mol/l- 8,0.10-6

mol/l

2,9.10-9mol/l [13]

trong đệm BR (pH=11)

Mẫu nước tiểu được pha loãng trực tiếp trong dung dịch đệm

6,3-100 mg/l 2,0 mg/l [26]

1.5 Giới thiệu về vật liệu vàng nano và ứng dụng

1.5.1 Vật liệu vàng nano

Nano là một từ có nguồn gốc Hy Lạp, có nghĩa là kích thước nhỏ Các hạt có kích

thước trong phạm vi từ 1-100nm được xác định là hạt nano [12]

Năm 1857, Michael Faraday đã phát hiện ra các hạt nano vàng ruby (AuNPs), đặt nền tảng cho công nghệ nano hiện đại Bốn mươi năm sau, Zsigmonday đã sáp nhập công nghệ của ông với khám phá của Faraday và giới thiệu một quy trình gọi là:

“phương pháp phát triển mầm”, vẫn được sử dụng đến ngày nay để tổng hợp hạt nano vàng Zsigmondy cũng phát minh ra một máy siêu âm để mô tả cấu trúc, hình dạng và kích thước của hạt nano vàng[30]

Các hạt vàng nano với kích thước từ 1-100nm có tính chất quang, điện độc đáo, khác hẳn so với vật liệu vàng dạng khối Trong đó, sự khác nhau đáng chú ý giữa vàng

nano và kim loại vàng dạng khối là sự thay đổi màu sắc của chúng, cụ thể là sẽ chuyển

từ màu vàng sang đỏ tía, màu tím hoặc xanh tùy thuộc vào kích thước của hạt vàng nano Sự thay đổi màu sắc này là do hiệu ứng plasmon bề mặt tạo ra [5]

Hình 1.3: Màu sắc của các keo vàng nano theo kích thước hạt Bảng 1.3 Kích cỡ các hạt nano vàng được sử dụng hiện nay

Kích cỡ của

các hạt (nm)

Thể tích của hạt (nm 3 )

Số hạt trên 1ml

Số hạt nmol/ml

1.5.2 Tính chất quang của hạt nano vàng

1.5.2.1 Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt cục bộ (Localized surface plasmon

resonace :LSPR)

Do tính chất vật lý và hóa học của hạt nano vàng phụ thuộc vào sự giam cầm không gian của các hạt điện tử, nên các tính chất của hạt nano vàng thay đổi tùy theo kích

thước, hình dạng, mức độ tổng hợp và môi trường của chúng Các hạt nano vàng cho thấy các thuộc tính quang học khác thường, chúng hiển thị màu sắc đặc trưng tùy thuộc vào kích thước, hình dạng và hằng số điện môi của môi trường xung quanh Các hạt nano vàng có màu đỏ rượu đặc trưng, đây là kết quả của hiệu ứng cộng hưởng plasmon

bề mặt (LSPR) Đây là một tính chất quan trọng của hạt nano vàng, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong chẩn đoán và điều trị ung thư [5,46]

Hình 1.4.Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt

Hiện tượng này được giải thích như sau: điện trường của sóng điện từ tác động lên các electron tự do trên bề mặt hạt nano, làm electron bị dồn về một phía, gây ra sự phân cực (hình 1.4) Sau đó dưới tác động của lực phục hồi Coulombic, các electron sẽ trở lại vị trí ban đầu Vì có bản chất sóng, nên điện trường dao động làm cho sự phân cực này dao động theo Sự dao động này gọi là: “plasmon” Khi tần số dao động của đám mây electron trùng với tần số của một bức xạ điện từ nào đó gây ra sự dao động hàng loạt của các electron tự do ở bề mặt sẽ xuất hiện hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt Đối với hạt vàng nano, hiện tượng cộng hưởng plasmon dẫn tới sự hấp thụ mạnh của ánh sáng vùng khả kiến, dẫn tới sự thay đổi màu sắc của dung dịch nano vàng Số lượng và vị trí của dải plasmon phụ thuộc chủ yếu vào kích thước và hình thái của hạt vàng nano, peak cộng hưởng có thể xuất hiện trong vùng khả kiến đến vùng hồng ngoại

gần Ngoài ra, hằng số điện môi của vật liệu cấu trúc nano, chỉ số khúc xạ của môi trường xung quanh, trạng thái của bề mặt (dung môi, chất ổn định) hay khoảng cách giữa các hạt cũng ảnh hưởng đến vị trí và hình dạng của cộng hưởng plasmon bề mặt [5,44]

1.5.2.2 Sự phụ thuộc của tính chất quang học vào kích thước hạt

a) Hạt nano vàng dạng cầu

Để giải thích được các tính chất quang của các hạt nano kim loại, Mie đã giải bài toán tán xạ của sóng điện từ trên một hạt cầu kim loại bằng cách giải phương trình Maxwell Bằng cách này ông đã mô tả tính chất quang học (tán xạ và hấp thụ) của vàng nano dạng cầu ở bất kỳ kích thước nào Theo đó, với vàng nano dạng cầu, SPR xảy ra

ở vùng khả kiến tại bước sóng khoảng 520-540nm (hình 1.5) Nếu kích thước (d) của hạt tăng lên thì cực đại hấp thụ ứng với SPR sẽ dịch chuyển về vùng có bước sóng dài, tức là vùng ánh sáng đỏ Tuy nhiên, khi hạt cầu lớn đến một kích thước nào đó, sẽ trở

thành dạng khối (bulk) và hiện tượng SPR sẽ biến mất [5,44]

Hình 1.5 Hiện tượng SPR của nano vàng dạng cầu b) Hạt nano vàng dạng thanh

Đối với vàng nano dạng thanh, tính chất quang học được thể hiện qua thuyết Gans,

dự đoán rằng sẽ xảy ra sự thay đổi trong cộng hưởng plasmon bề mặt khi các hạt đi chệch khỏi dạng cầu Đối với dạng thanh, khả năng phân cực lưỡng cực của điện tử

theo chiều ngang và theo chiều dọc không còn tương đương Do đó xuất hiện hai cộng hưởng plasmon: một cộng hưởng plasmon theo chiều dọc tương ứng với dao động của các điện tử tự do dọc theo trục dài của thanh (transverse surface plasmon resonace- TSPR) và một cộng hưởng plasmon theo chiều ngang tương ứng với dao động của các điện tử tự do theo phương vuông góc với trục dài của thanh nano (longitudianal surface plasmon resonance- LSPR) [16] Dao động TSPR có cực đại nằm trong vùng khả kiến (520-540 nm), còn dao động LSPR có cường độ mạnh hơn rất nhiều và có cực đại nằm trong vùng có bước sóng lớn hơn, từ vùng khả kiến đến vùng hồng ngoại gần phụ thuộc vào tỉ số cạnh (tỷ số giữa trục dọc/ trục ngang hay tỉ số dài/ngang) của vật liệu [5]

Hình 1.6 Sự phân bố điện tích trên một thanh nano dưới kích thước của ánh sáng tới

Ngoài ra, bước sóng hấp thụ cực đại của dao động LSPR còn phụ thuộc nhiều vào chỉ số khúc xạ của môi trường xung quanh nó Khi chỉ số khúc xạ tăng thì SPR có xu hướng chuyển sang vùng ánh sáng màu đỏ và sự dịch chuyển SPR gần như tuyến tính với chỉ số khúc xạ [4,39] Đây là một trong những tính chất quan trọng được áp dụng trong các ứng dụng về cảm biến plasmon

1.5.2.3 Một số tính chất khác của hạt nano vàng

a Tính chất nhiệt

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể Trong tinh thể, mỗi nguyên tử có một số các nguyên

tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số phối vị Các nguyên tử trên bề mặt vật liệu sẽ

có số phối vị nhỏ hơn số phối vị của các nguyên tử ở bên trong nên chúng có thể dễ dàng tái sắp xếp để có thể trạng thái khác hơn Như vậy, nếu kích thước của hạt

nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm Ví dụ, hạt vàng 2nm có Tm=5000C, kích thước 6nm có Tm = 950oC

1.5.3 Công nghệ sản xuất hạt nano vàng

Hiện nay có hai phương pháp để chế tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phương pháp từ trên xuống Phương pháp từ trên xuống liên quan đến tổng hợp bắt đầu

từ các vật liệu khối bằng cách giảm kích thước của chúng, phương pháp từ dưới lên bắt đầu từ các nguyên tử hoặc các ion kết hợp lại với nhau Các phương pháp tổng hợp keo vàng nano có thể chia làm ba nhóm: các phương pháp hóa học, các phương pháp bức

xạ và phương pháp khử sinh học

1.5.3.1 Phương pháp Turkevich

Phương pháp được phát triển bởi J.Turkevich và đồng nghiệp vào năm 1951 Phương pháp này là phương pháp phổ biến nhất và được coi là phương pháp tổng hợp thông thường của các hạt nano Trong phương pháp này, natri citrate thường đóng vai trò là chất khử và chất ổn định (mặc dù các chất khử khác, như axit amin cũng đã được

sử dụng thành công), được phản ứng với Au ở nhiệt độ cao tạo thành huyền phù keo Phương pháp này có thể tổng hợp được các hạt nano vàng đơn phân tán dạng cầu tan trong nước với kích thước từ 10-20nm với độ bền cao Kích thước hạt có thể tăng lên bằng cách giảm lượng natri citrate Quy trình tạo hạt vàng nano gây ra do phản ứng giữa dung dịch nóng chloauric với natri citrate Ở đây, natri citrate vừa đóng vai trò làm chất khử vừa là tác nhân làm bền

1.5.3.2 Phương pháp Brust-Schiffrin

Brust và Schiffrin đã phát triển một phương pháp vào năm 1994 để tạo ra các hạt nano vàng ổn định nhiệt và có kích thước nằm trong khoảng từ 1,5-5,2nm, thông qua một quy trình tổng hợp dễ dàng Phương pháp Brust liên quan đến chuyển pha Au từ pha nước đến pha hữu cơ bằng thuốc thử chuyển pha, tetraoctyl ammonium bromide (TOAB) Tuy nhiên, TOAB không bao bọc xung quanh hạt nano một cách bền vững,

do đó dung dịch sẽ bị kết tủa sau khoảng thời gian 2 tuần, để hạn chế hiện tượng này,

sử dụng một tác nhân làm bền mạnh hơn ví dụ như alkanethiol Bổ sung các chất khử gây ra sự thay đổi màu sắc của pha hữu cơ, từ màu cam sang nâu sẫm, cho thấy có sự hình thành của hạt nano vàng [23]

1.5.3.3 Phương pháp phát triển mầm

Phương pháp phát triển mầm có thể tạo ra hạt nano vàng có đường kính 5-40nm và

có phân bố kích thước hẹp Kích thước hạt có thể được kiểm soát bằng tỷ lệ thay đổi của hạt mầm với muối kim loại, dó đó mọi hạt nano có kích thước trong phạm vi 5-40nm đều có thể tổng hợp được Ưu điểm của phương pháp là quy trình đơn giản, nhanh chóng và chi phí thấp Các hạt nano kim loại quý không đẳng hướng có hình dạng khác nhau có thể được tổng hợp một cách thuận tiện khi sử dụng phương pháp này Dung dịch phát triển mầm chứa các ion kim loại dư, chất hoạt động bề mặt hoặc chất tạo hình

và chất khử nhẹ Các muối kim loại bị khử trên bề mặt của các hạt nano và phát triển thành các hạt nano có kích thước mong muốn [23]

1.5.3.4 Phương pháp khử sinh học

Mặc dù phương pháp hóa học là phương pháp phổ biến nhất để tổng hợp các hạt

nano kim loại những việc sử dụng các hóa chất đắt tiền và các thuốc thử độc hại như các chất khử và các chất ổn định làm hạn chế tính ứng dụng của chúng Ngoài ra các hạt nano này có thể có hại trong các ứng dụng y sinh Hiện nay, tổng hợp sinh học đang rất được quan tâm như một phương pháp thân thiện với môi trường Hạt nano được tổng hợp bởi vi sinh vật, enzyme, hoặc chiết xuất thực vật Các ống nano vàng tinh thể đã được tổng hợp ở nhiệt độ phòng bằng cách khử các ion AuCl4- bằng chiết xuất từ sả [39] Ngoài ra, chiết xuất của cây lô hội [16], đơn bào tảo xanh và Chlorella Vulgaris [20] đã được sử dụng để sản xuất nhiều loại hạt nano khác nhau

1.5.3.5 Phương pháp tổng hợp điện hóa

Phương pháp tổng hợp điện hóa được nghiên cứu lần đầu tiên vào năm 1994 bởi Reetz và cộng sự Nghiên cứu cho thấy hạt nano có kích thước chọn lọc của các kim loại chuyển tiếp có thể tổng hợp được bằng phương pháp điện hóa, sử dụng muối amoni tetraakyl như một chất ổn định của các kim loại trong môi trường khan Các hạt nano vàng được tổng hợp trên bề mặt ống nano cacbon đa thành bằng điện cực cacbon thủy tinh, quá trình oxi hóa xảy ra ở cực dương và quá trình khử ở cực âm

Phương pháp điện hóa có ưu điểm so với các phương pháp tổng hợp khác vì thiết

bị đơn giản, chi phí thấp, nhiệt độ quá trình tổng hợp thấp hơn, chất lượng tốt và dễ kiếm soát hiệu suất [23]

1.5.3.6 Các phương pháp khác

Một phương pháp khử hóa học khác được nhóm tác giả Eah phát minh vào năm

2010, gọi là phương pháp Martin [29] Phương pháp này tạo ra các hạt vàng nano trong nước bằng cách khử HauCl4 bằng NaBH4 Mặc dù không sử dụng các chất hoạt động

bề mặt như citrate nhưng các hạt vàng nano vẫn có độ phân tán cao

Năm 2009, Perault và Chan [36] đã phát minh ra phương pháp mới để tổng hợp vàng nano (phương pháp Perault), sử dụng hydroquinone để khử HAuCl4 trong dung dịch có chứa sẵn các hạt vàng nano Trong phương pháp này, các hạt vàng nano có thể đóng vai trò là chất cầu nối với hydroquinon để xúc tác việc khử các ion vàng trên bề

mặt Sự tồn tại các chất ổn định như các ion citrate có thể giúp các hạt lớn lên một cách

có kiểm soát và tạo ra các hạt nano với kích thước rất lớn, khoảng 30-250nm

1.5.4 Ứng dụng của hạt nano vàng

1.5.4.1 Ứng dụng của hạt nano vàng nói chung

Hạt nano vàng với các tính chất đặc biệt đi kèm với nhiều ứng dụng ngày càng quan trọng Các ứng dụng của hạt nano vàng đang phát triển trong các lĩnh vực phân tích, y học, sinh học hay khoa học sự sống

- Ứng dụng trong cảm biến sinh học được sử dụng rộng rãi khi các hạt nano kết hợp với các phân tử sinh học

- Là chất chống vi khuẩn, chống nấm và kháng khuẩn khi được thêm vào chất dẻo, vật liệu tráng, sợi nan và nguyên liệu dệt

- Trong liệu pháp quang động học, khi ánh sáng được chiếu lên một khối u có chứa các hạt nano vàng, các hạt nóng lên nhanh chóng, giết chết tế bào khối u

- Trong các cảm biến khác nhau, ví dụ: cảm biến màu với hạt nano có thể xác định được liệu thực phẩm có phù hợp để tiêu dùng hay không

- Làm đầu dò cho kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) nhờ khả năng tạo tương phản tốt

- Sử dụng trong các pin nhiên liệu

1.5.4.2 Ứng dụng của hạt nano vàng trong phân tích

Nhờ tính chất quang học là hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt, các hạt nano vàng có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực hóa học phân tích như xác định các cation kim loại nặng Pb2+, Cr2+, Hg2+ trong nước ô nhiễm, phát hiện anion như F-, các anion độc hại như CN- và AsO33-/AsO43-, các chất hoạt động bề mặt dạng anion PFOS, các chất hữu cơ như axit nucleic, protein, acetamiprid, amoxicilin, dopamine, morphine, ibuprofen Bảng 1.4 liệt kê một số ứng dụng của hạt nano vàng trong phân tích:

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của hạt nano vàng trong phân tích

Chất phân

tích

Tín hiệu / Detector Dung dịch

Khoảng tuyến tính LOD TLTK

F-

Hấp thụ tại

529 nm /

800 nm, hoặc bằng mắt thường

Dithiol- modified flexible/

đệm phosphat, pH=7,7

120 𝜇𝑀 – 1,5 mM (~ 2-30 ppm)

120 𝜇𝑀 ( ~ 2

Hấp thụ tại bước sóng

525 nm/625

nm, hoặc bằng mắt thường

20mM EDTA, pH=5-8

Huỳnh quang tại

520 nm

10mM đệm phosphat, pH=7,4

5-4,5 𝜇𝑀 (95-855 ppb)

50 nM [48]

CN-

Hấp thụ ở bước sóng

680 nm

Dung dịch trung hòa

pH, không cần thời gian phản ứng

10-25 𝜇𝑀 (260-650 ppb)

10 𝜇𝑀 (260

Huỳnh quang tại bước sóng

NaOH- NaHCO3 pH=12, thời

200 nm – 9,5 𝜇𝑀

200 nM (~5ppb) [41]

640 nm (kích thích ở bước sóng

520 nm)

gian phản ứng 20 phút

30 phút tại nhiệt độ phòng

5-550 ppb 2 ppb [43]

PFOSs

Hấp thụ tại

520 nm, bằng mắt thường

Trước hết

xử lý mẫu nước từ 200

mL thành 5

mL methanol Đo: 0,2 mL

10-1000

dung dịch đặc trộn với 0,8 mL dung dịch nano Au phản ứng trong 30 phút

15 phút tại nhiệt độ phòng

3,3×10-8 – 1,0×10-7

M và 3,0×10-7 – 4,5×10-6

250C

1,33-33,29

𝜇𝑔/ml và 0,28-6,9

𝜇𝑔/ml

0,15 𝜇𝑔/ml và 0,03 𝜇𝑔/ml [51]

Meropenem có thể xác định được bằng nhiều phương pháp như phương pháp sắc

ký, phương pháp điện hóa, điện di tuy nhiên các phương pháp này đỏi hỏi xử lý mẫu phức tạp, mất nhiều thời gian Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis,dựa trên cơ sở đo sự biến đổi các tính chất quang học của dung dịch nano vàng khi có mặtchất phân tích, là một phương pháp đơn giản, không tốn kém, không cần sử dụng dung môi hữu cơ cũng như không cần tạo dẫn xuất hoạt động quang học Do đó trong luận văn này chúng tôi dự định nghiên cứu việc tổng hợp dung dịch nano vàng và ứng dụng vào phân tích meropenem bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

CHƯƠNG II-THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu

Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng quy trình xác định meropenem bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng hạt nano vàng và ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng kháng sinh meropenem trong các mẫu dược phẩm

2.1.2 Đối tượng

Nghiên cứu được tiến hành phân tích trên đối tượng là mẫu thuốc chứa meropenem

2.1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung của nghiên cứu bao gồm:

1 Tổng hợp hạt nano vàng dạng cầu bằng phương pháp Turkevich

2 Khảo sát các đặc trưng quang học, hình thái học.v.v của dung dịch nano vàng điều chế được bằng các phương pháp UV-Vis, TEM

3 Khảo sát các yếu tổ ảnh hưởng đến phương pháp xác định meropenem bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng hạt nano vàng

- Khảo sát chọn cực đại hấp thụ để đo độ hấp thụ quang

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến dung dịch

-Khảo sát ảnh hưởng của môi trường phản ứng: nồng độ muối NaCl và pH

-Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch vàng và nồng độ dung dịch meropenem đến tỉ lệ độ hấp thu quang A660/A520

3 Đánh giá phương pháp phân tích

- Xác định khoảng tuyến tính

- Xây dựng đường chuẩn

- Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đánh giá độ chụm và độ chính xác của phương pháp phân tích

4 Áp dụng quy trình phân tích để phân tích mẫu thực tế: mẫu thuốc tiêm chứa meropenem

- Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu tới việc xác định meropenem