(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase từ bacillus subtilis PY79

Catalase từ các sinh vật khác nhau cũng đã được tinh sạch và nghiên cứu tính chất như: B.subtilis [30],Vibrio rumoiensis S-1T[59],Comamonas terrigena[64],chủng Rhizobiumradiobacter 2-

ĐẠI HỌC QUỐCGIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Phạm Thu Hương

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT

CỦA CATALASE TỪ Bacillus subtilis PY79

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Phạm Thu Hương

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT

CỦA CATALASE TỪ Bacillus subtilisPY79

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Thị Hồng Loan

TS Đinh Nho Thái

Hà Nội, 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với

TS Nguyễn Thị Hồng Loan và TS Đinh Nho Thái đã tận tình hướng dẫn và t ạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong su ốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đ ến các thầy giáo, cô giáo của Khoa Sinh h ọc cũng như các thầy, cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức nền tảng bổ ích

Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các cán bộ, học viên sau đại học và sinh viên Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã chia sẻ và tạo những điều kiện tốt

nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và ba ̣n bè đã luôn dành tình c ảm, động

viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn

Luậnvănđượcthựchiệntrongphạmvinội dung vàkinhphícủađềtàicấpĐạihọcQuốcgiaHàNội, mãsố QG.16.82

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Phạm Thu Hương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CATALASE 3

1.1.1 Giới thiệu và lịch sử phát hiện catalase 3

1.1.2 Cấu trúc và phân loại catalase 4

1.1.3 Cơ chế hoạt động phân tử của catalase 8

1.1.4 Vai trò và ứng dụng của catalase 9

1.1.5 Tình hình nghiên cứu catalase ở trong và ngoài nước 12

2.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis 14

2.2.1 Lịch sử phát hiện, đặc điểm và phân loại 14

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sự phân bố 15

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa và ảnh hưởng của các yếu tố đến sự tổng hợp catalase của B subtilis 17

2.2.4 Tính an toàn và ứng dụng của B subtilis 18

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 NGUYÊN LIỆU 21

2.2 MÁY MÓC VÀ CÁC TRANG THIẾT BỊ 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Nuôi cấy, thu dịch chiết tổng số của vi khuẩn B subtilis PY79 21

2.3.2 Tinh sạch catalase từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis bằng kết tủa thuận nghịch và sắc kí trao đổi ion 22

2.3.3 Định lượng protein bằng đo quang phổ ở bước sóng A280 nm 23

2.3.4 Kiểm tra độ sạch của protein bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) 23

2.3.5 Xác định hoạt độ của catalase dựa trên khả năng phân giải H2O2 ở bước sóng A240 nm bằng quang phổ kế 25

2.3.6 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và một số ion đến hoạt tính của catalase 26

2.3.7 Xác định các hằng số động học của catalase 26

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO NUÔI CẤY VI KHUẨN B subtilis PY79 SINH CATALASE 27

3.1.1 Môi trường nuôi cấy thích hợp cho B subtilis PY79 27

3.1.2 Nồng độ H2O2 dùng để cảm ứng B subtilis PY79 sinh catalase 29

3.1.3 Thời điểm cảm ứng B subtilis PY79 bằng H2O2 31

3.1.4 Thời điểm thu sinh khối tế bào B subtilis PY79 32

3.2 TINH SẠCH CATALASE TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN B subtilis PY79 35

3.2.1 Sắc ký trao đổi anion Q-sepharose 35

3.2.2 Sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose 37

3.3 MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CATALASE TINH SẠCH TỪ B subtilis PY79 41

3.3.1 Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase 41

3.3.2 pH tối thích và độ bền pH của catalase 42

3.3.3 Thông số động học của catalase tinh sạch từ B subtilis PY79 43

3.3.4 Ảnh hưởng của một số chất lên hoạt độ của catalase tinh sạch từ B subtilis PY79 44

KẾT LUẬN 46

KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần gel cô và gel tách trong polyacrylamide SDS-PAGE 24

Bảng 2.2: Thành phần của một phản ứng xác định hoạt tính 25

Bảng 3.1: Thành phần các môi trường nuôi cấy 27

Bảng 3.2: Bảng tóm tắt tinh sạch catalase từ dịch chiết B subtilis PY79 39

Hình 1.5: Các phản ứng phân giải H2O2 bởi catalase 9

Hình 3.1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh catalase của vi

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời điểm thu sinh khối tế bào đến khả năng sinh catalase

của B Subtilis PY79 33

Hình 3.5: Hoạt độ phân giải H2O2 của catalase trong dịch chiết protein tổng số 34

Hình 3.6: Sắc ký đồ tinh sạch catalase từ dịch chiết B subtilis bằng sắc ký cột

Q-sepharose 36 Hình 3.7: SDS-PAGE các phân đoạn chạy qua cột Q-Sepharose 36

Hình 3.8: Sắc ký đồ tinh sạch catalase từ dịch chiết B subtilis bằng sắc ký cột

CM-Sepharose 38 Hình 3.9: SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch qua cột CM-Sepharose 38 Hình 3.10: SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch 39

Hình 3.11: Nhiệt độ tối thích và độ bền nhiệt độ của catalase tinh sạch từ B subtilis

PY79 41

Hình 3.12: pH tối thích và độ bền pH của catalase tinh sạch từ B subtilis PY79 42

Hình 3.13: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng thuỷ phân H2O2 của catalase ở các nồng độ H2O2 khác nhau theo phương trình Lineweaver-Burk 43

Hình 3.14: Ảnh hưởng của các chất đến hoạt độ của catalase tinh sạch từ B subtilis.45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP Adenosine triphosphate

dd H2O Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H2O) Đệm A Kali phosphate 50 mM pH 7

Đệm B Tris-HCl 20 mM pH 8

Đệm C Natri acetate 10 mM pH 4,8

FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

(Food and Agriculture Organization) FDA Cục an toàn Thực phẩm và Thuốc của Mỹ (Food and

Drug Administration)

kDa Kilodalton

KLPT Khối lượng phân tử

LB Luria Bertani

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

OD Mật độ quang học (Optical Density)

PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel

Electrophoresis) ROS Các dạng oxi hóa hoạt tính (ReactiveOxidative Species) SDS Sodium Dodecylsulphate

TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

1

MỞ ĐẦU

Catalase (E.C 1.11.1.6) là enzyme có ở hầu hết các vi khuẩn hiếu khí và là một trong những thành phần trung tâm của các quá trình khử độc, ngăn chặn cực nhanh sự hình thành phản ứng hydroxyl bằng cách xúc tác sự phân giảihydrogen peroxide (H2O2) thành nước và oxy [43, 52] Catalase điển hình hoạt động trong khoảng pH 5 - 10, tối ưu tại pH 6 - 8 và ổn định ở nhiệt độ 10 - 30oC [5]

Catalase đã được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghệ sinh học khác nhau Do có hoạt tính phân giải nhanh H2O2 nên catalase có khả năng ức chế sự phân giải của tế bào viêm, một loạt các khối u, apoptosis, tế bào thần kinh và lão hóa [12, 18, 33, 57, 58] Enzyme cũng được chứng minh là tác nhân có thể hỗ trợ dẫn truyền thuốc nội bào [53] và sử dụng trong định lượng cholesterol [42] Theo một số công bố gần đây, sự giảm của catalase có thể đóng vai trò trong quá trình bạc tóc sớm ở người H2O2 tự nhiên được tạo ra bởi các hoạt động trao đổi của cơ thể và catalase có vai trò phân giải chúng rất nhanh Do vậy, nếu hàm lượng catalase giảm đi, nó sẽ không thể phân giải hết H2O2, dẫn đến tóc bị tẩy trắng từ bên trong Nhận định này vẫn đang được làm sáng tỏ với hy vọng phát triển các phương pháp chữa bạc tóc dựa trên việc bổ sung catalase [20, 62]

Catalase từ các sinh vật khác nhau cũng đã được tinh sạch và nghiên cứu tính chất như: B.subtilis [30],Vibrio rumoiensis S-1T[59],Comamonas

terrigena[64],chủng Rhizobiumradiobacter 2-1 [23] Hầu hết các nghiên cứu

thường tinh sạch enzyme bằng cách sử dụng muối amoni sulfate kết tủa chọn lọc protein và các loại sắc ký như lọc gel [23, 30], trao đổi ion (DEAE Sephadex hoặc

DEAE cellulose[23, 30], Q Sepharose FF [59]) Trong đó,B subtilis được xem như

là một chủng vi khuẩn có lợi cho con người và đã được sử dụng để sản xuất nhiều chế phẩm sinh học như: men vi sinh; men Natto – một thực phẩm chức năng rất bổ

dưỡng cho sức khỏeở Nhật Bản [61] Ngoài ra, B subtilis còn được biết đến với khả

năng sinh ra nhiều enzyme, trong đó có catalase với hoạt tính cao, an toàn khi thao tác [46] Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch và xác định

2

các tính chất của catalase từ nguồn gốc tự nhiên Các nghiên cứu chủ yếu là định tính và định lượng hoạt tính của catalase có trong mẫu dịch chiết [1] Từ thực tế

trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch và xác định một

số tính chất của catalase từ Bacilus subtilisPY79” với mục tiêu tạo được chế

phẩm enzyme có độ tinh sạch, độ bền và hoạt tính tốt để phục vụ cho các nghiên cứu sau này

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CATALASE

1.1.1 Giới thiệu và lịch sử phát hiện catalase

Hydrogen peroxide (H2O2) là một trong những gốc oxy hoạt tính (ROS) phổ biến nhất trong khí quyển H2O2 xuất hiện do có trong môi trường, là sản phẩm phụ của chuỗi vận chuyển điện tử trong quá trình hô hấp hiếu khí, quang hợp hoặc sản phẩm của sự hoạt động enzyme (chủ yếu là oxidase) [63] Trong tế bào, các gốc oxi hóa tự do tấn công hầu hết các hợp chất quan trọng như DNA, protein, màng lipid kép và thậm chí phá hủy cả tế bào Do đó, các sinh vật đã tiến hóa để có một hệ thống enzyme phức tạp và hiệu quả bao gồm: catalase, peroxidase và superoxide dismutase nhằm loại bỏ nhanh chóng và hiệu quả các gốc ROS này [41, 50, 63]

Catalase (EC 1.11.1.6) thuộc lớp oxidoreductase, có mặt trong hầu hết các sinh vật hiếu khí (bao gồm thực vật, động vật và vi sinh vật), có vai trò quan trọng chống lại các stress oxy hóa bằng cách xúc tác cho phản ứng phân giải H2O2 thành

H2O và O2 Trong tế bào, catalase chủ yếu được sinh ra trong peroxisome của các sinh vật nhân thực và trong tế bào chất của sinh vật nhân sơ Đây là một trong những enzyme hoạt động nhanh nhất, một phân tử catalase có thể phân giải hàng triệu phân tử H2O2 trong mỗi giây [50, 55]

Catalase là một trong những enzyme có lịch sử phát hiện sớm và có nhiều nghiên cứu chi tiết về đặc điểm và tính chất của enzyme Enzyme lần đầu tiên được phát hiện bởinhà bác học Thénarad(1818), được gọi tên lần đầu là catalase bởi nhà bác học Loew (1900) [29], được chứng minh trong trung tâm hoạt động có chứa sắt bởi Warburg (1923) và được xác định chức năng trong tế bào là tác nhân xúc tác phân giải H2O2 thành H2O và O2bởi Wieland và tập thể (1927) [65] Năm 1937, hai nhà bác học Sumner và Dounce [56] lần đầu tiên đã kết tinh được catalase từ gan bò

và xác định được khối lượng phân tử (KLPT) là 232 kDa; tiếp theo là những công

bố về trình tự amino acid và cấu trúc không gian ba chiều của enzyme [35, 47, 65] Cho đến nay, đặc điểm cấu trúc, cơ chế hoạt động và tính chất của enzyme đã được

4

làm sáng tỏ; hơn 300 công trình tinh sạch enzyme đã được công bố; catalase được xem là một trong những enzyme có nhiều đặc điểm hóa sinh hấp dẫn các nhà khoa học nghiên cứu và có tiềm năng ứng dụng vô cùng to lớn trong các ngành công nghiệp và lĩnh vực y dược [9, 24]

1.1.2 Cấu trúc và phân loại catalase

Cấu trúc của catalase rất đa dạng và phụ thuộc vào nguồn phân lập, tuy nhiên nhìn chung có một số đặc điểm chung cơ bản Một phân tử catalase hoạt động chức năng thường có cấu trúc dimer hoặc tetramer hoặc hexamer Mỗi monomer là một chuỗi polypeptide có khoảng 500-700 amino acid và một nhóm heme có chứa nguyên tử Fe ở trung tâm, một số trường hợp Fe được thay bằng Mn hoặc NADPH với vai trò bảo vệ nhân heme khỏi sự oxi hóa [31]

5

Về phân loại, có hơn 300 catalase đã được biết đến, chúng được tinh sạch từ các chủng khác nhau, có thể có nhân heme hoặc không có nhân heme Dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phần dưới đơn vị cấu tạo nên enzyme và có hay không có nhân heme chúng được chia ra làm ba loại khác nhau Nhóm một là các catalase đơn chức năng (monofunctional catalase) có chứa nhân heme, được tìm thấy nhiều nhất ở trong tự nhiên Nhóm thứ hai là catalase hai chức năng (Bifunctional catalase-peroxydase), có chứa nhân heme, ít phổ biến hơn, có mối liên quan chặt chẽ đến các peroxidase ở thực vật về cấu trúc và trình tự amino acid Cuối cùng là nhóm manganese catalase, không chứa nhân heme, tìm thấy ở các vi khuẩn

có khả năng chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như nhiệt độ, nồng độ muối cao…[39]

Nhóm catalase đơn chức (monofunctional catalase): Đây là nhóm phổ biến

nhất, có mặt ở hầu hết các đại diện của động vật, thực vật và vi sinh vật với số lượng hơn 225 catalase trong số hơn 300 catalase được phát hiện đến nay; có chức năng chính là phân giải H2O2và chức năng phụ là peroxy hóa [9] Catalase thường

có hoạt tính khi ở dạng tetramer, nhưng một số dạng như dimer, hexamer hay thậm

chí dạng hiếm gặp như heteromer cũng được tìm thấy (Pseudomonas aeruginosa)

[31].KLPT của catalase dao động khoảng từ 200-340 kDa với một nhóm heme ở vùng trung tâm hoạt động Dựa trên kích thước của mỗi monomer, catalase được chia ra loại có monomer kích thước nhỏ (55-69 kDa) và loại có kích thước lớn (75-

84 kDa) [31, 38, 56, 65]

6

Hình1.2:Cấutrúc monomer của catalase hemeđơnchứcnăng [54]

Bên cạnh đó, cũng có sự khác nhau ở loại nhân heme, nhân heme loại b hay tồn tại trong các catalase có monomer kích thước nhỏ (catalase từ gan bò) và nhân heme loại d hay tồn tại trong những catalase có monomer kích thước lớn (catalase

của E coli).Cấu trúc bậc 4 của catalase có vùngbảo thủ bao gồm: đầu N-terminal

với 70 amino acid đầu tiên, vùng gấp nếp β từ vị trí amino acid thứ 72-318, vùng domain kết nối hay còn gọi là vùng kết nốivà vùng xoắn α (vị trí 444-503) Một số catalase thuộc nhóm này cũng có vùng bảo thủ là đầu C-terminal dài khoảng 150 amino acid (Hình 1.2)[54] Theo nghiên cứu gần đây, catalase điển hình ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực đều có vùng β-barrel là vùng có tính bảo thủ cao nhất, vùng kết nối và α-helical vẫn có một số biến đổi [31, 54]

Nhóm hai chức năng (Bifunctional catalase- peroxydase)

Nhóm catalase hai chức năng thường ít gặp, chỉ có chủ yếu ở các vi sinh vật hiếu khí, chưa được phát hiện ở những đại diện như thực vật và động vật Catalase thuộc nhóm này có KLPT dao động trong khoảng 120-340 kDa Nhóm enzyme này thể hiện cả hoạt tính catalase và hoạt tính peroxidase, thường rất nhạy cảm với nhiệt

độ và pH phụ thuộc vào điều kiện phân lập Enzyme tồn tại chủ yếu ở dạng dimer

có khoảng 750 amino acid trong mỗi monomer (Hình 1.3), ngoài ra dạng tetramer

7

cũng được tìm thấy ở E coli Mỗi monomer được chia ra 2 vùng chủ yếu là vùng N

và C được sắp xếp dọc theo chiều dài của phân tử, nhân heme nằm ở vùng terminal Một đặc điểm bảo thủ ở hầu hết các catalase thuộc nhóm 2 là sự có mặt của một covalent adduct- cấu trúc mà vị trí ortho của tyrosine sẽ liên kết với methionine ở một bên và bên đối diện sẽ liên kết với tryptophan [54]

N-Hình1.3:Cấutrúcđơnphâncủa catalase-peroxidases từSynechococcus elongates

PCC7942 [73]

Nhóm pseudocatalase (Manganese catalase)

Nhóm non-hemecatalase còn gọi là pseudocatalase,là nhóm catalase đặc biệt, có 2 nguyên tử Mn ở vùng trung tâm hoạt động thay cho Fe, thường được tìm thấy ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ Những enzyme này có KLPT trong khoảng 170-210 kDa (Hình 1.4) [11, 54] Catalase thuộc nhóm này là một homohexamer, mỗi tiểu đơn vị có khối lượng khoảng 30 kDa Cơ chế thủy phân H2O2 của catalase thuộc nhóm này khác biệt lớn so với các catalase có nhân heme: quá trình xúc tác phản ứng thủy phân không có những phản ứng trung gian, hai phân tử H2O được hình thành trong một bước xúc tác và không có các gốc tự do trong quá trình xúc tác [39]

8

Hình 1.4:Cấutrúcđơnphântửcủamangan catalase từLactobacillus plantarum[63]

1.1.3 Cơ chế hoạt động phân tử của catalase

Chức năng chính của catalase là xúc tác cho sự phân giải H2O2 thành H2O và

O2, phản ứng xúc tác có thể khác nhau tùy thuộc vào nhóm catalase, tuy nhiên chúng thường diễn ra theo 2 giai đoạn: giai đoạn 1, sự oxy hóa của nguyên tử Fe bởi

1 phân tử H2O2 hình thành nên phức hệ A, trong giai đoạn này sự liên kết O-O trong phân tử sẽ bị phân cắt một cách nhanh chóng dẫn đến một nguyên tử O liên kết trong phân tử H2O và một nguyên tử O sẽ gắn với nguyên tử Fe trong nhân heme hình thành phức hệ A và một phân tử H2O (phản ứng 1) (Hình 1.5) Giai đoạn 2, với nhóm catalase điển hình, phức hệ A là một loại gốc cation (*+Por Fe (IV) =O) bị khử bởi phân tử H2O2 thứ 2 dẫn đến sự hình thành thêm một phân tử H2O và 1 phân

tử O2 (phản ứng 2) (Hình 1.5) Còn với nhóm catalase-peroxidase, ban đầu enzyme

sẽ thể hiện hoạt tính peroxidase liên quan đến việc sử dụng chất cho e hữu cơ (AH2) cho sự khử của phức hệ A (phản ứng 3) (Hình 1.5) Chu trình xúc tác sẽ gồm 3 bước: phức hệ A được hình thành ở phản ứng 1, sau đó là sự khử phức hệ A tạo thành phức hệ C (Por Fe (IV) =O) (phản ứng 4), cuối cùng là sự khử của phức hệ C

và kết thúc quá trình xúc (phản ứng 5) (Hình 1.5) Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phức hệ A có thể bị khử một cách trực tiếp trong phản ứng thể hiện hoạt tính peroxidase để tạo enzyme tự do như phản ứng (phản ứng 6) [54]

9

Hình1.5:CácphảnứngphângiảiH 2 O 2 bởi catalase [54]

Cơ chế phản ứng phân giảiH2O2 của Manganese catalase khác với hai nhóm còn lại Cả giai đoạn oxy hóa của cụm dimangan là ổn định, cân bằng và thường có trong enzyme cô lập Trong những phản ứng xúc tác Mn+2-Mn+2 sẽ bị oxi hóa thành

Mn+3- Mn+3 bởi phân tử O2 và sự khử diễn ra bởi hydroxyamine Vị trí hoạt động của enzyme trong cả giai đoạn này là cốt lõi của phản ứng xúc tác [54]

1.1.4 Vai trò và ứng dụng của catalase

Vai trò của catalase với cơ thể sinh vật

Các gốc ROS và đặc biệt H2O2 được xem là sản phẩm sinh học gây hại, sản sinh trong quá trình trao đổi chất trong tế bào, chúng có thể phá hủy các đại phân tử như DNA, các protein, thậm chí có thể phá hủy tế bào và mô Catalase có khả năng làm giảm H2O2 trong tế bào bằng cách thủy phân chúng thành H2O và O2

[30].Ngoài chức năng phân giải và cân bằng lượng H2O2,catalase cũng có khả năng

sử dụng H2O2 để oxi hóa các chất độc như methanol, ethanol, formic acid, formaldehydevà nitrate [30] Catalase là enzyme tìm thấy ở tất cả các tế bào của cơ

10

thể người và nhiều nhất trong tế bào gan Ở tế bào hồng cầu người, hemoglobin được bảo vệ bởi sự sắp xếp catalase H2O2 được tạo ra với nồng độ khá cao trong quá trình trao đổi chất Do vậy nếu trong hồng cầu thiếu catalase, hemoglobin bị oxy hóa bởi H2O2 tạo thành methamoglobin (Por Fe (III)) và cuối cùng là oxoiron (IV) Hậu quả làm tan máu hồng cầu, trùng hợp hemoglobin và sự kết tủa của hồng cầu bị sai hỏng [63] Catalase còn được chứng minh là ngăn cản yếu tố phiên mã NF-kB nhạy cảm với các oxy hóa Bên cạnh đó, tế bào ung thư tạo ra mức H2O2 cao bất thường do hoạt động của catalase rất thấp so với tế bào bình thường Sau khi phát hiện ra sự hình thành phức hợp giữa Grb2 – một protein gắn với yếu tố tăng trưởng và trình tự 447Tyr-Val-Asn-Val trong catalase của người, người ta đã cho rằng catalase tham gia vào tín hiệu integrin Những kết quả trên đề xuất sự tham gia gián tiếp của catalase trong việc điều hòa sự tăng sinh tế bào [63] Các nghiên cứu cũng cho thấy có sự liên quan giữa sự thiếu hụt catalase và bệnh đái tháo đường ở những bệnh nhân tiểu đường týp I Các đột biến chèn và thay thế trong gen catalase làm giảm đáng kể hoạt tính của catalase trong máu dẫn đến tăng nồng độ H2O2

trong huyết thanh và mô; hậu quả là các tế bào β của tụy sản sinh ra insulin bị sai hỏng Các đột biến ác tính khác trong gen catalase cũng có thể ảnh hưởng đến chuyển hóa lipid, homocysteine, làm tăng huyết áp và bạch biến [63]

Một số nghiên cứu khác còn cho thấy, catalase có khả năng chống lại sự thoái hóa và sự già hóa, có vai trò trong kéo dài tuổi thọ và sức sống[70]

Màu tóc được quyết định bởi hàm lượng sắc tố melanin [25] Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Kauser và tập thể (2006) [26], catalase biểu hiện kém ở nang tóc của người cao tuổi, do vậy lượng H2O2 dư sẽ ngăn cản các tế bào sắc tố sản sinh ra melanin dẫn đến tóc bạc Nghiên cứu của Wood và tập thể (2009) [64] cũng chỉ ra rằng ở phần nang tóc của sợi tóc bạc tích lũy đến mM H2O2 và làm phân giải melanin dẫn đến tế bào thiếu hắc tố, góp phần gây nên chứng bạc tóc Ở người bình thường, catalase được biểu hiện đủ giúp phân giải hiệu quả H2O2 giúp ngăn cản quá trình hình thành tóc bạc và lão hóa [74]

Trong các ngành công nghiệp: catalase đã được cấp phép bởi nhiều nhãn hiệu như fermcolase, CAT_IG, Enzeco và Terminox Trong ngành công nghiệp sản xuất

và chế biến sữa, H2O2 được dùng ở bước thanh trùng sữa, do đó catalase được sử dụng để loại bỏ H2O2 trước khi sản phẩm được cung cấp ra thị trường [44] Sử dụng catalase để xây dựng các thiết bị cảm ứng điện hóa đã được nghiên cứu để ứng dụng trong: ước lượng hàm lượng H2O2, fluoride và cyanide, phát hiện mức độ phân giải của H2O2 trong sữa [54] H2O2cũng thường được sử dụng làm chất tẩy trắng trong ngành công nghiệp dệt may và bột giấy, loại bỏ chất này sau khi tẩy trắng là một bước quan trọng để không ảnh hưởng đến những bước nhuộm tiếp theo [45]

Trong lĩnh vực y học: Catalase đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa lượng H2O2 trong tế bào hồng cầu, một nửa lượng H2O2 sinh ra sẽ được catalase phân giải [54] Enzyme này cũng được ứng dụng trong việc ngăn ngừa ung thư, ức chế khả năng di căn ra các phần khác nhau của cơ thể Qua các nghiên cứu trên bệnh nhân đái tháo đường, tình trạng thiếu hụt catalase dẫn đến tăng nguy cơ mắc bệnh cao hơn những trường hợp bình thường, những tế bào β ở đảo Langerhans của tuyến tụy rất nhạy cảm với H2O2, nên tình trạng thiếu catalase làm cho các tế bào này có thể bị ảnh hưởng hoặc thậm chí bị phá hủy [54] Một phức hệ bao gồm các

áp tròng [54]

Theo những nghiên cứu gần đây, sự thiếu hụt catalase là nguyên nhân gây ra bạc tóc sớm ở người Tóc bạc sớm là do sự hình thành của H2O2 thường có trong thuốc nhuộm tóc hoặc được sinh ra từ nang tóc; do vậy việc thiếu hụt catalase làm cho phân giải không hết H2O2 dẫn đến tóc bị tẩy trắng từ trong Nhận định này đang được làm sáng tỏ với hi vọng sản xuất ra các sản phẩm ngăn ngừa và chữa trị bạc tóc sớm [26]

1.1.5 Tình hình nghiên cứu catalase ở trong và ngoài nước

Catalase là enzyme có mặt trong hầu hết các sinh vật từ thực vật, động vật và

vi sinh vật [36] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tinh sạch và xác định tính chất của catalase từ nhiều nguồn sinh vật khác nhau: ở thực vật như mầm lúa mì, phèn đen, táo [8, 16, 60]; gan của nhiều động vật như gan ễnh ương [24], gan trâu

[34]; vi khuẩn như B subtilis [30], Vibrio rumoiensis S-1T[59], Comamonas

terrigena[65], chủng Rhizobium radiobacter 2-1 [23]

Tony và tập thể(1972) [49] đã nghiên cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của enzyme catalase từ nấm men bánh mỳ Kết quả nghiên cứu cho thấy, catalase được tinh sạch có hoạt độ riêng 62000 U/mgvới hiệu suất thu hồi10% và độ sạch tăng 77 lần so với dịch protein ban đầu Tuy nhiên, quy trình tinh sạch catalase khá phức tạp và được thực hiện qua 5 bước như: i) hòa tan tế bào nấm men khô trong đệm veronal-HCl 3 mM pH 8,2, phá vỡ tế bào bằng cách lắc va đập với các hạt thủy tinh và ly tâm lấy dịch protein; ii) chiết catalase sử dụng hỗn hợp dung dịch ethanol và CHCl3 (1:1 v/v); iii) tủa protein bằng (NH4)2SO4 40%, hòa tan tủa protein trong đệm phosphate 5 mM pH 7,0; iv) bước iii) được lặp lại hai lần nhưng

13

với (NH4)2SO4 45%, nhằm loại bớt một số protein không mong muốn; và bước cuối cùng là tinh sạch protein bằng sắc kí lọc gel Sephadex G-75

Yumoto vàtập thể(2000) [59] đã nghiên cứu tinh sạch và xác định một số

tính chất của catalase từ vi khuẩn Vibrio rumoiensis S-1T Catalase được tinh sạch bằng 2 bước sắc kí trao đổi anion Q Sepharose FF và bước 3 là sắc kí lọc gel Sephacryl S-300 cùng với các bước thẩm tách Kết quả cho thấy, catalase tinh sạch

có hoạt độ riêng 395000 U/mg, với hiệu suất tinh sạch 20% và độ sạch gấp 54 lần

so với mẫu protein ban đầu

Hossain và tập thể(2008) [23] đã nghiên cứu tinh sạch và nhân dòng catalase

bền nhiệt từ chủng vi khuẩn Rhizobium radiobacter 2-1 Catalase được tinh sạch

theo quy trình gồm 3 bước: biến tính protein ở nhiệt độ 50oC sau đó làm lạnh tại

4oC để loại bỏ các protein không bền nhiệt bị kết tủa; tinh sạch catalase bằng sắc kí trao đổi anion và sắc kí lọc gel superose-12 Kết quả cho thấy, catalase tinh sạch có hoạt độ riêng 764500 U/mg với hiệu suất thu hồi 12%, tuy nhiên, độ sạch của chế phẩm catalase tinh sạch chỉ gấp 14 lần so với dịch protein ban đầu

Haiyong và tập thể (2008) [19] đã nghiên cứu tinh sạch và mô tả đặc tính của

catalase từ vi khuẩn B subtilis WSHDZ-01 Catalase được tinh sạch theo quy trình

gồm 3 bước: kết tủa protein tổng số bằng ethanol, sắc kí trao đổi anion DEAE sepharose, và sắc kí tương tác kị nước Phenyl sepharose cùng với các bước thẩm

tách loại muối Kết quả cho thấy, catalase tinh sạch từ B subtilis WSHDZ-01 có

hoạt độ riêng 13568 U/mg, hiệu suất thu hồi 32,5% và có độ tinh sạch thấp, chỉ cao hơn 6,8 lần so với dịch protein tổng số ban đầu

Hussein (2012) [24] đã nghiên cứu tinh sạch và mô tả đặc tính của catalase từ

vi sinh vật kiềm Bacillus sp Quá trình tinh sạch catalase từ Bacillus sp được thực

hiện qua 3 bước: kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 55%; sắc kí trao đổi anion DEAE cellulose và sắc kí lọc gel Sephacryl S-300 cùng với các bước thẩm tách loại muối

Kết quả cho thấy, catalase được tinh sạch từ Bacillus sp có hoạt độ riêng khá thấp

14

566.6 U/mg, hiệu suất thu hồi 56% và có độ tinh sạch thấp, chỉ cao hơn 6,2 lần so với dịch protein ban đầu

Nhìn chung, các nghiên cứu về tinh sạch và xác định tính chất của catalase từ

vi khuẩn cho thấy: i) quy trình tinh sạch catalase còn khá phức tạp, qua nhiều bước [48]; ii) hàm lượng và độ sạch của catalase chưa cao, cho băng protein chưa rõ nét trên điện di gel polyacrylamid [23, 24]

Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về catalase chủ yếu là định tính và định lượng enzyme từ các dịch chiết thô [1]; chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch và xác định tính chất của enzyme từ các nguồn tự nhiên Theo các nghiên cứu trước đó,

catalase được tinh sạch từ các chủng B subtilis có hoạt tính cao, khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ và pH khá rộng [15, 30] Thêm nữa, chủng B subtilis

PY79 là chủng vi sinh vật được nghiên cứu khá nhiều trong phòng thí nghiệm [48]

Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thiết lập một quy trình tinh sạch

hiệu quả và xác định một số tính chất của catalase từ B subtilis

2.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis

2.2.1 Lịch sử phát hiện,đặc điểm và phân loại

Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả

trong giai đoạn đầu tiên của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỉ

19 [3] Năm 1835, Ehrenberg đã phát hiện ra vi khuẩn B subtilis và đặt tên là

Vibrio subtilis[67, 68] Gần 30 năm sau, Davaine đặt tên là Bacteridium Đến năm

1872, Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đổi tên thành B

subtilis Năm 1941, tổ chức y học Nazi của Đức đã phát hiện B subtilis trong phân

ngựa Năm 1949 – 1957, Henry và tập thể đã phân lập được chủng B subtilis thuần

khiết [68]

B subtilisphân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến

dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại Dương;

là những vi khuẩn gram dương có hình que và có khả năng hình thành nên bào tử

15

[3] Gần đây, B subtilis đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên thế giới

Chúng được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi,

công nghiệp, xử lí môi trường [68] Vì vậy, B subtilis đã được quan tâm nghiên cứu

ở mọi cấp độ trong tế bào như giải mã trình tự hệ gen, nghiên cứu cơ chế điều hòa gen, biểu hiện enzyme và protein, sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ các sản phẩm trao đổi bậc hai, cũng như ứng dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại trong phân

loại vi sinh vật ở cấp độ loài và dưới loài [3, 55] Hệ gen của B subtilis có kích

thước 4,2 Mb gồm 4100 gen mã hóa protein, trong số những gen mã hóa này khoảng 53% là những gen đơn bản chỉ mã hóa cho một loại protein duy nhất, khoảng 25% là các họ gen được tạo ra do sự lặp gen, họ gen lớn nhất liên quan đến

sự tổng hợp ATP [67].B.subtiliskhông gây hại cho con người, động vật; về mặt

thương mại, nó như một nhà máy sản xuất nhiều sản phẩm bậc hai quan trọng như các kháng sinh, enzyme, protein dị hợp, kháng nguyên và vacxin [40]

Về phân loại: Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994), B subtilis thuộc:

Giới (regnum): Bacteria Ngành (divisio): Firmicutes Lớp (class): Bacilli

Bộ (ordo): Bacillales

Họ (familia): Bacillaceae

Chi (genus): Bacillus Loài : Bacillus subtilis

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sự phân bố

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tímgram dương, kích

thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đơn lẻ hoặc hình chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ nằm giữa hoặc lệch tâm

tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt

16

của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng, thời gian sống có thể vài năm đến vài chục năm [67]

Vi khuẩn B subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện

Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm

rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô” Thông thường, số lượng B subtilis

trong đất trồng trọt có khoảng 106 – 107CFU/g; đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm [68] Nhiệt độ tối ưu để chúng phát triển

là 25oC đến 35oC Khi gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt, B subtilis có khả năng hình thành bào tử,thông thường đến 60% B subtilis tìm thấy tồn tại ở dạng bào tử

[55]

Hình1.6:HìnhảnhB subtilis [71]

Vi khuẩn B subtilis được coi là vi khuẩn hiếu khí Tuy nhiên, một số nghiên

cứu cho thấy chúng có thể phát triển trong điều kiện yếm khí nhờ khả năng tạo ra

ATP thông qua quá trình lên men butanediol cũng như amoni nitrat B subtilis khác

với các sinh vật yếm khí khác khi trải qua quá trình lên men mà không có chất nhận điện tử từ bên ngoài Trong quá trình lên men, việc tái tạo NAD+ chủ yếu là do lactate dehydrogenase có chức năng chuyển hóa pyruvate thành lactate, được tìm thấy trong tế bào chất[67]

17

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa và ảnh hưởng của các yếu tố đến sự tổng hợp catalase

của B subtilis

B subtilis có khả năng sản xuất enzyme với hiệu suất cao khoảng 20 – 25 g

trên lít môi trường [4] Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiện môi trường có nguồn nitơ và carbon thấp do có khả năng phân giải nhiều loại protein, cacbohydate

và lipid có nguồn gốc từ động vật, thực vật thành những thành phần đơn giản hơn

để sử dụng B subtilis có thể sử dụng các loại monosaccharide như glucose,

fructose, các disaccaride như maltose, saccarose, đường 5C như pentose, các polysacchride như tinh bột, nhưng nguồn tốt nhất cho sự đồng hóa của chúng là glucose; chính vì vậy trong quá trình nghiên cứu glucose thường được sử dụng chính cho sự phát triển sinh khối cũng như quá trình chuyển hóa thành các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Nitơ cũng là một nguyên tố quan trọng đối với sự phát triển của vi khuẩn, xây dựng các amino acid cần thiết cho việc tạo nên protein của tế bào Nguồn Nitơ thường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn là peptone, cao nấm

men, casein Các nguyên tố khoáng cũng rất cần thiết cho sự phát triển của B

subtilis Ngoài ra, B subtilis hầu như không có khả năng tổng hợp ra các vitamin và

phải lấy vào từ cao nấm men, cao thịt, dịch chiết khoai tây [4]

Nhiệt độ có vai trò quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát

triển của B subtilis Khoảng nhiệt độ phù hợp cho vi khuẩn tối đa là 45 – 55oC, tối thiểu 5 – 20oC và tối thích 35 – 37oC Khi vượt ra khỏi dải nhiệt độ cho phép, quá

trình phát triển của B subtilisbị ức chế, số lượng tế bào giảm, vi khuẩn có xu hướng

hình thành bào tử với khả năng chịu nhiệt cao 80 - 100oC

B subtilis có thể phát triển được trong môi trường có pH4,5 – 8,5, tuy nhiên

còn tùy thuộc vào đặc điểm của từng chủng và điều kiện phân lập Khi gặp điều kiện pH không thuận lợi chúng cũng phát triển thành dạng bào tử và trở lại dạng tế bào sinh dưỡng khi môi trường thuận lợi [2]

Những hiểu biết toàn diện về điều kiệnsinh trưởng của vi khuẩn cho phép đơn giản quá trình tối ưu các điều kiện nuôi cấy và sản xuất ở quy mô công nghiệp,

từ đó ảnh hưởng trực tiếp tới lượng enzyme mà vi khuẩn sản xuất ra[54] Trong quá

18

trình nuôi cấy vi khuẩn, một số chất có vai trò như chất cảm ứng đã được bổ sung, glucose với một lượng thích hợp giúp tổng hợp catalase từ các vi khuẩn khác nhau

như Sacchamyces cerevisidae,E.coliK12, giúp hoạt tính của enzyme tăng lên 3-4

lần; bổ sung một lượng nhỏ của H2O2 vào môi trường tại pha log của vi khuẩn

Vibrio fischeri [59], hay bổ sung 25-100 µg/ml Fe đã thu được catalase với lượng

lớn từ Listeria monocytogenes [44] Sự sinh tổng hợp catalase ở Staphylococus

carnosuscũng được tăng lên khi thêm nitrat vào môi trường phát triển [54] Các

nghiên cứu cũng đã công bố bổ sung một số yếu tố để tăng hoạt tính catalase củaB

của vi khuẩn B subtilis 168 để thu nhận catalase [30] Fusho và tập thể (1994) khi tinh sạch catalase từ B subtilis IAM 1026 đã bổ sung H2O2 2 mM [15] Zamocky và tập thể (2002) cũng đã tiến hành kiểm tra khả năng sinh catalase trong điều kiện cảm ứng tại các thời điểm khác nhau vàcho thấy có sự khác nhau về hoạt tính enzyme thu được [64] Chính vì vậy, việc tối ưu các điều kiện nuôi cấy vi khuẩn như môi trường nuôi cấy, chất cảm ứng, và thời điểm thu tế bào có vai trò quan trọng để thu được catalase hoạt tính cao

2.2.4 Tính an toàn và ứng dụng của B subtilis

Theo tiêu chuẩn của Cục An toàn Thực phẩm và Thuốc của Mỹ FDA (Food

and Drug Administration, USA), tại Châu Âu và Mỹ, B subtilis được chấp nhận là

an toàn đối với con người và không có tác dụng phụ [13] Ngày nay, những chủng

B subtilis đang sử dụng được kiểm soát chặt chẽbởi tổ chức Lương thực Quốc tế

(FAO), Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và FDA [21] Một số chủng B subtilis và họ hàng gần của nó như: B licheniformis, B pumulis, B megaterium có khả năng sản

xuất lecithinase, một enzyme gây hoại tử hoặc làm tan máu ở động vật có vú Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người [22]

B subtilis cũng đã được phát hiện ở một số bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư

bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhưng với tỉ lệ rất thấp (2 trong 1034 ca phát

hiện có B subtilis)[22].B subtiliscòn đóng vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu

tình trạng viêm tự miễn và viêm đại tràng; giúp tiêu hóa, đồng hóa thực phẩm và

19

giải độc hệ thống đường tiêu hóa ở người Hơn nữa, B subtilis cũng tổng hợp nhiều

dưỡng chất quan trọng (vitamin, enzyme, carotenoid, chất béo, ) [37]

Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy, B subtilis là một sinh vật mô hình tốt

cho hệ thống phân tích sinh học về chỉnh sửa gen trong những điều kiện khác nhau [10] Các nhà nghiên cứu đã tìm ra mô hình biệt hóa tế bào dựa trên những nghiên

cứu về quá trình hình thành bào tử của B subtilis [6] cũng như mô hình điều hòa hoạt động của gen trong tế bào thông qua quá trình phiên mã [32] Ngoài ra, B

subtiliscũng được sử dụng như tế bào vật chủ cho việc nhân dòng và biểu hiện

vector [10]

Trong lĩnh vực y học, B subtilis có khả năng tự sản sinh ra hơn 24 loại

kháng sinh khác nhau trong cơ thể, giúp ngăn sự xâm nhập và phát triển quá mức của vi khuẩn trong ruột và dạ dày [37] Gần đây, các nghiên cứu cũng đã thành công

trong biểu hiện một số kháng nguyên trên bề mặt bào tử B subtilis để sản xuất các vacxin như vacxin kháng bệnh than, phòng virus Rota gây bệnh tiêu chảy, uốn ván, bạch hầu, ho gà.… B subtilis được xem như nhà máy sản xuất các loại vacxin dạng

uống ổn định và an toàn [14, 51]

Ở Nhật Bản, chủng B subtilis var natto được sử dụng trong các món ăn cổ

truyền từ hàng nghìn năm trước để sản xuất nattokinase – một enzyme có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe; giúp chống đông máu, kích thích hệ miễn dịch, phòng

tránh nhiễm khuẩn đường tiết niệu ở người cao tuổi [21] B subtilis còn có khả năng lây nhiễm, gây chết ấu trùng của muỗi Anophlis aulicifacies (côn trùng chính

gây sốt rét ở Ấn Độ) và được sử dụng như tác nhân kiểm soát sinh học phòng chống bệnh sốt rét [17]

Trong công nghiệp, B subtilis được ứng dụng để sản xuất các enzyme:

protease, amylase, cenlulase, lipase …;các enzyme thường được dùng trong sản xuất một số phụ gia trong chất tẩy rửa và các sản phẩm khác [49] và kháng sinh

[37] Một số loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho cây trồng như B subtilis

QST-731 có khả năng kích hoạt sức đề kháng cho cây để kháng lại sự tấn công mạnh mẽ của nấm và được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu [72]

20

Trong lĩnh vực nông nghiệp, B subtilis còn là một tác nhân sinh học đầy

tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh cây trồng Vi khuẩn có khả năng kháng lại các loại vi nấm gây bệnh, mặt khác chúng còn tham gia vào quá trình cải tạo đất, chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân giải thành những chất đơn giản dễ sử dụng, khống chế và tiêu diệt một số loại vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng [10]

Trong xử lí ô nhiễm môi trường, B subtilis có khả năng phân giải chất gây ô

nhiễm,phân giải phần dầu nhẹ của dầu thô như parafin và biến chúng thành chất ít

gây hại đối với môi trường Ngoài ra, B subtilis có thể sản xuất chất hoạt động bề

mặt giúp phân tán dầu thô, ví dụ tổng hợp lipase giúp phân giải chất béo trong nước thải [72]

B subtilis đã được nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm khoảng hơn

100 năm mang lại cái nhìn tổng quan về vi khuẩn Gram dương Trong đó, các

nghiên cứu chủ yếu sử dụng các chủng B subtilis PY79 và JH642 [48]

Dựa trên các thực tế trên, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu tinh sạch và xác định một số tính chất của catalase từ B subtilis PY79

21

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Chủng vi khuẩn B subtilis PY79 là quà tặng của GS Simon Cutting Đại học

Hoàng Gia Holoway London, Vương quốc Anh

Thang chuẩn protein của Thermo (Mỹ); gel Q-Sepharose và CM-Sepharose được mua từ GE Healthcare (Mỹ); H2O2 được mua từ hãng Sigma Aldrich (Mỹ)

Các hóa chất còn lại đều được mua từ các hãng tin cậy và đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

2.2 MÁY MÓC VÀ CÁC TRANG THIẾT BỊ

Các máy móc và các trang thiết bị dùng trong nhiên cứu bao gồm: tủ ấm nuôi

vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt (Biobase), máy ly tâm Sigma 3K (Sartorius), thiết bị điện di đứng (Bio-rad) và máy quang phổ khả kiến DU800 (Beckman coulter)

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nuôi cấy, thu dịch chiết tổng số của vi khuẩn B subtilis PY79

Tế bào vi khuẩn B subtilis PY79 được nuôi khởi động trong 20 ml môi

trường Luria bertani (LB) ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong 14-16 giờ Môi trường nuôi cấy sau đó được trẻ hóa trong 1 lít môi trường LB sao cho nồng độ vi khuẩn đạt mật độ quang học (OD)600=0,05 Tiếp tục nuôi cấy cho tới khi OD600 đạt 0,6-0,7, tiến hành cảm ứng H2O2 4 lần, mỗi lần cách nhau 10 phút và đạt nồng độ cuối cùng

là 0,1 mM Sau 2 giờ nuôi cấy, tế bào sẽ được thu lại bằng cách ly tâm dịch nuôi ở

4o C trong 10 phút với tốc độ 6000 vòng/phút

Để thu protein tổng số, sinh khối tế bào sẽ được hòa lại trong 50 ml đệm A (kaliphosphate 50 mM, pH 7), phá vỡ tế bào bằng siêu âm trên đá 4 lần, mỗi lần 10 giây Dịch siêu âm sau đó được ly tâm ở 4oC trong 30 phút với tốc độ 12000 vòng/phút để loại bỏ tủa tế bào và thu dịch nổi protein tổng số

22

2.3.2 Tinh sạch catalase từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis bằng kết tủa thuận

nghịch và sắc kí trao đổi ion

Bước đầu tinh sạch catalase bằng kết tủa thuận nghịch với (NH 4 ) 2 SO 4

Catalase bước đầu được tinh sạch từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis bằng kết

tủa với (NH4)2SO4 bão hòa ở nồng độ 50%, bổ sung muối từ từ cho đến khi tan hết, ủ mẫu tại 4oC trong 3 giờ nhằm tủa hết catalase và loại bỏ tối đa các protein không mong muốn Tiến hành thu tủa, loại dịch nổi bằng ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút, tủa thu lại được hòa với 10 ml đệm A Dịch hoà tan tủa sẽ được thẩm tích trong đệm B (Tris HCl 20 mM pH 8) trong 24 giờ, 4oC để loại (NH4)2SO4

Tinh sạch catalase bằng cột sắc ký trao đổi anion Q-Sepharose

Dịch protein tổng số sau thẩm tích sẽ được gắn lên cột Q-sepharose fast flow (1 x 10 ml) đã được cân bằng trong đệm B, với tốc độ dòng chảy 0,5 ml/phút Sau gắn mẫu, các protein không gắn hoặc gắn không đặc hiệu sẽ được rửa khỏi cột với đệm B cho đến khi A280 của dịch chảy qua cột nhỏ hơn 0,05 Phần protein gắn trên cột sẽ được rửa chiết bằng gradient NaCl 0-0,7 M trong đệm B Các phân đoạn chiết (1ml/phân đoạn) được thu lại để xác định nồng độ protein bằng đo hấp thụ tại A280

nm cũng như hoạt tính catalase bằng khả năng phân giải cơ chất H2O2 tại bước sóng

A240 nm và kiểm tra độ tinh sạch trên SDS-PAGE (điện di trên gel polyacrylamide

có SDS)

Những phân đoạn có hoạt tính catalase được thu lại và thẩm tích qua đêm trong đệm C (natri acetate 10 mM pH 4,8) với nồng độ protein nhỏ hơn 0,1 mg/ml (tỷ lệ thể tích mẫu và thể tích đệm thẩm tích là 1:100) Sau khi thẩm tích, protein được cô đặc bằng amplicon 10 kDa (Millipore) với tốc độ ly tâm 6000 vòng/phút ở

4oC cho đến khi nồng độ protein đạt khoảng 0,5 mg/ml Dịch thu được lại tiếp tục đưa lên cột sắc ký tiếp theo

Tinh sạch catalase bằng cột sắc ký trao đổi cation CM-Sepharose

Các phân đoạn có hoạt tính catalase từ cột Q-Sepharose tiếp tục được tinh sạch bằng cách gắn lên cột CM-Sepharose (1 x 2 cm) đã được cân bằng với đệm C

23

Các protein gắn trên cột đã được rửa chiết bằng đệm C có NaCl 0,15 – 0,5 M Phân đoạn rửa chiết có hoạt tính catalase sẽ được cô đặc bằng amplicon 10 kDa (Millipore) cho đến khi nồng độ protein đạt khoảng 0,1-0,5 mg/ml, thẩm tích trong đệm A, xác định độ tinh sạch bằng SDS-PAGE và bảo quản ở -20oC cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.3 Định lượng protein bằng đo quang phổ ở bước sóng A 280 nm

Protein trong tế bào cũng như trong các phân đoạn tinh sạch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 280 nm (A280)

Nguyên tắc: dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280

nm của các protein Tại bước sóng này các amino acid có vòng thơm sẽ hấp thu cực đại Từ giá trị OD ở bước sóng 280 nm ở các mẫu, sử dụng protein albumin huyết thanh bò (BSA) làm chuẩn với hệ số A280 =0,66 tương ứng với 1 mg/ml để tính ra hàm lượng protein có trong mẫu Dung dịch protein sau khi được pha loãng thành các nồng độ khác nhau trong đệm mẫu tương ứng và giá trị A280 bằng quang phổ kế

2.3.4 Kiểm tra độ sạch của protein bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE)

Độ tinh sạch cũng như KLPT của catalase qua các bước tinh sạch được xác định bằng điện di protein trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli (1970) [28]

Gel polyacrylamide gồm 2 lớp, trong đó lớp gel tách 12% và gel cô 5%, với

tỷ lệ thành phần được nêu ở (Bảng 2.1)

Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp sẽ được trộn đều và đúc vào khuôn kính đã được lắp sẵn trên giá đỡ Gel tách được đúc trước và trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục trùng hợp phần gel cô và cài lược để tạo giếng, để gel trùng hợp hoàn toàn sau 20-30 phút trước khi sử dụng cho mục đích điện di

Mẫu protein được trộn đều với đệm mẫu nồng độ 5X theo tỷ lệ 4:1, xử lý mẫu ở 95oC trong 5 phút, làm lạnh nhanh trên đá trước khi tra mẫu Hàm lượng