(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống việt nam

Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìm thấy thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân cơ chất giàu tinh bột thành đường nhưng chưa được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU

TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ này được em thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm, để có được những kết quả này em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS Vũ Nguyên Thành và Cô PGS.TS Bùi Thị Việt Hà - những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện luận văn

Để có được nền tảng kiến thức khoa học tốt, phục vụ trong nghiên cứu này em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tận tình truyền đạt kiến thức, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian sinh viên và học viên cao học Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm

ơn tới các anh chị cán bộ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệp, hỗ trợ kỹ thuật trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em yên tâm học tập và nghiên cứu khoa học

Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2019

Học viên

Lê Thị Quyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về rượu truyền thống 3

1.1.1 Men rượu 3

1.1.2 Các giai đoạn lên men rượu 5

1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae 9

1.3 Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam 11

1.4 Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) 12

1.5 Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo hương của đồ uống 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng 16

2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 16

2.2.1 Hóa chất 16

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp phân lập 17

2.3.2 Làm sạch và giữ giống 17

2.3.3 Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào 18

2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men 18

2.3.5 Phương pháp tinh chế DNA 18

2.3.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting 19

2.3.7 Phương pháp điện di 20

2.3.8 Nhuộm gel và đọc kết quả 20

2.3.9 Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA 20

2.3.10 Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc 21

2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện 23

2.3.12 Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường 23

2.3.13 Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc 24

2.3.14 Đo độ cồn bằng sôi kế 25

2.3.15 Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí kết nối khối phổ GCMS 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men 28

3.2 Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào 28

3.3 Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA 34

3.4 Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS 39

3.5 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện 43

3.6 Kết quả sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường 45

3.7 Kết quả lên men rượu từ các chủng nấm mốc và nấm men thuần 47

3.8.Phân nhóm mẫu rượu dựa trên kết quả các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần 49

KẾT LUẬN 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á 4Bảng 2.1 Tỷ lệ bổ sung giống ở mỗi mẫu lên men 25Bảng 3.1 Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting và đọc trình tự các chủng đại diện 36 Bảng 3.2 Hoạt lực enzyme amylase của các chủng mốc thuần 39 Bảng 3.3 Kích cỡ khuẩn lạc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ 44 Bảng 3.4 Kết quả đo độ cồn của dịch lên men rượu từ các chủng thuần và 15 mẫu bánh men 47 Bảng 3.5 Các nhóm hợp chất xuất hiện trong các mẫu rượu 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam 5

Hình 1.2 Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase 6

Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu 9

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS 13

Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS 14

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện 32

Hình 3.2 Phổ băng DNA fingerprinting 35

Hình 3.3 Hoạt lực enzyme amylase của các chủng nấm mốc (IU/ml) 42

Hình 3.4 Đường kính khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ 45

Hình 3.5 Kết quả thủy phân tinh bột trong môi trường có đường của các chủng mốc 46

Hình 3.6 Các nhóm rượu khác nhau từ 32 mẫu rượu……… …….51

DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

°C: độ celsius

CNTP: Công nghiệp Thực phẩm

dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate

h: hour (giờ)

ITS: Internal transcribed spacer

PCR: Polymerase chain reaction

rDNA: ribosomal DNA

rpm: round per minute (vòng/phút)

TTVSVCN: Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp

HS-SPME GCMS: headspace-solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometer

MỞ ĐẦU

Rượu truyền thống là loại đồ uống có cồn, xuất hiện từ rất lâu đời và được sử dùng rộng rãi trong nhân dân Chúng thường được sản xuất theo quy mô hộ gia đình và có hương vị đa dạng của từng vùng miền như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định) Để tạo nên sự khác biệt đó có nhiều yếu tố như nguyên liệu, cách thức nấu, và đặc biệt là sự biến đổi của hệ vi sinh vật trong bánh men Việc sử dụng bánh men với phức hệ vi sinh quá đa dạng thường gây khó khăn trong quá trình kiểm soát chất lượng sản phẩm rượu, vì vậy việc nghiên cứu sâu về chủng giống sẽ rất cần thiết Các loại rượu trên thế giới đều cho thấy

loài Saccharomyces cerevisiae đóng vai trò chủ đạo trong lên men rượu, tuy nhiên nấm

mốc thì khác biệt hơn, với mỗi loại rượu thì loài nấm mốc là khác nhau như khi nói tới

rượu Sake của Nhật Bản thì đều biết đến loài Aspergillus oryzae, khi nhắc tới rượu Hong Qu ở Trung Quốc thì đều biết đến loài Monascus purpureus, thế nhưng ở Việt

Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào chỉ ra loài nấm mốc nào đóng vai trò chủ đạo trong lên men rượu truyền thống Việt Nam

Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìm thấy thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân cơ chất giàu tinh bột thành đường nhưng chưa được nghiên cứu kỹ về đặc tính liên quan tới đường hóa Các nghiên cứu trước đây liên quan tới men rượu thì chủ yếu về tính đa dạng vi sinh vật của bánh men và lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt để làm bánh men Vì vậy, luận văn này được thực hiện nhằm đánh giá đặc tính thủy phân tinh bột của các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae phân lập từ bánh men rượu từ đó biết được chủng nào đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đường hóa và bước đầu thử nghiệm sử dụng chủng mốc thuần kết hợp với chủng nấm men thuần làm giống khởi động nhằm mục đích so sánh phổ hương rượu với các dòng rượu truyền thống để từ đó biết được loài nấm mốc nào đóng vai trò quan trọng trong lên men rượu truyền thống Việt Nam Việc sử dụng chủng thuần cũng như phương pháp phân tích sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) để nghiên cứu hương rượu cũng là những tính mới của luận văn

Để thực hiện mục tiêu đề tài đã nêu, các nội dung chính sau đã được thực hiện:

- Phân lập vi nấm từ men rượu truyền thống Việt Nam

- Phân nhóm vi nấm bằng PCR-fingerprinting và định tên chủng đại diện bằng giải trình tự rDNA

- Đánh giá hoạt tính amylase của nấm mốc thuộc họ Mucoraceae

- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột các chủng mốc thuộc họ Mucoraceae trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau

- Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột của Mucoraceae trong môi trường đường

- Thử nghiệm sử dụng chủng thuần khiết làm giống khởi động, phân tích các hợp chất bay hơi của dịch chưng cất sau lên men và so sánh với các sản phẩm rượu truyền thống khác

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về rượu truyền thống

Đồ uống có cồn như bia, rượu là những sản phẩm lên men phổ biến và đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và văn hóa của con người Ở Việt Nam, rượu gạo đã có từ rất lâu đời, cho đến nay nó vẫn là thức uống phổ biến và chiếm 80% trong tổng số các loại đồ uống có cồn Tùy thuộc vào từng địa phương mà thành phần

và quy trình sản xuất rượu có sự khác nhau, do đó rượu được sản xuất có tên địa phương khác nhau như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Kiên Lao (tỉnh Nam Định), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định), rượu Gò Đen (tỉnh Long An) Tuy nhiên, phương thức sản xuất chung đều dựa vào quá trình biến đổi hóa sinh của hệ vi sinh vật trong men rượu [8]

1.1.1 Men rượu

Việc chuẩn bị và sử dụng men rượu như là nguồn cung cấp vi sinh vật trong sản xuất rượu gạo là rất quan trọng Thông thường, giống khởi động cho lên men rượu gồm 3 thành phần vi sinh cơ bản là: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Trong đó, nhóm nấm mốc chủ yếu sinh enzyme amylase để đường hóa tinh bột thành các phân

tử đường khử như glucose, maltose, hay n-dextrin dài hơn Sau đó, lượng đường này được nấm men chuyển hóa thành ethanol vì vậy chất lượng của các sản phẩm cuối cùng phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động của các vi sinh vật này Một trong những cách tiếp cận để cải thiện sản xuất rượu là thiết lập các điều kiện tối ưu cho quá trình đường hóa và lên men đồng thời với nuôi cấy hỗn hợp vi sinh vật sinh enzyme thủy phân tinh bột và lên men ethanol [8]

Như được liệt kê trong Bảng 1.1, các loài mốc chính trong các loại giống khởi

động truyền thống ở Châu Á là Rhizopus spp và Mucor spp Nhóm nấm men phổ biến là Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., và Candida spp., còn loài giả nấm men phổ biến là Saccharomycopsis fibuligera

Bảng 1 1 Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á

Sản

Bakhar Ấn Độ Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae

Bubud Philippines

Mucor spp., Rhizopus spp.,, Candida spp., Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis spp

Chu Trung Quốc Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., Saccharomyces

cerevisiae

Look-pang Thái Lan

Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp., Saccharomyces cerevisiae

Men

rượu Việt Nam

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera

Murcha Nepal Rhizopus spp., Mucor spp., Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomycopsis fibuligera

Nurock Hàn Quốc

Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., A.niger, Penicillium

spp., Mucor spp., Hansenula anomala, Pichia anomala,

Saccharom yces cerevisiae

Ragi Indonesia

Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium

spp., Candida spp., Saccharom yces cerevisiae,

Saccharomycopsis fibuligera , Hansenula spp., Rhodotorula spp

Tapai Malaysia Rhizopus spp., Saccharomycopsis fibuligera

Các thành phần để làm viên men thường là bột gạo, bột sắn hoặc kết hợp cả bột gạo và bột sắn- Các loại bột đó có thể được trộn với một số loại thảo mộc, những thành phần bổ sung này được cho là có vai trò trong việc ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật tạp nhiễm Tỷ lệ giữa bột nghiền với các loại thảo mộc thường là 14:1 theo khối lượng Sau đó, nước được thêm vào để tạo độ ẩm tương đối cho khối bột là 55-60%, và trộn đều với bột men từ những mẻ trước Những viên men được nặn hình tròn với đường kính 4 cm, dày 1 cm Các khay bánh men được ủ trong điều kiện nhiệt

độ phòng 28-32 ºC trong 2-5 ngày và được hong khô bởi gió hoặc ánh sáng mặt trời [8]

Hình 1 1 Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam

1.1.2 Các giai đoạn lên men rượu

Có 2 giai đoạn chính trong lên men sản xuất rượu đó là: Giai đoạn đường hóa và giai đoạn lên men rượu

1.1.2.1 Giai đoạn 1- Giai đoạn đường hóa

Gạo sau khi được nấu chín sẽ được tãi ra khay, vải sạch để nguội đến nhiệt độ 30-35°C thì rắc bột bánh men vào với tỉ lệ bột bánh men so với gạo là 1-5% theo khối lượng Trộn đều bột bánh men và ủ khoảng 3 ngày để vi sinh vật sinh amylase thủy phân tinh bột thành đường trong điều kiện hiếu khí [8]

1.1.2.1.1 Đặc điểm của enzyme amylase

Amylase có thể được tổng hợp từ một số loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn; Tuy nhiên, nấm mốc được biết đến nhiều nhất vì tính phổ biến và ổn định

Khối bột với 50-60%

hàm ẩm

Nặn viên men tròn

Hong khô

ủ 2-5 ngày

của enzyme này Có 3 loại amylase là α-amylases, β-amylases và γ-amylase, glucosidase) mỗi loại cắt các vị trí khác nhau Hình 1.2 minh họa vị trí thủy phân liên kết của 3 loại enzyme này

(α-Hình 1 2 Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase

a α- amylase

α-amylases có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside ở phía trong của mạch amylose và amylopectin Enzyme này được tìm thấy ở rất nhiều loài vi sinh vật, nó cắt ở các vị trí ngẫu nhiên dọc chuỗi tinh bột, cuối cùng tạo ra glucose, maltose, n-dextrin α-amylases có xu hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase bởi nó có thể thủy phân nhiều vị trí của cơ chất Loại enzyme này được tìm thấy nấm Ascomycetes và

Basidiomycetes, vi khuẩn Bacillus, nước bọt và tuyến tụy ở người [22]

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylases là quá trình đa giai đoạn:

Giai đoạn 1 (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) [2]

Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp ở giai đoạn 1 bị thủy phân tiếp tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose [2]

Giai đoạn 3: Các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose và glucose Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.[2]

c γ-amylase

γ-amylase cắt liên kết α(1-6) và α(1-4) glycoside ở đầu không khử của amylose

và amylopectin, tạo ra glucose Đa số Enzyme này có hoạt lực cao nhất ở vùng PH 3,5-5,5 và nhiệt độ 50ºC Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton[22]

1.1.1.2.2 Đặc điểm của vi nấm trong giai đoạn đường hóa

Quá trình đường hóa tinh bột sẽ cho ra maltose, glucose để sản xuất ethanol

có nguồn gốc từ các quá trình lên men Thủy phân tinh bột bằng phương pháp enzyme

có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học, như hoạt động trong điều kiện pH và nhiệt độ vừa phải, ngăn ngừa ăn mòn thiết bị và các bước trung hòa tiếp theo Enzyme có tính đặc hiệu cơ chất, loại bỏ sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn như thường được xuất hiện trong quá trình thủy phân axit [26]

1.1.2.2 Giai đoạn 2- Giai đoạn lên men rượu

Nhóm nấm men thường phân lập được từ bánh men là Saccharomyces

cerevisiae, Pichia anomala, Candida tropicalis trong đó Saccharomyces cerevisiae

được cho là đóng vai trò chính, phát triển trong điều kiện ít oxy, lên men chuyển hóa đường thành ethanol Ethanol là sản phẩm chính ở giai đoạn này, khi nồng độ cao trong dịch lên men sẽ ức chế màng sinh chất, thay đổi tính bán thấm tế bào nấm men

và các vi sinh vật khác Thực tế sản xuất cho thấy giai đoạn ủ cho lên men phụ thuộc vào thời tiết, vào những ngày nóng, giai đoạn ủ thường ngắn Ví dụ như ở vùng Đồng bằng Sông Cửu Long ở miền Nam Việt Nam, nhiệt độ trung bình 30-33ºC, thời gian

ủ cho giai đoạn 1 là 2-3 ngày, giai đoạn 2 là 3-4 ngày [8]

+ Lên men rắn là phương pháp thường được sử dụng ở các vùng núi cao Nguyên liệu cho sản xuất rượu ở những vùng này thường là ngô và sắn Ngô và sắn sau quá trình đường hóa trở nên ngọt và mềm, sau đó được thêm nước Quá trình lên men diễn ra trong 5-7 ngày và sau đó đem đi chưng cất [3]

+ Lên men lỏng thường được sử dụng ở các làng nghề dưới đồng bằng Gạo, sau quá trình đường hóa trở nên mền ngọt và được bổ sung nước theo tỉ lệ 1:1 Lên men tiếp trong 3-5 ngày Vào mùa hè nhiệt độ cao thì thời gian lên men thường ngắn hơn mùa đông [3]

Sản phẩm sau lên men rượu gạo

Đối với rượu không chưng cất, dịch lên men sau khi kết thúc giai đoạn 2 sẽ được lọc lấy dịch trong chứa glucose, ethanol, và các chất hòa tan khác, với những loại rượu không chưng cất độ cồn chỉ khoảng 7-10% (v/v), và rượu sẽ không bảo quản được lâu Để giải quyết vấn đề này, người sản xuất sẽ tăng hàm lượng cồn bằng cách hoặc bổ sung đường vào sau giai đoạn 1 hoặc bổ sung cồn vào sau giai đoạn 2, như vậy vừa đáp ứng được nhu cầu khách hang vừa kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm [3]

Đối với rượu chưng cất, sử dụng thiết bị chưng cất có nguyên lý hoạt động như hình dưới, gồm 3 phần cơ bản là: khoang đun, hệ thống làm mát, và khoang chứa rượu chưng cất Thông thường, mẫu rượu đầu có nồng độ cồn cao có thể lên đến 65% (v/v) sau giai đoạn chưng cất đầu tiên, và khoảng 25-30% (v/v) cho mẫu rượu sau [3]

Hình 1 3 Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu 1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae

Họ Mucoraceae là họ nấm thuộc bộ Mucorales, đặc trưng bởi hệ sợi không

vách ngăn Một số chi có thể kể đến bao gồm Absidia, Apophysomyces, Mucor,

Rhizomucor, và Rhizopus.Theo ước tính năm 2008, họ này bao gồm 25 chi và 129

loài [15] Sau đây là một số loài thuộc chi Rhizopus và Mucor thường xuất hiện ở

bánh men rượu

a Rhizopus oryzae

Rhizopus oryzae là thành viên của chi Rhizopus, thuộc họ Mucoraceae Hệ thống

phân loại Rhizopus oryzae không đơn giản Những nghiên cứu gần đây về Mucorales dựa trên trình tự ITS đã đưa ra các tên loài đồng nghĩa sau: Amylomyces rouxii,

Rhizopus achlamydosporus, R arrhizus, R boreas, R delemar, R chiuniang, R javanicus, R oryzae, R maydis, R niveus, R peka, R tonkinensis [26] Mặc dù nhiều

chủng nấm mốc trong bánh men đều có khả năng thủy phân tinh bột gạo nhưng

Rhizopus oryzae (hay Amylomyces rouxii được biết đến là chủng điển hình nhất, được

mô tả đầu tiên bởi Calmette năm 1982) Ông coi chủng này đóng vai trò quan trọng

trong quá trình thủy phân tinh bột gạo Khi sử dụng nấm mốc thuần chủng này và nấm men thương phẩm ông có thể thu 340 g cồn đặc từ 1000 g gạo thay vì 180 g khi sử dụng bánh men Ngoài ra, nấm này cũng được sử dụng trong nghiên cứu tạo bánh men

để sản xuất rượu gạo từ gạo nếp cẩm [1] Bên cạnh đó, R oryzae cũng là loài phổ biến

và chiếm ưu thế được phát hiện ở Yao Qu, và ở một số Hồng Qu Nó cũng được tìm thấy ở một số giống khởi động khác với khả năng sinh amylase mạnh, đóng góp lớn

cho sản xuất rượu [23] Nghiên cứu trước còn chỉ ra rằng R oryzae cũng có thể tạo ra

các hợp chất dễ bay hơi trong quá trình lên men, chẳng hạn như ethanol, butanol và 3- methyl-1-butanol [4]

2-methyl-1-b Rhizopus microsporus

Rhizopus microsporus là nhóm nấm thuộc chi Rhizopus, họ Mucoraceae phổ

biến thứ hai khi phân lập từ bánh men [6] Các enzyme thủy phân từ các loài Rhizopus

hoạt động tối ưu trong điều kiện pH 4.0-5.5 Nhóm Rhizopus microsporus có khả năng chịu nhiệt độ cao, chủng Rhizopus microsporus var rhizopodiformis có thể sinh trưởng ở 50°C và sinh amylase tối ưu ở 45°C [7] Rhizopus microsporus var

chinensis CICIM-CU F0088 cũng cho thấy khả năng phát triển ở 40°C, và tiết ra các

amylase ở nhiệt độ cao hơn Rhizopus oryzae [17]

Các chủng R microsporus có thể sinh độc tố rhizoxins, nhưng bản thân nó không tạo ra mà được tạo bởi vi khuẩn Burkholderia chúng sống bên trong tế bào

nấm Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn này đã từng được tìm thấy ở chủng

Rhizopus microsporus CBS 111563, được phân lập từ sufu Một lượng đáng kể

rhizoxins được phát hiện trong sản phẩm cuối cùng [7] Tuy nhiên vẫn chưa biết rõ

rằng Rhizopus microsporus từ bánh men có độc tố không

c Mucor indicus

Các chủng Mucor indicus thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng đậm

đặc trưng, có nhiệt độ tăng trưởng tối đa 42ºC Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục phân nhánh, với các nhánh dài Túi bào tử có màu vàng đến nâu, đường kính lên tới

75 µm, với các màng khác nhau Cuống gần hình cầu, cao tới 40 µm Bào tử có vách trơn, gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm Có nhiều Chlamydospores, đặc biệt

là trong ánh sáng Bào tử tiếp hợp zygospores có màu đen, hình cầu, có đường kính lên tới 100 µm [14]

M indicus có khả năng sinh ethanol từ nhiều nguồn đường khác nhau như

glucose, mannose, fructose, hay galactose Chúng cũng có khả năng lên men xylose thành ethanol nhưng chỉ trong điều kiện hiếu khí hoặc vi hiếu khí Sản lượng ethanol

sau lên men từ xylose xấp xỉ lượng ethanol do Pichia stipites lên men (Pichia stipites

được biết đến là loài sản xuất ethanol tốt nhất từ xylose) Tuy nhiên, nhiều chủng nấm

này không có khả năng lên men đường sucrose, vì vậy M indicus không thể thay thế

S cerevisiae để lên men ethanol từ cơ chất chứa sucrose [14]

M indicus là loài nấm mốc lên men ethanol khá hiệu quả và có thể sinh ra

ethanol 5% khi sinh trưởng trong môi trường chứa glucose Bên cạnh đó, một nghiên

cứu khác chỉ ra rằng hoạt lực amylase của M indicus dường như rất thấp hoặc không

có khi sinh trưởng trong môi trường gạo [14]

d Mucor circinelloides

Trong số nấm thuộc chi Mucor tìm thấy trong bánh men, Mucor circinelloides

là loài cũng khá phổ biến Tuy nhiên khả năng thủy phân tinh bột của chúng kém [12] Chúng là loài dị hình giới tính và có thể phát triển giống nấm mốc và nấm men Bên cạnh khả năng thủy phân tinh bột, chúng còn có khả năng thủy phân cellulose [14]

1.3 Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam

Các nghiên cứu về lên men rượu truyền thống của Việt Nam có thể được phân loại thành hai nhóm chính: (i) tính đa dạng vi sinh vật của bánh men và (ii) lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt để làm bánh men, cải tiến quy trình [25]

Hệ vi sinh của bánh men đã được nghiên cứu khá rõ, mỗi gam bánh men chứa

103-106 CFU mốc, 103-107 CFU men, và 103-106 CFU vi khuẩn lactic Bánh men chứa

hệ vi sinh vật tương đối ổn định, bao gồm các loài mốc Rhizopus microsporus, Mucor

indicus, Mucor circinelloides, loài giả men Saccharomycopsis fibuligera, loài nấm

men Hyphopichia burtonii, Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis,

Pichia anomala, Candida tropicalis, Pichia ranongensis, Clavispora lusitaniae, Pediococcus pentosaceus, và các loài vi khuẩn Lactbacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Weissella confusa, Weissella paramesenteroides Nó được kết luận rằng hệ vi

sinh trong bánh men tương tự như ragi và các dạng men Châu Á khác Tuy nhiên, để có một cái nhìn rõ hơn về đặc tính thủy phân tinh bột của các nhóm chủng vi nấm xuất hiện phổ biến trong bánh men rượu Việt Nam thì vẫn chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trước đó

Bên cạnh đó, khi đã chọn các chủng nấm tốt để tạo men rượu cải tiến từ chủng thuần thì rượu sau khi chưng cất chỉ được đánh giá bằng cảm quan mà ít có phân tích phổ hương rõ bằng sắc kí khí [9] nên nghiên cứu này sẽ phân tích các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu sử dụng chủng thuần và so sánh với các sản phẩm rượu truyền gạo truyền thống

1.4 Phân tích hợp chất bay hơi

1.4.1 Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS)

Sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) gồm 2 phần chính là GC và MS, trong đó

GC (Gas Chromatography) là loại sắc kí có pha động là khí mang, thường là các khí trơ như heli, nitơ hay hydro, còn pha tĩnh là một lớp dịch mỏng hoặc polymer bên trong cột Mẫu được chạy qua cột bởi dòng khí mang Các thành phần của mẫu được tách nhau ra khi đi qua cột dưới một chu trình nhiệt độ từ thấp tới cao Còn MS (Mass Spectrometer) là detector khối phổ cho GC, các chất khí sau khi đi qua cột sẽ sang

MS và bị bắn phá thành các mảnh có khối lượng khác nhau, mỗi chất khí có một danh sách các mảnh khác nhau, dựa vào thông tin khối lượng trên điện tích m/z, sau đó chất này được so sánh với thư viện phổ để biết tên chất [11]

Sắc kí khí kết nối khối phổ là một phương pháp phân tích kết hợp cả đặc trưng của sắc kí khí và khối phổ để định tính các hợp chất trong mẫu GC có thể tách hợp chất bay hơi và bán bay hơi nhưng không thể định danh chúng MS có thể cung cấp thông tin cấu trúc chi tiết cho hầu hết các hợp chất và định danh chúng nhưng MS lại không tách được chúng khỏi mẫu [16] Sơ đồ cấu tạo được trình bày ở hình 1.4

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS 1.4.2 Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo hương của đồ uống

Hương rượu được hình thành bởi nhiều hợp chất dễ bay hơi và nó đặc trưng cho từng sản phẩm Thông thường nồng độ các chất này rất thấp và có ngưỡng cảm giác phát hiện rất thấp (giữa ng/L và µg/L) Để phân tích hương rượu cần cô đặc các chất bay hơi trước khi thực hiện phân tích sắc ký khí Một số phương pháp chuẩn bị mẫu để phân tích đã được biết đến như chưng cất, tách chiết pha lỏng (liquid-liquid extraction, LLE), tách chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE), tách chiết khoảng trống (dynamic headspace extraction) và vi tách chiết pha rắn-khoảng trống (headspace-solid phase microextraction, HS-SPME) [28]

Chromatography Mass Spectrometer) được gọi là phương pháp vi tách chiết pha rắn- khoảng trống kết hợp với sắc kí khí kết nối với khối phổ trong đó ở bước đầu tiên, pha tĩnh của sợi fiber sẽ hấp phụ các hợp chất hữu cơ ở không gian đầu phía trên mẫu chất lỏng Sau một khoảng thời gian xác định, sợi được kéo vào bên trong kim để bảo vệ Tiếp theo, kim được đưa vào injector, và sợi được đẩy ra Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ cao, các hợp chất được giữ lại trong pha tĩnh được giải hấp rồi nhờ dòng khí

mang định lượng trên cột sắc ký [28]

Ưu điểm của SPME như sau: là thiết bị cầm tay, sử dụng đơn giản, chi phí tương đối thấp, độ nhạy cao, kích thước nhỏ và loại bỏ dung môi; tính năng quan trọng nhất là thời gian chuẩn bị mẫu tương đối ngắn trước khi phân tích Tuy nhiên,

so với các kỹ thuật khác, SPME có nhiều nhược điểm, ví dụ như sự xuống cấp một phần của pha tĩnh trong quá trình giải hấp nhiệt ở nhiệt độ cao ảnh hưởng tới khả năng hấp phụ và tuổi thọ sợi fiber

Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS

SPME được phát triển vào những năm 1990 bởi Pawliszyn và cộng sự, mỗi năm có hàng ngàn bài báo khai thác các khía cạnh khác nhau của phương pháp này

và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau được công bố (phân tích hóa học, phân tích sinh học, khoa học thực phẩm, khoa học môi trường, khoa học dược và y) Kỹ thuật chiết mẫu này đã được mô tả là nhanh, đơn giản, không sử dụng dung môi, và phù hợp cho việc chiết số lượng lớn các hợp chất dễ bay hơi và bán bay hơi từ dung dịch Ngoài ra, SPME chỉ cần lượng mẫu nhỏ, kết hợp với sắc ký khí khối phổ (GC/MS) với độ nhạy cao Vì những ưu điểm này, nó đã được sử dụng để nghiên cứu hương của nhiều loại trái cây, rau quả, đồ uống và rượu [28]

Bằng cách sử dụng phương pháp GCMS để đánh giá định tính hoặc định lượng những khác biệt này, ngoài các kỹ thuật cảm quan, các nhà phân tích có thể thu được nhiều thông tin về sản phẩm của họ Các đặc tính cảm quan độc đáo của các sản phẩm rượu chưng cất thường là do sự khác biệt nhỏ giữa các hợp chất dễ bay hơi [21] Nghiên cứu trước đây sử dụng phương pháp này để định tính và bán định lượng các hợp chất bay hơi trong mẫu rượu chưng cất sử dụng bánh men rượu truyền thống

Trung Quốc xác định được 118 hợp chất chủ thuộc 5 nhóm chính là ester (32), alcohol (22), acid (23), aldehyde (9) và ketone (15) [11] Các nhóm này cũng xuất hiện ở sản phẩm makgeolli của Hàn Quốc, ngoài ra còn xuất hiện têm nhóm phenol và terpene [13] Đối với sản phẩm rượu của Combodia, phân tích 5 nhóm rượu từ các nhóm bánh men tương ứng xác định được 25 hợp chất bao gồm ester, alcohol, acid, aldehyde, and ketone Trong đó nhóm xuất hiện nhiều nhất là alcohol (chiếm 93% tổng các hợp chất tạo hương) điển hình như 2-methylbutan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol, butane-2,3-diol, 2-phenylethan-1-ol [18]

Ngoài rượu và các hợp chất tạo hương, đôi khi có khí tạp như khí lưu huỳnh

và có thể dẫn đến mùi hoặc hương vị lạ cho sản phẩm Bởi vì ngay cả tỷ lệ nhỏ (ppb) của các hợp chất lưu huỳnh có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Phần lớn các chất gây ô nhiễm này có mặt trong pha khí, đòi hỏi phải có hệ thống lấy mẫu và phân tích pha khí Sắc ký khí (GC) là một công cụ mạnh mẽ trong việc phân tích các sản phẩm đồ uống có cồn Các hợp chất tạo hương có xu hướng dễ bay hơi trong tự nhiên, đáp ứng một trong những yêu cầu chính của GC [21]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Trong nghiên cứu này, 15 mẫu bánh men (ký hiệu từ MQ1-MQ15) từ các tỉnh Ninh Bình, Tuyên Quang, Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Bắc Giang đã được thu thập và tiến hành thí nghiệm Danh sách các mẫu bánh men với những thông tin cụ thể được trình bày trong phần phụ lục S1

Ngoài ra, một số chủng nấm đã định danh thuộc bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm cũng được sử dụng phục vụ nghiên cứu bao gồm::

Rhizopus oryzae BMM 111, R oryzae BMM 131, R oryzae BMM 1015, Saccharomyces cerevisiae BMQ 467: được dùng làm 3 mẫu rượu từ 1 chủng thuần

mốc với 1 chủng thuần men

Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908: bổ sung vào mẫu lên men sử dụng 1 chủng nấm mốc R.oryzae và 1 chủng nấm men S cerevisiae để so sánh với mẫu không

bổ sung chủng này

Aspergillus oryzae CNTP 5026 : dùng làm mẫu đối chứng trong thí nghiệm

kiểm tra khả năng thủy phân tinh bột trong môi trường đường

2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất dùng trong nuôi cấy:

Agar (Việt Nam), Malt (Đan Mạch), Glucose, Yeast extract (Ấn Độ), Malt extract (Ấn Độ), Peptone (Ấn Độ)

Hóa chất dùng cho PCR

Thang DNA mẫu dùng trong điện di Thermo Scientific (Mỹ)

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc

Máy móc, thiết bị: bộ điện di ngang, box cấy (Bioblock Scientific, Pháp), cân điện tử (Precisa, Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600-Nikon, Nhật), lò

vi sóng (LG, Hàn Quốc), hệ thống soi và chụp ảnh gel điện di (Syngene), máy đo pH (Toledo - Anh), máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm cao tốc (Heraeus – Sepatech), máy PCR, nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo,Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products), máy đông khô (VirTis Freeze Dryers 2.0)

Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ống Eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20-1000), bình Schott, que cấy,

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập

Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu để phân lập nấm mốc, nấm men, giả men trong bánh men:

Quy trình phân lập như sau:

- Bước 1: Nghiền mịn các mẫu bánh men trong các túi riêng

- Bước 2: Cân 3 gam mẫu bánh men đã nghiền với 27 g dung dịch NaCl 0.9% (đã hấp) trong ống falcon 50 ml, vortex đều

- Bước 3: Pha loãng theo hệ số 10 đến nồng độ 10-6

- Bước 4: Sau đó hút 100 µl dịch pha loãng của từng nồng độ chang trên đĩa thạch Malt 2°Bx rồi nuôi trong điều kiện hiếu khí trong tủ 30°C

- Bước 5: Từ sau 24 giờ, tiến hành quan sát các khuẩn lạc khác nhau Chọn lấy các khuẩn lạc đại diện tiến hành làm sạch và giữ giống

2.3.2 Làm sạch và giữ giống

Lấy một ít sinh khối cần làm sạch và cấy lên đĩa Petri chứa môi trường Malt 2ºBx, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 30ºC trong 2-3 ngày Khi thấy nấm đã mọc mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc khác lạ thì lấy một ít sinh khối và cấy giữ giống vào trong ống nghiệm nút xoáy chứa môi trường Malt 4ºBx Đem các ống nghiệm nuôi cấy ở nhiệt độ 30ºC khoảng 2 ngày, sau đó cất giữ trong tủ mát Trường hợp khuẩn lạc nào chưa sạch (có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại như cách trên

Đối với các chủng mốc, sử dụng cách bảo quản cát

Lấy sinh khối mốc thuần cho vào các ống cát sấy khô (kích thước dài 8-10 cm, đường kính 8mm) với độ dày cát 15 mm, mỗi chủng làm 3-5 ống, đảo đều rồi đưa vào bình hút ẩm chứa hạt silicagen sấy khô Đợi 3 đến 5 ngày sau, khi các ống cát khô tơi, tiến hành nhúng đầu bông vào paraffin nóng chảy để khô rồi bảo quản trong

tủ lạnh 5ºC

Đối với các chủng nấm men và giả men, sử dụng cách bảo quản lạnh sâu, thành phần môi trường như sau: peptones 1,5%, yeast extract 0,3%, sodium chloride 0,6%, glucose 0,1%, glycerol 15% Dùng pipet Pasteur hút dịch cho vào ống nghiệm đã có giống lấy hết các tế bào cho vào ông sữa, hàn lại Hấp các ống nghiệm nút xoáy 2ml, mỗi ống đựng 3 ống sữa, mỗi chủng làm 6 ống sữa, rồi để vào tủ -80ºC

2.3.3 Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào

Các chủng nấm mốc, men và giả men được nuôi cấy trên môi trường Malt 2ºBx ở 30ºC sau 2 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Tiến hành làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x Sau đó chụp ảnh lại

2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường Malt 2ºBx sau 2 ngày Lấy sinh khối tế bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 0,75 ml SSC 2x vào mỗi ống Lắc đều và đun ở 100ºC trong 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Hút bỏ phần dịch

và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng Qua mỗi lần rửa ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thủy tinh, 150 µl dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong phía trên có chứa DNA

2.3.5 Phương pháp tinh chế DNA

Do DNA của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, tiến hành tinh chế DNA bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào Eppendorf vô trùng Bổ sung 150µl dung dịch Binding buffer có chứa Silica Đem ly tâm ở 13000 vòng/phút

trong 1 phút Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt thủy tinh Rửa 3 lần bằng Washing buffer Sau đó phơi khô trong box cấy rồi bổ sung 15 µl nước cất vô trùng dùng cho PCR Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút, DNA ở phần dịch nổi là DNA đã được tinh chế DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứng PCR

2.3.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting

Từ các chủng thuần sau khi phân lập, sẽ có nhiều cách khác nhau để phân loại và định danh loài trong đó phương pháp truyền thống là dựa vào các khóa phân loại hình thái khuẩn lạc và tế bào, bên cạnh đó các nhà khoa học có thể áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định danh loài một cách chính xác hơn như kỹ thuật PCR-Fingerprinting

Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting: phương pháp fingerprinting là

phương pháp dùng để phân nhóm loài dựa trên sự tương đồng các đoạn ADN vệ tinh ADN vệ tinh là các đoạn ADN có trình tự lặp lại lớn, thường không mã hóa cho gen

và ít bị đột biến, thay đổi Do đó chúng thường được dùng làm công cụ đắc lực trong phân loại Sử dụng các mồi được thiết kế theo trình tự của các ADN vệ tinh trong phản ứng PCR Sau đó các đoạn ADN vệ tinh đã khuếch đại sẽ được điện di để so sánh kích thước Sự tương đồng của các phổ băng thể hiện sự gần gũi của các chủng nấm mốc Phản ứng PCR finger printing được tiến hành với thành phần phản ứng như sau:

Tiến hành hút 20 µl master mix vào mỗi ống effendorf nhỏ, rồi bổ sug 1 µl DNA, mix đều, spin down Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng mồi MST2 trên máy, chương trình MST2

Gia nhiệt ở 94ºC trong 3 phút, tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 30 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94ºC trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52ºC trong 1 phút

và kéo dài ở 72ºC trong 10 phút

2.3.7 Phương pháp điện di

Sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1 % với dung dịch đệm là 0,5x TAE Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1 % được đun tan trong đệm TAE bằng lò vi sóng Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60 - 70ºC, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE Dùng micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản gel Với các gel sử dụng răng lược nhỏ, dùng 3-5 µl mẫu cho mỗi giếng Điện di với hiệu điện thế 50-100V

2.3.8 Nhuộm gel và đọc kết quả

Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0,5 µg/ml pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước để loại bỏ Ethidium Bromide bám không đặc hiệu Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát bằng máy soi gel InGenius của hãng Syngene

2.3.9 Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA

DNA sau khi được tách và tinh chế như trên, tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS hoặc ITS-D1D2 với thành phần master mix như sau:

Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l

Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System

9700 (PE) Chu trình gia nhiệt như sau: Gia nhiệt ở 94ºC trong 3 phút, tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 30 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94ºC trong vòng 40 giây, gắn mồi ở 50ºC trong 40 giây và kéo dài ở 72ºC trong 10 phút

Sản phẩm PCR sau đó cũng được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng ethidium bromit như trên, và soi bằng máy soi gel Sau đó sản phẩm PCR được đọc trình tự với 3 mồi ITS1, ITS4, NL4 Kết quả đọc trình tự được xử lý với các phần mềm Bioedit

2.3.10 Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc

Cân 20 g gạo nếp với 20 g nước RO vào các bình tam giác 100 ml, ngâm trong

1 giờ rồi hấp thanh trùng ở 121 °C/15phút Làm nguội rồi bổ sung 1 vòng tròn thạch giống đường kính 1 cm Sau 2 ngày nuôi hiếu khí bổ sung 40g hoặc 60 g đệm

CH3COONa 0.1M, PH 5 rồi lắc 150 rpm/1h/27°C để chiết enzyme amylase, ly tâm khối dịch ở 5000 rpm/20 phút/4°C thu dịch trong rồi lại ly tâm 10000 rpm/10 phút/4°C

Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS [23]

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định So màu tiến hành ở bước sóng 540

nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Hòa tan và bổ sung thêm:

Phenol tinh thể (để tan trong ở 50C trước khi dùng) 3,8 ml

Tiến hành xây dựng đường chuẩn:

- 200 µL D-glucose theo các nồng độ trên được cho vào eppendorf 1.5 mL

- Bổ sung thêm 400 µL DNS, mix đều Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh

nhanh bằng nước đá

- Lấy 40 µL dịch phản ứng + 180 µL nước cất, mix đều trong vi đĩa

- Đo OD 540nm Dựng được đường chuẩn y = ax

- Mẫu Blank: nước cất thay cho đường D-glucose và tiến hành tương tự mẫu thí nghiệm

Tiến hành phân tích mẫu enzyme

Mẫu thí nghiệm:

- Bước 1: Cho 0.3 ml enzyme vào ống nghiệm để vào bể ổn nhiệt 50°C trong 5 phút (làm ấm ống nghiệm enzyme), ống cơ chất cũng được làm ấm 50°C trong 5 phút

- Bước 2: Cho 0.6 ml cơ chất vào ống nghiệm enzyme, cho enzyme phản ứng với cơ chất chính xác 20 phút ở 50°C

- Bước 3: Nhỏ ngay 0.1 ml NaOH 0.1 M để dừng phản ứng Làm nguội nhanh bằng

Mẫu đối chứng thí nghiệm (kiểm tra lượng đường có sẵn trong enzyme và

ảnh hưởng của các phản ứng phụ khác)-ký hiệu C1:

Bổ sung 0.3 ml enzyme với 0.1 ml NaOH 0.1M, gia nhiệt ở 100°C trong 10 phút (để diệt enzyme), làm lạnh nhanh trong nước đá, cho bổ sung 0.6 ml cơ chất vào các ống

đối chứng vortex đều Sau đó tiến hành các bước tiếp theo từ bước 4

Mẫu đối chứng cơ chất- không có enzyme (để kiểm tra cơ chất có đường

không)- ký hiệu C2

Cho 0.4 ml đệm vào 1 ống nghiệm có chứa 0.6 ml cơ chất, vortex đều Gia nhiệt ở 50°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong nước đá Tiến hành các bước tiếp theo từ bước 4

IU/ml = (𝐓−𝐂𝟏−𝐂𝟐)∗𝐃∗𝐕

𝐚∗𝟎.𝟏𝟖∗𝐭∗𝐯

Trong đó: T: Độ hấp phụ của mẫu thí nghiệm

C1: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng 1 C2: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng 2 D: hệ số pha loãng

V: tổng thể tích mẫu a: hệ số góc của đường chuẩn 0.18: 180/1000 của đường D-glucose khan t: thời gian phản ứng (phút)

2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện

Để đảm bảo các chủng giống đều khỏe như nhau, tiến hành lấy giống từ các ống bảo quản cát rắc lên đĩa Malt 2ºBx, sau 1 đến 2 ngày khi có các đĩa giống thuần, tiến hành cấy chấm sinh khối mốc trên môi trường tinh bột 1%, thạch 1.8% trong 2 ngày ở 6 điều kiện nhiệt: 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C Sau 24 giờ, 48 giờ tiến hành đo đường kính khuẩn lạc để so sánh sự phát triển của các nhóm chủng rồi chụp ảnh lại

2.3.12 Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường

Như chúng ta đã biết, vi sinh vật có khả năng thủy phân tinh bột khi sống trong môi trường có tinh bột thì chúng sẽ kích hoạt gen, tổng hợp enzyme amylase, enzyme này sẽ thủy phân tinh bột thành đường dễ sử dụng để phục vụ sự sinh trưởng và phát triển của loài đó Tuy nhiên, trong môi trường có cả tinh bột và đường thì liệu rằng các nhóm nấm khác nhau có xu hướng sử dụng hết đường rồi mới sử dụng đến tinh bột hay chúng vẫn sinh enzyme thủy phân tinh bột ngay cả khi môi trường có đường Để trả lời câu hỏi đó, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm như sau:

Chọn ra các chủng đại diện mỗi nhóm để kiểm tra tính thủy phân tinh bột khi trong môi trường có sẵn glucose, ta tiến hành thí nghiệm như sau: thu sinh khối các chủng mốc sau 2 ngày nuôi trên đĩa thạch Malt 2°Bx ở tủ 30°C, bổ sung 0.7 mL NaCl 0.9%, sau đó trộn đều với 25mL thạch Agar-agar Type I 1.5% chứa soluble starch 0.5%, đổ ra đĩa Petri, cắt miếng tròn d=1.3cm, thả vào mỗi bình dịch YM (đã pha loãng 10 lần có bổ sung chloramphenicol 0.1%) với nồng độ đường glucose khác nhau rồi nuôi lắc ở 30°C, 150 rpm (Thành phần môi trường YM gốc không có glusose và cao malt: cao nấm men 3g/L; peptone 5g/L.)

2.3.13 Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc

Từ các thí nghiệm trên, tiến hành chọn nhóm chủng nấm mốc Rhizopus oryzae

có hoạt lực enzyme amyase cao, có khả năng thủy phân tinh bột khi trong môi trường đường, và nhóm chủng này được cho là an toàn trong thực phẩm để thử nghiệm lên

men rượu kết hợp với chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc giả men

Saccharomycopsis fibuligera

Sử dụng 3 chủng nấm mốc thuần có hoạt lực enzyme amylase cao, 1 chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt, và 1 chủng giả nấm men của Viện Công nghiệp Thực phẩm:

- Chủng nấm mốc: Rhizopus oryzae BMM 111, Rhizopus arrhizus (Rhizopus

oryzae) BMM131, Rhizopus arrhizus (Rhizopus oryzae) BMM1015 Đĩa giống mốc

thu sinh khối sau 2 ngày cấy trên đĩa malt 2°Bx

- Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae BMQ 467 (nồng độ 107 tế bào)

- Chủng giả nấm men Saccharomycopsis fibuligera BMQ908 (nồng độ 107 bào tử) Nuôi tăng sinh trong các bình tam giác 100 ml, dịch malt 4°Bx sau 24h nuôi lắc

Chuẩn bị cơm gạo để lên men rượu như sau: Cân 250 g gạo với 250 g nước

RO (ngâm 2h) vào mỗi bình tam giác 1000 ml Hấp ở 121°C/15 phút, sau đó để nguội, bổ sung giống mỗi loại như bảng 2.1 Sau đó lên men ẩm trong 3 ngày, bổ sung 500

ml nước để lên men rượu 7 ngày Sau 10 ngày thu dịch đem đo độ cồn và chưng cất

Lượng giống đươc bổ sung như sau:

- Nấm mốc: bổ sung 1 vòng tròn thạch đường kính d= 1.3 cm

- Nấm men: bổ sung 2 ml dịch sinh khối (107 tế bào)

- Giả nấm men: bổ sung 200 µl dịch

Bảng 2 1 Thành phần giống ở mỗi mẫu lên men

LAB 5

Rhizopus oryzae BMM 131 Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908 Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

LAB 6

Rhizopus oryzae BMM 1015 Saccharomycopsis fibuligera BMQ 908 Saccharomyces cerevisiae BMQ 467

Ký hiệu: d là đường kính (cm)

2.3.14 Đo độ cồn bằng sôi kế

Đo độ cồn, ta sử dụng sôi kế ebulliometer Cách đo như sau:

➢ Để đo điểm sôi của nước:

- Bước 1: Rửa sạch buồng sôi cẩn thận bằng nước sạch

- Bước 2: Thêm khoảng 20mL nước RO vào buồng sôi

- Bước 3: Lắp nhiệt kế rồi đốt đèn và đặt dưới chân thiết bị

- Bước 4: Khi nước sôi, quan sát nhiệt kế, khi mức thủy ngân ổn định (> 30 giây) ghi lại nhiệt độ đọc gần nhất có thể Nhiệt độ này là T1

- Bước 5: Để dụng cụ nguội trước khi tháo nhiệt kế và xả nước

➢ Để đo điểm sôi của rượu:

- Bước 1: Rửa sạch khoang sôi với rượu

- Bước 2: Đo 50mL rượu và đổ vào buồng sôi

- Bước 3: Lắp nhiệt kế

- Bước 4: Đổ đầy khoang ngưng bằng nước lạnh

- Bước 5: Đốt đèn và đặt dưới chân thiết bị

- Bước 6: Khi rượu sôi, quan sát nhiệt kế Khi mức thủy ngân ổn định (15-30 giây) ghi lại nhiệt độ đọc gần nhất có thể Nhiệt độ này là T2

- Bước 7: Để dụng cụ nguội trước khi tháo nhiệt kế và xả nước

➢ Để tính toán nồng độ cồn:

1 Tính giá trị T = T1 - T2

2 Xác định nồng độ cồn từ bảng hiển thị đi kèm

2.3.15 Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí kết nối khối phổ GCMS

Thông số chạy máy [21]

Việc đánh giá các hợp chất bay hơi trong sản phẩm lên men được thực hiện sử dụng phương pháp vi tách chiết pha rắn kết hợp với sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS)

Các mẫu được phân tích bởi GC/MS sử dụng sắc kí khí SCION 456-GC và khối phổ SQ

- Cột: mao quản Rt-Wax, dài 30m, 0.25 mm film thickness

- Khí mang: Heli với độ tinh khiết cao

- Vận tốc khí mang: 42 cm s-1

- Tốc độ dòng là 1.2 ml/min

- Nhiệt độ lò: bắt đầu là 35 ºC giữ trong 2 phút, sau đó tăng 5 ºC/1 phút lên 155 ºC

và giữ 0 phút Tiếp theo tăng 20ºC/1 phút lên 200 ºC và giữ trong 10 phút

- Sợi fiber SPME được đưa vào trong liner và giữ trong 20 phút, sử dụng chế độ chia dòng như sau: trong 1 phút đầu là không chia dòng, từ phút 1.01 thì chia dòng 1:10 Đối với MS, nhiệt độ nguồn ion và nhiệt độ transfer line là 230 ºC Chế độ electron impact mode là 70 eV

Sử dụng 32 mẫu rượu chưng cất bao gồm 26 mẫu thu thập (ký hiệu COM) và 6 mẫu của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp (LAB1-LAB6) để phân tích Điều kiện

xử lý mẫu trước khi cho vào injector như sau: Đo cồn kế các mẫu rượu chưng cất rồi pha loãng về độ cồn 12 % (v/v) bằng nước deion, hút 5 ml vào các ống 20 ml chứa 1.5

g NaCl Bổ sung 5µl chất nội chuẩn là 2-pentanol,4-methyl với nồng độ 5ppm, sử dụng khuấy từ trong lúc gia nhiệt mẫu lên 60ºC, giữ sợi hấp phụ fiber The Supelco Carbowax/divinylbenzene (CW/DVB) 65 mm trong 30 phút rồi đưa vào máy

Việc bán định lượng các chất bay hơi được thực hiện bằng cách sử dụng pentanol,4-methyl là chất nội chuẩn Cách tính bán định lượng của những chất bay hơi đó được tính theo công thức sau [29]

2-C (µg/L) = 𝐴𝑐

𝐴is x Cis (µg/L) Trong đó: C: nồng độ tương đối của chất phân tích

Cis: nồng độ chất chuẩn nội trong mẫu rượu Ac: diện tích chất phân tích

Ais: diện tích của chất nội chuẩn

Phổ phổ của các hợp chất chưa biết được so sánh với các hợp chất trong thư viện phổ Phân tích mỗi mẫu được lặp lại 2 lần, rồi phân nhóm mẫu theo thứ bậc bằng phần mềm ORANGE

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men

Để nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột, bước đầu tiên các chủng nấm mốc được phân lập từ 15 mẫu bánh men thì kết quả là hầu hết các chủng nấm mốc đều thuộc

họ Mucoraceae

Bằng việc phân lập, quan sát hình thái khuẩn lạc, làm sạch các chủng vi nấm khác nhau từ 15 mẫu bánh men được thu thập từ các tỉnh Ninh Bình, Tuyên Quang, Thái Bình, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Hưng Yên, Bắc Giang, có 73 chủng nấm mốc, 16 chủng nấm men và 12 chủng giả nấm men Thông tin chi tiết chủng được ghi

rõ trong phụ lục

Tổng số chủng được phân lập từ 15 mẫu bánh men là 101, trong đó chủ yếu là nấm mốc chiếm 73 chủng, nấm men 16 chủng và giả men chỉ có 12 chủng Nấm mốc xuất hiện ở tất cả các bánh men, từ 2 đến 8 chủng trên một bánh Tuy nhiên, các chủng nấm men phân lập được chỉ xuất hiện ở bánh men MQ2, MQ3, MQ4, MQ7, MQ8, MQ9, MQ11, MQ12, MQ13 mà không phân lập được ở bánh men MQ1, MQ5, MQ6, MQ10, MQ14, MQ15 Đối với các chủng giả men cũng vậy, chỉ xuất hiện ở bánh men MQ2, MQ3, MQ7, MQ8, MQ9, MQ12, MQ13, MQ14 mà không có ở bánh men MQ1, MQ4, MQ5, MQ6, MQ10, MQ11, MQ15

3.2 Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào

Sau khi phân lập, các chủng cần được xếp nhóm trong đó phân nhóm hình thái khuẩn lạc và tế bào là một bước rất quan trọng Các chủng được cấy trên đĩa Petri Malt 2ºBx, sau 2 ngày nuôi trong tủ 30ºC sẽ được xếp nhóm sơ bộ bằng hình thái khuẩn lạc dựa trên 3 đặc điểm cơ bản của khuẩn lạc là: hình dạng, kích thước, màu sắc Sau đó, tiếp tục làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi Dưới đây là hình thái khuẩn lạc mặt trước, mặt sau và hình thái tế bào (thứ tự từ trái sang phải) của các chủng vi nấm đại diện các nhóm

Nhóm 1 (18 chủng): Rhizopus microsporus MQF 4.2

Nhóm 2(8 chủng): Rhizopus microsporus MQF 1.2

Nhóm 3 (3 chủng): Mucor indicus MQF 12.1

Nhóm 4 (5 chủng): Rhizopus oryzae MQF 2.4

Nhóm 5 (7 chủng): Rhizopus oryzae MQF 2.5

Nhóm 6 (4 chủng): Rhizopus oryzae MQF 1.3

Nhóm 7 (12 chủng): Rhizopus oryzae MQF 10.5

Nhóm 8 (3 chủng): Lichtheimia ramosa MQF 9.4

Nhóm 1(14 chủng): Saccharomyces cerevisiae MQY 4.1

Nhóm 2 (2 chủng): Wickerhamomyces anomalus MQY 11.3

Nhóm giả men

Có 12 chủng Saccharomycopsis fibuligera MQS 14.1

Hình 3 1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện Nấm mốc:

Nhóm 1 (18 chủng): Nhóm này có hình thái khuẩn lạc màu xám ghi, hệ sợi phát triển nhanh, túi bào tử màu đen Dễ thấy, nhóm khuẩn lạc này rất phổ biến, chúng xuất hiện ở hầu hết các bánh men từ MQ4 đến MQ15

Nhóm 2 (8 chủng): Nhóm này đặc trưng bởi hình thái khuẩn lạc màu đen, hệ sợi bò lan, ít hoặc không có hệ sợi khí, bào tử đen to Khi quan sát tiêu bản có rễ Nhóm này cũng khá phổ biến, chúng xuất hiện ở 7 bánh men MQ 1,4,5,6,10,11,14