(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều merrf ở người việt nam 14

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – M

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bùi Thị Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bùi Thị Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TS Phan Tuấn Nghĩa

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn

thạc sĩ khoa học

GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Bùi Phương Thuận

Hà Nội - 2015

ỜI

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, thầy đ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS Nguyễn Văn Minh và CN Phùng Bảo Khánh và các anh chị em làm việc tại phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đ giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm

Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Y tế Thái Bình, Trưởng khoa Y học cơ sở và các anh em trong bộ môn Y học cơ sở đ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được đi học nâng cao trình độ của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đ truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu Tôi xin g i lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng chức năng của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đ tạo điều kiện cho tôi học tập, hoàn thành chương trình học Cao học

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đ luôn động viên, khích lệ tôi hoàn thành khóa học

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

HVCH: Bùi Thị Khánh

MỤ Ụ

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

D NH MỤC C C K HI U V CHỮ VIẾT TẮT vi

D NH MỤC C C BẢNG viii

D NH MỤC C C HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QU N T I LI U 3

1.1 CẤU TRÚC V CHỨC NĂNG CỦ TY THỂ NGƯỜI 3

1.1.1 Cấu trúc của ty thể 3

1.1.2 Chức năng của ty thể 6

1.1.2.1 Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào 6

1.1.2.2 Ty thể và quá trình lão hóa 7

1.1.2.3 Ty thể và quá trình tự chết của tế bào 9

1.1.3 Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể 10

1.1.3.1 Hệ gen ty thể 10

1.1.3.2 Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể 12

1.1.3.3 Tính chất dị tế bào chất và tốc độ đột biến của ty thể 12

1.2 ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ V C C B NH LIÊN QU N 13

1.2.1 Các loại đột biến gen ty thể 13

1.2.1.1 Đột biến điểm 14

1.2.1.2 Đột biến cấu trúc mtDNA 15

1.2.2 Các bệnh do đột biến gen ty thể 15

1.2.2.1 Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen

mã hóa tRNA 17

1.2.2.2 Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein 19

1.2.2.3 Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA 21

1.2.2.4 Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA 22

1.3 HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU

(MERRF) 24

1.3.1 Các đột biến của hội chứng MERRF 24

1.3.1.1 Đột biến A8344G 24

1.3.1.2 Đột biến T8356C 25

1.3.1.3 Đột biến G8363A 26

1.3.2 Những tác động của hội chứng MERRF trên người bệnh 27

1.3.3 Các phương pháp phát hiện đột biến MERRF 29

1.3.3.1 Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp

với RFLP 29

1.3.3.2 Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định

trình tự gen 30

1.3.3.3 Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism) 30

1.3.3.4 Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time

PCR 31

1.3.3.5 Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học 31

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LI U V PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU 33

2.1 NGUYÊN LI U 33

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 33

2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác 33

2.2 M Y MÓC V TR NG THIẾT BỊ 33

2.3 PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU 34

2.3.1 Tách chiết DN tổng số 34

2.3.2 Kiểm tra và định lượng DN tách chiết 34

2.3.3 Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR 35

2.3.4 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn

phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) 36

2.3.5 Điện di trên gel agarose 36

2.3.6 Điện di trên gel polyacrylamide 37

2.3.7 Kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid) 38

2.3.8 Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 42

3.1 THU THẬP MẪU M U B NH NHÂN V T CH CHIẾT DN

TỔNG SỐ 42

3.1.1 Một số đặc điểm của mẫu phân tích 42

3.1.2 Tách chiết DN tổng số của các mẫu 42

3.2 S NG LỌC C C ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƯỜI VI T N M BẰNG PHƯƠNG PH P PCR-RFLP 43

3.2.1 Sàng lọc đột biến 8344G 43

3.2.1.1 Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR 43

3.2.1.2 Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP 44

3.2.2 Sàng lọc đột biến T8356C 46

3.2.2.1 Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR 46

3.2.2.2 Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP 47

3.2.3 Sàng lọc đột biến G8363 48

3.2.3.1 Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582 48

3.2.3.2 Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP 50

3.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘT BIẾN 8344G BẰNG KỸ THUẬT RE L-TIME PCR 52

3.3.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 52

3.3.1.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 52

3.3.1.2 Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G 54

3.3.2 Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp

real-time PCR để định lượng đột biến 8344G 56

3.3.2.1 Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G 56

3.3.2.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G 56

3.3.3 Th nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến 8344G 60

3.4 S NG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF

BẰNG PHƯƠNG PH P GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP 61

Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292

trên hệ gen ty thể 61

KẾT LUẬN 63

T I LI U TH M KHẢO 64

PHỤ LỤC 73

H Ụ HI U V H VI T TẮT

APS Ammonium persulfate

ANT Adenine nucleotide translocase

ADP Adenosine diphosphate

ATP Adenosine triphosphate

bp Base pair (cặp bazơ)

BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ huỳnh quang) CoQ Coenzyme Q

CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên)

Cyt c Cytochrome c

Cyt b Cytochrome b

D-loop Vòng chuyển vị

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

ddH2O Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, kh trùng)

EtBr Ethidium bromide

FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng kh )

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside

kb Kilobase

KSS Kearns-Sayre syndrome (Hội chứng KSS)

LB Luria Bertani

LHON Leber’s hereditary optic neuropathy

(Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)

LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like Episodes (Hội chứng n o giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch)

MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres

(Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều)

MIDD Maternally inherited diabetes and deafness

(Bệnh tiểu đường và câm điếc di truyền theo mẹ)

MRI Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ) mtDNA Mitochondrial DN (DN ty thể)

nDNA Nuclear DNA (DNA nhân)

NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng kh )

NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos

(Hội chứng gây liệt, mất sự điều hòa và viêm võng mạc

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PEO Progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

(Sự đa hình các đoạn phân cắt giới hạn)

ROS Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng)

SDS Sodium dodecylsulphate

TAE Tris -Acetate-EDTA

TBE Tris -Borate-EDTA

TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

Tm Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi)

H Ụ B G

Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF 28

Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến

MERRF 35

Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% 37

Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR 40

Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 43

Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII 45

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 46

Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 49

Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR 53

Bảng 3.6: Tương quan giữa nồng độ DN plasmid mang đột biến và không đột biến 8344G ban đầu và số chu kỳ ngưỡng được xác định bằng real-time PCR 57

Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn 58

Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn 59

H Ụ HÌ H

Hình 1.1 Cấu trúc ty thể 3

Hình 1.2 Cấu tạo màng ty thể 4

Hình 1.3 Hệ gen ty thể 10

Hình 2.1 Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LN 38

Hình 2.2 Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman 39

Hình 3.1 Điện di sản phẩm DN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân 42

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8155 - 8366 44

Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân 45

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8166 - 8385 47

Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân 48

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8342 - 8582 49

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân 50

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra mẫu dò 55

Hình 3.9 Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến 8344G bằng real-time PCR 57

Hình 3.10 Sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết 59

Hình 3.11 Th nghiệm định lượng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến 8344G bằng real-time PCR 60

Hình 3.12 Kết quả blast của trình tự 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2 .62

Ở ĐẦU

Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năng cung cấp năng lượng dưới dạng TP cho các hoạt động của tế bào Ty thể sản xuất năng lượng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trình chuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H2O, CO2, và năng lượng dưới dạng TP

Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân DNA ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho 2 RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp DNA ty thể dễ bị tổn thương do ty thể là môi trường giàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế s a chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DN ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chức khác nhau

Năm 1988, Wallace và tập thể đ công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty thể người gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy - LHON) Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể người đ được xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khả năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau

MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hưởng đến hệ thần kinh và cơ xương cũng như các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của

DN ty thể Ngoài ra, người mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh, mất điều hòa vận động, suy nhược và mất trí nhớ Triệu chứng thường khởi phát ở trẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thường, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé, thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát được các u mỡ khu trú dưới da Tế bào

cơ bất thường và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm với Gomori trichrome và quan sát dưới kính hiển vi

Hiện nay, trên thế giới đ có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứng MERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền của bệnh Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ chế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phương pháp thăm khám lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thường quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh nhân MERRF vẫn chưa được phát hiện và không có phương pháp điều trị hiệu quả

Ở Việt Nam, gần như chưa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện và định lượng đột biến MERRF ở người Việt Nam

Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền đối với các bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam“

HƯ G 1: TỔNG QUAN TÀI LI U

1.1 ẤU TRÚ V HỨ Ă G Ủ TY THỂ GƯỜI

1.1.1 ấu trúc của ty thể

Ty thể là bào quan phổ biến được tìm thấy trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn Chức năng chính của ty thể là cung cấp năng lượng hóa học cần thiết cho các hoạt động sinh tổng hợp và vận động của tế bào Ty thể được lần đầu tiên tìm thấy trong tế bào cơ năm 1857 bởi nhà giải phẫu học người Thụy Sĩ, Kollier Đến năm 1890, nhà mô học người Đức, Richard ltmann, bằng phương pháp nhuộm fuchsine đ quan sát được ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển

vi quang học [27].Ty thể có đường kính khoảng 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm Hình dạng và số lượng ty thể tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng của mỗi loại tế bào khác nhau, các tế bào mô cơ xương hoặc thận cần một lượng ty thể lớn hơn các tế bào khác trong cơ thể Ty thể có thể hình cầu, hình que hay hình sợi nhưng đều có cấu trúc chung giống nhau Ty thể có khả năng thay đổi hình dạng, kích thước, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc nhỏ hơn Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý bên trong tế bào [35]

Hình 1.1 ấu trúc ty thể [68]

Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng trong và màng ngoài, bao lấy khối chất nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng được gọi là xoang gian màng Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tương tự như màng sinh chất, nhưng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất lý hóa chuyên trách cho việc thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng [35]

Màng ngoài của ty thể có độ dày 6 nm, có tỷ lệ protein (P)/ lipid (L) lớn hơn hoặc bằng 1 Màng ngoài ty thể chứa tỷ lệ cholesterol thấp (bằng 1/6 so với màng tế bào hồng cầu), tỷ lệ phosphatidyl choline cao gấp hai lần so với màng tế bào Màng ngoài có nhiệm vụ tiếp thu phần lớn protein sản xuất từ tế bào chất để xây dựng ty thể và kiến tạo màng Đặc biệt, màng ngoài của ty thể có tính bán thấm rộng hơn với các ion và các phân t lớn cho phép các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngược lại Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl

CoA synthetase [35]

Hình 1.2 ấu tạo màng ty thể [67]

Màng trong của ty thể có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%,

và một lượng nhỏ cholesterol Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53 Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cường vận chuyển điện t và tổng hợp TP Màng trong

chứa nhiều protein vận chuyển chủ động TP, DP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+ Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện t (phức hợp I-IV), ATP synthase (phức hợp V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) [9]

Xoang gian màng (khoảng xen kẽ giữa hai màng) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng, môi trường cũng tương tự và cân bằng với bào tương của tế bào Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận

chuyển điện t , chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện t cơ động cho chuỗi

hô hấp, giải phóng Cyt c vào bào tương sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình chết theo chương trình của tế bào [32]

Chất nền (matrix) là một vùng vật chất không định hình chứa nhiều cấu trúc đặc biệt Chất nền này là một phức hệ protein tan trong nước, tương đối đậm đặc và chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể Như vậy, ở tế bào động vật, thực vật

và người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể Ty thể có vật chất di truyền và bộ máy của riêng nó để tổng hợp nên các RN cũng như protein của chúng Các DN ngoài nhiễm sắc thể này m hóa một số các peptide của ty thể (ở người là 13 loại peptide) Các peptide này gắn vào lớp màng trong cùng với các protein khác được m hóa trong nhân tế bào [32]

Ty thể nhân lên theo phương thức rất giống với tế bào vi khuẩn Khi chúng trở nên quá lớn, chúng bắt đầu chia đôi Quá trình này xảy ra sau khi bộ DN của

ty thể được nhân đôi hoàn toàn, được thực hiện bằng sự tạo thành r nh bên trong

và sau đó màng ngoài thắt lại hình thành hai ty thể con Đôi khi các ty thể mới được tổng hợp ở các trung tâm giàu protein và polyribosome cần thiết Tuy nhiên, nhiều ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy) Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào [9]

1.1.2 hức năng của ty thể

1.1.2.1 Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào

Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào Quá trình hô hấp biến đổi hóa học và trao đổi chất tại ty thể đ giúp chúng chuyển đổi năng lượng hóa học tiềm tàng trong các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2,

H2O và giải phóng năng lượng vào phân t cao năng TP TP được tạo thành từ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa dựa trên các phức hệ hô hấp (gọi là chuỗi vận chuyển điện t ) nằm trên màng trong của ty thể Quá trình oxy hóa của tế bào s dụng nguồn các đương lượng kh N DH và F DH2 như nguồn điện t chính trong chuỗi vận chuyển điện t Các thành phần của chuỗi vận chuyển điện t nằm ở màng trong của ty thể bao gồm bốn phức hợp I, II, III và IV và một số chất mang điện t Các điện t được vận chuyển dọc theo chuỗi, ba trong bốn phức hợp hoạt động như máy bơm proton, đẩy proton từ chất nền tạo thành dòng chuyển proton Nhờ gradient proton và sự chênh lệch điện thế qua màng, mà TP được tổng hợp từ ADP và Pi bởi phức hệ F0F1 synthase, do đó cho phép các proton trở lại chất nền

Sự kết hợp vận chuyển điện t và tổng hợp TP hoạt động theo cơ chế hóa thẩm

Có hai giai đoạn tạo ra TP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện t nằm ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme [23]

Nguồn tạo ra năng lượng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein được lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate Các hợp chất carbohydrate, chủ yếu là glucose thông qua quá trình đường phân (glycolysis) được phân cắt và biến đổi cuối cùng tạo thành pyruvate, chất kh N DH và một lượng TP Pyruvate được đưa vào ty thể và bị oxy hóa, decarboxyl hóa để tạo thành acetyl-CoA (acetyl-Co có thể tạo ra từ quá trình oxy hóa acid béo) và tiếp tục được oxy hóa hoàn toàn qua chu trình Krebs để tạo thành CO2, H2O và năng lượng chủ yếu được tích trữ dưới dạng TP Trong chu trình Krebs, điện t và proton H+ được tách ra và chuyển đến các phân t nhận điện t là N D+ và F D trong chuỗi vận chuyển điện t để tạo thành N DH và F DH2 Chuỗi vận chuyển điện t bao

gồm bốn phức hợp: nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase (NADH-CoQ reductase/ phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II), ubiquinol cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV) và hai phân t vận chuyển điện t giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt c Phức hệ I và II có vai trò xúc tác cho sự nhận điện t của CoQ từ

N DH và succinate Sau đó phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện t từ CoQ đến Cyt c Cuối cùng phức hệ IV xúc tác cho sự vận chuyển điện t từ Cyt c tới chất nhận cuối cùng là oxy phân t Ở mỗi giai đoạn, điện t đi qua các phức

hệ, năng lượng được giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H+) từ chất nền qua màng trong ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng Do đó, hệ thống F0F1 synthase hoạt động và tổng hợp TP từ DP và phosphate vô cơ [35]

TP là nguồn năng lượng lớn được s dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào Vì vậy, khi ty thể bị tổn thương, quá trình sản sinh ra năng lượng bị chậm lại, thậm chí là ngừng lại hoàn toàn Pyruvate không được chuyển hóa tiếp, nên bị biến đổi thành lactate, vì vậy các bệnh nhân bị bệnh ty thể thường có hàm lượng lactate trong máu và trong dịch n o tủy cao Do gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp nên khi ty thể

bị tổn thương có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào cũng như mô và các cơ quan [35]

1.1.2.2 Ty thể và quá trình lão hóa

Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, là yếu tố nguy cơ lớn cho sự phát triển của ung thư, thoái hóa thần kinh và các bệnh tim mạch Cơ chế phân t của sự

l o hóa là vấn đề phức tạp, tuy nhiên quá trình oxy hóa và nitrate hóa protein trong

tế bào đ được đề xuất là cơ sở cho việc suy giảm chức năng của tế bào và làm giảm khả năng chống chịu của cơ thể [60]

Các gốc tự do, chủ yếu là các dạng oxy phản ứng (ROS – Reactive oxygen species) được xem là những phân t tín hiệu của nhiều hoạt động sinh lý Những năm 1990, hydrogen peroxide được phát hiện là có liên quan đến cytokine, insulin,

yếu tố tăng trưởng, P-1 và tín hiệu NF-кB [48] Sau đó, nhiều báo cáo chỉ ra rằng

H2O2 có thể thúc đẩy sự bất hoạt phosphatase bằng sự oxy hóa cysteine làm ảnh hưởng đến con đường truyền tín hiệu [58]

Hệ quả của các phản ứng hô hấp trong ty thể là các điện t chưa ghép cặp, sự tương tác của các điện t này với oxy tạo thành các gốc superoxide rất hoạt động, các gốc tự do có hoạt tính cao Có 8điểm trong ty thể có khả năng sản xuất O2-

, superoxide được chuyển hóa thành hydrogen peroxide (H2O2) bởi superoxide dismutase (SOD) khi có sự tham gia của một điện t và 2 proton H+ [48]

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ROS có thể gây ra những thay đổi trong quá trình dịch m protein Cụ thể, H2O2 có thể oxy hóa nhóm thiol (-SH) trong cysteine để tạo thành axit sulphenic (-SOH), tiếp theo phản ứng với GSH sinh

ra glutathionylate (-SSG) mang liên kết disulfide (-S-S-) hoặc amide sulfenyl (-SN) Mỗi sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến hoạt động của một protein nhất định Phosphorylase bị tác động khá nặng bởi ROS, làm ức chế hoạt động tách gốc phosphate [48]

Hơn nữa, các gốc tự do khác như các gốc hydroxyl (OH.) và hydrogen peoxyde (H2O2) cũng có thể tồn tại ở nồng độ tương đối cao, gây nên nguy cơ oxy hóa lipid làm tổn thương màng tế bào và ảnh hưởng đến cấu trúc DN Đáng chú ý rằng sự tác động của các gốc tự do này tới DNA ty thể sẽ lớn hơn DNA trong nhân

do DNA ty thể không liên kết với Histone và không có cơ chế tự s a chữa Khả năng tạo năng lượng TP của ty thể giảm và tăng quá trình oxy hoá làm hư hại cấu trúc tế bào Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát,

tế bào không tăng trưởng, không được s a chữa và chết ROS phá hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp protein, lipid, đường, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho collagen, elastin mất tính đàn hồi khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [22] ROS được cho là tác nhân chính gây ra những tổn thương sinh lý của tế bào

Sự tích lũy ROS và các tác nhân oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm các bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, ung thư và l o hóa sớm ROS và các gốc

tự do gây ra các đột biến gen, tăng sự hình thành và tích lũy các đột biến DNA ty thể ở các mô trong quá trình l o hóa [48] Theo thuyết ty thể về l o hoá, việc tích luỹ những tổn thương ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDN , protein, lipid làm ảnh hưởng đến chức năng của ty thể Nói chung, những tổn thương của mtDN trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn đến ty thể bị rối loạn, thậm chí ngừng hoạt động là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị l o hoá [21]

1.1.2.3 Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào

“Chết theo chương trình” (apoptosis) là một quá trình quan trọng giúp các sinh vật đa bào duy trì sự toàn vẹn và chức năng của mô và để loại bỏ những hư hại hoặc các tế bào không mong muốn Ty thể đóng vai trò cốt lõi trong việc điều tiết sự chết của tế bào bằng cách cung cấp nhiều yếu tố quan trọng bao gồm cả sự hoạt hóa caspase và phân mảnh nhiễm sắc thể Ty thể có vai trò quan trọng trong cơ chế tích

tụ Ca2+ và rối loạn quá trình oxy hóa, sự tích lũy lượng Ca2+ đủ lớn trong ty thể dẫn đến chết theo chương trình của tế bào Nồng độ và khả năng hoạt động của Ca2+trong ty thể được điều khiển bởi họ protein Bcl-2, yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình chết theo chương trình của tế bào [34]

Tín hiệu gây chết nội bào phụ thuộc vào sự phóng thích Cyt c Tác động của Cyt c là liên kết với thụ thể protein hoạt hóa procaspase ( paf-1), tổ hợp lại với nhau tạo thành heptamer gọi là apoptosome Apaf-1 trong apoptosome hoạt hóa procaspase mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn

sự chết tế bào Bcl-2 điều hòa con đường apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sự phóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bào chất Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kích thích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngược lại, ức chế sự giải phóng Cyt c từ đó kìm h m sự chết của tế bào [32, 60]

Nồng độ Ca2+

trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào Sự kích hoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca2+ trong ty thể phải đủ lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c

và hoạt hóa caspase Mặt khác, khi một lượng lớn Ca2+

tích tụ trong ty thể, sẽ tương tác với cyclophilin D để kích thích mở lỗ bán thấm trên màng trong của ty thể làm chất nền bị trương lên làm vỡ màng ty thể và phát tán Cyt c Hơn nữa, Ca2+ còn kích thích sự tổng hợp các gốc tự do có hoạt tính cao (ROS) Sự dư thừa ROS trong ty thể hoạt động như chất trung gian của các con đường truyền tín hiệu chết theo chương trình [34]

Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tố làm tổn thương gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chương trình

1.1.3 Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

1.1.3.1 Hệ gen ty thể

Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân DN ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16.569 bp, gồm 37 gen m hóa cho 2 phân t RN ribosome, 22 phân t RN vận chuyển và 13 phân t protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp

Hình 1.3 Hệ gen ty thể [11]

ND1-ND6 và ND4L m hóa 7 tiểu đơn vị của phức hợp (N DH-ubiquinone oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ được m hóa bởi mtDN (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 m hóa cho 3 tiểu đơn vị của phức hợp V ( TP synthase) Các phân t protein còn lại của chuỗi hô hấp được m hóa bởi gen nhân, được dịch m trong tế bào chất, sau đó được vận chuyển vào bên trong ty thể [59]

Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không m hóa xen kẽ với vùng m hóa D-loop nằm giữa gen tRN Phe

(gen MT-TK) và tRNAPro(gen MT-TP) là vùng không m hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình sao chép và phiên m của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên

m chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản Hai gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA được nằm giữa các gen m hóa cho protein Các gen này cung cấp các RN cần thiết cho

sự tổng hợp protein bên trong ty thể [11]

Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng trong

ty thể nhưng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân m hóa Quá trình phiên m và dịch mã của DN ty thể lại được điều khiển bởi gen nhân Hệ gen ty thể được phiên m từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên m sau

đó được endonuclease phân cắt để hình thành nên phân t rRNA 12S và 16S, tRNA

và mRNA tiền thân Phân t mRN hoàn thiện của ty thể không được gắn mũ nhưng có đuôi poly Mô hình phiên m trên có nhiều điểm giống với một operon của vi khuẩn [11, 59]

Các tế bào người có thể chứa tới hàng ngàn bản sao mtDN trong một tế bào và

có số lượng dao động tùy thuộc vào nhu cầu s dụng năng lượng của từng loại tế bào

Số bản sao mtDN giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng nhưng dường như tăng đột ngột trong quá trình tạo trứng Số lượng bản sao mtDN thay đổi rất lớn ở các mô khác nhau và được kiểm soát nghiêm ngặt trong thời kỳ đầu của quá trình phát triển của động vật Số bản sao mtDN tăng khi quá trình trao đổi chất tăng [46]

1.1.3.2 Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

Sự di truyền của các gen trên mtDN là sự di truyền qua tế bào chất Giống như các DN ngoài nhân, DN ty thể được di truyền theo dòng mẹ, người mẹ truyền gen ty thể cho các con, nhưng chỉ con gái của bà mới có thể truyền các kiểu gen này cho thế hệ tiếp theo Cơ chế di truyền này được lý giải bởi tế bào trứng của người phụ nữ trung bình chứa khoảng 100.000 phân t DN ty thể, trong đó một tinh trùng khỏe mạnh chỉ chứa trung bình 100 - 1500 phân t , mặt khác sự suy thoái của mtDN trong đường sinh dục nam và sự phá hủy mtDN của tinh trùng khi vào tế bào trứng là rất rõ ràng nên mtDN trong tế bào hợp t thường chỉ được thừa hưởng từ trứng [29, 61]

Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào Nhưng

hệ gen ty thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những kiểu di truyền riêng đặc trưng cho chúng Đột biến mtDN được truyền từ mẹ sang con nhưng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rất khác nhau [29, 46]

Một đặc điểm khác biệt nổi bật về tính di truyền gen ty thể là tần số xuất hiện của gen đột biến giữa mẹ và con cái Ví dụ, một người mẹ khỏe mạnh mang đột biến mtDN có thể sinh ra hai người con với tần suất mang gen đột biến hoàn toàn khác nhau, một người con khỏe mạnh và một người con có biểu hiện bệnh trầm trọng ngay từ khi còn nhỏ Kiểu di truyền này được gọi là “nút cổ chai”, theo đó tần suất mang mtDN đột biến của các thế hệ con cháu khác nhau đáng kể và cũng khác với mẹ [14, 46, 50]

1.1.3.3 Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể

Mỗi tế bào có thể chứa hàng ngàn bản sao DN Vì vậy, khi xuất hiện đột biến thì trong cùng một mô có thể có cả mtDN bình thường và mtDN đột biến, hiện

tượng này được gọi là tính không đồng nhất (Heteroplasmy) Nếu các bản sao của mtDN đều giống nhau thì được gọi là đồng nhất giữa các bản sao ty thể (Homoplasmy)

Số bản sao mtDN đột biến so với tổng lượng mtDN của tế bào sẽ xác định mức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh Đa

số các đột biến mtDN gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy Những hiểu biết

về mức độ dị plasmid của người mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiên lượng được tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể [14]

mtDNA có tốc độ đột biến cao gấp 10 - 20 lần so với DN trong nhân, do hệ gen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone như hệ gen nhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do [54] Ngoài ra, ty thể không có cơ chế s a chữa DN hiệu quả như với DNA trong nhân Hiện nay, đ có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh được phát hiện và nghiên cứu Các đột biến gen ty thể này thường gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể

1.2 ĐỘT BI GE TY THỂ V B H IÊ QU

1.2.1 ác loại đột biến gen ty thể

Bộ gen ty thể có tỷ lệ đột biến rất cao, cao hơn từ 10 đến 20 lần so với đột biến DNA trong nhân

Hầu hết những thay đổi trên DN ty thể là đa hình và có vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự di cư của con người Những đột biến mtDN gây bệnh đầu tiên đ được xác định vào năm 1988 Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh đ được phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là đột biến điểm và đột biến cấu trúc Các đột biến mtDN có tính không đồng nhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ của bệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn Ước tính ở phía Đông Bắc nước nh có

tỷ lệ 1/10.000 người đ có biểu hiện lâm sàng bệnh ty thể và 1/6000 người có nguy cơ mắc bệnh Một nghiên cứu gần đây đ cho thấy tần số đột biến là 0,14%

đối với đột biến 3243G và 0,2% đối với đột biến 1555G liên quan đến RNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những hiểu biết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56]

m hóa tRN , rRN hay protein, tuy nhiên hơn một n a trong số các đột biến điểm được báo cáo liên quan đến gen tRNA của ty thể [31]

tRN ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với tRN trong tế bào chất (mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạng hình L của tRN , ảnh hưởng đến cấu trúc bậc ba của chúng Một số đột biến trên tRN ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS Tùy thuộc vào điểm đột biến trên gen tRN ty thể sẽ ảnh hưởng đến các kênh vận chuyển điện t khác nhau trong chuỗi hô hấp tế bào Các nguyên nhân gây ra khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp các tRN ty thể là rất nhiều bao gồm: kết thúc phiên mã, biến đổi tRN trưởng thành, thay đổi bộ ba đối m , ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của tRN do đó giảm khả năng gắn acid amin, giảm liên kết với các yếu tố dịch m mtEFT hoặc các ribosome ty thể Đột biến điểm ở gen

m hóa protein ty thể đặc biệt ảnh hưởng đến các chức năng của phức hợp chuỗi

hô hấp tế bào mà nó đảm nhiệm [56]

Đột biến điểm trên mtDNA chủ yếu ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy),

tỷ lệ đột biến giữa các mô trong cùng một cá thể cũng rất khác nhau Một số đột biến gen ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) đang được nghiên cứu nhiều hơn, đột biến này thường ảnh hưởng đến các mô xác định và có biểu hiện lâm sàng đặc trưng Tuy nhiên, đột biến điểm gen ty thể rất đa hình nên việc xác định tỷ lệ đột biến gen gây bệnh ty thể là vấn đề cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa [31]

1.2.1.2 Đột biến cấu trúc mtDNA

Đột biến cấu trúc gen ty thể bao gồm mất đoạn, lặp đoạn và một số sự sắp xếp cấu trúc phức tạp khác đ được nghiên cứu gắn với tình trạng bệnh lý Phần lớn đột biến cấu trúc mtDN được phát hiện liên quan đến mất đoạn, thay đổi kích thước khoảng 1,3 - 8 kb hay một vài gen Đột biến mất đoạn mtDN thường xảy ra ở giai đoạn sớm trong quá trình phát triển của hợp t dẫn đến tần số xuất hiện và biểu hiện bệnh ở các mô là tương tự nhau Kích thước đoạn mtDN bị mất có thể do đột biến gen nhân quy định việc duy trì, sao chép và trao đổi nucleotide trong mtDN (ví

dụ, POLG và PEO1 m hóa Twinkle) [56]

Ở cấp độ phân t , khoảng 60% đột biến mất đoạn mtDN xảy ra trong khu vực mtDN mà hai bên là trình tự lặp ngắn, kiểu mất đoạn này được gọi là đột biến mất đoạn type I Khoảng 30% đột biến mất đoạn mtDN xảy ra tại những vùng có trình tự lặp không tuyệt đối, được gọi là mất đoạn type II Còn lại khoảng 10% đột biến mất đoạn xảy ra ở vùng không có trình tự lặp Mất đoạn mtDN phổ biến nhất, gặp ở khoảng 1/3 số bệnh nhân, là đột biến mất đoạn 5 kb (8470 - 13447) được giới hạn bởi trình tự lặp 13 bp (type I) [24]

Mặc dù có nguồn gốc khác nhau, hầu hết đột biến mất đoạn mtDN đều có đặc điểm chung, chủ yếu xảy ra từ quá trình sao chép Cơ chế xảy ra đột biến cũng giống nhau, Krishnan và cộng sự [24] đ đề xuất rằng mất đoạn mtDN phát sinh trong quá trình s a chữa các sai hỏng trong phân t mtDN tái bản Số lượng nucleotide bị mất và tần suất xuất hiện của đột biến trong các mô là cơ sở quan trọng cho việc xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh, nhưng có thể không tỷ lệ thuận với nhau

1.2.2 ác bệnh do đột biến gen ty thể

Ty thể là bào quan sản xuất năng lượng quan trọng trong các tế bào nhân chuẩn Bệnh ty thể là bệnh lý trong đó khả năng sản xuất năng lượng và đảm nhiệm vai trò bình thường trong tế bào của ty thể bị tổn hại Nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến mtDN là một trong các nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở

người, ngoài ra một số đột biến gen nhân cũng có thể làm mất chức năng của ty thể gây nên bệnh ty thể [56] Bệnh ty thể có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan với tập hợp các triệu chứng liên quan đến cơ, hệ thần kinh và các cơ quan thiết yếu cho sự sống cần năng lượng cao Biểu hiện lâm sàng của bệnh ty thể rất đa dạng, có những triệu chứng đan xen vào nhau, thường được xác định bởi tình trạng thiếu năng lượng tế bào do khiếm khuyết quá trình phosphoryl hóa oxy hóa

Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu hiện của bệnh ty thể chịu sự chi phối của một số yếu tố bao gồm hiệu ứng ngưỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lượng bản sao DN được nhân lên trong ty thể, và sự di truyền “nút cổ chai” Nhiều đột biến gen gây bệnh

ty thể ở trạng thái không đồng nhất, trong trường hợp này thì tỷ lệ gen đột biến

có liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh Tỷ lệ gen đột biến nhỏ nhất cần thiết có thể gây nên những biến đổi sinh hóa và chức năng của tế bào dẫn đến biểu hiện lâm sàng của bệnh được gọi là ngưỡng biểu hiện của đột biến Giá trị ngưỡng này khác nhau đối với từng loại đột biến và giữa các mô, cơ quan trong

cơ thể; sự hô hấp của tế bào theo con đường hiếu khí sẽ bị ảnh hưởng sớm hơn

so với con đường kị khí Thông thường các giá trị ngưỡng trong khoảng 60 - 90% gen đột biến mtDN [14] Trong quá trình phân bào, ty thể được tách ngẫu nhiên và trong tế bào con sẽ không có sự đồng nhất về tỷ lệ đột biến mtDN , sự thay đổi này đôi khi thấp hơn hoặc cao hơn ngưỡng biểu hiện của bệnh Mặt khác, mỗi ty thể của tế bào có hàng ngàn bản sao DN dẫn đến sự thay đổi tỷ lệ mtDN đột biến trong tế bào và mô Cơ chế di truyền “nút cổ chai” cũng quyết định sự biểu hiện bệnh ty thể ở các con sinh ra từ trứng của người mẹ mang đột biến gen ty thể ở dạng không đồng nhất, bởi sự di truyền ngẫu nhiên lượng mtDN đột biến vào tế bào trứng của mẹ tạo nên tỷ lệ không đồng nhất ở tế bào hợp t cao hơn hay thấp hơn ngưỡng biểu hiện của bệnh [46]

Từ việc xác định được các đột biến mtDN đầu tiên vào năm 1988, sau đó đ

có nhiều nghiên cứu quan trọng đi sâu tìm hiểu những rối loạn di truyền mtDN dẫn đến tình trạng bệnh lý Hiện nay, đ có hơn 250 đột biến mtDN gây bệnh

được xác định Ngoài ra còn có nhiều báo cáo về các đột biến gen nhân làm thay đổi protein trong chuỗi hô hấp của ty thể gây nên bệnh ty thể Những nghiên cứu này làm sáng tỏ cơ chế phân t của bệnh ty thể, đặc biệt tập trung vào các khuyết tật di truyền mtDN , hệ quả chức năng đặc trưng của đột biến mtDN nhằm mang lại sự tiến bộ về phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ty thể

1.2.2.1 Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and

stroke-like episodes) là hội chứng n o giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai

biến mạch, được di truyền từ mẹ sang con Bệnh có ảnh hưởng đến nhiều hệ thống của cơ thể, đặc biệt là n o bộ, hệ thần kinh và cơ bắp Các dấu hiệu và triệu chứng của rối loạn này thường xuất hiện ở trẻ em sau một thời gian phát triển bình thường, có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi Triệu chứng của bệnh bao gồm yếu cơ, đau cơ, đau đầu, nôn, và co giật, một số cá nhân có thể bị đột quỵ trước tuổi 40 Bệnh tiến triển có thể là liệt n a người, bất thường về thị giác, co giật và nhức đầu nghiêm trọng, những lần đột quỵ lặp lại làm tổn thương n o dẫn đến mất thị lực, mất chức năng trí tuệ [6, 56]

Hầu hết bệnh nhân MEL S đều bị tích tụ acid lactic trong cơ thể dẫn đến nhiễm toan làm nôn m a, đau bụng, rất mệt mỏi, yếu cơ và khó thở Một số trường hợp MEL S co thắt cơ không tự chủ, giảm thính lực, bệnh tim và thận, tiểu đường, mất cân bằng nội tiết tố [40]

Nguyên nhân là do một trong các loại đột biến 3243G, A3251G, T3271C,

T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu; đột

biến G13513 , 12770G và 13514G trên gen MT-ND5 mã hóa cho ND5

ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I, G583 trên gen MT-TF mã hóa cho tRNAPhe, G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal, A5814G trên gen MT-TC

mã hóa cho tRNACys Trong đó, đột biến 3243G chiếm 80% số ca mang hội chứng MEL S, tiếp theo là đột biến T3271C xảy ra khoảng 7,5% [16] MEL S có thể gây

ra bởi các đột biến điểm mtDN ở các gen khác như COXIII, ND1, ND5 hoặc gen

mã hóa tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, rRNA hoặc mất đoạn với kích thước ngắn Tuy nhiên, đột biến trên tRNALeu vẫn là đột biến phổ biến nhất liên quan đến kiểu hình MELAS Trong số đó, đột biến 3243G được báo cáo đầu tiên trên gen m hóa cho tRNALeu và là đột biến phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc [1] Như vậy, đột biến 3243G là một chỉ tiêu quan trọng để chẩn đoán hội chứng MEL S ngoài các kiểm tra lâm sàng

Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội

chứng liệt cơ mắt ngoài tiến triển do rối loạn chức năng ty thể, thường gặp ở người lớn Triệu chứng điển hình của bệnh là liệt cơ mắt, sa mí mắt, rối loạn tâm thần và đột t

CPEO là một bệnh tiến triển chậm, có thể bắt đầu ở mọi lứa tuổi và tiến triển trong khoảng thời gian 5 đến 15 năm Các triệu chứng đầu tiên xuất hiện thường là mí mắt sụp xuống làm giảm giới hạn vận động của mắt, hạn chế tầm nhìn của mắt, và tổn thương giác mạc Bệnh nhân thường s dụng cơ trán để giúp nâng mí mắt nên có thể xảy ra teo các nhóm cơ trên mặt, khó khăn trong việc nhai, một số bệnh nhân đục thủy tinh thể, suy giảm thính giác, đau thần kinh sợi trục, mất điều hòa co cơ, Parkinson [56]

CPEO là tình trạng bệnh gây nên bởi những khuyết tật trong ty thể làm ảnh hưởng đến quá trình phosphoryl oxy hóa trên chuỗi hô hấp tế bào Trong một số trường hợp, đột biến ở gen MT-TL1 trên mtDN gây nên CPEO Nguyên nhân của bệnh là do đột biến 3243G nằm trên gen m hóa tRN Leu(UUR)

và đột biến T4274C nằm trên gen m hóa tRN Ile Mất đoạn mtDN là nguyên nhân quan trọng gây nên hội chứng CPEO, những mất đoạn có kích thước 3,4 đến 6,9 kb với mức độ không đồng nhất dao động trong khoảng 18,8 đến 85,5% cho thấy các biểu hiện lâm sàng khác nhau Một nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể ở Malaysia cho thấy rằng độ dài, vị trí mất đoạn và mức độ không đồng nhất đóng vai trò quan trọng trong việc xác định kiểu hình lâm sàng của bệnh nhân CPEO, hai bệnh nhân nặng được tìm thấy mất đoạn mtDN có kích thước 4320 bp và 4717 bp Bệnh nhân CPEO có thể mang đột biến điểm, bao gồm các đột biến trên tRN Leu, tRNAIle

và tRNAAsp Mặt khác, các đột biến gen POLG, SLC25 4 và C10orf2 trên DN nhân cũng là nguyên nhân gây bệnh, những gen này rất quan trọng để bảo vệ mtDN Mặc dù cơ chế chưa rõ ràng, nhưng đột biến bất kỳ trong 3 gen này đều dẫn đến mất đoạn lớn trên mtDN , dao động từ 2-10 kb [17]

1.2.2.2 Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein

Hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)/NARP

(neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos)

Hội chứng Leigh và N RP (yếu cơ do thần kinh, mất điều hòa và viêm sắc tố võng mạc) là một phần của chuỗi các rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển gây ra bởi sự bất thường của chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể [53]

Hội chứng Leigh đặc trưng bởi tình trạng thoái hóa thần kinh tiến triển, trong đó đặc biệt ảnh hưởng đến n o, n o trung gian và hạch thần kinh, thường dẫn đến t vong do suy hô hấp Các dấu hiệu đầu tiên ở trẻ mắc hội chứng Leigh

là nôn m a, tiêu chảy, khó nuốt dẫn đến ăn uống kém, không phát triển, giảm trương lực cơ, co cơ không kiểm soát, mất cảm giác và yếu ở các chi, triệu chứng phổ biến là c động khó khăn Một số cá nhân liệt cơ mắt, teo dây thần kinh thị giác, phì đại cơ tim Ngoài ra, khó thở thường gặp ở những người mắc hội chứng Leigh dẫn đến suy hô hấp, hoặc sự tích tụ lactate trong cơ thể đo được ở máu, dịch n o tủy và nước tiểu [56]

N RP được đặc trưng bởi yếu cơ do thần kinh gây mất cảm giác thần kinh, mất điều hòa và bệnh võng mạc sắc tố Triệu chứng khởi phát là mất điều hòa vận động và trí tuệ chậm phát triển, thường xuất hiện ở trẻ em Một số bệnh nhân N RP

có thể tương đối ổn định trong nhiều năm, nhưng có thể bị xuống cấp từng đợt, thường có biểu hiện rõ ràng khi kết hợp với các bệnh do virus [66]

Hầu hết các đột biến gen ty thể gây ra hội chứng Leigh được báo cáo là trên các gen MT-ATP6, MT-ND3 và MT-ND5, một vài đột biến được xác định trên các gen MT-ND2, MT-ND6 và MT-ND4 Ngoài ra, còn có trường hợp trên gen liên

quan đến quá trình tổng hợp protein, đó là gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal

, gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu, gen MT-TW mã hóa cho tRNATrp và gen MT-TK

mã hóa cho tRNALys MT- TP6 là gen duy nhất bị đột biến gây N RP [66]

Trong các trường hợp của hội chứng Leigh, đa số các đột biến nằm trên gen MT-ATP6, đặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C Sự biến đổi T thành G tại 8993 trong mtDN người là một trong các đột biến ty thể kèm theo hội chứng Leigh được mô tả nhiều nhất Đột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí 156 trên TPase 6 của ty thể, một trong hai tiểu đơn vị của tiểu phần Fo của phức hệ TPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng hợp TP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc oxy tự

do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [53]

Hội chứng Leigh còn liên quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫn đến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124 ND5 là gen chức năng gồm

1812 bp (từ vị trí 12337 tới 14148) được m hóa bởi chuỗi nặng của mtDN Sản phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ N DH-ubiquinon oxidoreductase Sản phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nước của phức hệ I Protein này là một trong 7 tiểu phần được m hóa bởi mtDN trong số 42 tiểu phần của phức hệ I của chuỗi hô hấp Đột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnh trong đó có LHON, Leigh và MEL S [61]

Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt thần

kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây hội chứng teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt Bệnh thường phát triển ở tuổi trưởng thành, tỷ lệ ảnh hưởng của nam giới cao hơn 4 đến 5 lần so với nữ giới Người mang bệnh ban đầu hoàn toàn không có biểu hiện cho đến giai đoạn phát triển thị giác làm mờ một mắt, mắt còn lại biểu hiện tương tự sau 2 - 3 tháng, khoảng 25% bệnh nhân khởi phát bệnh với 2 mắt ở cùng thời điểm Thị lực giảm nghiêm trọng đến mức không thể đếm được ngón tay hoặc kém hơn nữa Sau giai đoạn cấp tính, đĩa quang trở nên teo Bất thường về thần kinh như run chân tay, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh cơ và rối loạn vận động được báo cáo là thường gặp ở bệnh nhân LHON, ở nữ giới có thể phát triển triệu chứng đa xơ cứng [69]

Khoảng 95% trường hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778 trên gen ND4 (50-70% trường hợp), đột biến G3460 trên gen ND1 (15% trường hợp) và đột biến T14484C trên gen ND6 (10% trường hợp) Đột biến G11778 là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác liên quan đến gen ND5 và ND6 [3]

Các đột biến trên gen ND6 bao gồm T14484C, T14459C, các đột biến này không những gây ra các triệu chứng của hội chứng LHON mà còn gây ra hội chứng Leigh Đột biến G14453 cũng trên gen này, tác động lâm sàng phức tạp hơn, kèm theo các triệu chứng của LHON còn có các biểu hiện của MEL S

LHON thường là do một đột biến mtDN homoplasmy và các con sẽ kế thừa các đột biến từ mẹ Tuy nhiên khoảng 50% nam giới sẽ biểu hiện bệnh, trong khi chỉ có 10% nữ giới bị mất thị giác Sự tiến triển của bệnh phụ thuộc vào gen đột biến, 71% bệnh nhân đột biến T14484C có dấu hiệu phục hồi, trong khi đó ở bệnh nhân 11778G chỉ là 25% Phần lớn các bệnh nhân mang đột biến 11778G sớm khởi phát triệu chứng LHON, đ có một vài báo cáo về kiểu hình suy thoái thần kinh thị giác [69]

1.2.2.3 Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA

Bệnh do đột biến trên gen m hóa rRN chiếm tỷ lệ rất nhỏ Đột biến 1555G

và C1494T được phát hiện trên gen m hóa cho rRN 12S, các đột biến này gây mất khả năng nghe do kích thích bởi aminoglycoside và mất khả năng nghe không

có hội chứng Trong đó, đột biến 1555G phổ biến hơn C1494T

Đột biến 1555G là đột biến điểm mtDN nằm trên gen MT-RNR1, quy dịnh

sự tổng hợp 12S rRN Đột biến này nằm trên vị trí m hóa tiểu đơn vị rRN và được dự đoán gây ra một sự thay đổi trong cơ cấu thứ cấp của rRN Sự thay đổi này làm suy yếu tổng hợp protein và tăng cường tương tác với kháng sinh aminoglycoside, tiếp tục làm trầm trọng hơn tình trạng bệnh [2] Đột biến đơn thuần thường không dẫn đến tình trạng bệnh lý, nhưng khi kết hợp với các yếu tố môi trường như kháng sinh nhóm aminoglycoside sẽ biểu hiện triệu chứng bệnh

điển hình, thường quan sát được là mất thính lực ở các mức độ khác nhau Đột biến 1555G thường ở dạng đồng nhất nhưng biểu hiện triệu chứng bệnh của các thành viên trong gia đình là rất khác nhau Trong một nghiên cứu cũng chỉ ra rằng biểu hiện của bệnh chịu ảnh hưởng của việc s dụng kháng sinh amimoglycoside với 96,5% ở nhóm tuổi 30 điều trị kháng sinh và 39,9% với nhóm không điều trị kháng sinh [7]

Đột biến khác trên gen rRN 12S là T1095C, gây nên sự thay đổi base bảo thủ

ở vòng xoắn 25 của rRN 12S Nucleotide này nằm ở vị trí P của ribosome, có vai trò quan trọng trong giai đoạn khởi đầu của quá trình tổng hợp protein của ty thể

Sự thay đổi cấu trúc bậc ba của rRN 12S làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein, vì vậy dẫn đến mất chức năng của ty thể và gây ra mất khả năng nghe

1.2.2.4 Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA

Hội chứng Kearns-Sayre (KSS) là bệnh liên quan đến sự phát triển sắc tố

võng mạc và liệt cơ mắt ngoài tiến triển, thường khởi phát trước tuổi 20 Nguyên nhân là do mất đoạn mtDN khoảng 2-4 kb, thường là 4997 bp từ vị trí 8488-

13460, tại điểm đứt g y thường có một đoạn 13 bp lặp lại Ngoài những triệu chứng nhược cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, thoái hóa sắc tố võng mạc, bệnh nhân thường có các biến chứng bao gồm thất điều tiểu n o, suy giảm nhận thức và điếc, tắc nghẽn

cơ tim, dáng người thấp bé, nuốt khó [56]

Hội chứng Pearson là một rối loạn hiếm gặp, thường khởi phát trong những

năm đầu đời, đặc trưng bởi thiếu máu hồng cầu, tủy xương và suy tụy ngoại tiết Diễn biến lâm sàng ở trẻ em có thể nặng dẫn đến t vong sớm, những trường hợp sống sót thường có biểu hiện thiếu máu sau đó phát triển các đặc điểm lâm sàng của KSS Bệnh thường được xác định là do mất đoạn mtDN quy mô lớn, có mặt

ở tất cả các mô [65]

Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển (progressive external ophthalmoplegia-

PEO) được đặc trưng bởi sự suy yếu của các cơ mắt, thường xuất hiện ở độ tuổi 18 -

40 Dấu hiệu phổ biến và khác so với bệnh liệt mắt tiến triển kinh niên (CPEO) như

nhược cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, rách cơ Nguyên nhân gây bệnh là những khuyết tật trong ty thể, hay gặp ở các rối loạn mất đoạn mtDN quy mô lớn, trong một số trường hợp là đột biến gen MT-TL1 Mặt khác, các đột biến gen nhân POLG, SLC25 4 và C10orf2 cũng là nguyên nhân gây nên bệnh này Các nghiên cứu gần đây chưa chứng minh được sự tương quan giữa kích thước và vị trí đoạn mtDN bị mất với mức độ biểu hiện của bệnh [54]

Bệnh Parkinson/hội chứng MELAS gối nhau do đột biến mất đoạn TT

bắt đầu ở vị trí 14787 của gen CYTB Bệnh nhân biểu hiện rối loạn tiến triển nặng, bắt đầu từ 6 tuổi với biểu hiện khó phối hợp và tập trung vận động Sau này, bệnh nhân thể hiện hội chứng Parkinson, rung giật cơ và nhồi máu n o [24]

Mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xảy ra ở vùng không m hóa nằm giữa gen m

cho cytochrome oxidase II (COII) và tRNALys trong hệ gen ty thể Vùng không m hóa gồm hai trình tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp từ vị trí 8272-8289 trên hệ gen

ty thể Hiện tượng mất đoạn 9 bp được xem là một dạng đột biến của hệ gen ty thể

và có tỷ lệ cao ở các quần thể người châu bao gồm Trung Quốc (15%), Việt Nam (20%), Thái Lan (29%) và Nhật Bản (20%) [62]

Đột biến mất đoạn xuất hiện do những sai hỏng trong quá trình tái bản không được s a chữa hoặc do quá trình sao chép bị lỗi Vì vậy, mất đoạn 9 bp có lẽ xuất hiện như kết quả của một lỗi không được s a chữa trong quá trình sao chép của mtDNA Hiện tượng mất đoạn 9 bp được xem xét trên hai phương diện đó là nguồn gốc tiến hóa và mối liên quan giữa mất đoạn 9 bp với bệnh tật đặc biệt là các rối loạn ty thể

Ngoài ra, một số bệnh ty thể còn liên quan đến sự đảo đoạn Nghiên cứu đầu tiên về một đột biến đảo đoạn trong mtDN gây bệnh cơ được phát hiện bởi Musumeci và tập thể vào năm 2000 [41] Bệnh nhân được phát hiện mang đột biến đảo đoạn 7 nucleotide (ACCTTGC thành GC GGT) ở vùng 3902-3908 thuộc gen

mã hóa cho ND1 của N DH ubiquinone oxidoreductase Đột biến đảo đoạn này

dẫn đến thay thế 3 acid amin (D199G, L200K, và A201V) có tính bảo thủ cao trong chuỗi polypeptide, là đột biến ở dạng không đồng nhất 80% và được phát hiện trong

cơ nhưng không có trong máu bệnh nhân Sự thay đổi 3 acid amin liên tiếp từ Leu-Ala thành Gly-Lys-Val, liên quan đến một vùng bảo thủ cao của gen ND1 có vai trò quan trọng trong việc gắn ubiquinone

sp-1.3 HỘI HỨ G ĐỘ G I H, GIẬT VỚI SỢI HÔ G ĐỀU

(MERRF)

Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liên quan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên được mô tả Sau đó các trường hợp khác tiếp tục được mô tả, Fukuhara và cộng sự [28] đ đưa ra các tính năng cơ bản của bệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều được gọi là hội chứng MERRF Bệnh nhân MERRF được chẩn đoán bởi các tiêu chí: rung giật cơ, động kinh, thất điều tiểu n o, sinh thiết cơ cho thấy sợi cơ đỏ bị rách Mặc dù đó là những biểu hiện chính nhưng thực tế lâm sàng tìm thấy nhiều bệnh nhân MERRF

có triệu chứng không đồng nhất, có thể gặp bệnh nhân điếc, không chịu được vận động, mất trí nhớ, u mỡ đối xứng, bệnh sắc tố võng mạc [15, 37]

Hội chứng lần đầu tiên được mô tả là do đột biến 8344G trên gen m hóa cho tRNALys của ty thể [13, 20, 42] Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do

đột biến 8344G, T8356C và G8363 nằm trên gen MT-TK mã hóa cho tRNALys

hô hấp trong ty thể Từ đó, ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là các phức hợp I (N DH dehydrogenase) và IV (cytochrome c oxidase) [10, 20, 33] Đột biến 8344G được di truyền độc lập từ mẹ sang con và thường tồn tại ở dạng không đồng nhất, nhưng mức độ phân bố của thể đột biến rất khác nhau giữa các cá thể và các mô trong cùng một cá thể [10] Một nghiên cứu cho thấy rằng ở một phụ nữ có tỷ lệ bản sao ty thể mang đột biến 8344G trong cơ xương là 94%, trong máu là 38%, trong nước tiểu là 18%, còn mẹ của bệnh nhân có 16% gen đột biến trong máu và 18% trong nước tiểu, còn em gái có tỷ lệ đột biếntrong máu là 3% và trong nước tiểu là 4% Định lượng được tỷ lệ gen đột biến nhằm xác định mức độ ảnh hưởng của bệnh đến cá thể mang đột biến Tỷ lệ đột biến A8344G có tương quan với sự giảm tổng hợp protein, giảm tiêu thụ oxy và thiếu cytochrome c oxidase, cũng như các polypeptid lớn và giàu lysine bị ảnh hưởng nặng nề gợi ý rằng các đột biến MERRF trực tiếp hạn chế quá trình tổng hợp protein của ty thể Hơn thế nữa, stress oxy hóa và oxy hóa trên các mô bị ảnh hưởng bởi thiếu chuỗi hô hấp dẫn đến sự tiến triển các triệu chứng của bệnh ty thể [30]

Mặc dù được mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứng MERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ rách nham nhở nhưng đột biến 8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất Một nghiên cứu ở người phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứng MERRF còn có nhiều triệu chứng khác như suy hô hấp và loạn dưỡng cơ Một số trường hợp biểu hiện tầm vóc ngắn, mất thính lực, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh

cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gen đột biến 8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thể biểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh, rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30]

1.3.1.2 Đột biến T8356C

Hội chứng MERRF thường được biết đến với đột biến 8344G, nhưng không quan sát thấy trong khoảng 10 - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu

biểu của hội chứng MERRF Một nghiên cứu giải trình tự gen tRN lys

của năm bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng được xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh), mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền s gia đình tương thích với sự kế thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy tăng hàm lượng acid lactic, sinh thiết cơ cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách Kết quả cho thấy có sự thay đổi nucleotide tại vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base được bảo tồn trong phân t mtDN gốc [51]

Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356C cũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhưng sự phân bố của gen đột biến cũng rất khác nhau, kết quả phân tích trên 1 bệnh nhân mang đột biến trong cơ là 100% còn trong máu là 47% Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này cũng khá phức tạp, có bệnh nhân xuất hiện triệu chứng rung giật cơ, động kinh, điếc và đột quỵ giả tai biến giống như hội chứng MEL S [6]

Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa (OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biến G8363 gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gen tRNAlys Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hưởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp

của tế bào, ảnh hưởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thường trong nguyên bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363 [45, 49, 57]

Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến 8363G cũng không đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính giác, nhiều u mỡ, được chẩn đoán giống hội chứng Leigh

1.3.2 hững tác động của hội chứng ERRF trên người bệnh

Những đột biến gây MERRF làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo

ra các protein, s dụng oxy và sản xuất năng lượng Những đột biến này ảnh hưởng đến các cơ quan và các mô với nhu cầu năng lượng cao như n o và cơ Bệnh thường biểu hiện trong các mô và dễ dàng phát hiện trong mtDN từ bạch cầu trong máu [37] Tuy nhiên, sự xuất hiện của dạng không đồng nhất có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện ở các mô mang đột biến Do đó những người có triệu chứng ít phù hợp với MERRF có thể không được phát hiện từ bạch cầu mà chỉ phát hiện ở các mô khác như nguyên bào sợi da nuôi cấy, niêm mạc miệng, nhưng đáng tin cậy nhất

là phát hiện từ các tế bào cơ xương [38]

Hội chứng MERRF thường được chẩn đoán lâm sàng dựa trên các triệu chứng tăng nồng độ lactate, pyruvate trong máu và trong dịch n o tủy Protein dịch n o tủy có thể tăng lên trong hội chứng MERRF Kỹ thuật chụp ảnh n o như hình ảnh cộng hưởng từ có thể tìm thấy các tổn thương như đột quỵ Điện tâm đồ

có thể được s dụng để chẩn đoán bất thường về tim Bảng 1.1 liệt kê các triệu chứng và dấu hiệu thấy được trong 62 bệnh nhân mang đột biến MERRF [70] Các đặc điểm lâm sàng thường gặp nhất có tỷ lệ tương ứng là: giật cơ, yếu cơ, mất điều hòa (35 - 45%); động kinh tổng quát, mất thính lực (25,0 - 34,9%); suy giảm nhận thức, nhiều u mỡ, bệnh thần kinh, không dung nạp tập thể dục (15,0 - 24,9%); tăng CK, teo dây thần kinh thị giác, teo cơ, suy hô hấp, tiểu đường, đau

cơ, run, và chứng đau n a đầu (5,0 - 14,9%) [70]

Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF [70]

Biểu hiện lâm sàng Tần số xuất hiện Tỷ lệ %

Phát triển ban đầu bình thường 17/17 100%

từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên Vì vậy việc phân tích mtDN là quan trọng

ở nhiều trường hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng

1.3.3 ác phương pháp phát hiện đột biến ERRF

1.3.3.1 Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP

Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DN được phân cắt giới hạn Phương pháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phân cắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DN Sự thay đổi về trình tự nucleotide của DN dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho các đoạn DN bị phân cắt có kích thước khác nhau, có thể nhận biết được dựa trên phổ băng khi điện di Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DN tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn

DN khi được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu Hiện tượng này đ tạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DN mà khi điện di chúng trên gel thì có thể phát hiện được các đột biến [25, 30, 45]

Kỹ thuật RFLP đ trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reation) PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu của

DN và khả năng kéo dài chuỗi của DN polymerase để nhân bản các đoạn DN khác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu DN polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn - mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì

sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn Vì vậy, để nhân bản được đoạn

DN đích, người ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu Đây là một kỹ thuật rất nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DN khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứng cũng có thể diễn ra

Việc kết hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phát hiện các đột biến

di truyền, trong đó có đột biến điểm trên gen ty thể PCR-RFLP là công cụ chẩn đoán sớm được s dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong mtDN Phương pháp này bao gồm các bước chính sau: (1) đoạn mtDN chứa vị trí đột biến được khuếch đại nhờ các đoạn mồi được thiết kế đặc hiệu; (2) sản phẩm PCR được phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn DN cắt được