Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

82 PHỤ LỤC ĐỀ TÀI 83 Báo cáo tình hình sử dụng và Quyết toán kinh phí Bản thuyết minh đề cương đề tài Quyết định của Bộ trưởng về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác khoa học Công văn

ViiÖn khoa häc

vµ c«ng nghÖ viÖt nam

Bé khoa häc

vµ c«ng nghÖ ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc

-

V.KHCNVN V.CNSH

C¬ quan chñ tr×: ViÖn C«ng nghÖ sinh häc

C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam

Thêi gian thùc hiÖn: 2002 - 2005

Hµ Néi, 2006

Lời cảm ơn

Trong khuôn khổ hợp tác song phương về khoa học và công nghệ giữa

CHLB Đức và Việt Nam thì lĩnh vực công nghệ sinh học được chú trọng

như một lĩnh vực ưu tiên Tuy nhiên, hầu hết các nội dung hợp tác giữa

các đối tác Việt Nam và đối tác Đức nổi bật vẫn là những nội dung nặng về

chuyển giao công nghệ và đào tạo nguồn nhân lực

Lần đầu tiên trong lĩnh vực công nghệ sinh học có một đề tài mà cả hai bên

đối tác đều muốn tập trung khai thác những thành tựu mới nhất của thế

giới về Giải mã genom cây lúa nước Đó cũng là lý do vì sao một quốc gia

như Đức, không trồng một cây lúa nước nào ở ngoài đồng ruộng tự nhiên

mà lại quan tâm đến những nghiên cứu rất cơ bản về cây lúa nước

Vì thế việc xây dựng một đề tài đối ứng với một Viện đầu ngành về sinh

học phân tử thực vật như Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử,

Golm là một cơ hội lớn cho Viện Công nghệ sinh học nhằm học hỏi cách

thức tiếp cận tiến hành nghiên cứu khoa học tân tiến

Chủ nhiệm đề tài xin trân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ Liên bang về Đào tạo và nghiên

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic axít

ADC Arginindecarboxylase

APS Ammonium persulfate

RNAse RNA polymerase

ATP Adenosine triphosphate

BSA Bovine serum albumin

Bc Bacillus cereus

Bt Bacillus thuringiensis

CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor

cDNA Complementary DNA

CHLB Cộng Hoà Liên Bang

DNAse DNA polymerase

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

Et-Br Ethidium Bromide

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry

GC-TOF-MS Gas Chromatograph/time-of-flight mass spectrometers

GCN Guanidium thiocyanate

GUS β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase

HSK Homoserine kinase

HPLC High Performance Liquid Chromatography = sắc ký lỏng cao áp

IRRI International Rice Research Institute = Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

IPTG Isopropylthio-o-D-galactoside

Kb Kilobase

KDa Kilo dalton

KN&CN Khoa học và Công nghệ

Km Kanamycine

LB Luria và Bertani

mRNA Messenger RNA

MPI Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck

MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog

MST Mass Spectral Target = Chất mục tiêu

NCS Nghiên cứu sinh

NhaA Na+/H+ antiporter

NOS-P Nopaline Synthase Promotor

nptII Neomycine phosphotransferase II gene=Gen mã hoá neomycine phosphotransferase II

OAT Ornithine Aminotransferase

OD Optical density

PA Polyamin

PAM Chlorophyll Fluorometers to measuring systems of plant Gas Exchange = Hệ

thống đo huỳnh quang diệp lục PAO Polyaminoxidase

PCR Polymerase Chain Reaction

PGS.TS Phó Giáo sư Tiến sĩ

Q A, Q B Quinon A, Quinon B

RNA Ribonucleic axít

RT-RT-PCR Real Time-Reverse Trascription-Polymerase Chain Reaction = PCR định lượng SAMDC S-Adenosylmethionin-decarboxylase

SAT Serine acetyltransferase

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis = Điện di biến tính

trên gel polyacrylamide SPD Spermidinsynthase

T-DNA Transfer-DNA = DNA chuyển

TF Transcription factor = Yếu tố điều khiển phiên mã

Ti-plasmit Tumor inducing plasmid = Plasmit gây khối u thực vật

Vip Vegetative insecticidal protein = protein sinh dưỡng diệt côn trùng

Vir Virulence Region = Vùng gây độc có khả năng tạo khối u

X-gal 5-bromo-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

MỤC LỤC

BÀI TÓM TẮT 1

LỜI MỞ ĐẦU ……… 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ……… 5

1.1 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước ……… 5

1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước ……… 6

1.3 Mục tiêu của đề tài 7

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 8

2.1 Đối tượng và thiết bị nghiên cứu 8

2.1.1 Các giống lúa 8

2.1.2 Các thiết bị chính 9

2.2 Nội dung nghiên cứu ……… … 9

2.2.1 Tìm kiếm và phân lập các gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA ……… 9

2.2.2 Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và muối bằng phổ phiên mã RNA 10

2.2.3 Kỹ thuật sao chép gen ……… 10

2.2.4 Kỹ thuật phân tích phổ chất bằng sắc ký khí/quang phổ khối 11

2.2.5 Tối ưu phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa Việt Nam 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu ……… 12

2.3.1 Phương pháp sinh lý học thực vật ……… 12

2.3.2 Phươn g pháp sinh học phân tử thực vật ……… 18

2.3.3 Phương pháp phân tích ……… 22

2.3.4 Phương pháp biến nạp gen vào cây lúa ……… 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……… 31

3.1 Vai trò của Polyamin đối với tính chịu hạn và chịu mặn ……… 31

3.1.1 Đánh giá tính chịu mặn ……… … 31

3.1.2 Đánh giá tính chịu hạn ……… 32

3.1.3 Phân tích polyamin và biểu hiện gen ……… 35

3.2 Xác định gen điều khiển mới kiểm soát tính chịu mặn và chịu hạn 39

3.2.1 Thiết lập ……… 39

3.2.2 Xây dựng phương pháp 41

3.2.3 Xử lý hạn 41

3.2.4 Xử lý muối 41

3.2.5 Xây dựng ngân hàng dữ liệu về Tác nhân phiên mã ở lúa 47

3.3 Các chất trao đổi trong rễ ở trạng thái ổn định và chuyển trạng thái khi bị xử lý stress 47

3.3.1 Xây dựng phương pháp nuôi trồng và chuyển gen lúa ở các giống thuộc loài phụ Indica … 47 3.3.2 Xử lý hạn ……… 47

3.3.3 Xử lý muối ……… 48

3.3.4 Thiết lập một ngân hàng các chất trao đổi của lá và rễ lúa khi phân tích phổ …… 48

3.3.5 Xác định bằng khối phổ các chất chưa biết 49

3.3.6 Xác định và phân tích chất chỉ thị khi xử lý mặn 50

3.3.7 Phân tích tương quan trong xác định chất chỉ thị ……… 51

3.3.8 Đề xuất bổ sung 55

3.4 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 55

3.4.1 Chuyển gen tăng cường khả năng chịu hạn và mặn 55

3.4.2 Chuyển gen cải thiện thành phần aminoacid trong lúa gạo 56

3.4.3 Đề xuất bổ sung 66

CHƯƠNG 4 TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC 68

41 Kết quả về khoa học 68

4.2 Kết quả nổi bất và khả năng áp dụng 70

4.3 Trình độ công nghệ 72

4.4 Khả năng áp dụng 72

4.5 Đào tạo 74

4.6 Sản phẩm khoa học của đề tài 75

4.7 Hợp tác quốc tế 76

4.8 Tình hình sử dụng kinh phí 76

4.9 Danh sách các công trình công bố 77

4.10 Hạn chế của đề tài 78

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79

5.1 Kết luận 79

5.2 Đề nghị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

PHỤ LỤC ĐỀ TÀI 83 Báo cáo tình hình sử dụng và Quyết toán kinh phí

Bản thuyết minh đề cương đề tài Quyết định của Bộ trưởng về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác khoa học

Công văn gia hạn sử dụng kinh phí đề tài Quyết định thành lập và Biên bản đánh giá của Hội đồng nghiệm thu cấp Cơ sở

Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí trong nước Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí quốc tế

Poster Danh sách các gen tìm được trong ngân hàng các dòng KO

So sánh trình tự các gen thiết kế với Genbank Danh sách các giống lúa làm nguyên liệu Trang web Ngân hàng dữ liệu về tác nhân phiên mã ở lúa Trang web của Viện IRRI - Phân loại khả năng chống chịu của các giống lúa theo tiêu

chuẩn của IRRI

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các giống lúa được sử dụng trong các nghiên cứu đề tài co nguồn gốc từ

các quốc gia khác nhau, chủ yếu là các giống của Việt Nam 8

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy trong chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens ……… 26

Bảng 3.1: Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa tham gia thí nghiệm tổng hợp theo IRRI trong điều kiện sử dụng nồng độ muối là 100mM NaCl (5,8 g/l), thí nghiệm 3 lần với 5 lần nhắc lại ……… 31

Bảng 3.2: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa Thí nghiệm với 5 lần nhắc lại Nhóm được phân theo mức 30% và 70% chênh lệch ……… 33

Bảng 3.3: Kết quả xử lý hạn nhẹ kéo dài và xử lý hạn khắc nghiệt ……… 53

Bảng 3.4: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa chuyển gen nhaA ……… 55

Bảng 3.5: Tiến độ chuyển các gen cải thiện chất lượng amino acid gồm Cystathionin gamma-Synthase (CGS), Serinacetyltransferase (SAT), Homoserinkinase (plastid, SSUHSK), Homoserinkinase (cytosolic, HSK) và Glucoronidase (GUS) của gạo vào cây lúa ……… 58

Bảng 3.6: Điều kiện thuỷ phân protein bằng lò vi sóng MAR5 ……… 64

Bảng 4.1: Báo cáo tóm tắt kết quả thực hiện từ 12/2001 - 12/2005 ……… 70

Bảng 4.2: Khả năng áp dụng của đề tài ……… 72

Bảng 4.3: Danh sách các học viên được đào tạo ……… 74

Bảng 4.4: Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ ……… 74

Bảng 4.5: Nội dung hợp tác quốc tế ……… 76

Bảng 4.6: Tình hình sử dụng kinh phí ……… 76

MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1: Hiện tượng dịch chuyển điện tử quang hợp trong các tâm phản ứng của hệ

quang hóa II ……… ……… 14

Hình 2.2: Nguyên lý cường độ phát quang ……… 18

Hình 2.3: Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng ……… 19

Hình 2.4: Mẫu dò lai ……… ……… 20

Hình 2.5: Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe) ……… 20

Hình 2.6: Định lượng (I), xác định đột biến với hybrydzation probes (II), xác định đột biến với TaqMan probes (III), Định tính ví dụ xác định gen nào thuộc loài nào (IV) ……… 21

Hình 2.7: Cấu trúc vector pCAMBIA1300 dùng để thiết kế gen nhaA, OAT 21 Hình 2.8: Cấu trúc vector pCAMBIA1390/Ubill dùng để thiết kế gen CGS 22 Hình 2.9: Phân tích protein tổng số 22

Hình 2.10: Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ……… 23

Hình 3.1: Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 32

Hình 3.2: Các giống lúa được trồng trong phytotron 32

Hình 3.3: Lượng nước mất đi ở mỗi cây/ 1 ngày 33

Hình 3.4: Sự biến động về số nhánh/ cây, chiều dài lá, trọng lượng tươi, khô của các giống

34-35 Hình 3.5: Hàm lượng Putresine ở các giống xử lý mặn 35

Hình 3.6: Hàm lượng Spermidine và Spermine ở các giống xử lý mặn 36

Hình 3.7: Hàm lượng Putresine, Spermidine và Spermine ở các giống xử lý hạn 37

Hình 3.8: Hàm lượng Putresin đo được trong mẫu lá các giống lúa và sự thay đổi của chúng khi xử lý sau 14 ngày với các nống độ NaCl tăng dần từ 0 lên 50 và 100 mM 38

Hình 3.9: Biểu hiện của gen Arginindecarboxylase (ADC) trong 7 giống lúa có mức độ chịu mặn khác nhau ……… 39

Hình 3.10: Hiệu quả hoạt động của các cắp mồi dùng trong phản ứng RT-PCR khi nhân những đoạn gen điều khiển bằng RNA tách chiết từ lúa 39

Hình 3.11: Độ nhạy của phản ứng RT-RT-PCR với các mẫu RNA thu được từ thân (trái)

và rễ (phải) cây mạ 40

Hình 3.12: Đánh giá mức độ biểu hiện của gen điều khiển liên quan đến tính chịu mặn

trong cây lúa bằng kỹ thuật RT-RT-PCR với 6 cặp mồi đặc hiệu thiết kế theo

số liệu thu được từ ngân hàng gen cây lúa 40

Hình 3.13: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ

đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ

RNA cây mạ Biểu đồ phản ứng theo thời gian 41

Hình 3.14: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ

đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ

RNA cây mạ Biểu đồ tốc độ phản ứng 42

Hình 3.15: Hiệu quả hoạt động của các cặp mồi chuyên dụng dùng trong phản ứng

RT-RT-PCR khi đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều khiển bằng RNA tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý mặn 43

Hình 3.16: Tần suất lặp lại của kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều

khiển bằng RNA tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý nặm bằng phản ứng

RT-RT-PCR khi đánh giá 43

Hình 3.17: Sự phân bố tần xuất gen „cảm ứng do tiếp xúc“ ở các giống lúa tham gia thí

nghiệm tại điều kiện đối chứng không có muối vào thời điểm 30&180 phút 44

Hình 3.18: Sự phân bố tần xuất gen chịu tác động „cảm ứng“ và „ức chế“ bởi tác động

của mặn ở các giống lúa tham gia thí nghiệm tại điều kiện có muối (100 mM)

vào thời điểm 30 và 180 phút 45

Hình 3.19: Mức độ biểu hiện của những gen điều khiển hoạt động có tính đặc thù riêng

của giống khi chịu tác động mặn ……… 46

Hình 3.20: Tác động của mặn (NaCl) lên độ dẫn điện của dịch bào ở cây mạ hai giống

DR2 và Chàm khi bị xử lý các thời gian khác nhau từ 0 đến 24 h 47

Hình 3.21: Kho dữ liệu các phổ nhân tạo của các chất trao đổi từ cây mạ (lúa nước) xác

định bằng phương pháp GC-TOF-MS làm nguồn so sánh (bên trái) và phổ GC-TOF-MS của một mẫu đại diện (bên phải) 49

Hình 3.22: Glycine N,N-di(trimethylsilyl) -, trimethylsilyl ester được đánh dấu tại vị trí

C1 và C2 với đồng vị nặng 13 C, cũng như tại vị trí C2 với hai nguyên tử

Deuteri (D) 50

Hình 3.23: Biến động của hàm lượng Putrescine và Spermidine trong 4 giống lúa đối

chứng ……… 51

Hình 3.24: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều

kiện xử lý hạn nhẹ kéo dài 52

Hình 3.25: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều

kiện xử lý hạn khắc nghiệt 53

Hình 3.26: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II tại các ngày 0, 4, 5, 6, 7, 8 rút nước để hạn 54

Hình 3.27: Kết quả đo hiệu suất quang hợp (PAM) đối với mảnh lá của các giống lúa có mức độ chịu muối khác nhau theo thời gian xử lý tăng dần nồng độ NaCl …… 54

Hình 3.28: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa C71 chuyển gen nhaA 56

Hình 3.29: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen OAT bằng PCR 56

Hình 3.30: Sơ đồ vector chuyển gen pCAMBIA1390/Ubiqutin/SAT/HSK/CGS 57

Hình 3.31: Qui trình chuyển gen vào lúa giống Tapei 57

Hình 3.32: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu cho gen CGS được chuyển 59

Hình 3.33: Phổ 23 axit amin chuẩn xác định bằng RP HPLC 61

Hình 3.34: Phổ các hợp chất thiols chuẩn xác định bằng RP HPLC 62

Hình 3.35: Chu trình trao đổi chất methionine và các gen tham gia 62

Hình 3.36: Các mẫu RNA tổng số sau khi xử lý DNAse, không nhận được sự khuyếch đại nào sau 35 chu kỳ phản ứng 63

Hình 3.37: Nguyên tắc phân tích axit amin tổng số từ protein 64

Hình 3.38: Thành phần amino acid của protein chuẩn BSA và của protein gạo toàn phần 65

Hình 3.39: Kết quả chiết rút protein gạo bằng các dịch đệm khác nhau và phân tích trên điện di PAGE (trên) và định lượng bằng Bradford (dưới) 66

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN CHÍNH

STT Họ và tên Học hàm, học vị Cơ quan

1 Lê Trần Bình PGS.TS Viện Công nghệ sinh học

2 Nông Văn Hải PGS.TS Viện Công nghệ sinh học

3 Trần Phương Liên TS Viện Công nghệ sinh học

4 Lê Thị Thu Hiền TS Viện Công nghệ sinh học

5 Phan Văn Chi PGS.TS Viện Công nghệ sinh học

6 Nguyễn Thu Hà ThS Viện Công nghệ sinh học

7 Nguyễn Thị Tỵ CN Viện Công nghệ sinh học

9 Lê Xuân Đắc ThS Viện Công nghệ sinh học

10 Lê Văn Sơn TS Viện Công nghệ sinh học

11 Nguyễn Phương Thảo ThS Viện Công nghệ sinh học

12 Nguyễn Thị Hồng Châu ThS Viện Công nghệ sinh học

13 Ellen Zuther TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

14 A Heyer TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

15 Bernd Müller-Röber TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

16 Joachim Kopka TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

17 L Willmitzer GS.TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

18 Rainer Höfgen TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

19 Nguyễn Hữu Cường NCS Viện CNSH tại Viện MP và SLTVPT

20 Đỗ Thị Phúc NCS Trường ĐHKHTN tại Viện MP và SLTVPT

DANH SÁCH CÁC CƠ QUAN PHỐI HỢP THỰC HIỆN

STT Cơ quan phối hợp Nội dung phối hợp

1 Đại học Tổng hợp Greifswald Đào tạo NCS

2 Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử Đào tạo NCS, nâng cao trình độ cán bộ

khoa học, trao đổi và phân tích mẫu

BÀI TÓM TẮT

Đề tài “Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng

công nghệ sinh học thực vật” được thực hiện phối hợp giữa Viện Công nghệ sinh

học, Việt Nam với Viện Max Planck về Sinh học Phân tử thực vật, CHLB Đức do sự chủ trì của PGS.TS Lê Trần Bình nhằm mục tiêu nâng cao tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

Trong khuôn khổ nghiên cứu, đề tài được thực hiện và thu được những kết quả chính sau đây:

Các kết quả nghiên cứu khoa học

1 Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân

và lưu giữ tại Viện Công nghệ sinh học

2 Tổng số 33 giống lúa trong đó có 29 giống Indica có nguồn gốc từ Việt Nam

và 4 giống Japonica đối chứng được đưa vào nghiên cứu đánh giá khả năng

chịu hạn và chịu mặn thông qua đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, xác định hàm lượng polyamin; mối tương quan giữa hàm lượng polyamin và khả năng chống chịu hạn, mặn; đánh giá mức độ biểu hiện các gen điều khiển các gen cảm ứng khi xử lý hạn và mặn, các chất trao đổi trong rễ và trong lá

3 Hoàn thiện và tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các giống lúa phù hợp với điều kiện ở Việt Nam Kết quả xử lý mặn thu được 5 giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển, IR57311, Cườm và Nước mặn), 7 giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp mặn, Đốc phụng, C71 và Cha va) và 6 giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua, Taipei và Nipponbare) Kết quả xử lý hạn thu được 7 giống chịu hạn khá tốt (CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh, IR57311, C70, LC-93-1 và Nếp mèn), 7 giống chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa mặn, Lốc dâu, K.lúa nương) và 7 giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom, Songhua, Nipponbare)

4 Kết quả xử lý mặn cho thấy (i) Giữa các nhóm có sự khác biệt rất rõ về hàm

lượng polyamin, (ii) Các giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn hẳn, (iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả năng chịu mặn, (iv) Hàm lượng Putrescine tăng lên khi xử lý với nồng độ NaCl tăng dần Hoạt động của enzym Arginindecarboxylase (ADC) ở những giống mẫn cảm tăng lên rất rõ rệt Thí nghiệm chuyển các gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin đang được tiến hành

5 Một ngân hàng dữ liệu về các gen điều khiển phiên mã (TF) với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa và sắp xếp thành 44 họ gen khác nhau, được hoàn thành và công bố trên http://ricetfdb.bio.uni-potsdam.de Thông qua việc thiết

kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu và tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đã đánh giá được mức độ biểu hiện của các đoạn gen điều khiển khi cây mạ bị xử lý mặn tại hai thời điểm Kết quả cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 và

hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần hoặc kích thích hoặc ức chế thì ở hai giống nghiên cứu là Chàm và DR2 có đến 12%, tức là 313 gen trong số 2512 gen được coi là cảm ứng hoặc ức chế do mặn

6 Đối với cây mạ, 132 MSTs đã được xác định Trong đó có 109 chất thuộc các chất trao đổi sơ cấp, một số chất bị biến đổi thành 2 hoặc nhiều dẫn xuất hóa học

do hóa chất sử dụng trong kỹ thuật GC-MS Tuy nhiên, 148 MSTs của cây mạ chưa được xác định Khẳng định được những chất trao đổi như Spermidine và Putrescine trong rễ và lá lúa khi bị xử lý hạn và mặn có những thay đổi rất đáng

kể

7 Hệ thống nuôi cấy mô tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu ban đầu là hạt lúa chín (thay vì phôi non rất khó chủ động) đã được thiết lập Chuyển được gen CGS và các gen khác như Serinacetyltransferase, Homoserinkinase và Homoserinkinase (cytosolic) nhằm cải thiện thành phần axít amin trong gạo của các giống lúa Việt Nam đang được thực hiện Bước đầu thu được các dòng cây chuyển gen phục vụ cho các phân tích tiếp theo

8 Để có thể định lượng chính xác thành phần axít amin trong gạo, phương pháp thủy phân protein tổng số của hạt gạo bằng vi sóng được hoàn thiện kết hợp với việc tách chiết bằng các hệ dịch đệm khác nhau cho phép hình thành một

hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân bằng vi sóng, tạo dẫn xuất và định lượng với HPLC cho phép phân tích được hàm lượng axít amin trong lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo

9 Đã có 13 bài báo khoa học trong đó có 7 bài đăng trên tạp chí trong nước, 4 bài đăng trên tạp chí Quốc tế và 2 poster tham dự Hội nghị Quốc tế

Kết quả phục vụ thực tế

Những kết quả thu được góp phần định hướng việc chuyển gen nhằm cải tiến tính chịu hạn và chịu mặn của các giống lúa Việt Nam, đồng thời góp phần xác định cách thức cải tiến chất lượng dinh dưỡng thông qua hàm lượng và thành phần axít amin của protein trong gạo Việt Nam

Qui trình chuyển gen vào cây lúa sẽ được áp dụng đối với các cây trồng khác đồng thời sẽ được chuyển giao cho các Viện nghiên cứu Cây lúa chuyển gen sẽ được trồng và ứng dụng trong điều kiện Việt Nam

Kết quả đào tạo

Đào tạo Nghiên cứu sinh:

1 Nguyễn Hữu Cường - NCS tại CHLB Đức

2 Đỗ Thị Phúc - NCS tại CHLB Đức

3 Lê Xuân Đắc - NCS tại Viện Công nghệ sinh học

4 Nguyễn Phương Thảo - NCS về proteomic cây chuyển gen ở Nhật

Đào tạo cao học:

1 Nguyễn Thị Hải Yến - Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống chuyển gen ở lúa

Kết quả nâng cao tiềm lực khoa học

Hoàn thiện hệ thống chuyển gen, phân tích và đánh giá cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm, nhà kính trồng cây đồng thời phân tích năng suất và chất lượng cây lúa chuyển gen

Có thêm 2 Ngân hàng dữ liệu về gen điều khiển và cấu trúc các chất trao đổi của lúa gạo phục vụ công tác nghiên cứu

LỜI MỞ ĐẦU

Lúa nước là cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ 3 trên thế giới sau lúa

mỳ và ngô Gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số thế giới (chủ yếu ở châu Á và châu Mỹ La tinh), điều này làm cho nó trở thành loại lương thực được con người tiêu thụ nhiều nhất

Trong danh sách các cây ngũ cốc như: lúa mỳ, lúa mạch, ngô, cao lương, kê thì genome của cây lúa nước được coi là nền tảng cho bộ gen của các cây ngũ cốc khác Chính vì vậy mà Chương trình giải mã genom cây lúa (Rice Genome Project) được lựa chọn để tiến hành và đã hoàn thành vào tháng 3 năm 2004 mở ra khả năng tiến hành hàng loạt các nghiên cứu hậu genomic, trong đó bao gồm các nghiên cứu về những gen liên quan đến tính chịu mặn và chịu hạn của cây lúa, cũng như các gen liên quan đến chất lượng của hạt gạo

Sử dụng các trang thiết bị phân tích hiện đại như: đo huỳnh quang diệp lục, phân tích khối phổ GC/MS, sắc ký lỏng cao áp, PCR định lượng (RT-RT-PCR), đồng thời với việc khai thác triệt để các Ngân hàng dữ liệu về genom của cây lúa nhằm tìm ra các yếu tố điều khiển, các chất chỉ thị liên quan đến tính chống chịu là một phần nội dung của đề tài Phần thứ hai là dùng các phương pháp nuôi cấy tế bào, chuyển gen vào cây lúa và khai thác các dòng lúa mang bộ gen bị khiếm khuyết do loại thải (knock-out) nhằm mục tiêu tìm ra cơ chế chống chịu, biện pháp tăng cường tính chống chịu và chất lượng lúa gạo ở mức độ phân tử

Nội dung nghiên cứu của đề tài này mang tính nghiên cứu cơ bản có định hướng sâu sắc và lâu dài, đòi hỏi nhiều thời gian, trang thiết bị tiên tiến, cách tiếp cận hiện đại và phạm vi hợp tác rộng lớn (Ngân hàng dữ liệu gen các tác nhân TF ở lúa và cây khác, Ngân hàng phổ GC/MS và cấu trúc phân tử các chất trao đổi, Ngân hàng các dòng lúa (KO)

Kết quả thu được ban đầu là rất khả quan cho thấy cách đặt vấn đề và hướng tiếp cận là phù hợp và mang lại hiệu quả Tuy nhiên, cần nhiều thời gian tiếp tục nghiên cứu thì mới đi đến được những kết luận chắc chắn, mang tính lý luận và thực tiễn cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước

Vai trò của một số nhóm chất như: proline, glycine betaine, fructant, manitol liên quan đến tính chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi của môi trường đặc biệt là hạn và mặn đã được khẳng định Hiện nay một số gen liên quan đến chất lượng thực phẩm như gen làm tăng hàm lượng methionine (CGS), tryptophan, lysine, cysteine (SAT) cũng đã được công bố Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen đối với tính chống chịu và cải biến chất lượng ở lúa luôn là những nội dung nghiên cứu chính ở nhiều Viện nghiên cứu lớn trên thế giới Có khá nhiều phương pháp để tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu như: (i) Tìm trên mạng trình tự đã công bố, thiết kế primer và nhân dòng bằng DNA của đối tượng quan tâm, sau đó so sánh trình tự và thiết kế vào vector để sử dụng; (ii) Kỹ thuật sàng lọc cDNA dựa trên nguyên tắc kích thích cho gen cần tìm hoạt động; (iii) Thông qua nghiên cứu hệ proteomics để tìm các protein mới có hoạt tính dưới tác động của điều kiện môi trường hay nhu cầu của các giai đoạn sinh trưởng phát triển bằng kỹ thuật 2D kết hợp với các phân tích khối phổ và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen mà biết được trình tự axít amin của protein và trình tự nucleotit của gen đó

Cho đến nay, nhiều gen liên quan đến tính chống chịu đã được phân lập chủ yếu bằng các phương pháp trên và đã được ứng dụng để nâng cao tính chống chịu trên đối tượng cây thuốc lá, lúa mỳ, lúa nước như: gen nhaA (chịu mặn), gen HAL, gen codA, betA, nhóm gen RAB, gen P5CS, gen OAT (chịu hạn) Hiện nay Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck, CHLB Đức đang có những nghiên cứu sâu và rất thành công về vai trò của một số hợp chất như polyamin, đường tan, axít béo dưới điều kiện bất lợi ở lúa thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA và các phương pháp phân tích bằng quang phổ khối Cơ sở của phương pháp như sau:

Trường hợp phân lập gen, bao gồm các bước:

i) Tách chiết mRNA từ các giống lúa có tính chống chịu ở các vùng sinh thái khác nhau dưới điều kiện stress và không stress

ii) Tạo ngân hàng cDNA bằng enzym sao chép ngược

iii) Tạo các vi bản trên màng chuẩn (15000)

iv) Lai với cDNA không xử lý

v) Thu các dòng lai dương tính và nhân bản các dòng lai bằng PCR

vi) Đọc trình tự và thiết kế gen cho mục đích chuyển gen

Trường hợp phân tích phổ chất:

i) Tách chiết các chất từ các giống lúa xử lý và không xử lý

ii) Phân tích phổ chất bằng kỹ thuật sắc ký khí hoặc quang phổ kế

iii) So sánh phổ chất giữa giống chống chịu và giống không chống chịu trong điều kiện bất lợi và điều kiện thường

1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Hiện nay các kỹ thuật dùng để xác định sự gia tăng một số chất liên quan đến tính chống chịu ở cây lúa như proline và các đường tan đang được sử dụng rất hiệu quả

để đánh giá tính chống chịu của cây trồng đối với điều kiện bất lợi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới cũng đã được sử dụng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, kỹ thuật phân lập gen đi từ cDNA cũng đã được triển khai nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu tìm kiếm các gen cũng mới chỉ được tiến hành nghiên cứu ở cây đu đủ đối với bệnh vi rút đốm vòng và tính chịu hạn ở đậu tương song chưa được nghiên cứu cho các giống lúa Việt Nam

Viện Công nghệ sinh học đang xây dựng một dự án hợp tác với Viện Max Planck

về Sinh học phân tử thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Greifswald, CHLB Đức theo

hướng nghiên cứu Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng

công nghệ sinh học thực vật Dự án được Bộ Đào tạo và Nghiên cứu Đức tài trợ về

kinh phí Kinh phí này chủ yếu dành để cán bộ của Việt Nam sang học phương pháp

và làm việc ở Đức trên đối tượng là các giống lúa của Việt Nam Sự hợp tác này là một điểm thuận lợi để chúng ta có thể nhanh chóng tiếp cận với kỹ thuật hiện đại để phân lập tìm kiếm các gen cũng như các phương pháp nghiên cứu phân tích xác định phổ các chất (polyamin, proline, axít béo, ABA ) có liên quan đến tính chịu hạn và mặn nhằm đưa ra được các phương pháp cải biến tính chống chịu ở lúa Vì thế, việc triển khai kỹ thuật này tại Việt Nam là rất cần thiết, giúp cho Việt Nam có thêm một

công cụ hiện đại về Sinh học phân tử để cải biến tính chống chịu của các giống lúa Việt Nam với các điều kiện bất lợi môi trường Trên cơ sở của những phương pháp này, những nghiên cứu tương tự sẽ được triển khai trên một số đối tượng cây trồng khác như ngô và đậu tương

1.3 Mục tiêu của đề tài

Tìm kiếm, đánh giá, phân lập và sử dụng các gen nhằm nâng cao khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa và chất lượng tinh bột của hạt gạo thông qua các kỹ thuật phân tử và biến nạp gen

Các mục tiêu cụ thể

i) Nghiên cứu vai trò của polyamin đối với khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa thông qua các kỹ thuật ức chế gen bằng RNA ii) Nghiên cứu phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và chịu muối bằng phổ phiên mã RNA từ những giống lúa chống chịu

iii) Phân tích phổ trao đổi chất ở rễ của các giống lúa (chống chịu và không chống chịu với hạn và muối) trong điều kiện stress bằng kỹ thuật sắc ký khí/quang phổ khối

iv) Chuyển gen tăng cường tính chịu hạn và mặn, tăng cường hàm lượng axít amin vào cây lúa

Trong nội dung hợp tác của dự án với Đức có phần nghiên cứu thực hiện tại Việt Nam từ 2002 đến 2005 Các nội dung của đề tài được thực hiện tốt nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Bộ dành cho việc đón tiếp chuyên gia bạn sang làm việc và gửi cán bộ sang Đức làm việc để thực hiện các nội dung nghiên cứu tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Các giống lúa: Tổng số có 33 giống lúa được sử dụng trong các thí nghiệm (Bảng 2.1), các giống thí nghiệm được gieo trồng tại nhà lưới Viện Công nghệ sinh học, Hà

Nội, Việt Nam và tại nhà kính tại Viện MPI, Golm, CHLB Đức Các giống lúa C71, DR2 và Taipei được dùng để chuyển gen

Vector: Vector dùng để chuyển gen quan tâm là pCAMBIA1390/Ubill và

pCAMBIA1300

Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector chuyển gen quan tâm

Bảng 2.1: Các giống lúa được sử dụng trong các nghiên cứu của đề tài

Giống số Giống Khả năng chịu hạn* Khả năng chịu mặn* Nguồn gốc

21 Nước mặn x Việt Nam

Ghi chú: * Tính chống chịu hạn và mặn theo mô tả trong lý lịch giống

2.1.2 Các thiết bị chính

Các thiết bị chính phục vụ nghiên cứu bao gồm:

i) Thiết bị nuôi trồng và xử lý mô, cây: Phytotron, bàn cấy vô trùng, buồng nuôi cấy mô, nhà kính trồng cây

ii) Thiết bị phân tích: Khối phổ, máy PCR, máy lai và đọc DNA array, máy đọc trình tự gen

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tìm kiếm và phân lập các gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua

kỹ thuật ức chế gen bằng RNA

Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

i) Đánh giá khả năng chịu hạn và chịu muối NaCl của ít nhất 20 giống lúa

Indica của Việt Nam có khả năng chống chịu khác nhau thông qua phép thử

chịu hạn và chịu muối

ii) Xác định hàm lượng PA (Putrescine, Spermidine, Spermine ) và mối tương quan của chúng đến tính chống chịu ở 20 giống lúa trên theo phương pháp của viện MPI

Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức

i) Thiết kế các gen ức chế từ RNA tách chiết được từ các giống có tính chống chịu cao

2.2.2 Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và muối bằng phổ phiên mã RNA

Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

i) Chọn 4 giống lúa có tính chịu hạn (CR203; DR2, DR3, Lốc) và 5 giống lúa

có tính chịu muối (Cườm; CR203, NN8; SR26; SR59) từ các giống lúa

Indica của Việt Nam

ii) Thiết lập thư viện cDNA từ rễ, lá, phôi hạt của các giống lúa có tính chống chịu hạn và muối cao (xử lý stress và không xử lý)

iii) Thu nhận, nhân dòng, đọc trình tự và so sánh các dòng lai cDNA

Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức

i) Tạo các vi bản của 10 000-15 000 dòng cDNA từ mỗi thư viện cDNA trên ii) Nhân bản 10 000-15 000 dòng cDNA bằng phản ứng PCR

iii) Tạo các bản màng chuẩn mang 15 000 cDNA

iv) Chuyển RNA lên màng chuẩn

v) Tiến hành lai 15 000 cDNA (không xử lý) với cDNA (đã xử lý) trên bản màng chuẩn để phát hiện các dòng lai cDNA

2.2.3 Kỹ thuật sao chép gen

Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

i) Thiết kế mồi để nhân các đoạn gen từ DNA hoặc cDNA (rễ, lá, cây con) ii) Nhân dòng bằng kit TA

iii) Tạo các vi bản trên màng chuẩn và lai với cDNA tách từ các giống chống chịu hạn và mặn trong điều kiện stress

iv) Thu nhận các dòng lai dương tính để đọc trình tự gen

v) Thiết kế đoạn gen phân lập được vào vector thích hợp bao gồm gen chỉ thị, gen chọn lọc, đoạn promoter và đoạn terminator cần thiết cho chuyển gen vào thực vật

Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức

i) Tạo 17 000 dòng cDNA bằng enzym sao chép ngược từ mRNA tổng số tách

từ giống lúa chịu hạn và chịu mặn

2.2.4 Kỹ thuật phân tích phổ chất bằng sắc ký khí / quang phổ khối

Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

i) Tối ưu phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các giống lúa ii) Tìm mối tương quan của các nhóm chất giữa điều kiện môi trường và các giai đoạn phát triển (đẻ nhánh, trỗ bông)

iii) Xử lý với proline để nghiên cứu tính chống chịu

iv) Xác định hàm lượng ABA ở rễ của các giống lúa trên trong điều kiện stress

và không stress

v) Đưa ra được protocol đánh giá kiểu hình tính chịu hạn ở lúa

Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức

i) Phân tích phổ trao đổi chất của rễ ở 4-5 giống lúa (2-3 giống chống chịu và 2-3 giống không chống chịu) trong điều kiện bình thường và xử lý dưới điều kiện không có stress (thay đổi thời gian và chế độ xử lý)

ii) Xác định khoảng 300 chất từ các giống lúa đã đánh giá được tính chống chịu hạn hoặc muối (nhóm đường đơn, đường đôi, axít amin, axít béo, proline,

K+, Na+, đường tan ) Phát hiện các chất tương tự có trong cây lúa (khoảng

50 chất)

2.2.5 Tối ưu phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa Việt Nam

Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

i) Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy mô tế bào và tái sinh cây trên các đối tượng giống nghiên cứu

ii) Thử nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens trên một số

giống lúa bao gồm các bước chính sau: Nhiễm mẫu nuôi với vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens, diệt khuẩn, chọn dòng mô sẹo và tái sinh cây

iii) Tối ưu hóa điều kiện chuyển gen và tái sinh cây để thu được hiệu quả tái sinh và chuyển gen cao

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp sinh lý học thực vật

i) Xử lý hạn và mặn; Thu thập và đánh giá khả năng chịu hạn và muối các giống lúa (33 giống)

Xử lý hạn: Cây mạ được nuôi 10 ngày trong các chậu có đường kính 10cm (1

cây/1 chậu) chứa cát thạch anh trộn với phân bón hỗn hợp gồm 0,4g Fetrilon và 8g Levatit HD5. Cây mạ được xử lý hạn bằng cách để khô các chậu trồng cây trong 4 ngày không tưới Sau đó các chậu trồng cây được tưới bổ sung thêm một lượng nước hạn chế (khoảng 13.68ml/1 cây/1 ngày) trong khoảng 14 ngày Thí nghiệm được thực hiện trong phytotron với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ ngày/ 12 giờ đêm), cường độ ánh sáng ngày đạt khoảng 2500lux, nhiệt độ 22-26oC, độ ẩm 70-75%

Xử lý muối: Hạt lúa được cho nảy mầm trong 10 ngày sau đó cây mạ được nuôi

trong dung dịch (Yang et al., 1994) trong phytotron ở điều kiện chiếu sáng 14 giờ,

cường độ ánh sáng ngày đạt khoảng 2500lux, nhiệt độ 26oC, độ ẩm 70% Nhiệt độ

22oC và độ ẩm 70% vào ban đêm Sau 14 ngày cho cây phát triển bình thường, dung dịch nuôi cây được thay mới và bổ sung muối NaCl với các nồng độ 0; 50; 100 mM Thời gian xử lý muối được thực hiện trong 14 ngày

ii) Trồng, nhân giống và theo dõi các đặc điểm nông sinh học của các giống thí nghiệm được thực hiện theo yêu cầu cụ thể của từng thí nghiệm

iii) Phân loại khả năng chống chịu của các giống lúa theo tiêu chuẩn của IRRI Các chỉ tiêu theo dõi như số nhánh, chiều dài lá, sự thay đổi huỳnh quang diệp lục, trọng lượng tươi và khô của lá, thân, rễ được sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống theo 3 mức: Chống chịu, chống chịu trung bình và mẫn cảm theo phương pháp tính toán của IRRI (http://www.knowledgebank.irri.org/ses/)

Phân loại khả năng chịu muối của các giống được thực hiện dựa theo thang điểm đánh giá lá bị hại như sau:

1 Đầu lá hơi bị héo hoặc lá gần như bình thường

3 < ¼ tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh

5 1/4 - 1/2 tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh

7 Hơn 2/3 tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh

9 Hầu hết các lá bị héo

iv) Phương pháp đo huỳnh quang diệp lục

Để đánh giá ảnh hưởng của xử lý hạn đối với khả năng quang hợp thông qua

đo hàm lượng quang hoá II, phương pháp đo huỳnh quang diệp lục bằng PAM Flurometer (Walz, Germany) được sử dụng dựa trên cơ sở khoa học sau:

IMAGING-Phần năng lượng ánh sáng, được các sắc tố của bộ máy quang hợp hấp thụ, không được sử dụng trong quang hợp, đã được bức xạ dưới dạng huỳnh quang hay mất đi dưới dạng nhiệt Huỳnh quang chlorophyll ở thực vật cũng là một chỉ số phản ánh hoạt tính quang hợp Trong những năm gần đây, các kĩ thuật hiện đại đo huỳnh quang

đã đưa phương pháp này trở thành một công cụ hết sức quan trọng trong nghiên cứu sinh lý thực vật (ví dụ như phương pháp đo huỳnh quang ở lá nguyên vẹn) Nhờ việc

áp dụng các kĩ thuật hiện đại, người ta đã thu nhận các kết quả quan trọng cho phép giải thích nguồn gốc và hiểu được một cách sâu sắc về cơ chế của hiện tượng bức xạ huỳnh quang Tuy vậy, giải thích về lí thuyết hiện tượng huỳnh quang mới chỉ thu nhận được trên các đối tượng nghiên cứu như protoplast, lục lạp được tách ra, màng thylakoid, v.v… Vì thế, để hiểu thêm vấn đề này ở các cơ thể quang hợp nguyên vẹn

và đặc biệt là ở lá của thực vật bậc cao vẫn còn là một vấn đề cần được làm sáng rõ Trong vòng 15 năm lại đây đã xuất hiện hàng loạt các nghiên cứu về huỳnh quang chlorophyll (Papageorgiou, 1975) về mối liên quan của nó với các hiện tượng vật lí và quang hợp (Lavorel và Etiene, 1977; Butler, 1977; Van Gorkom, 1986; Holzwarth, 1991) Trong các công trình của Renger và Schireiber (1986), Murata và Satoh (1986) và Krause và Weis (1991) đã đưa ra các dẫn liệu mới nhất về mối liên

hệ của bức xạ huỳnh quang và quang hợp sau khi đã phân tích các thông tin nhận được theo quan điểm lí sinh và hoá sinh một cách đầy đủ nhất

Những nét cơ bản nhất của việc sử dụng đo huỳnh quang chlorophyll để đánh giá hoạt tính quang hợp như sau:

Như chúng ta đều biết, trong bộ máy quang hợp, ánh sáng được các sắc tố anten hấp thụ, sau đó năng lượng kích thích này được truyền về tâm phản ứng của các hệ quang hoá I và II Ở đó, năng lượng này được dùng vào phản ứng quang hoá đầu tiên Khi cường độ ánh sáng thấp và trong các điều kiện tối ưu, phản ứng quang hoá đầu tiên thường có hiệu quả cao Theo Bjorkman và Deming (1987), hơn 90% lượng tử ánh sáng được hấp thụ đã được quang hợp sử dụng Hiệu suất biến đổi năng lượng quang hoá đầu tiên, thậm chí có thể còn cao hơn nữa Chỉ một phần rất nhỏ năng lượng kích thích bị mất đi dưới dạng huỳnh quang chlorophyll “a” Ở nhiệt độ phòng,

phần lớn huỳnh quang được phát ra do chlorophyll “a” của hệ quang hoá II Trong dung dịch (ví dụ trong ether), hiệu suất huỳnh quang của chlorophyll “a” cao và gần bằng 30% ánh sáng đã được hấp thụ Ngược lại, hiệu suất cực đại huỳnh quang cholorophyll trong bộ máy quang hợp (quan sát được khi các tâm phản ứng đóng) bằng gần 3% lượng ánh sáng được hấp thụ Còn khi tất cả các tâm phản ứng ở trạng thái mở, hiệu suất huỳnh quang sẽ giảm đi khoảng 6 lần (gần bằng 0,5% lượng ánh sáng được hấp thụ) do có sự cạnh tranh với phản ứng quang hóa

(theo Krause và Weis 1991)

Hình 2.1: Hiện tượng dịch chuyển điện tử quang hợp trong các tâm phản ứng của hệ

quang hóa II

Như vậy, trước hết để xem xét sự cạnh tranh giữa phản ứng quang hóa và huỳnh quang chlorophyll, chúng ta sẽ mô tả một cách ngắn gọn hiện tượng dịch chuyển điện

tử quang hợp trong các tâm phản ứng của hệ quang hóa II

Khi xảy ra phản ứng quang hóa, 1 điện tử được chuyển từ sắc tố P680 (là phân tử chlorophyll) ở trạng thái kích thích mức singlet đầu tiên (P680) đến phân tử pheophytin Và từ đó, điện tử được chuyển tiếp đến chất nhận đầu tiên dạng Quinon (QA, QB)

Sự phân chia điện tích đã tạo ra chất ôxy hóa có hoạt tính cao –P+

680 và nó có thể nhận điện tử từ chất cho điện tử thứ 2 Z (có bản chất là Tirozin D1- protein) Chất cho điện tử Z ở trạng thái ôxy hóa sẽ được khử bằng các điện tử từ hệ ôxy hóa nước Khi phản ứng chậm, với sự tham gia của nguyên tử sắt, điện tử dịch chuyển đến Quinon B (QB ) Tiếp theo, sau khi đã nhận 2 điện tử, Q B liên kết với 2 proton từ vùng

stroma của màng thylakoid và chuyển về plastoquinon Như vậy, hiệu suất huỳnh quang của phân tử chlorophyll ở các cơ thể quang hợp, thay đổi và phụ thuộc vào trạng thái của các tâm phản ứng của hệ quang hoá II

Khi kích thích huỳnh quang bằng sung ánh sáng cực ngắn và yếu, trong khoảng thời gian này, mỗi tâm phản ứng chỉ hấp thụ không quá một lượng tử ánh sáng, thì năng lượng kích thích, một cách nhanh chóng, được vận chuyển từ phức hệ anten cảm nhận ánh sáng về phức hợp sắc tố của tâm phản ứng được cấu tạo chỉ gồm có chlorophyll “a” Phần năng lượng kích thích này được xác định bằng sự tương quan các hằng số tốc độ của ba quá trình cạnh trạnh nhau, nhằm làm mất đi trạng thái kích thích của phân tử chlorophyll trong phức hợp của tâm phản ứng

P

K K K

Hiệu suất lượng tử của phân chia đầu tiên điện tích và huỳnh quang sẽ tương ứng bằng:

ph d f

ph

K K K

K Qz

+ +

ph d f

f o

K K K

K QF

+ +

Ý nghĩa của các hằng số này được xác định bởi cấu trúc phân tử của tâm phản ứng và hơn nữa lại không phụ thuộc vào thuộc tính phân loại học của tảo Trong các điều kiện tối ưu, khi các tâm phản ứng hoạt động (các tâm phản ứng mở) hằng số Kphlớn hơn không đáng kể so với các hằng số còn lại Và do đó, năng lượng kích thích được sử dụng trong phản ứng quang hợp với hiệu suất lượng tử QZ gần bằng đơn vị (=1) và chỉ có một phần tử rất nhỏ năng lượng kích thích (gần 0,3%) bị mất đi dưới dạng huỳnh quang trong quá trình vận chuyển năng lượng kích thích về tâm phản ứng Khi tâm phản ứng mở, xảy ra quá trình oxy hoá hoàn toàn chất nhận đầu tiên quinon (QA) ( Karapetian, Bukhov, 1986) còn khi các tâm phản ứng đóng xảy ra quá trình khử chất nhận đầu tiên quinon (QA) và khi đó hiệu suất huỳnh quang đạt giá trị cực đại Hiệu suất huỳnh quang ở trạng thái này (FM) thường lớn hơn nhiều lần (đến 6 lần) so với hiệu suất huỳnh quang ở trạng thái Fo 9 hiệu suất huỳnh quang ổn định, khi tâm phản ứng mở)

Như vậy là khi tâm phản ứng đóng (ví dụ như khi có lượng tử kích thích thứ hai rơi vào tâm phản ứng với khoảng thời gian nhỏ hơn khoảng thời gian quay vòng của tâm phản ứng và khi đó điện tích đầu tiên trong tâm phản ứng vẫn còn chưa được sử dụng trong các phản ứng tiếp theo) thì hằng số tốc độ mất trạng thái kích thích bằng quang hóa sẽ bằng không, còn hiệu suất huỳnh quang tăng lên và đạt giá trị cực đại (FM):

QZ = 0; còn

ph d f

f M

K K K

K QF

+ +

Hiệu suất giữa cường độ huỳnh quang khi tâm phản ứng đóng và mở (FV= FM-

F0) được gọi là huỳnh quang biến đổi của chlorophyll Nó tương ứng với phần năng lượng ánh sáng được các tâm phản ứng mở sử dụng trong phản ứng quang hóa Một cách dễ dàng có thể chỉ ra rằng tỷ lệ hiệu suất huỳnh quang biến đổi và huỳnh quang cực đại bằng hiệu suất lượng tử của phản ứng quang hóa đầu tiên phân chia các điện tích ở các tâm phản ứng quang hợp:

Qz K

K K

K QF

QF

QF

ph d f

ph M

o

+ +

phản ứng nhận được không quá một lượng tử kích thích:

F0= K x F0 (6) Còn cường độ huỳnh quang cực đại- FM khi tâm phản ứng đóng, có thể xác định được khi chiếu sáng với hai xung ánh sáng Khi đó đầu tiên chiếu sáng với xung ánh sáng có công suất cao, nhằm mục đích đưa tất cả các tâm phản ứng về trạng thái đóng

và sau đó với khoảng thời gian ngắn hơn thời gian quay lại của tâm phản ứng (<100 mks), chúng ta sẽ đo được cường độ huỳnh quang

FM = K x FM (7) Như vậy, đo cường độ huỳnh quang chlorophyll ổn định – F0 và cực đại – FM, trong một đơn vị thời gian tương đối đã cho phép nhận được giá trị tuyệt đối về hiệu quả lượng tử phân chia điện tích trong các tâm phản ứng quang hợp

QZ = FV/FM, ở đây FV= FM- F0 (8) Hiệu quả phân chia điện tích trong các tâm phản ứng bị giảm đi khi điều kiện sinh trưởng gặp bất lợi (như khi ánh sáng dư thừa, nhiệt độ thấp và khi không đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng) Hiệu suất tương đối huỳnh quang biến đổi FV/FM đặc trưng cho hiệu quả khử quinon QA trong hệ quang hoá II (Malkin, Sindere, 1974), liên quan với hiệu suất lượng tử thải ôxy (Deming và cộng sự, 1987) và khử CO2 (Baker và cộng

sự, 1989) Như vậy, thông số FV/FM có thể được sử dụng để đánh giá trạng thái sinh lí của thực vật phù du

Cho đến hiện nay, chưa có được các phương pháp đủ đơn giản và đáng tin cậy để đánh giá sự sinh trưởng của thực vật phù du Thông thường để đánh giá về điều này, người ta sử dụng các chỉ tiêu khác nhau, ví dụ như hàm lượng chlorophyll Tuy nhiên, việc xác định chlorophyll là khá phức tạp và phản ánh lại không trung thực sự sinh trưởng của thực vật phù du, bởi vì hàm lượng chlorophyll trong sinh khối của thực vật phù du và hàm lượng của nó trong thành phần sắc tố quang hợp thay đổi rất nhiều và phụ thuộc vào thành phần nước, trạng thái sinh lí của thực vật phù du Trong bối cảnh như vậy, một trong các phương pháp đơn giản và nhanh để đánh giá mật độ của thực vật phù du là đo cường độ huỳnh quang chlorophyll khi tâm phản ứng mở –

Fo , mà thường tỷ lệ với hàm lượng chlorophyll

v) Xác định hàm lượng PA (Putrescine, Spermidine, Spermine…)

Hàm lượng Putrescine, Spermidine, Spermine của các giống xử lý hạn và mặn được đo đạc và đánh giá dựa theo phương pháp của Smith và Davies (1985) nhằm tìm

ra mối tương quan giữa sự thay đổi hàm lượng của các chất này với khả năng chống chịu

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử thực vật

i) Phương pháp tách mRNA và tạo dòng phân tử cDNA, thiết lập thư viện cDNA mRNA tổng số được tách chiết dựa theo phương pháp Guanidium thiocyanate (GCN) của Chomczynski và Sacchi (1987) có biến đổi: RNA tổng số được tách chiết bằng RNeasy kit của hãng QIAGEN

ii) Tạo các vi bản dòng cDNA từ mỗi thư viện, lai và chọn lọc các dòng cDNA dương tính Đọc trình tự gen phân lập được Tạo được ngân hàng cDNA đa dạng từ rễ, lá, phôi từ giống lúa có tính chịu hạn và mặn

iii) Tạo các vi bản của khoảng 10000 - 15000 dòng cDNA từ mỗi thư viện

iv) Phương pháp RT-RT- PCR

Nguyên lý

Khái niệm: PCR (Định lượng) = quantitative PCR hoặc Real-time PCR là PCR

có thể xác định được lượng sản phẩm PCR (tương đối hoặc tuyệt đối) ở mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (hay ở mỗi chu kỳ của phản ứng)

Nguyên lý: Cường độ phát quang trong ống phản ứng tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm PCR trong ống phản ứng Có hai cách để đo được cường độ phát quang:

Hình 2.2: Nguyên lý cường độ phát quang

1) Bổ sung một hợp chất hóa học đặc biệt có tên gọi SYBR Green 1 Hợp chất này có tính chất đặc biệt là dưới ánh sáng halogen phát quang rất mạnh khi chui vào

kẽ của DNA sợi kép; khi ở dạng tự do hầu như không phát quang:

Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng, lượng SYBR Green 1 bám vào sợi đôi

cũng tăng dần, cường độ phát quang tăng theo Hệ thống detector nhận tín hiệu phát quang báo về trung tâm, phần mềm ghi nhận dưới dạng đường cong tương ứng

Hình 2.3: Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng

Tín hiệu phát quang được ghi dưới dạng đường cong tương ứng Ở ống phản ứng

có số lượng sợi khuôn lớn, đường cong sẽ xuất hiện sớm và ngược lại

2) Nguyên lý chuyển năng lượng cộng hưởng phát quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET): Nếu cả hai hợp chất màu A và B, hợp chất A được kích hoạt bởi nguồn sóng có bước sóng λ1 và phát ra ánh sáng có bước sóng λ2; ánh sáng có bước sóng λ2 lại chính là nguồn kích hoạt đối với hợp chất B khi B đứng gần A và hấp thụ ánh sáng phát ra từ A làm cho B phát ra ánh sáng có bước sóng λ3 Hiệu ứng này được gọi là FRET Real-time PCR lợi dụng tính chất này để định lượng sản phẩm PCR có trong ống phản ứng theo hai cách: a) mẫu dò thủy phân (Roche) và b) Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe, Applied Biosystems)

a) Mẫu dò thủy phân

Real-time PCR thực hiện với mẫu dò thủy phân: probe 1 có đầu 3’ gắn huỳnh quang được kích hoạt với bước sóng λ1 và phát quang ở bước sóng λ2 Probe 2 có đầu 5’ gắn LC Red được kích hoạt ở bước sóng λ2 phát ra từ Fluorecein làm cho LC Red phát quang ở bước sóng λ3 nếu cả hai probe này bắt cặp bổ sung với sản phẩm PCR ở một thời điểm nhất định để cho huỳnh quang đứng gần LC Red (cách nhau từ

1 đến 3 bazơ) Máy lắp hệ thống lọc chỉ cho λ3 đi qua, vì vậy tín hiệu phát quang chỉ nhận được khi cả hai probe bám vào sợi khuôn (sản phẩm PCR) Sản phẩm PCR tăng

dần theo chu kỳ – probe bám vào sợi khuôn tăng theo – cường độ phát quang tăng theo

Hình 2.4: Mẫu dò lai

b) Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe)

Cả hai chất phát quang, ví dụ FAM (Reporter) và TAMRA (Quencher) cùng được gắn trên một probe (FAM gắn ở đầu 5’ và TAMRA gắn cách FAM khoảng 18-20 bazơ

về phía 3’) sao cho khi FAM được kích hoạt bởi bước sóng λ1 và phát ra bước sóng λ2 thì bước sóng λ2 sẽ bị TAMRA hấp thụ và phát ra bước sóng λ3 vì vậy λ2 sẽ không phát

ra được Taq DNA polymerase ngoài hoạt tính polymerase còn có hoạt tính exonuclease, nó sẽ cắt FAM ra khỏi đầu 5’ của probe làm cho FAM phát ra buớc sóng λ2 Máy chỉ lắp lọc thu nhận bước sóng λ2 vì vậy sẽ chỉ nhận được tín hiệu phát quang khi FAM được giải phóng ra khỏi probe Theo chu kỳ sản phẩm PCR tăng, probe bám vào càng nhiều và FAM cũng bị cắt ra càng nhiều – phát quang càng mạnh

Hình 2.5: Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe)

Cách tiến hành: PCR định lượng được thực hiện như đối với cách thực hiện

PCR thông thường nhưng phải bổ sung SYBR Green 1 (đối với Real-time PCR sử dụng SYBR Green 1) và mẫu dò thủy phân hoặc TaqMan probe(s) và tất nhiên phải

sử dụng máy Real-time PCR (Roche thường dùng mẫu dò thủy phân còn các máy của các Hãng khác như Applied Biosystems, Bio Rad, Stratagene và thường dùng TaqMan probes), SYBR Green 1 thì dùng chung cho tất cả các máy

Áp dụng: Định lượng (I), xác định đột biến với mẫu dò thủy phân (II), xác định

đột biến với TaqMan probes (III), Định tính ví dụ xác định gen nào thuộc loài nào

(IV)

Hình 2.6: Định lượng (I), xác định đột biến với mẫu dò lai (II), xác định đột biến với

TaqMan probes (III), Định tính ví dụ xác định gen nào thuộc loài nào (IV)

v) Phương pháp phân lập gen theo hoạt tính từ ngân hàng

vi) Phương pháp đọc trình tự và đọc trình tự 3-4 gen phân lập được

vii) Phương pháp thiết kế gen: Thiết kế được plasmid mang gen chịu mặn và

hạn (gen PA, gen tách từ giống lúa chống chịu) Tạo plasmid mang gen chịu mặn và hạn phân lập được từ lúa

Hình2.7: Cấu trúc vector pCAMBIA1300 dùng để thiết kế gen nhaA, OAT

Hình 2.8: Cấu trúc vector pCAMBIA1390/Ubill dùng để thiết kế gen CGS

2.3.3 Phương pháp phân tích

2.3.3.1 Phân tích protein tổng số, phân tích khối phổ bằng sắc ký/ quang phổ khối

Hạt lúa chín được tách lớp vỏ cứng bên ngoài, sau đó được nghiền thành bột mịn Cân 1mg bột gạo trong các ống thuỷ tinh Chuyển các ống thuỷ tinh vào hệ thống phân tích dưới điều kiện nhiệt độ 150oC, 1034mbar Quá trình phân tích được tiến hành 20 phút Sau đó làm khô các ống thuỷ tinh và chuyển sang hệ thống phân tích sắc kí lỏng cao áp để phân tích thành phần axít amin của các phản ứng thủy phân Sau khi lập các đường cong chuẩn, thành phần mỗi axít amin sẽ được tính theo nmol/mg vật liệu phân tích BSA được dùng như một mẫu chuẩn cho trong thí nghiệm

Hình 2.9: Phân tích protein tổng số

Tách chiết và xác định hàm lượng PA (Putrescine, Spermidine, Spermine) Tách chiết các chất từ giống lúa xử lý và không xử lý Xây dựng và tối ưu phương pháp xác định hàm lượng PA Tìm mối tương quan của PA và các nhóm chất giữa điều kiện môi trường và các giai đoạn phát triển ở lúa

2.3.3.2 Xây dựng phương pháp xác định mối tương quan của PA

Xác định mối tương quan của PA, các nhóm chất nghiên cứu đến tính chống chịu

và hàm lượng ABA

Phân tích phổ trao đổi chất bằng GC/MS nhằm xác định được 300 chất có ở giống lúa chịu hạn và mặn

2.3.4 Phương pháp biến nạp gen vào cây lúa chuyển gen tăng cường tính chống

chịu hạn và mặn và hàm lượng axít amin

- Thiết kế vector mang gen quan tâm để chuyển vào lúa

- Gen nhaA (Na+/H+ antiporter), OAT (Ornithine Aminotransferase), CGS (Cystathionin gamma-Synthase) và các gen quan tâm khác được thiết kế vào vector pCAMBIA1300, pCAMBIA1390/Ubill phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen

2.3.4.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

- Các bước chuyển gen được mô tả theo Hình 2.10

Hệ thống chuyển gen được khẳng định bằng biểu hiện tạm thời gen GUS 10 ngày sau khi diệt khuẩn, các mô sẹo được nhuộm GUS Gen GUS được sử dụng để kiểm tra tính hiệu quả của hệ thống chuyển gen

Qui trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

(1) Tạo mô sẹo từ hạt chín

1 Bóc vỏ trấu, khử trùng trong cồn 70o 1 phút, sau đó khử trong chlorox 45% (5 - 25% dung dịch Na-hypochlorite) với 1 - 2 giọt Tween 20 trong

30 phút

2 Rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng 4 - 5 lần

3 Gieo hạt vô trùng trong môi trường tạo mô sẹo (Thường là môi trường

7 Cấy chuyển mô sẹo mỗi lần sau 3 - 4 tuần

(2) Nuôi khuẩn (làm trước 4 ngày)

1 Cấy Agrobacterium tumefaciens trong 10ml môi trường lỏng AAM hoặc LB

có bổ sung các nhân tố chọn lọc Chú ý: Trong trường hợp dùng LBA4404 (pTOK223) để chọn lọc cho 50mg/l kanamycin và 50mg/l hygromycin

5 Giữ ở 28oC trong 2 ngày

(3) Nhiễm khuẩn - chuyển gen

1. Ly tâm dịch vi khuẩn 3800v/p trong 30 phút, loại bỏ môi trường, cho vi khuẩn vào 20ml MgSO4 (10mM) trong ống ly tâm 50ml Trong trường hợp nuôi vi khuẩn trong MT rắn thì lấy trực tiếp trong dung dịch MgSO4

2 Hút 2.7ml dung dịch MgSO4cho vào 1 ống khác, lấy 300µl dịch vi khuẩn cho vào

3 Đo chỉ số OD (optical density) của hỗn hợp (bước 2), 600nm

4 Ly tâm dịch vi khuẩn trong 20ml MgSO4, 3800v/p, 30 phút, loại bỏ dịch nổi

5 Làm tan tủa, dựng pipet hút lên, xuống vài lần trong môi trường thẩm thấu N6-AS, chỉnh thể tách dịch sao cho khi đo chỉ số OD xấp xỉ bằng 2

6 Cho các mô sẹo hoá phôi vào đĩa petri có vi khuẩn trong môi trường thẩm thấu

7 Thẩm thấu bằng máy hút chân không, cho đĩa petri vào máy hút chân không trong 10 phút

8 Để 20 phút sau dựng pipet hút hết dịch vi khuẩn

9 Thấm khô mô sẹo bằng giấy lọc vô trùng Cấy mô lên môi trường rắn (N6-AS), để trong tối, 3 ngày, ở 25oC

(4) Diệt khuẩn và chọn lọc

1 Rửa mô sẹo hai lần bằng nước cất khử trùng có chứa 250mg cefotaxime

để loại bỏ vi khuẩn

2 Cho mô sẹo vào giấy thấm vô trùng để thấm sạch nước

3 Lấy một vài cục mô nhuộm GUS để kiểm tra biểu hiện của GUS, phần còn lại cấy vào môi trường chọn lọc (N6-CH) có chứa 250mg/ l cefatoxime và 50mg/l hygromycin

4 Giữ mô sẹo nhuộm GUS qua đêm ở 37oC

5 Kiểm tra và đếm số chấm màu xanh trên từng cục mô

6 Nuôi cấy các mô sẹo được chuyển gen trên môi trường chọn lọc, và chọn lọc ít nhất 6 lần

7 Chuyển mô sang môi trường tái sinh cây

(5) Tái sinh cây

1 Chuyển các mô sẹo hoá phôi sang môi trường tái sinh

2 Đặt trong điều kiện 26oC, thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2500lux

3 Chuyển các cây mới tái sinh sang môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng để tạo rễ và cây hoàn chỉnh, trong điều kiện 26oC, thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2500lux

Dựa trên các kết quả nghiên cứu, hoàn thiện hệ thống tái sinh cao trong nuôi cấy

mô lúa để chuyển gen

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu chuyển

gen thông qua A tumefaciens ở lúa

Môi trường tạo mô sẹo cơ bản NB cơ bản, 100mg/l inositol, 1g/l casmino, 30g/l sucrose,

3g/l Gelrite, pH5.8 Môi trường NHCI Môi trường tạo mô sẹo cơ bản + 3.0mg/l 2,4-D

Môi trường NHCII Môi trường tạo mô sẹo cơ bản + 2.0mg/l 2,4-D

AAM AAM cơ bản, 200µM acetosyringone, 10g/l glucose, pH5.2 Môi trường NB cơ bản NB cơ bản, 100mg/l inositiol, 1g/l casmino, 30g/l sucrose,

pH5.8 Môi trường CB NB cơ bản, 2.0mg/l 2,4-D, 30 g/l glucose, 100µM

acetosyringone, 3g/l Gelrite, pH5.2 Môi trường NHCIII NB cơ bản, 2.0mg/l 2,4-D, 25mg/l hygromycin, 250mg/l

cefotaxime, 3g/l Gelrite, pH 5.8 Môi trường NHCIV NB cơ bản, 2.0mg/l 2,4-D, 50mg/l hygromycin, 250mg/l

cefotaxime, 3g/l Gelrite, pH 5.8 Môi trường NHCV NB cơ bản, 2.0mg/l BA, 0.5mg/l NAA, 0.5mg/l Kin, 50mg/l

hygromycin, 250mg/l cefotaxime, 3g/l Gelrite, pH 5.8

2.3.4.2 Đánh giá cây chuyển gen

Theo dõi và nuôi trồng cây tái sinh được chuyển gen (thế hệ T o )

1 Chuyển những cây có bộ rễ khoẻ mạnh trồng trên các lỗ của tấm xốp mỏng đặt trong chậu có chứa dung dịch nuôi cấy Yoshida hoặc 1/2MS Nuôi trồng trong nhà lưới hoặc phytotron ở nhiệt độ ban đêm 210C, ban ngày 29oC (9-10giờ/ngày, 14-15giờ/đêm)

2 Ghi số ký hiệu cho từng cây, những cây trồng trong dung dịch phải thay dung dịch thường xuyên hoặc 1-2 tuần một lần

3 Trồng những cây có bộ rễ khoẻ mạnh trong các chậu có chứa đầy đủ phân bón

4 Cho mỗi đòng lúa vào một bao nhỏ trước khi nở hoa để tránh thụ phấn chéo

5 Thu các bông lúa có 85% số hạt chín vàng

6 Cho từng bông vào các bao giấy, phơi nắng 3 ngày hoặc sấy hơi nóng 700

trong 24 giờ, đạt độ ẩm là 12 - 14%

7 Dùng tay tách hạt ra khỏi bông, cho vào túi nhựa hoặc cốc thuỷ tinh có chất hút ẩm silica gel, để ở 8-10oC Sử dụng hạt To cho các nghiên cứu tiếp theo

Theo dõi và nuôi trồng cây chuyển gen ở các thế hệ tiếp theo

1 Hạt của từng bông được gieo cấy riêng rẽ trong nhà kính hoặc nhà lưới đảm bảo an toàn cho cây chuyển gen

2 Theo dõi các đặc điểm nông sinh học của từng dòng

3 Đánh giá và sàng lọc các cây bị nhiễm bệnh và côn trùng để tách ra và kiểm tra về bệnh học và côn trùng học

4 Qua mỗi thế hệ thu mẫu, phân tích và đánh giá sự tồn tại và ổn định của gen được chuyển

Đánh giá cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm

(1) Kiểm tra cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

- Sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen được chuyển để kiểm tra sự có mặt của gen

- Sử dụng các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen để tách chiết DNA

- Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích 25 µl gồm các thành phần: 2,5 µl đệm 10X; 2,5 µl MgCl2 2,5 µM; 1 µl dNTP 2,5µM; 1 µl mồi 1; 1 µl mồi 2; 0,125 µl Taq polymerase (5U/µl); 1µl DNA khuôn (10ng/µl); 15,875 µl H2O

- Tiến hành nhân bản đoạn gen quan tâm trong máy PCR, chu trình nhiệt của máy: 94oC - 3 phút; 30 chu kỳ (94oC - 30 giây, 52-58oC - 30 giây, 72oC - 1 phút); 72oC - 10 phút; sau đó giữ ở 4oC

- Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1,4% trong dung dịch TBE 0,5X, sau đó gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 1% và chụp ảnh

- Trong cây lúa có mặt gen chuyển, sẽ xuất hiện một bóng vạch có kích thước bằng kích thước của gen chuyển trên bản điện di Nếu cây không được chuyển gen sẽ không có bóng này

(2) Kiểm tra cây chuyển gen bằng kỹ thuật lai Southern

* Hoá chất, dung dịch và thiết bị

Hoá chất: NaCl; NaOH; Na-Citrat; Tris-HCl; SDS; axit maleic;

N-lauroylsarcosine; Tween 20; bộ kit lai DIG (DIG-High Prime DNA labeling