(Luận văn thạc sĩ) đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong rau đắng biển (bacopa monnieri) thu hái tại viêt nam bằng phương pháp HPLC

Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin trong Rau đắng biển 4 Bảng 1.2 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID

TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID

TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: 1 TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

2 TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn được hoàn thành tại Khoa hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện

Dược Liệu dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Phương và TS Nguyễn Thị

Thanh Bình

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Nguyễn

Thị Phương và TS Nguyễn Thị Thanh Bình, PGS TS Nguyễn Hữu Tùng những

người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, luôn động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dược liệu, PGS.TS Phương

Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu) cùng

toàn thể anh chị, bạn bè, cán bộ, nhân viên Khóa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện

Dược liệu đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân – người đã luôn theo sát, hướng dẫn

cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Y-Dược đã dạy dỗ, trang

bị kiến thức cho em trong suốt năm năm theo học tại trường

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Cuối cùng em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

ACN Acetonitrile Acetonitril

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà Hóa phân

tích

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

jujubogenin trong Rau đắng biển 4

Bảng 1.2 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

pseudojujubogenin trong Rau đắng biển 5 Bảng 1.3 Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin 6

Bảng 1.4 Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid trong

Rau đắng biển 15 Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập 19 Bảng 3.1 Chương trình gradient 28 Bảng 3.2 Thời gian lưu tương đối của các bacosid 29 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 30

Bảng 3.4 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của píc

bacosid A3 32 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại 32 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 33 Bảng 3.7 Hàm lượng tryterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid

A3) trong dược liệu Rau đắng biển thu hái tại Việt Nam 34

Hình Tên hình Trang

Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển 3 Hình 1.2 Cấu trúc của Luteolin và Apigenin 7 Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích Rau đắng biển 28

Hình 3.2 Vị trí các píc bacosid trong Rau đắng biển 29

Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 31

Hình 3.4 So sánh phổ UV của bacosid A3 trong mẫu thử và mẫu

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ………1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Rau đắng biển 2

1.1.1 Vị trí, phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Phân bố 3

1.1.4 Bộ phận dùng 3

1.1.5 Thành phần hóa học 3

1.1.6 Một số tác dụng dược lý 7

1.2 Tổng quan về phương pháp HPLC 10

1.2.1 Nguyên tắc hoạt động 10

1.2.2 Cấu tạo HPLC 10

1.3 Những nghiên cứu về định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 22

2.2.1 Chất chuẩn 22

2.2.2 Hóa chất 22

2.2.3 Thiết bị 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng bacosid tổng số trong Rau đắng biển

23

2.3.3 Áp dụng trên một số mẫu dược liệu Rau đắng biển 25

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 27

3.1 Khảo sát điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu 27

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 30

3.2.1 Tính thích hợp hệ thống 30

3.2.2 Tính chọn lọc của phương pháp 30

3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 31

3.2.4 Độ lặp lại 32

3.2.5 Độ đúng 33

3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) trong Rau đắng biển 34

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 36

4.1 Về thu thập mẫu dược liệu 36

4.2 Về xây dựng phương pháp định lượng 36

4.3 Về kết quả định lượng triterpen glycosid tổng số trong các mẫu Rau đắng biển 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát, có

tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng [11, 13, 24, 26] Ngày nay, ngoài việc sử dung rau đắng biển như một loại thức

ăn, rau đắng biển được sử dụng như một vị thuốc trong các thang thuốc sắc, dịch ép tươi, tán bột sau phơi khô Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam hiện nay đã có một số chế phẩm đông dược được sản xuất từ vị thuốc này như: Hoạt huyết bổ máu Đại Bắc, thông huyết Tuệ Linh, chế phẩm phối hợp Ginkgo Giloba 6000 mg và Brahmi 3000

mg, … Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy tác dụng nổi bật của rau đắng biển trên hệ thần kinh giúp cải thiện trí nhớ, tăng cường khả năng nhận thức, học hỏi

là nhờ vào hoạt chất triterpen glycosid với 5 loại chính có trong rau đắng biển gồm: bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, bacopasid X và Bacopasaponin C [13, 21, 23, 26] Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng triterpen glycosid trong rau đắng biển còn chưa được tiêu chuẩn hóa Hơn nữa, trong dược điển Việt Nam V chưa đề cập đến dược liệu rau đắng biển cũng như các thành phần hóa học trong dược liệu này Do đó, việc định lượng hàm lượng các triterpen glycosid trong rau đắng biển là rất cần thiết

Theo Dược điển Mỹ (USP 40), chất chuẩn bacosid A3 được sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng tổng các loại triterpen glycosid chính chiếm hàm lượng chủ yếu trong Rau đắng biển [41] Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện

công việc “Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển

(Bacopa monnieri) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu:

- Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) bằng phương pháp HPLC

- Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) trong các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập tại một số tỉnh ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Rau đắng biển

gọi là rau Sam trắng, Sam trắng [1, 10]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, sống lâu năm, cao 10-20 cm Thân nhẵn, phần gốc mọc bò, bén rễ ở những mấu, phần trên mọc đứng Thân có vị đắng Lá mọc đối, không cuống, hình trái xoan, mọng nước, dài 0,8-1,2 cm, rộng 3-5 mm, gốc thuôn, đầu tù, hai mặt nhẵn

Lá có màu xanh đậm ở trên mặt, xanh nhạt ở mặt dưới, một gân chính, gân phụ không

rõ Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở kẽ lá trên một cuống dài Hoa không đều, lưỡng tính mẫu 5 Cuống hoa dài 2,6-5,6 cm, không lông, hai lá bắc con hình dải, dài 0,6

cm, ở đỉnh cuống hoa Bao hoa: năm lá đài rời, không đều, lá đài sau to nhất, hình trứng, có năm gân chính, dài 0,8 cm, rộng 0,5 cm, hai lá đài trước hình trứng, mũi nhọn, 3 gân chính, dài 0,7 cm, rộng 0,4 cm, hai lá đài bên nhỏ nhất, hình dải, 1 gân,

có lông ở bìa, dài 0,6 cm, rộng 0,1 cm Năm lá đài không đều, cao 5-6 mm, năm cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở thành ống Bốn nhị, bầu không lông Quả nang hình trứng, nhẵn, có đài còn lại, hạt nhỏ, có góc cạnh Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4-9 [6, 8, 10]

Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Rau đắng biển [42, 43]

1.1.3 Phân bố

Chi Bacopa tương đối lớn, có khoảng 70 loài, phân bố rải rác khắp các vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới; song tập trung nhiều ở khu vực Trung và Nam Mỹ Ở Việt Nam chỉ có 2 loài Loài Rau đắng biển được coi là cây liên nhiệt đới, đồng thời cũng

có thể thấy vùng cận nhiệt đới Ở châu Á, rau đắng biển phân bố rộng rãi từ vùng Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào đến các nước khác ở Đông Nam Á

Ở Việt Nam, Rau đắng biển phân bố ở khắp các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc và miền Nam Cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, pha cát lẫn với các loại cỏ thấp ở bờ ruộng, bãi sông, bờ kênh mương, Cây ra hoa quả nhiều năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt Cây còn có khả năng mọc chồi khỏe từ kẽ lá, kể cả phần còn sót lại sau khi cắt Do đó, Rau đắng biển cũng bị coi là loại cỏ dại ảnh hưởng tới cây trồng [10]

1.1.4 Bộ phận dùng

Dược liệu Rau đắng biển là phần trên mặt đất dùng tươi hoặc phơi khô của cây Rau đắng biển [8, 10]

1.1.5 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chính có tác dụng dược lý của Bacopa monnieri là các

triterpen glycosid, sterol, sterol glycosid, các phenylethan glycosid, cucurbitacin, alkaloid và flavonoid [10, 15] Trong đó thành phần quan trọng là các hợp chất thuộc

nhóm saponin và các saponin trong Bacopa monnieri được xác định là các triterpen

glycosid nhóm dammaran (bacosids)

1.1.5.1 Triterpen glycosid

Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B.monnieri là các hợp chất

triterpen glycosid có cấu trúc nhân dammaran (bacosids) với aglycon là jujubogenin

và pseudojujubogenin [21] ( Bảng 1.1 và 1.2) Cấu trúc của các saponin này khác nhau về phần đường

Những saponin quan trọng bao gồm: bacosid A1, bacosid A2, bacosid A3[24,

34, 35], các bacopasaponin A-D [18, 20, 30, 31], các bacosaponin E và F [31], bacopasaponin G [20], bacopasaponin I và II [18], bacopasaponin III-V [17, 18, 20], bacopasaponin VI-VIII [41], bacopasaid N1, bacopasid N2 và bacopasid X [21] Trong các saponin này, các bacopasaponin A, E, F và bacopasid VIII là các jujubogenin bisdesmosid [29] Hơn nữa, hai triterpen glycosid nhóm drammaran được acyl hóa là bacomosaponin A và bacomosaponin B cũng đã được phân lập bằng

kỹ thuật quang phổ [15]

Trong những năm đầu nghiên cứu về B.monnieri, thành phần hóa học đầu tiên trong B.monnieri được xác định là 3-(α-L-arabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid-10,20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-en thường được gọi là bacoside A đã được phân lập và được coi là thành phần có tác dụng lên hệ thần kinh giúp tăng cường trí nhớ Sau đó, vào cùng thời điểm, người ta đã xác định bacosid B chỉ khác bacosid A

ở góc quay quang học [15]

Tuy nhiên các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng bacosid A và bacosid B không phải là những hợp chất hóa học đơn lẻ, mà chúng được chứng minh là các hỗn hợp của triterpen glycosid Nghiên cứu gần đây cho thấy bacosid A là hỗn hợp của bốn triglycosidic saponin: bacosid A3, bacosid II, 𝛼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-(β-

D-glucopyranosyl-(1→3)- 𝛼-L-arabinofuranosyl] jujubogenin (còn gọi là bacopasid X) và bacopasaponin C [21] và bacosid B là một hỗn hợp của bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid IV và bacopasid V

Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

jujubogenin trong rau đắng biển [41]

Jujubogenin

1 Bacosid A3 β-D -glucopyranosyl-(1→3)-O-(𝛼-L-arabinofuranosyl

(1→2))-O-(β-D-glucopyranosyl)

2 Bacopasid N1 β-D -glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl

3 Bacopasid IV β-D-glucopyranosyl-(1→3)- 𝛼-L-arabinofuranosyl

Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

pseudojujubogenin trong rau đắng biển [41]

Pseudojujubogenin

5 Bacopasaponin C β-D -glucopyranosyl-(1→3)-O-(𝛼-L

-arabinofuranosyl-(1→2))-𝛼-L-arabinofuranosyl

6 Bacopasid N2 β-D -glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl

7 Bacopasid II 𝛼-L-arabinofuranosyl-(1→2)-β-D

-glucopyranosyl-(1→3))-β-D-glucopyranosyl

8 Bacopasid V β-D-glucopyranosyl-(1→3)-𝛼-L-arabinofuranosyl

1.1.5.2 Cucurbitacin

Phần trên mặt đất của B.monnieri sau khi được chiết bằng methanol 50%, cô

đặc và để qua đêm Lấy phần dịch chiết đi lọc và phân đoạn liên tiếp với Ethyl Acetat (EtOAc) và n-Butanol (n-BuOH) Chiết xuất EtOAc đã được phân tích bằng sắc ký

silicagel để thu được các cucurbitacin: cucurbitacin A-D, cucurbitacin E và ba phenylethanoid glycosid gồm: monnierasid I, III và plantiosid B [28]

Bảng 1.3: Cấu trúc một số hợp chất cucurbitacin [28]

R=R2=H, R1=OH Bacobitacin A

R=R1=H, R2=Ac Bacobitacin B

R=B, R1=R2=H Bacobitacin C R=B, R1 = OH, R2 = H Bacobitacin D

năng cao và thu được kết quả hàm lượng Luteolin tại thân của B monnieri tại vùng

Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500g; trong khi hàm lượng Luteolin trong

lá B monnieri thu hái tại cùng Bhayander, Maharashtra là 0,01691 ± 0,0024 mg/ 500g

[12] Ngoài ra, một nghiên cứu khác cũng định lượng hàm lượng Luteolin và

Apigenin ở các phần trên mặt đất trong dịch chiết Methanol (MeOH) của B monnieri

bằng sắc ký lỏng pha đảo lần lượt là 0,22% và 0,45% [11]

1.1.6 Một số tác dụng dược lý

Rau đắng biển là một loại thảo dược lâu năm được sử dụng rộng rãi trong y

học cổ truyền như một loại thuốc bổ thần kinh để cải thiện trí thông minh và trí nhớ, tăng cường chức năng não và giúp gia tăng tuổi thọ Theo y thuật Ayurveda, một hệ thống y học được phát triển tại Ấn Độ cách đây hơn 3000 năm, Rau đắng biển đã được sử dụng lần đầu tiên để bảo vệ thần kinh chống lại chứng mấy trí nhớ

Trong suốt bốn thập kỉ qua, Rau đắng biển và các hợp chất được phân lập từ

nó ngày càng thu hút rất nhiều các nhà nghiên cứu hóa sinh vì các tác dụng dược lý bảo vệ thần kinh đáng chú ý đã được xác định như: tác dụng chống lại chứng mất trí nhớ, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer; chống trầm cảm, lo âu; chống co giật và chống

oxy hóa, [29] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu về dược lý cũng chỉ ra rằng, B.monnieri mang nhiều tác dụng khác như tác dụng chống viêm, chống vi khuẩn Helicobacter

Pylori, thuốc chống giun, chống ung thư, an thần và làm ổn định hoạt động của các

tế bào mast, [8, 15]

1.1.6.1 Tác dụng cải thiện trí nhớ và khả năng nhận thức, học hỏi

Những nghiên cứu trong dịch chiết cồn của các hợp chất được phân lập từ

B.monnieri đã chứng minh tác dụng giúp tăng cường nhận thức và trí nhớ của nó trên

hệ thần kinh nhờ vào sự có mặt của bacosid A và bacosid B [15] B.monnieri cũng

được xác định là có hoạt tính kháng cholinesterase giúp tăng việc tiếp nhận thông tin

và khả năng học tập của chuột bị gây mất trí nhớ bởi scopalamin, natri nitrit và BN52021 (yếu tố kích hoạt tiểu cầu, PAF,chất đối kháng thụ thể) [29]

Một nghiên cứu được thực hiện bởi Uabundit và cộng sự trên mô hình động vật mắc bệnh Alzeimer do dùng chất AF64A ( một chất độc thần kinh đặc hiệu cho

tế bào thần kinh) cho thấy, chiết xuất của B.monnieri có thể giảm thiểu sự suy giảm trí nhớ và thoái hóa các tế bào thần kinh ở đồi hải mã Chiết xuất B.monnieri giúp cải

thiện thời gian thoát khỏi ra trong mô hình thử nghiệm mê cung nước Morris và giảm nhẹ sự giảm của các tế bào thần kinh và mật độ của nó Những phát hiện này cho thấy

rằng B.monnieri giúp tăng cường nhận thức và bảo vệ thần kinh chống lại bệnh

Alzheimer [27] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Viện Dược Liệu ở Việt Nam cũng tham gia nghiên cứu đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập và trí nhớ trong cao chiết cồn ở rau đắng biển trên mô hình chuột nhắt trắng bị suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ, một tròn những mô hình mất trí nhớ giống bệnh Alzheimer [5]

Bên cạnh những nghiên cứu trên mô hình động vật của Rau đắng biển, cũng

có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng dược lý trên hệ thần kinh người Một nghiên cứu được tiến hành trên 76 người có độ tuổi từ 40 đến 65 của Steven Roodentrys đánh giá chức năng của bộ nhớ và mức độ lo lắng Kết quả của thử nghiệm đã chỉ ra rằng, rau đắng biển có ảnh hưởng đáng kể trong việc ghi nhớ các thông tin mới [33] Một nghiên cứu khác của C.Stough và cộng sự cũng đưa ra kết quả rằng cao chiết Rau đắng biển với liều sử dụng là 300mg/ngày giúp cải thiện quá trình xử lý thông tin, học tập bằng lời nói và quá trình ghi nhớ ở người [32]

1.1.6.2 Tác dụng đối với những rối loạn tâm thần

Từ thời xa xưa rau đắng biển đã được biết đến như một loại thảo dược giúp điều trị các rối loạn tâm thần và có thể là một thuốc hướng thần tiềm năng Với sự phát triển của khoa học hiện đại ngày nay, rất nhiều bằng chứng đã được đưa ra để chứng minh điều này

Nghiên cứu của Yun Zhon và cộng sự đã chỉ ra được tác dụng chống trầm cảm

và lo lắng của cao chiết rau đắng biển và một số hoạt chất của nó bao gồm: bacosid I,II, bacopasaponin C [39] Một nghiên cứu khác gần đây của Manavi và cộng sự (2010) cũng chứng minh rằng với liều dùng 80mg/kg của rau đắng biển có tác dụng chống lại rối loạn tâm thần bao gồm cả trầm cảm và lo lắng [22]

Cao chiết Rau đắng biển (chứa 25% bacosid A) có tác dụng an thần tương đương benzodiazepin và lorazepin Hoạt tính này tùy thuộc vào liều lượng sử dụng

và đặc biệt là không gây phản ứng phụ như tạo sự lãng quên, nhầm lẫn như lorazepam

và còn giúp cải thiện trí nhớ [13]

Ngoài ra, Rau đắng biển cũng được biết đến với tác dụng có lợi đối với bệnh động kinh Gần đây, một nghiên cứu đã khẳng định về vai trò kiểm soát cơn động kinh thông qua việc giảm thụ thể GABA ở vùng thể vân và vùng hải mã trong não chuột cống trắng của loài cây này và hoạt chất bacosid A được phân lập từ nó [26]

1.1.6.3 Tác dụng chống oxy hóa

Rau đắng biển đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa dựa trên thử nghiệm não chuột thông qua việc thay đổi nồng độ của các enzym superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathion peroxidase (GPX) Khi so sánh với hoạt tính chống oxy hóa của deprenyl , rau đắng biển tác dụng vào mọi khu vực trong não bộ, trong khi đó deprenyl chỉ giới hạn tại khu vực vỏ não và khu vực trán [41] Rau đắng biển được coi như một loại thảo dược bảo vệ não chống lại các tổn thương oxy hóa

Một nghiên cứu khác ở Việt Nam vào năm 2009 của Nguyễn Thị Thu Hương

và các cộng sự về tác dụng chống oxy hóa invitro của Rau đắng biển tại trung tâm

Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh của 5 phân đoạn chiết từ rau đắng biển là cao toàn phần (cao RĐB); cao chiết bằng ethanol (cao EtOH); cao chiết bằng methanol (cao MeOH); saponin toàn phần chiết từ dược liệu (Sdl) và saponin toàn phần chiết từ rau đắng biển (Sc) Các kết quả chỉ ra rằng, mẫu Sdl và Sc có hoạt tính dập tắt gốc tự do tương đương nhau nhờ tác dụng ức chế hình thành MDA tỷ lệ thuận với nồng độ mẫu Tuy nhiên Sc có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn Sdl Mẫu cao RĐB, cao EtOH và cao MeOH cũng có hoạt tính dập tắt gốc tự do tương đương nhau Nhìn chung, cao MeOH có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn cao RĐB và cao EtOH, còn cao RĐB và cao EtOH có hoạt tính chống oxy hóa xấp xỉ nhau [7]

1.1.6.4 Các tác dụng khác

Ngoài những tác dụng trên, rau đắng biển cũng được chứng minh mang các tác dụng khác như: Tác dụng trên huyết áp, chống ung thư, trên hô hấp và huyết áp, Cao khô chiết cồn của cây rau đắng biển có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Walker carcinosarcoma 256 khi tiêm bắp cho chuột cống trắng Ancaloid bradmin chiết từ cây Rau đắng biển với liều 0,5 mg/kg ở mèo có tác dụng làm hạ huyết áp

Tuy nhiên, liều nhỏ hơn lại gây tăng huyết áp nhẹ do co mạch và kích thích cơ tim [8]

1.2 Tổng quan về phương pháp HPLC

1.2.1 Nguyên tắc hoạt động

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ phận xử lý số liệu Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lưu Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [3, 4, 23]

Pha tĩnh

Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường là các hạt hình cầu có đường kính 1,5 – 10 μm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo

- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2, ), pha động không phân cực

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8, ), pha động phân cực

Pha động

Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực như hexan, isopropylether, ngược lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril,

1.2.2 Cấu tạo HPLC

Nguyên tắc cấu tạo của một bộ máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một

số bộ phận kết nối với nhau [2, 3, 4, 23]

- Hệ thống cấp pha động;

- Bơm sắc ký lỏng;

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của píc thay đổi

- Trong trường hợp bọt quá nhiêu, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì

có thể bơm sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất kì trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại dung môi được đặt trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi) nhờ bộ trộn Tốc độ dòng pha động có thể thay đổi theo áp suất của bơm

1.2.2.3 Bộ phận tiêm mẫu

Mẫu được tiêm thẳng vào pha động ở ngay đầu cột với áp suất cao nhờ sự điều chỉnh dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu cho phép thể tích tiêm từ 5 μL - 100μL Có hai cách tiêm mẫu vào cột là tiêm mẫu bắng tay hoặc tiêm mẫu tự động Khi tiêm bằng tay có thể gây sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ

Chất nhồi cột: đường kính 1,8-5 μm có thể dùng cột ngắn 3-10 cm và nhỏ (đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao Chất nhồi cột tùy

theo loại cột và kiểu sắc ký Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion

- Cột bảo vệ:

Cột được nhồi các hạt nhồi cột và pha tĩnh tương tự như cột phân tích, nhưng ngắn hơn và rẻ hơn, dài 7,5 mm và giá chỉ bằng 1/10 cột phân tích thông thường; đặt trước cột sắc kí để loại bỏ bớt tạp và gia tăng tuổi thọ của cột phân tích

1.2.2.5 Đầu dò (Detector)

- Đầu dò là một bộ phận phát hiện chất phân tích khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector phù hợp Một số loại detector hiện đang được

sử dụng:

- Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/VIS) từ 190 đến 900 nm, áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến

- Detector huỳnh quang sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang (tính chọn lọc) Đối với những chất có bản chất không phát huỳnh quang, cấu tạo dẫn xuất của chất phân tích có khả năng bắt huỳnh quang

- Hiện nay, có một số detector hiện đại hơn như: detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất

- Ngoài ra còn một số loại detector khác là:

+ Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng các hợp chất

máy tính giúp lưu lại tất cả các thông số, phổ dồ và các thông số của píc như tính đối xứng, hệ số phân giải, trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông

số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD,

1.3 Những nghiên cứu về định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số trong Rau đắng biển

Triterpen glycosid là thành phần chính và đã được nhiều nghiên cứu chứng minh tạo lên tác dụng trên hệ thần kinh của Rau đắng biển nên những hợp chất triterpen glycosid thường được lựa chọn làm chất đánh dấu hóa học trong tiêu chuẩn hóa dược liệu Rau đắng biển Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các bacosid trong Rau đắng biển Một số chương trình chạy sắc ký trong các tài liệu tham khảo được tổng kết như bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid trong Rau đắng biển

Dung

1 HPLC-DAD

Chiết hồi lưu cách thủy

[25]

2 HPLC-DAD Siêu âm Methanol

+ Cột: Luna RP-18 (150 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm + Cột bảo vệ: Phenomenex RP-18

+ Pha động: ACN : H3PO4 0.2% (35:65, tt/tt), điều chỉnh pH đến 3,0 bằng NaOH 5M

[40]

+ Thể tích tiêm: 20µL + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: PDA (205 nm)

3 HPLC-DAD

Chiết hồi lưu cách thủy

Methanol

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) + Pha động: ACN : Na2SO4 0,05M (pH= 2,3) (31,5 : 68,5, tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Nhiệt đô cột: 30oC + Thể tích tiêm: 20µL + Bước sóng phát hiện: 205 nm

[21]

4 HPLC-DAD

Chiết hồi lưu cách thủy

Methanol

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)

+ Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4

khan 0,71%, kl/tt) (315 : 685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric

[36]

+ Dung môi pha mẫu: MeOH 70%

+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nhiệt độ cột: 30oC

+ Thể tích tiêm mẫu: 20µL + Bước sóng phát hiện: 205 nm

- Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển: Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid X và Bacopasaponin C so với Bacopasid II lần lượt là: 1,4; 0,9; 1,2;

1,3

5 HPLC-DAD

Chiết hồi lưu cách thủy

Methanol

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm) + Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan

và H3PO4, pH = 2,3) + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút + Nhiệt độ cột: 27oC

+ Thể tích tiêm mẫu: 20µL

[38]

+ Detector: UV (205 nm)

- Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển: Bacopasid I, bacopasid II, bacopasid X và bacopasaponin C so với bacosid A3 lần lượt là: 0,73; 1,04;

1,15; 1,22

Nhận xét:

Đối tượng nghiên cứu của tất cả các tài liệu tham khảo đều là Rau đắng biển được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột Các chương trình sắc ký đều sử dụng thành phần pha động chính là ACN cùng một dung dịch đệm nhất định có pH vùng acid, và chủ yếu chạy với chế đồ đẳng dòng pha động (isocratic) Các điều kiện sắc ký trong các tài liệu tham khảo hầu hết đều sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thể tích tiêm mẫu 20 µL, tốc độ dòng 1,0 – 1,5 ml/phút và bước sóng phát hiện là 205 nm Trong Dược điển Anh [15],

và USP 40 – NF35 [18], hàm lượng bacosid tổng số được tính là tổng hàm lượng bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, đồng phân isomer jujubogenin của bacopasaponin C (bacopasid X) và bacopasaponin C tính theo bacosid A3 Trong nghiên cứu này chúng tôi

sẽ tiến hành định lượng triterpen glycosid tổng số tham khảo theo USP 40 – NF35

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Rau đắng biển được thu hái ở vùng

một số tỉnh tại Việt Nam Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược Liệu Sau đó được gửi về Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu để tiến hành đánh xây dựng phương pháp và đánh giá chất lượng Dược liệu tươi sau đó được sấy khô ở 55oC, bảo quản trong túi bóng kín

ở nơi khô ráo thoáng mát

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập

TT Ký hiệu Tên Việt

Nam

Tên khoa

Ngày lấy

1 RĐB1 Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae Tiền Hải,

Thái Bình

07-

07-2019

3 RĐB3a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae Giao Thủy,

Nam Định

09-

07-2019

4 RĐB3b Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae Giao Thủy,

Nam Định

09-

07-2019

5 RĐB4a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae Thuận An,

Huế

11-

07-2019

6 RĐB4b Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae Thuận An,

Huế

11-

07-2019

7 RĐB5a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae Cửa Tùng,

Quảng Trị

11-

07-2019

8 RĐB5b Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae Cửa Tùng,

Quảng Trị

11-

07-2019

9 RĐB6a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Nhật Lệ, Đồng Hới, Quảng Bình

12-

07-2019

10 RĐB6b Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Nhật Lệ, Đồng Hới, Quảng Bình

12-

07-2019

11 RĐB7a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Bố Trạch, Quảng Bình

07-

13-2019

12 RĐB8a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Quỳnh Lưu, Nghệ

An

07-

13-2019

13 RĐB8b Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Hoàng Mai, Nghệ

An

07-

13-2019

14 RDB9a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

16 RDB10a Rau đắng

biển

Bacopa monnieri

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Hoàng Hóa, Thanh Hóa

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Quảng Xương, Thanh Hóa

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Quảng Thành, TP Thanh Hóa

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Quảng Thành, TP Thanh Hóa

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Quảng Thành, TP Thanh Hóa

(L.) Wettst

Scrophulariaceae

Quảng Thành, TP Thanh Hóa

8-2019

2.2 Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

2.2.1 Chất chuẩn

- Các chất chuẩn chuẩn bacopasid I (CAS: 382148-47-2, LOT: PRF9012222), bacosid A3 (CAS: 157408-08-7, LOT: PRF9212143), bacopasid II (CAS: 382146-66-9, LOT: PRF8062301), bacopasid X (CAS: 94443-88-6, LOT PRF9162411) và bacopasaponin C (CAS: 178064-13-6, LOT: PRF8062302) được cung cấp bởi hãng Biopurify Phytochemicals Ltd với độ tinh khiết trên 98%

- Cột sắc ký Zobax Eclip XDB C18 (250 x 4,6mm, 5µm) của Agilent

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích (Precisa XT 220A), độ chính xác 0,00001 g

- Cân kỹ thuật điện tử (Ohaus) độ chính xác 0,01 g

- Tủ sấy (Memmert, ULM 500)

- Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45)

- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm