(Luận văn thạc sĩ) bước đầu thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA từ đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge)

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ CHUYÊN

BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN

TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM

(Salvia miltiorrhiza Bunge)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ CHUYÊN

BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN

TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM

(Salvia miltiorrhiza Bunge)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y

Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG

HÀ NỘI - 2018

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hữu Tùng – giảng viên

bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và các thầy cô, cán bộ thuộc Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc nói riêng đã dạy dỗ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại Khoa và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn anh Trần Đức Bình và các anh chị lớp Dược K57QH.2012.Y, đặc biệt là chị Bích, chị Huệ, chị Ngần đã luôn động viên, giúp đỡ

và cho em nhiều ý kiến giá trị trong quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn cùng Nhóm nghiên cứu đã đóng góp nhiều nhận xét bổ ích cho em trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Chuyên

Trang 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BuOH Buthanol

CC Sắc kí cột 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của C13

DAD Đầu dò UV DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EtOAc Etyl acetat

EtOH Ethanol

GC Sắc kí khí GLP Thực hành phòng thí nghiệm tốt HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Hex Hexan

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ proton

IR Phổ hồng ngoại IUPAC Tên hợp chất LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp

MS Phổ khối

Mp Nhiệt độ nóng chảy MeOH Methanol

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PL Phụ lục

Rf Hệ số lưu giữ RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKC Sắc ký cột

TLC Sắc ký lớp mỏng UV-VIS Phổ hấp thụ phân tử

UV Tử ngoại v/v Thể tích/thể tích

Φ Đường kính cột

Trang 5

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thiết lập chất chuẩn đối chiếu 3

1.2 Tổng quan về đan sâm 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Phân bố, sinh thái 5

1.2.3 Thành phần hóa học 5

1.2.4 Tác dụng sinh học 8

1.2.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 9

1.3 Tổng quan về tanshinon IIA 10

1.3.1 Cấu trúc hóa học 10

1.3.2 Đặc điểm tanshinon IIA 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 12

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 12

2.1.2 Dung môi, hóa chất 12

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế 13

2.2.2 Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu 14

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 15

2.3 Sơ đồ và nội dung nghiên cứu 16

2.4 Địa điểm nghiên cứu 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 Chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ đan sâm 18

3.1.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất 18

Trang 6

3.1.2 Phương pháp phân lập và tinh chế 18

3.2 Xác định cấu trúc tanshinon IIA 20

3.2.1 Tính chất vật lý 20

3.2.2 Các phương pháp phổ: phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 20

3.2.3 Xác định cấu trúc 22

3.2.4 Đánh giá sơ bộ độ tinh khiết 23

3.3 Thiết lập chất chuẩn đối chiếu 24

3.3.1 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng của tanshinon IIA 24

3.3.2 Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất 24

3.4 Bàn luận 28

3.4.1 Về phân lập và xác định cấu trúc của tanshinon IIA 28

3.4.2 Về phân tích HPLC 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR của tanshinon

Bảng 3.2 Chương trình gradient trong 30 phút 25

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi

định lượng tanshinon IIA tinh chế được 25 Bảng 3.4 Kết quả phân tích độ tinh khiết của tanshinon IIA tinh chế 26

Trang 8

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.2 Cấu trúc một số abietane diterpenoid 6 Hình 1.3 Cấu trúc một số acid phenolic 7 Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L 8 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA 10 Hình 2.1 Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai 12 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất, phân lập và tinh chế tanshinon IIA 19 Hình 3.2 Tanshinon IIA tinh chế được 20

Hình 3.3 Phổ1H-NMR (CDCl3,400MHz) và13C-NMR (CDCl3,100MHz)

của tanshinon IIA phân lập được 21 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA 23 Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng khảo sát tanshinon IIA tinh chế được 23 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC của tanshinon IIA 27

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đan sâm ở nước ta được biết đến như một cây thuốc quý có nguồn gốc từ Trung Quốc hiện nay được trồng nhiều và sinh trưởng tốt ở vùng Tây Bắc nước ta

Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô hoặc sấy khô của cây

đan sâm, thường được dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không đều, phong thấp, thần kinh suy nhược, mất ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc, đan sâm là thuốc tăng cường tuần hoàn máu, chữa đau nhói ở ngực và bụng, nhiễm khuẩn da, bồn chồn, chứng to gan lách, đau thắt ngực, đột quỵ [7,25]

Ở nước ta, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng dụng loại dược liệu quý này trong y học hiện đại Nghiên cứu của Viện Dược liệu

đã cho thấy cây đan sâm trồng ở Sapa có hàm lượng tanshinon IIA cao bên cạnh một số thành phần tanshinon khác [15,21] Gần đây, tác giả Nguyễn Thanh Hải và cộng sự đã công bố phân lập thêm một số thành phần tanshinon [23] và hai hợp chất triterpen là acid ursoli và acid 2β-hydroxypomolic [23]

Các kết quả nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy đan sâm có các thành phần tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester, trijuganon B, cryptotanshinon, tanshinon IIA và tanshinon I,….Trong đó, tanshinon IIA là thành phần tanshinon chính, hoạt chất chính của đan sâm được dùng làm chất chuẩn đánh dấu trong đánh giá dược liệu đan sâm Cho đến thời điểm này chưa có nhiều nghiên cứu chiết xuất, tinh chế tanshinon IIA làm chất chuẩn đối chiếu ở nước ta

Nhìn chung với các sản phẩm từ dược liệu hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở phần lớn dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần cao dược liệu hoặc một nhóm chất bằng các phương pháp không đặc hiệu mà không định lượng được các hợp chất chính đặc trưng, được coi là các hợp chất có hoạt tính sinh học do thiếu chất chuẩn đối chiếu Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu ngày càng trở nên cần thiết đối với công tác đảm bảo chất lượng thuốc và sản phẩm từ dược liệu, từ giai đoạn lựa chọn nguyên liệu đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, cũng như giám sát chất lượng thuốc lưu hành của cơ quan quản lí Ở nước ta đan sâm hiện được trồng ngày càng nhiều và tập trung tại Hà Giang, Lào Cai, Tam Đảo, Lâm Đồng, tuy nhiên chưa thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của dược liệu rất có giá trị này Đan sâm bán trên thị trường thiếu sự đảm bảo về chất lượng và có thể bị nhầm lẫn do chưa có tiêu chuẩn đánh giá thành phần các hoạt chất Theo khảo sát trên thị trường và ở các công ty dược phẩm, phần lớn đan sâm vẫn phải nhập khẩu

Trang 10

từ Trung Quốc và cũng như nhiều dược liệu khác, vấn đề kiểm soát chất lượng cần được quan tâm, và kiểm soát dược liệu kém chất lượng đang tràn lan như hiện nay

Trên cơ sở thực tiễn đó và kế thừa, tiếp nối các nghiên cứu trước về đan sâm,

chúng tôi bước đầu tiến hành “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn của tanshinon

IIA từ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở Việt Nam” Kết quả của đề

tài sẽ góp phần cung cấp chất chuẩn tanshinon IIA dùng trong phân tích và kiểm nghiệm dược liệu đan sâm và sản phẩm chứa đan sâm

Mục tiêu của đề tài khóa luận:

1 Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế được tanshinon IIA có

độ tinh khiết trên 95% từ rễ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở Sapa để

sử dụng làm chất chuẩn đối chiếu

2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất và xác định độ tinh khiết

Trang 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), chuẩn đối chiếu là bất kỳ nguyên liệu

đã được xác định tính chất (định tính) và độ tinh khiết/hoạt lực Một chuẩn đối chiếu chính thức phải có mặt trong danh mục chính thức của Dược điển Anh (BP) hoặc Dược điển Mỹ (USP) hoặc của WHO Có thể thiết lập một chuẩn đối chiếu cơ sở thông qua so sánh tính chất và độ tinh khiết/hoạt lực với một chuẩn đối chiếu chính thức hoặc xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng các kỹ thuật khác Việc chấp nhận mức độ tinh khiết cao hơn hay thấp hơn đối với một chuẩn đối chiếu tùy theo mục đích sử dụng (dùng để định tính hay định lượng) và bản

Quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu

- Mua vật liệu với một lượng lớn

Nên lựa chọn vật liệu có chất lượng tốt từ quá trình sản xuất, lượng thay đổi

từ 20 g đến 500 g tùy thuộc vào nhu cầu dự kiến

- Đánh giá sơ bộ

Xác nhận danh tính, độ tinh khiết, hàm lượng bằng các kĩ thuật như: HPLC, sắc ký lớp mỏng và phương pháp hóa lý khác như phổ NMR, MS hoặc phối hợp các phương pháp

- Phân tích protocol

Đối với việc xác định chất:

+ Phổ - Infrared: phổ hồng ngoại so sánh với tiêu chuẩn tham chiếu chính + HPLC, GC và TLC: thời gian lưu giữ, thời gian chết, khoảng cách di chuyển nên tương ứng với những tiêu chuẩn tham chiếu đã được quy định trước

+ Phương pháp khác: Đo quang, nhiệt độ nóng chảy…

Đối với kiểm tra độ tinh khiết:

+ Kỹ thuật HPLC, GC và TLC: độ tinh khiết của chất hữu cơ hoặc các chất liên quan nên được đánh giá bằng cách so sánh với tiêu chuẩn tham chiếu chính

Trang 12

- Hợp tác giữa các phòng thí nghiệm quốc gia của các nước

- Thẩm định kết quả:

Các dữ liệu (kết quả cân, pha loãng, quang phổ hồng ngoại, UV, TLC, HPLC )

sẽ được tổng kết và lập bảng Bảng bao gồm tên của phòng thí nghiệm, phương pháp,

kết quả, phòng thí nghiệm có ý nghĩa và độ lệch chuẩn

Các kết quả được thẩm định bằng cách sử dụng score Các giá trị với score dưới 2 được chấp nhận sau đó giá trị trung bình với % RSD sẽ được báo cáo

Z-để xem xét và thông qua

1.2 Tổng quan về đan sâm

Cây đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc chi Salvia,

Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn gọi là huyết sâm, xích sâm,

huyết căn là cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vuông trên có các gân dọc Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7 Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa

Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm Mép lá chét có răng cưa tù Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng dài hơn Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc

Trang 13

thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5 mm [1,14]

1.2.2 Phân bố, sinh thái

S miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc Nó cũng có

mặt tại Nhật Bản [31] Cây đan sâm có nguồn gốc Trung Quốc [1] thích hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6] Cây trồng ở trại thuốc Sapa (Viện Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được đã gieo đi gieo lại nhiều năm Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng 11-12 thu hoạch [1] Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [14] Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6]

1.2.3 Thành phần hóa học

Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của đan sâm Thành phần hóa học chính là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác Bộ phận trên mặt đất của có chứa flavonoid, triterpenoid

và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và lá Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [28]

Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của đan sâm đã được chia thành hai nhóm là tanshinon tan trong lipid và acid phenolic tan trong nước Đến nay, hơn 20 acid phenolic phân lập từ rễ cây đan sâm đã được nghiên cứu Các chất có hoạt tính thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và

sinh tổng hợp [36]

1.2.3.1 Diterpenoid

Nhóm diterpenoid bao gồm rất nhiều chất có cấu trúc khác nhau được phân thành 4 phân nhóm là abietane diterpenoid, clerodane diterpenoid, pimarane diterpenoid và labdane diterpenoid Chủ yếu là abietane diterpenoid ở trong rễ, clerodane diterpenoid và labdane diterpenoid thì ít hơn [31]

Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon như tanshinon I, II và III, sau đó đến isotanshinon I và II, isocryptotanshinon và cryptotanshinon [31] (Hình 1.2)

Trang 14

Hình 1.2 Cấu trúc một số abietane diterpenoid

1.2.3.2 Các dẫn xuất của acid phenolic

Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của đan sâm Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid salvianolic từ A – K [35] (Hình 1.3)

Trang 15

(5,7,4’ Flavon và flavonol glycosid: các flavon O-glycosid xuất hiện phổ biến

trong các loài thuộc chi Salvia L và nhiều nhất trong số đó là các flavon 7-glycosid

như apigenin 7-glucosid (cosmosiin), luteolin 7-glucosid (cinarosid) và các

7-glucuronid tương ứng của chúng

- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều

trong các hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L

Trang 16

1.2.3.4 Một số thành phần khác

Triterpenoid phổ biến nhất và được tìm thấy trong đan sâm là acid ursolic và acid oleanolic (Hình 1.4) Ngoài ra còn tìm thấy một số triterpenoid khác như anagadiol, taraxerol acetate, germanicol, navidiol,…[ 31]

Ngoài ra còn có tanin và một số thành phần khác [35]

R R1 R2 R3 R4

R=H, R1=R2=Me, R3=H 3 OH OH H Me Me

R=R1=H, R2=R3=Me 5 OH H H Me Me

L Acid ursolic 2 Acid oleanolic 3 Anagadiol 4 Taraxerol 5.Germanicol

Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L

- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [25]

- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [2,10]

- Tác dụng an thần do thành phần miltiron nên được sử dụng điều trị chứng mất ngủ [7,10]

Trang 17

- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn

Staphylococus kháng thuốc Các thành phần như dihydrotanshinon I,

hydroxytanshinon II-A, cryptotanshinon, methyl tanshinat và tanshinon II-B

được chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus

- Hoạt tính chống oxy hóa gây bởi dihydrotanshinon I [2], acid salvinolic A,

B, acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [12]

- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [2]

- Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [10-11]

- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các huyết quản nhỏ [7]

- Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục: làm tăng nhẹ estrogen và androgen trên chuột [21]

1.2.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [1,3] Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt [2]

- Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng Khi dùng với tính chất

Trang 18

bổ huyết thì dùng đan sâm dạng không qua chế biến [3,7]

- Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp trùng đều có hiệu quả [3,7]

- Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [3]

- Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [1,2]

- Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [2]

Liều dùng: 8-20 g [3]

Chú ý: không dùng chung với Lê lô [6]

1.3 Tổng quan về tanshinon IIA

Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh và Việt Nam, tanshinon IIA là một trong những chất chính được dùng để định tính, có thể định lượng dược liệu đan sâm và cao đan sâm [7,24,34]

- Khối lượng phân tử: 294,3444 g/mol

1.3.2 Đặc điểm tanshinon IIA

- Là bột màu cam hoặc đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25oC), tan tốt trong các dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực, trong methanol

Trang 19

(5 mg/ml), ethanol (5 mg/ml) ở 25oC, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25 mg/ml) [27]

- Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid có khung terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy

đủ tính chất của terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy đủ tính chất của terpeniod

- Tanshinon IIA không bền vững ở nhiệt độ cao, ánh sáng, độ ẩm và tiếp xúc với oxy Dưới tác động của các tác nhân trên, nó có xu hướng bị phân hủy Đó

có thể là lí do chính trong việc giảm hàm lượng tanshinon IIA trong toàn bộ quá trình chiết, cô đặc, sấy khô [27,34]

- Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính, định lượng tanshinon IIA Tanshinon IIA hấp thu mạnh UV ở bước sóng từ 254-280 nm [27]

- Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng giảm

đáng kể kích thước vùng nhồi máu Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của Angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim

Trang 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Hình 2.1 Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai

Rễ đan sâm sử dụng để nghiên cứu chiết tách được thu hái tại Sapa (Lào Cai) tháng 9/2016 và được TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược

liệu giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà (Lamiaceae)

Tiêu bản của mẫu nghiên cứu (DS2016.01) được lưu tại Viện Dược liệu và Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm:

Trang 21

+ Ethylacetat (EtOAc)

+ n-butanol (BuOH)

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck,Đức

- Hạt nhồi dùng cho sắc kí cột loại:

+ Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản)

+Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co Ltd., Nhật Bản)

- Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

- Đo điểm chảy trên máy Kofler micro-hotstage

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap

- Phổ cộng hưởng từ (1D và 2D- NMR) được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT- NMR (Bruker, Đức)

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 series, đầu dò PDA (Agilent Technologies, Mỹ)

- Thiết bị chiết siêu âm, cân phân tích có độ chính xác 0,1 và 0,01 mg, máy cất quay chân không, đèn soi tử ngoại UV, tủ sấy và các dụng cụ thí nghiệm khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế

2.2.1.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

- Phương pháp chiết mẫu: chiết siêu âm với dung môi ethanol 80% - nước

- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Quy trình: rễ đan sâm sau khi sơ chế (làm sạch, sấy khô, nghiền nhỏ) được ngâm chiết kỹ bằng dung môi ethanol 80%, 3 lần, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở

40oC Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho cao chiết tổng ethanol Phân tán cặn chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố lần lượt với từng dung môi hexan, ethyl acetat

Trang 22

và butanol (3 lần) Phân đoạn hexan là phân đoạn tập trung các tanshinon bao gồm tanshinon IIA Các phân đoạn ethyl acetat và butanol được cất loại dung môi dưới

áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng

2.2.1.2 Phương pháp phân lập và tinh chế tanshinon IIA

Để phân lâ ̣p các hợp chất, sử dụng một số phương pháp sắc ký gồm: sắc ký

lớ p mỏng (dùng để khảo sát), sắc ký cô ̣t pha thường và sắc ký cô ̣t pha đảo

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiê ̣n trên bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) và Silica gel RP-18 F254s (Merck) Phát hiê ̣n chất bằng đèn tử ngoa ̣i ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoă ̣c dùng thuốc thử là dung di ̣ch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điê ̣n từ từ đến khi hiê ̣n màu

+ Sắc ký cô ̣t (CC): được tiến hành với chất hấp phu ̣ là Silica gel pha thường

và pha đảo

2.2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

Sử dụng các phương pháp vật lý (đặc điểm cảm quan, điểm chảy) và phương pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) kết

hợp so sánh với dữ liệu công bố trong các tài liệu tham khảo

2.2.2 Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Đánh giá chất lượng của chất chuẩn theo các chỉ tiêu chất lượng sau:

- Định tính: tiến hành phương pháp đo NMR hoặc phối hợp thêm HPLC

- Xác định độ tinh khiết: sử dụng phương pháp HPLC

- Công thức tính hàm lượng tạp chất gần đúng theo tỉ lệ diện tích pic khi áp dụng phương pháp HPLC:

- Trong đó:

Ctap %: tỉ lệ % tạp chất trong mẫu phân tích

Spic: diện tích pic tạp chất

∑Spic: tổng diện tích pic

+ Xác định hàm lượng: sử dụng phương pháp HPLC (Dựa trên cơ sở Chương

(2.1)

Trang 23

trình sắc ký trong DĐVN IV, phụ lục 5.3 và được đánh giá lại về tính thích hợp hệ thống) [6]

Hàm lượng tanshinon IIA trong dung dịch thử được tính theo công thức:

Trong đó:

ST, SC: Diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng (mAU.min)

Cc: Nồng độ của tanshinon IIA trong dung dịch chuẩn (mg/ml)

mcân: Khối lượng mẫu cân thực nghiệm (mg)

có thể kiểm soát được độ ẩm Tiến hành trong Glove – box đã nạp khí nitơ 99,99%,

độ ẩm tương đối trong buồng đóng khoảng 40% Khối lượng 20 mg/lọ Dán nhãn có ghi tên hoạt chất và đánh số thứ tự cho từng lọ

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê ứng dụng trong nghiên cứu phân tích, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel [6]

Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả:

Tính giá trị trung bình:

𝑋̅ = 1

𝑛∑𝑛𝑖=1𝑥𝑖

- Tính độ lệch chuẩn:

Định dạng
Số trang	47
Dung lượng	1,67 MB