Ứng dụng chỉ thị phân tử indel và kỹ thuật PCR định lượng để đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài tại viện huyết học truyền máu trung ương

Nhan đề : Ứng dụng chỉ thị phân tử Indel và kỹ thuật PCR định lượng để đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài tại Viện huyết học truyền máu trung ương Tác giả : Trần Thanh Hiền Người hướng dẫn: Trương Quốc Phong Dương Quốc Chính Từ khoá : Viện huyết học truyền máu trung ương; Tế bào gốc; Tế bào gốc tạo máu; Kỹ thuật PCR Năm xuất bản : 2019 Nhà xuất bản : Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Tóm tắt : Tổng quan về tế bào gốc, ghép tế bào gốc, tế bào gốc tạo máu và nguồn tế bào gốc tạo máu; đối tượng và phương pháp nghiên cứu; kết quả nghiên cứu.

TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

Trần Thanh Hiền

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ INDEL VÀ KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG

ĐỂ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI TẠI

VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

1 TS Dương Quốc Chính

2 PGS TS Trương Quốc Phong

Hà Nội – 2019

L ỜI CẢM ƠN

Truớc hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Dương Quốc Chính

- Trưởng khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW, người thầy đã trực tiếp hướ ng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm on chân thành và sâu sắc dến PGS.TS Trương Quốc Phong – Trưởng PTN Proteomics, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã định hướng và cho tôi những lời khuyên quý báu trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu

Tôi xin được cảm ơn toàn thể các anh chị tại Khoa Di truyền và Sinh học Phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW đã chỉ bảo để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu TW đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu tại đơn vị

Xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô giáo trong bộ môn Di truyền cùng các thầy cô giáo tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những nguời luôn ở bên, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận này

Hà N ội, ngày 30 tháng 9 năm 2019

SINH VIÊN

Tr ần Thanh Hiền

M ỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về ghép tế bào gốc 3

1.1.1 Tế bào gốc 3

1.1.1.1 Tế bào gốc là gì? 3

1.1.1.2 Quá trình phát triển của tế bào gốc 3

1.1.1.3 Phân lo ại tế bào gốc 4

1.1.2 Lịch sử ngành ghép TBG 7

1.1.3 Phân lo ại ghép tế bào gốc theo nguồn hiến 8

1.1.4 T ế bào gốc tạo máu và nguồn tế bào gốc tạo máu 9

1.1.4.1 Tế bào gốc tạo máu 9

1.1.4.2 Nguồn tế bào gốc tạo máu 13

1.1.5 Phác đồ điều kiện hóa 14

1.1.6 Ch ỉ định ghép TBG đồng loại 15

1.1.7 Các bước kỹ thuật trong ghép TBG đồng loại 15

1.1.8 Các phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu 17

1.1.9 T ầm quan trọng của hệ miễn dịch HLA trong ghép tế bào gốc tạo máu 18

1.2 T ổng quan về bệnh nhân ghép TBG 19

1.3 T ổng quan về người hiến tế bào gốc 20

1.4 Quá trình điều trị và diễn biến trên bệnh nhân ghép tế bào gốc (HSCT) 21

1.5 B ệnh ghép chống chủ 21

1.5.1 B ệnh ghép chống chủ cấp [3] 22

1.5.2 B ệnh ghép chống chủ mạn 22

1.6 M ọc mảnh ghép 23

1.6.1 Tiêu chu ẩn mọc mảnh ghép 23

1.6.2 Các y ếu tố ảnh hưởng đến mọc mảnh ghép 23

1.6.3 Các xét nghi ệm đánh giá mọc mảnh ghép 24

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2.2 Chỉ tiêu nghiên cứu 25

2.3 V ật liệu nghiên cứu 25

2.3 Quy trình th ực hiện 26

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 26

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu trước ghép 26

2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu theo dõi đánh giá thể khảm sau ghép 26

2.3.2 Tìm ki ếm chỉ thị Indel mang thông tin 27

2.3.3 Phân tích thể khảm DNA dựa trên các chỉ thị Indel mang thông tin 27

2.3.4 Sơ đồ nghiên cứu 30

2.3.5 Thu th ập, xử lý dữ liệu và phân tích kết quả 31

2.3.6 Đạo đức nghiên cứu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu và người hiến TBG 32

3.1.1 Đặc điểm tuổi giới 32

3.1.2 Phân bố các nhóm bệnh trong nghiên cứu 33

3.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng với bộ chỉ thị INDEL trong theo dõi mọc m ảnh ghép của bệnh nhân ghép TBG tạo máu đồng loài 34

3.2.1 K ết quả chuẩn bị DNA hệ gen 34

3.2.2 K ết quả tìm kiếm các Indel mang thông tin 35

3.2.2.1 Kết quả các marker theo dõi thể khảm 35

3.2.2.2 Kết quả các marker theo dõi tồn dư tối thiểu 36

3.2.2.3 Kết quả tìm kiếm chỉ thị INDEL mang thông tin của một số cặp ghép 37

3.3 Đánh giá hiệu quả phương pháp 38

3.3.1 Số ngày, số lượt theo dõi ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu 38

3.3.2 Theo dõi đáp ứng điều trị dựa trên dòng tế bào 39

3.3.3 Đánh giá tương quan giữa tỷ lệ mọc mảnh ghép với giới tính 40

3.3.4 Đánh giá phương pháp Indel với một số phương pháp khác 42

CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN 43

4.1 Đặc điểm của nhóm BN nghiên cứu 43

4.1.1 Đặc điểm của nhóm bệnh nhân nghiên cứu Error! Bookmark not defined. 4.1.1.1 Đặc điểm về nhóm bệnh 43

4.1.1.2 Đặc điểm về tuổi 44

4.1.1.3 Đặc điểm về giới tính 44

4 2 Hiệu quả của theo dõi thể khảm miễn dịch bằng phương pháp Indel 45

KẾT LUẬN 49

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 50

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các marker màng tế bào trong xác định tế bào gốc tạo máu

Bảng 1.2: Khuyến cáo về mức độ hòa hợp HLA sử dụng trong ghép TBG tạo máu đồng loài

Bảng 2.1: Các sinh phẩm hóa chất

Bảng 2.2: Các máy và thiết bị chính

Bảng 3.1: Đặc điểm chung của nhóm đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.2: Phân bố nhóm bệnh trong nghiên cứu… ……….33

Bảng 3.3: Kết quả tách chiết DNA hệ gen của một số mẫu sử dụng trong nghiên cứu ……… 34

Bảng 3.4: Kết quả sàng lọc chỉ thị Indel và tìm kiếm chỉ thị theo dõi thể khảm…35 Bảng 3.5: Kết quả tìm kiếm chỉ thị theo dõi tồn dư tối thiểu ……….36

Bảng 3.6: Kết quả tìm kiếm Indel mang thông tin của cặp ghép số 4 (BN4 và NC4) xuất ra từ phần mềm KMRengine ……….37

Bảng 3.7: Số lượt và số ngày theo dõi của nhóm bệnh nhân

Bảng 3.8: Theo dõi đáp ứng điều trị trên từng dòng tế bào

Bảng 3.9: Đánh giá tương quan giữa tỷ lệ mọc mảnh ghép với giới tính

Bảng 3.10: Đánh giá phương pháp Indel với một số phương pháp khác

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Các locus gen trong hệ thống HLA 9

Hình 1.2: Sơ đồ phát triển và biệt hóa tế bào máu 10

Hình 1.2: Đặc trưng cơ bản của tế bào gốc tạo máu 11

Hình 1.3: Khả năng tự tái tạo của tế bào gốc 12

Hình 2.1: Mô tả chỉ thị mang thông tin của người cho và người nhận 27

Hình 3.1: Kết quả theo dõi thể khảm của bệnh nhân MTTH 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ những thử nghiệm lâm sàng đầu tiên về ghép tế bào gốc tạo máu vào cuối thập niên 1950, đến nay TBG ngày càng phát triển và được ứng dụng rộng rãi, trở thành một phương pháp điều trị quan trọng để điều trị các bệnh ác tính và không ác tính của cơ quan tạo máu Cho đến nay, trên thế giới đã thực hiện thành công khoảng 200.000 ca ghép TBG và mỗi năm lại có thêm khoảng 20.000 bệnh nhân được ghép TBG để điều trị [11]

Ghép TBG đồng loài (allogenic stem cell transplatation) là một phương pháp điều trị mới có thể chữa khỏi nhiều bệnh máu lành và ác tính [10, 13] Phương pháp này nhằm cấy ghép TBG của người hiến vào người nhận, tạo nên quần thể tế bào sinh máu bình thường của người hiến trong người nhận Như vậy, trong cơ thể người nhận sẽ tồn tại song song tế bào sinh máu của chính họ và của người hiến, tình trạng này được gọi là thể khảm (chimerism) Phân tích thể khảm là một đánh giá để xác định sự phát triển tế bào tạo máu của người hiến trong cơ thể người nhận sau ghép Sau khi ghép TBG, tỷ lệ tế bào người cho trong người nhận là một chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ thành công của ca ghép, tiên lượng khả năng tái phát, thải ghép hoặc bệnh ghép chống chủ (grap versus host diseas – GvHD)

Hiện nay phương pháp phân tích thể khảm dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử (SHPT) được chứng minh là là công cụ có độ nhạy cao và hiệu quả để đánh giá tình trạng khảm của bệnh nhân sau ghép TBG tạo máu đồng loài Các phương pháp SHPT như realtime-PCR, giải trình tự gen (Sanger, NGS) được sử dụng để phân tích thể khảm, dựa trên các chỉ thị phân tử như VNTR, STR, Indel và SNP

Kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị STR (short tandem repeat) được sử dụng khá phổ biến trên hệ thống giải trình tự gen Sanger STR là các đoạn DNA lặp có độ dài

từ 2 - 6bp, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể Tuy nhiên các đoạn lặp này dễ có khả năng bị biến đổi dẫn đến khả năng mất tính đa hình và không hiệu quả trong việc phân tích thể khảm [7]

Một phương pháp khác rất hữu ích và phổ biến hiện nay là sử dụng chỉ thị đa hình chèn xóa (insersion deletion – indel) Indel là các chỉ thị có tính bảo toàn rất cao trong hệ gen người, xuất hiện khá phổ biến và mang tính cá thể Do vậy indel là chỉ thị phân tử rất phù hợp để định danh cá thể, thông qua đó xác định tỷ lệ quần thể

tế bào có nguồn gốc khác nhau trong mẫu phân tích Đây chính là điểm cốt lõi của phân tích chimerism sau ghép TBG tạo máu Ngoài ra, chỉ thị indel hoàn toàn có thể phân tích trên hệ thống realtime-PCR, vốn đơn giản hơn so với phương pháp giải trình tự gen

Quy trình phân tích thể khảm sử dụng PCR định lượng chỉ thị indel được thực hiện thông qua hai bước: (1) tìm kiếm chỉ thị indel có giá trị thông tin (informative) trong mỗi cặp ghép, được thực hiện trước khi ghép; (2) sau đó phân tích thể khảm dựa trên các chỉ thị indel mang thông tin tại thời điểm theo dõi sau ghép Việc tìm kiếm các indel mang thông tin là quá trình sàng lọc mỗi cặp ghép với 29 indel để tìm các Indel dương tính trong người cho mà âm tính trong người nhận và ngược lại

Kỹ thuật phân tích thể khảm phải đảm bảo một số tiêu chí như: (1) có độ nhạy cao để phát hiện tái phát bệnh ở giai đoạn sớm; (2) đủ rõ ràng để phân biệt tế bào người cho và tế bào người nhận về mặt di truyền; (3) thời gian thực hiện ngắn

để có thể thay đổi lựa chọn điều trị kịp thời; (5) và cuối cùng là giá thành phải hợp

lý vì đây là một xét nghiệm thường quy của bệnh nhân ghép

Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Ứng dụng chỉ thị phân tử INDEL và

kỹ thuật PCR định lượng để đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài tại Viện Huyết học – Truyền máu TW” với mục tiêu

1 Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng với bộ chỉ thị Indel trong theo dõi mọc mảnh ghép của bệnh nhân ghép Tế bào gốc tạo máu đồng loại tại Viện Huyết học – Truyền máu TW

2 Đánh giá hiệu quả theo dõi mọc mảnh ghép ở bệnh nhân ghép Tế bào gốc tạo máu đồng loài

CHƯƠNG 1

T ỔNG QUAN 1.1 T ổng quan về ghép tế bào gốc

1.1.1 T ế bào gốc

1.1.1.1 T ế bào gốc là gì?

Được James Till và Errest McCulloch định nghĩa lần đầu tiên vào năm 1960, qua việc phát hiện ra những tế bào gốc tạo máu trên chuột [16], định nghĩa và các tiêu chuẩn để định dạng chính xác tế bào gốc cho đến nay vẫn còn nhiều tranh cãi trong giới khoa học

TBG là các tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào khác và cũng có thể sao chép rất nhanh [14] Ngoài ra, trong các loại mô khác nhau, chúng phục vụ như một

hệ thống sửa chữa bên trong, phân chia không giới hạn để bổ sung các tế bào khác

miễn là cơ thể vẫn còn sống Khi một TBG phân chia, mỗi tế bào mới có khả năng duy trì TBG hoặc trở thành tế bào khác có chức năng chuyên biệt hơn, chẳng hạn như tế bào cơ, tế bào hồng cầu hoặc tế bào não [12]

TBG được phân biệt với các loại tế bào khác bởi hai đặc điểm quan trọng Đầu tiên, chúng là những tế bào không chuyên biệt có khả năng tự làm mới thông qua sự phân chia tế bào, đôi khi sau thời gian dài không hoạt động Thứ hai, trong

một số điều kiện sinh lý hoặc thực nghiệm, chúng Có thể được tạo ra để trở thành các tế bào đặc hiệu mô hoặc cơ quan có chức năng đặc biệt Trong một số cơ quan,

chẳng hạn như ruột và tủy xương, các TBG thường xuyên phân chia để sửa chữa và thay thế các mô già yếu hoặc bị hư hỏng Tuy nhiên, trong các cơ quan khác, chẳng

hạn như tuyến tụy và tim, các TBG chỉ phân chia trong các điều kiện đặc biệt [12]

1.1.1.2 Quá trình phát tri ển của tế bào gốc

Sự hợp nhất giữa trứng và tinh trùng tạo nên tế bào gốc đầu tiên của cơ thể Đây là tế bào gốc “trùm” hay tế bào gốc toàn năng (thấy trong phôi sớm) Với tế bào gốc này thì mỗi tế bào có hình thành một cơ thể hoàn chỉnh

Ở dạng hợp tử này chúng duy trì khoảng 3-5 ngày rồi phát triển thành phôi nang (blastocyst) Phôi nang sẽ phân thành 2 khối là: lớp tế bào bên ngoài (blastocytes) trở thành bánh rau (plancental), khối tế bào nội phôi (inner cell mass – ICM) sẽ phát triển thành phôi (embryo) rồi thành thai nhi (fetus) [4]

Các TBG tiềm năng hơn được thu từ khối tế bào nội phôi (ICM) của phôi giai đoạn phôi nang, chúng được gọi là tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cell) Các tế bào này có thể hình thành bất kì loại tế bào nào trong 200 loại tế bào của cơ

thể

Từ tế bào gốc vạn năng sẽ tạo ra 3 lá phôi: ngoài bì, trung bì, nội bì TBG

của 3 lá phôi này được gọi là TBG đa năng (Multipotent stem cell), chúng tạo ra tế bào gốc của nhiều cơ quan Cả 3 lá phôi đều có khả năng kế cận để tạo nên TBG

“trùm” của các cơ quan và tổ chức trong cơ thể Theo cách phân loại này đứng về góc độ toàn cơ thể chúng được gọi là TBG đơn khả năng (Unipotent stem cell) vì các TBG này tạo ra cùng một cơ quan tổ chức của nó Nhưng đứng về phía cơ quan riêng thì TBG cuối cùng trong quá trình phát triển phôi này lại trở thành TBG đầu tiên của mỗi cơ quan hay TBG “trùm” cơ quan hay TBG nguyên thủy của mỗi cơ quan tổ chức như sinh máu, tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa, da… Nhưng để phân biệt

với TBG “trùm” của cơ thể (Zygote stem cell) thì gọi TBG này là TBG vạn năng (Pluripotent stem cell) của cơ quan đó

Ví dụ: TBG vạn năng của cơ quan sinh máu là tế bào có dấu ấn CD34+ TBG này có trách nhiệm tạo ra tất cả dòng tế bào máu Tiếp theo là TBG đa năng (multipotent stem cell) chúng có khả năng tạo ra 2-3 dòng TBG như TBG dòng lympho, dòng tủy Sau đó TBG này lại biệt hóa thành các TBG đơn năng, chỉ tạo ra

một dòng tế bào có chức năng riêng như TBG dòng HC, TC, BC hạt trung tính, acid, baso… đây là các TBG đơn năng (Unipotent stem cell)

1.1.1.3 Phân lo ại tế bào gốc

a Phân lo ại theo tiềm năm biệt hóa của tế bào

Mỗi loại tế bào gốc có một giới hạn về khả năng biệt hóa của mình, được chia làm 4 nhóm chính

 Tế bào gốc toàn năng (Totipotent Cell)

Đây là loại tế bào có khả năng biệt hóa thành bất kì dòng tế bào nào của cơ

thể, có khả năng biệt hóa thành cơ thể hoàn chỉnh Ở người, tinh trùng thụ tinh với

trứng tạo hợp thành một Totipotent cell (hợp tử), vài giờ sau thụ tinh hợp tử này tiến hành phân chia tạo thành những Totipotent giống hệt nhau Tám tế bào này đều có

khả năng biệt hóa thành một cơ thể hoàn chỉnh

 Tế bào gốc vạn năng (Pluripotent Cell): có khả năng biệt hóa thành phần lớn các loại tế bào trong cơ thể Ví dụ như tế bào gốc phôi

 Tế bào gốc đa năng (Multipotent stem cell): có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào có liên quan chặt chẽ với nhau Ví dụ như tế bào gốc tạo máu biệt hóa đến kết quả cuối cùng là thành các tế bào máu trưởng thành

 Tế bào gốc đơn dòng (Unipotent stem cell): chỉ có khả năng biệt hóa thành

một dòng tế bào, tuy nhiên vẫn có khả năng tự tạo mới thỏa mãn điều kiện để là một

tế bào gốc Ví dụ tế bào gốc của dòng hồng cầu, dòng tiểu cầu,

b Phân lo ại theo nguồn gốc sinh TBG

Có nhiều quan điểm trong phân loại TBG Vào thời điểm năm 2005 trở về trước, người ta thường chia TBG thành hai dạng cơ bản: TBG phôi và TBG trưởng thành

 T ế bào gốc phôi thai (Embryonic stem cells)

Tế bào phôi (ES) là tế bào của khối lượng tế bào trên trong của phôi nang, phôi giai đoạn đầu [59] Chúng có thể phát triển thành từng loại tế bào trong hơn 200 loại ở cơ thể người trưởng thành và không đóng góp vào màng phôi ngoài

hoặc nhau thai

ES thành các tế bào hữu ích chỉ là một trong nhiều rào cản mà các nhà khoa học phải đối mặt [62] Nhiều quốc gia hiện nay có những hạn chế về mặt nghiên cứu ES ở người hoặc sản xuất các dòng ES mới do các lý do về mặt đạo đức

Hiện tại, không có phương pháp điều trị nào sử dụng TBG phôi thai được sử dụng Các tế bào phôi nang là những tế bào đa năng, đòi hỏi các tín hiệu rõ ràng để biệt hóa chính xác Nếu truyền vào cơ thể khác, ES sẽ biệt hóa thành các khối u ác tính

Việc biệt hóa các tế bào

 T ế bào gốc bào thai

Các TBG nguyên thủy nằm trong các cơ quan của bào thai được gọi là TBG bào thai Trong đó có hai loại TBG bào thai Loại thứ nhất là TBG nguyên

thủy bào thai (Fetal proper stem cell) xuất phát từ mô của thai, được lấy sau quá

trình phá thai TBG thai nhi không phải bất tử nhưng có khả năng phân chia cao và

đa dạng Loại thứ hai là TBG thai ngoài tử cung (Extraembryonic fetal proper stem cell) xuất phát từ màng thừa của phôi và được thu nhặt sau khi sinh TBG thai ngoài

tử cung không phải bất tử nhưng là tế bào đa năng pluripotent và có mức độ phân chia tế bào cao [46]

 T ế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell)

TBG trưởng thành còn được gọi là TBG sinh dưỡng (somatic), là TBG duy trì và sửa chữa các mô bị tổn thương, được tìm thấy ở cả trẻ em và người trưởng thành [38] TBG trưởng thành rất hiếm Chức năng chính của chúng là duy trì chức năng trạng thái ổn định của một tế bào được gọi là cân bằng nội môi và thay

thế các tế bào chết [23] Các TBG trưởng thành ít về số lượng Tủy xương là nơi bao gồm nhiều các TBG trưởng thành [47] Số lượng TBG tủy xương giảm theo

tuổi và số lượng này ở nam giới nhiều hơn nữ giới trong thời gian sinh đẻ [30] Các nghiên cứu về TBG trưởng thành hầu hết đều nhằm mục đích nắm được tính tiềm năng (potency) và năng lực tự làm mới (self-renewal) của chúng [51] Theo thời gian, các tổn thương DNA sẽ tích tụ ở TBG và cả các tế bào khác ở môi trường bao quanh TBG Sự tích tụ này lý giải cho sự rối loạn chức năng của TBG khi lão hóa

Các phương pháp điều trị bằng TBG người trưởng thành đã được áp

dụng thành công để điều trị nhiều loại bệnh bạch cầu, ung thư xương, ung thư máu liên quan tới cấy ghép tủy xương Sử dụng TBG trưởng thành trong nghiên cứu và điều trị không gây tranh cãi như việc sử dụng TBG phôi vì sản xuất TBG trưởng thành không đòi hỏi phá huỷ phôi Ngoài ra, trong những trường hợp tế bào TBG trưởng thành được thu nhận từ cùng cơ thể thì nguy cơ thải loại sẽ không có [55]

 T ế bào gốc dịch màng ối (Amniotic): TBG dịch màng ối là chủ đề nghiên

cứu tiềm năng hiện nay Các TBG này có khả năng di chuyển rộng mà không cần nguồn dinh dưỡng, đặc biệt là không hình thành khối u TBG buồng ối là tế bào đa năng multipotent, có thể biệt hóa thành các dòng tế bào của các tuyến adipogenic,

osteogenic, myogenic, endothelial, hepatic và nơ-ron thần kinh

 T ế bào gốc “Vạn năng cảm ứng” (Induced Pluripotent Stem Cells iPSC)

Năm 2006, các nhà khoa học tại Đại học Kyoto – Nhật Bản đã xác định được các điều kiện để tế bào trưởng thành được “lập trình lại” về trật tự di truyền đạt được trạng thái như Tế bào gốc Các tế bào trưởng thành, được gọi là “Tế bào

gốc vạn năng cảm ứng” (Induced Pluripotent Stem Cells – iPSC), được thiết lập lại

ở trạng thái giống như các TBG phôi (ESCs)[28] iPSC và ESCs có nhiều tính tương đương, thí dụ như tính đa năng và khả năng biệt hóa, sự biểu hiện của gene…[40] Tuy nhiên chúng không phải là giống nhau Trong thực tế có rất nhiều

sự khác biệt trong thuộc tính này Điều quan trọng là chromatin của iPSC dường

như bị "đóng" hoặc bị methyl hóa hơn so với các ESCs [40] Hơn thế nữa các tế bào iPSC có nhiều ưu điểm trong điều trị Tương tự như ESCs, iPSC là những tế bào

gốc vạn năng pluripotent Do đó chúng có khả năng biệt hóa cao Về mặt lý thuyết, các tế bào này có thể biệt hóa thành bất kỳ tế bào bào trong cơ thể [40] Hơn thế

nữa, nó còn cho phép tạo ra dòng tế bào pluripotent cho từng bệnh nhân[53] Trên

thực tế, các mẫu máu đông lạnh có thể được sử dụng như một nguồn cung cấp tế bào gốc đa năng pluripotent, mở ra một con đường mới cho việc thu hoạch các tế bào có giá trị Các tế bào gốc đặc hiệu cho bệnh nhân cho phép sàng lọc ác dụng

phụ trước khi điều trị, điều này giảm thiểu nguy cơ thải loại trong ghép tế bào gốc [52] Mặc dù còn nhiều hạn chế trong điều trị, việc sử dụng iPSCs trong nghiên cứu

và điều trị vẫn rất tiềm năng trong tương lai Ngoài ra, tế bào gốc còn có thể chia ra thành TBG nội sinh và TBG ngoại sinh TBG sinh là các TBG có sẵn trong cơ thể TBG ngoại sinh là các TB được lấy ra từ cơ thể người cho, sau đó được sử dụng các phưong pháp để tăng sinh trong phòng thí nghiệm, rồi được cấy ghép trở lại cơ thể người bệnh – phương pháp này còn được gọi là liệu pháp cấy ghép tế bào gốc ngoại

sinh

1.1.2 L ịch sử ngành ghép TBG

Ngành ghép tủy phát triển bắt đầu sau bùng nổ của năng lượng và vũ khí hạt nhân năm 1945 Mặc dù trước đó đã có một vài nỗ lực trong việc dùng tủy xương của người hiến đưa vào cơ thể người nhận là những bệnh nhân bị thiếu máu hay ung thư máu bằng đường uống, tiêm bắp hay truyền tĩnh mạch Vào thời điểm này, ngành ghép tủy bắt đầu được nghiên cứu nhiều vì xuất hiện những bệnh nhân bị các bệnh lý máu ác tính do phơi nhiễm phóng xạ ion hóa

Ca ghép tủy đầu tiên được ghi nhận năm 1939, thực hiện trên một bệnh nhân

bị xơ tủy do kim loại nặng, tủy ghép lấy từ người anh ruột của bệnh nhân Ca ghép này không thành công, bệnh nhân chết sau 5 ngày

Ca ghép tủy được ghi nhận thành công đầu tiên là năm 1965, khi một bệnh nhân Bạch cầu lymphô cấp loại nguyên bào lymphô được điều trị bằng hóa xạ trị, sau đó được truyền tế bào tủy xương từ 6 người hiến tủy khác nhau có liên hệ huyết

thống Bệnh nhân này tử vong sau 20 tháng vì bệnh tái phát

Từ năm 1977 đến 1980, thành công trong nghiên cứu ghép tủy dị thân Cũng

từ năm 1978, ghép tủy trong bệnh lympho bắt đầu có những thành công nhất định

Năm 1990, BS E.D Thomas đã được trao giải Nobel y học cho những nghiên cứu về ghép tủy

Đến năm 2000, thì đã có hơn 500.000 trường hợp ghép tủy thực hiện trên toàn thế giới Cho đến bây giờ ghép tủy đã được thử nghiệm nghiên cứu trong nhiều

bệnh lý, cả ác tính lẫn không ác tính, đáng kể là ghép tủy khá hiệu quả trong điều trị các bệnh lý thiếu máu bất sản, khi tủy hiến có HLA phù hợp người nhận, đặc biệt

giữa anh chị em ruột [8]

1.1.3 Phân lo ại ghép tế bào gốc theo nguồn hiến

Có nhiều nguồn hiến TBG được sử dụng trong ghép TBG tạo máu Nguồn

hiến được lựa chọn dựa vào chẩn đoán và tính trạng bệnh Dựa vào nguồn hiến HSCT được chia thành 3 loại:

Ghép t ự thân (autologous) là kỹ thuật HSCT sử dụng chính tế bào gốc của

bệnh nhân HCT được sử dụng dưới hình thức truyền tĩnh mạch TBG và TBG tạo máu được thiết kế để thiết lập lại chức năng miễn dịch ở bệnh nhân mắc nhiều

chứng rối loạn ác tính đang được điều trị bằng hóa trị liều cao [33]

Đồng ghép (syngeneic) là kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu mà người hiến là

anh/chị/em sinh đôi cùng trứng Phương pháp này thực tiễn rất ít gặp

D ị ghép (ghép đồng loài – allogeneic) là kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu

mà người hiến có kháng nguyên bạch cầu người (HLA) phù hợp HLA là kháng nguyên bề mặt có vai trò giúp hệ miễn dịch nhận ra các tế bào của cơ thể mình Các gen của HLA nằm trên đoạn ngắn của nhiễm sắc thể số 6, chiều dài tổng cộng là 3.600kb hoặc 4,6 x 106 bazơ nitơ, bao gồm 224 alen, trong đó có 128 alen có chức năng và 96 alen không có chức năng Cho đến nay, HLA được coi là hệ kháng nguyên của người phức tạp nhất và đa hình (polymorphism) nhất)

Hình 1.1: Các locus gen trong h ệ thống HLA

Do hiện tượng đa hình mà mỗi người có một kiểu HLA riêng Người hiến lí tưởng là người có thuận hợp “8/8” các HLA trên với người nhận Mức độ thuận hợp HLA ảnh hưởng nhiều đến nguy cơ thải ghép, ghép chống chủ và thời gian sống thêm của bệnh nhân [34, 60] Tỷ lệ anh em trong gia đình có thuận hợp HLA là ¼ [43] Nếu xét anh chị em có quan hệ huyết thống nhưng vẫn không phù hợp, người

hiến được lựa chọn là người không cùng huyết thống nhưng có HLA thuận hợp

hoặc gần như thuận hợp với bệnh nhân [43] Ghép đồng loài được chỉ định trong các bệnh máu ác tính (bệnh BC cấp, BC kinh, u lympho ác tính không Hodgkin, hội

chứng rối loạn sinh tủy, hội chứng thực bào máu) hoặc trong một số bệnh khác (suy

tủy xương, HC thiếu hụt miễn dịch, thalassemia, rối loạn chuyển hóa đường) [3]

1.1.4 T ế bào gốc tạo máu và nguồn tế bào gốc tạo máu

1.1.4.1 T ế bào gốc tạo máu

a Định nghĩa và đặc điểm của dòng tế bào gốc tạo máu

Tế bào gốc tạo máu vạn năng là các tế bào sinh máu sớm nhất, có khả năng

tự tái sinh và phát triển thành tế bào đầu dòng của các dòng tế bào máu, ngoài ra còn có chức năng duy trì năng lực hồi phục tủy sinh máu kể cả khi tủy xương chịu tác động của các tác nhân diệt tủy Những tế bào này đặc trưng bởi các dấu ấn miễn

dịch như CD34+, CD38+,… và có kích thước tương đương tế bào lympho nhỏ[5]

Trong quá trình sinh sản và biệt hóa, dần dần các tế bào này được biệt hóa thành tế bào gốc đa năng rồi thành tế bào gốc đơn dòng Các tế bào gốc đa năng hay

còn gọi là các tế bào gốc định hướng đa dòng có thể sinh ra 2, 3, 4 dòng tế bào Ví

dụ: CFU-GEMM là nhóm định hướng dòng tủy có khả năng sinh ra hồng cầu, mẫu

tiểu cầu, monocyte, bạch cầu hạt Các tế bào gốc đa dòng có thể nhận biết bằng kỹ thuật nuôi cấy clon và bằng các dấu ấn màng như CD33, CD7, CD19

Tế bào gốc đơn dòng chỉ sinh ra một dòng tế bào và biệt hóa thành tế bào chín Ví dụ các tế bào gốc của dòng hồng cầu BFU-E, CFU-E; dòng bạch cầu hạt CFU-G

Hình 1.2 : Sơ đồ phát triển và biệt hóa tế bào máu

Đặc trưng cơ bản của TBG tạo máu là khả năng tự tái tạo, khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào trưởng thành và khản năng phục hồi mô tạo máu Ngoài ra TBG tạo máu còn có một số khả năng di chuyển từ tủy ra máu và từ máu vào tủy, tính mềm dẻo trong biệt hóa và chết theo chu trình

Hình 1.3 : Đặc trưng cơ bản của tế bào gốc tạo máu

TBG tạo máu thường chiếm tỷ lệ rất thấp trong tủy xương, máu ngoại vi và máu dây rốn Hầu hết TBG tạo máu ở dạng nghỉ, không phân bào nhưng trong một

số trường hợp cần thiếu như nhiễm trùng, chảy máu… các TBG sẽ nhanh chóng tăng sinh, biệt hóa thành các tế bào chức năng để bù đắp kịp thời phần bị thiếu hụt

nhờ các đặc điểm sau

 Khả năng tự tái tạo (self renewal): TBG tạo máu cung cấp liên tục các tế bào máu trong suốt cuộc đời của một cá thể Mỗi ngày hàng tỷ tế bào máu mới được sản

xuất trong cơ thể và tất cả đều được bắt nguồn từ tế bào gốc tạo máu Tế bào gốc

tạo máu trưởng thành có tuổi thọ giới hạn nên khả năng tế bào gốc tạo máu tự đổi

mới và tạo ra các tế bào máu mới cho đời sống của sinh vật là rất quan trọng để duy trì sự sống Vấn đề then chốt là sự tự đổi mới theo đúng chương trình sinh lý của cơ

thể

Hình 1.0.4: Kh ả năng tự tái tạo của tế bào gốc

 Khả năng biệt hóa đa dòng (unlimited potency): TBG tạo máu toàn năng (Totipotent hemopoietic stem cell) có khả năng biệt hóa thành tất cả các tế bào máu,

tạo ra các TBG định hướng đầu dòng, các TBG đa năng và đơn năng để tạo thành

từng loại tế bào chức năng như: HC, BC, TC, BC hạt, lympho T… Trong trường

hợp cần thiết thì TBG định hướng dòng tủy có thể chuyển đổi thành định hướng dòng lympho và ngược lại [37]

 Khả năng tái định cư (homing): là hiện tượng các tế bào gốc khi truyền vào

cơ thể có thể di chuyển về tủy xương, ở đây chúng sẽ tăng sinh và biệt hóa ra các tế bào máu Có rất nhiều các chemomkine khác nhau và các receptor khác nhau tham gia vào quá trình này Đã gần một thập kỷ kể từ khi chứng minh rằng GSCs và FSCs được gắn kết trong hốc qua sự kết dính tế bào E-cadherin [32] Tiến bộ nhanh chóng đã được thực hiện để tìm hiểu làm thế nào các phân tử bám dính khác nhau

có thể làm trung gian sự tương tác giữa tế bào gốc Dựa trên các kết quả từ các hệ

thống tế bào gốc khác nhau, các cadherin và integin của các phân tử bám dính đã trở thành các trung gian phổ biến của neo thích hợp cho tế bào gốc, mặc dù các phân tử

kết dính khác cũng có liên quan Do đó, tùy tuộc vào loại tế bào, tế bào gốc có thể

sử dụng cadherins, intergins, hoặc sự kết hợp khác nhau của chúng và các phân tử

kết dính khác để tương tác vật lý với niche Sự tương tác giữa tế bào và tế bào trung gian giữa cadherin và tương tác cell-ECM qua trung gian kết hợp có thể làm tế bào

gốc trở nên thích hợp, cho phép tiếp xúc liên tục với các tín hiệu ngắn và tín hiệu

phụ thuộc tế bào, do đó duy trì khả năng tự tái tạo dài hạn Sự kết dính tế bào gốc cũng có thể giúp các tế bào gốc được cấy ghép vào các hốc thích hợp và thiết lập sự tương tác giữa tế bào gốc và tế bào gốc ổn định [56]

b Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu

Về hình thái, có thể sử dụng sinh thiết tủy, chọc hút dịch tủy – tủy đồ để nghiên cứu Nếu sử dụng hóa tế bào có thể dựa vào đặc điểm tế bào dòng tủy phản ứng với peroxydase; dòng lympho phản ứng (+) với periodic acid – Schiff

Hiện nay thường sử dụng các marker màng tế bào trong xác định tế bào gốc

tạo máu [1]:

B ảng 1.1: Các marker màng tế bào trong xác định tế bào gốc tạo máu

13 Myeloid/monocyt trưởng thành 56-16 NK (tế bào diệt tự nhiên)

Ngoài ra có thể dùng phương pháp nuôi cấy invivo và in-situ kết hợp với miên dịch huỳnh quang trong xác định tế bào gốc

1.1.4.2 Ngu ồn tế bào gốc tạo máu

Có 3 nguồn tế bào gốc tạo máu là ở tủy xương, ở máu ngoại vi và máu cuống

rốn

 Tủy xương chính là nguồn tế bào gốc sinh máu đầu tiên được sử dụng để ghép tế bào gốc tạo máu Phương pháp cổ điển để có được tế bào gốc là tiến hành

chọc hút nhiều lần tại vị trí gai chậu sau trên của người hiến đã được gây mê hoặc gây tê

 Các nghiên cứu về tế bào gốc đã phát hiện ra rằng các tế bào gốc tạo máu thường xuyên rời khỏi tủy xương đi ra máu ngoại vi và sau đó quay trở lại tủy xương Với phát hiện này, tế bào gốc ở máu ngoại vi đang dần dần thay thế cho tủy xương Để có được một số lượng lớn tế bào gốc ở máu ngoại vi đa số các phác đồ điều trị đều sử dụng thuốc kích thích tủy sinh bạch cầu (G-CSF)

 Máu cuống rốn được thu thập ngay sau đẻ và được lưu trữ đông lạnh, và rất giàu tế bào gốc tạo máu Mặc dù rất giàu tế bào gốc nhưng do thể tích thu thập được thường ít nên máu cuống rốn chủ yếu được dùng cho ghép tế bào gốc tạo máu ở trẻ

em Bên cạnh đó ghép tế bào gốc tạo máu bằng máu cuống rốn có tỷ lệ ghép chống

chủ thấp hơn do lượng lympho T ít hơn nên không đòi hỏi sự phù hợp về HLA cao như ghép máu ngoại vi hay ghép tủy xương

1.1.5 Phác đồ điều kiện hóa

Mục đích của điều trị điều kiện hóa trước ghép là để tiêu diệt tối đa các tế bào bất thường trong tủy xương nhằm đạt được lui bệnh hoàn toàn kéo dài và bền

vững Bên cạnh đó, phác đồ điều kiện hóa còn có khả năng loại trừ hệ thống miễn

dịch của người bệnh nhằm phòng ngừa thải ghép

Tia xạ toàn thân là phương pháp điều kiện hóa có hiệu quả cao đối với 2 mục đích diệt tủy và ức chế miễn dịch Phương pháp này không gây kháng thuốc chéo đồng thời tia xạ lại có thể tới được những nơi mà thuốc và hóa chất không thể tới được Tuy nhiên, phương pháp tia xạ có thể gây rất nhiều biến chứng như tăng nguy

cơ ghép chống chủ, viêm phổi, ung thư thứ phát, vô sinh, chậm phát triển về trí tuệ cũng như thể chất ở trẻ em

Phác đồ điều kiện hóa phối hợp tia xạ và cyclophosphamide đã trở thành phác đồ điều kiện hóa chuẩn cho ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại từ những năm

80 của thế kỷ trước Tuy nhiên do độc tính cao của phương pháp tia xạ toàn thân, đồng thời do một số trung tâm không đủ điều kiện để thực hiện tia xạ nên có rất nhiều tác giả đã nghiên cứu xây dựng các phác đồ điều kiện hóa không có tia xạ

Năm 1983 phác đồ phối hợp Busulfan với cyclophosphamide đã lần đầu tiên được ứng dụng thành công trong ghép tủy cho bệnh nhận LXM cấp dòng tủy

Nhiều nghiên cứu về bệnh ghép chống chủ nhận thấy nhóm bệnh nhân có ghép chống chủ thường có tỷ lệ tái phát thấp hơn nhóm không có biến chứng này Các tác giả cho rằng các tế bào có thẩm quyền miễn dịch của người hiến khi chống

lại các tế bào của người nhận gây ra ghép chống chủ còn chống lại cả các tế bào bất thường gây ra phản ứng ghép chống khối u

Kết luận này dẫn đến ý tưởng xây dựng một dạng phác đồ điều kiện hóa gọi

là điều kiện hóa giảm liều (RIC) để giảm tác dụng ức chế miễn dịch ở mức đủ để ngăn ngừa thải ghép nhưng tạo điều kiện cho phản ứng ghép chống khối u có thể

xảy ra Bên cạnh đó các phác đồ điều kiện hóa giảm liều sẽ có độc tính thấp hơn, tỷ

lệ biến chứng thấp hơn và tỷ lệ tử vong thấp hơn Một số phác đồ điều kiện hóa

giảm liều như là Fludarabin + Cyclophosphamide, Fludarabin + Busulfan + ATG,… Các phác đồ điều kiện hóa giảm liều rất có giá trị trong ghép tế bào gốc

tạo máu cho các bệnh nhân lớn tuổi

1.1.6 Ch ỉ định ghép TBG đồng loại

Các bệnh máu ác tính (chiếm khoảng 75%): Lơ xê mi cấp dòng tuỷ; Lơ xê

mi kinh dòng bạch cầu hạt, Lơ xê mi cấp dòng lympho, U lympho ác tính không Hodgkin, Hội chứng rối loạn sinh tuỷ, Hội chứng thực bào máu, Lơ xê mi kinh dòng lympho…

Một số bệnh máu khác: Suy tuỷ xương, hội chứng thiếu hụt miễn dịch (bệnh Chediak-Higashi, hội chứng thiếu hụt miễn dịch kết hợp mức độ nặng), bệnh tự

miễn, Thalassemia, bệnh rối loạn chuyển hoá đường (mucopolysaccharidose) [3]

1.1.7 Các bước kỹ thuật trong ghép TBG đồng loại

Chuẩn bị và thu nhận TBG

a Ngu ồn TBG từ máu ngoại vi

- Huy động TBG từ máu ngoại vi của người hiến phù hợp HLA bằng các thuốc kích thích sinh bạch cầu như:

+ G-CSF: Tiêm dưới da G-CSF:10g/kg cân nặng/ngày, chia hai lần, cách nhau 12 giờ

+ Plerixafor (mozobil, AMD3100): 0,24mg/kg/ngày tiêm dưới da ngày 1 lần trước khi gạn TBG 4-12 giờ; lưu ý không được quá 40mg/ngày

+ Pegfilgrastim: 12mg/ lần, tiêm dưới da, thường gạn tách TBG vào ngày

+ Số lượng TBG cần gạn: ≥ 3x106 CD34+ / kg cân nặng người bệnh

- Xử lý TBG: Khối TBG có thể cần được xử lý trước khi truyền cho người

bệnh hoặc trước khi bảo quản âm sâu

- Bảo quản khối TBG sau gạn tách bằng 1 trong 2 phương pháp sau:

+ Nhiệt độ 2°C đến 8°C: Chỉ trong 72 giờ, nên khi kết thúc phác đồ điều kiện hóa cho người bệnh đồng thời cũng là thời gian kết thúc gạn tách TBG ở người

hiến

+ Điều kiện âm sâu (-196oC): Gạn tách TBG cho người hiến trước để lấy đủ

số lượng CD34+ ≥ 3x106/kg cân nặng người bệnh, sau đó sẽ tiến hành điều kiện hoá cho người bệnh [3]

b Ngu ồn TBG từ máu tủy xương

- Lấy TBG ở gai chậu sau trên; hoặc trước trên hoặc ở xưong ức trong trường

c Ngu ồn TBG từ máu cuống rốn

- Liều TBG cần thiết truyền: Từ 1.7 dến 3.5 x 107 tế bào có nhân/kg cân

nặng người bệnh

- Lựa chọn đơn vị máu cuống rốn phù hợp dể ghép: dựa trên xét nghiệm HLA độ phân giải cao giữa người bệnh và đơn vị máu cuống rốn

1.1.8 Các phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu

Bước đầu tiên trong mọi quy trình ghép tế bào gốc tạo máu là giai đoạn chuẩn bị cho bệnh nhân Giai đoạn này có ba nhiệm vụ bao gồm: tạo ra khoảng

trống trong tủy xương, ức chế miễn dịch và loại bỏ tế bào bệnh Trong đó mục đích chính là loại bỏ tế bào bệnh ở bệnh nhân Có thể sử dụng hóa trị và kết hợp thêm xạ

trị toàn thân để loại bỏ tế bào bệnh

Tuy nhiên đối với trẻ em, khi sử dụng các biện pháp toàn thân để loại bỏ tế bào bệnh ví dụ như chiếu xạ toàn thân, có thể dẫn đến các biến chứng muộn như

chậm phát triển, dậy thì muộn đặc biệt quan trọng với lứa tuổi nhỏ Hơn nữa các nghiên cứu cho thấy không có khác biệt về mặt tiên lượng giữa sử dụng hóa trị đơn độc và kêt hợp chiếu xạ toàn thân Vậy nên cần tránh chiếu xạ với trẻ ít tuổi và không dùng với trẻ dưới hai tuổi [57]

a Ghép t ế bào gốc tự thân

Ghép tế bào gốc tự thân – Autologous HSCT là hình thức ghép trong đó khối

tế bào gốc tạo máu được lấy chính từ người được ghép và truyền trả lại cho bệnh nhân sau khi đã kết thúc điều kiện hóa Phương pháp này dùng phối hợp với hóa trị

liệu liều cao [11]

b Ghép t ế bào gốc đồng loài

Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài – Allogeneic HSCT là hình thức ghép trong đó khối tế bào gốc tạo máu được lấy từ anh, chị, em ruột hay người cho không cùng huyết thống nhưng hòa hợp HLA truyền cho bệnh nhân sau khi đã kết thúc điều kiện hóa Mục đích của phương pháp này là sửa chữa thay thế các tế bào gốc

tạo máu bị tổn thương, tạo hiệu quả mảnh ghép chống khối u và hỗ trợ hóa trị liều cao [11]

1.1.9 T ầm quan trọng của hệ miễn dịch HLA trong ghép tế bào gốc tạo máu

Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA-Human Leucocyte Antigen) là một

hệ thống gồm nhiều nhóm kháng nguyên có mặt tên bạch cầu và nhiều loại tế bào,

mô cơ thể, có vai trò quan trọng trong vấn đề miễn dịch của cơ thể Hệ HLA có vai trò quan trọng trong vấn đề miễn dịch của cơ thể và có nhiều ứng dụng trong phát

hiện một số bệnh lý, xác định tiên lượng đặc biệt là có vai trò quan trọng trong ghép

tế bào gốc tạo máu cũng như ghép tạng [6]

a Đặc điểm và tầm quan trọng của hệ miễn dịch HLA trong ghép tế bào gốc tạo máu

Trên mọi tế bào có nhân đều có phân tử HLA lớp I đánh dấu đặc tính và làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên cho tế bào Lympho T-CD8, nhằm tránh nhận biết

và tiêu diệt kháng nguyên cũng như cả tế bào đó Còn trên các tế bào có thẩm quyền

miễn dịch lại có thêm các phân tử HLA lớp II làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho T-CD4 khởi phát cho quá trình đáp ứng miễn dịch

Do có tính đa hình cao, rất khó tìm được 2 người giống nhau hoàn toàn về kháng nguyên HLA Trường hợp mảnh ghép có HLA khác với HLA cơ thể nhận, cơ

thể nhận sẽ sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại HLA khác biệt đó nhằm loại

trừ tế bào, mô ghép

Trong phản ứng thải ghép, những tế bào xâm nhiễm mảnh ghép đầu tiên là tế bào đơn nhân phản ứng dị gen, phần lớn là tế bào T-CD8 Các tế bào này xâm nhập

mảnh ghép và nhận diện cấu trúc phân tử HLA dị gen có trên các tế bào mảnh ghép

Mảnh ghép dị gen cũng có mang hai loại phân tử HLA nhưng của cơ thể người cho khác gen nên sẽ có khác biệt về cấu trúc không gian 3 chiều Các kháng nguyên HLA khác biệt này là đích nhận diện cho các tế bào T-CD8 của người nhận Trước hết là các tế bào có khả năng trình diện kháng nguyên đến tiếp xúc vào các tế bào mảnh ghép có mang HLA dị gen, xử lý và trình diện các phân tử dị gen này với các tế bào lympho T-CD4 Các tế bào này khi được hoạt hóa tiết ra các cytokin IL-

2, IFN-γ, TNF-α, làm tăng sinh tế bào T-CD8 gây độc đặc hiệu và tăng ỗ trợ lympho B tiết kháng thể đặc hiệu chống HLA Kháng thể đặc hiệu kháng HLA bám lên bề mặt các tế bào mảnh ghép sẽ làm tăng cường phản ứng độc tế bào phụ thuộc

kháng thể Các tế bào T-CD8 sau khi nhận diện các tế bào mảnh ghép có mang HLA lạ thông qua phân tử HLA lớp I sẽ tiêu diệt các tế bào mảnh ghép [1, 11, 16]

b Tiêu chu ẩn về phù hợp HLA trong ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài

Dưới đây là khuyến cáo về mức độ hòa hợp HLA sử dụng trong ghép TBG

tạo máu đồng loài [27]

B ảng 1.2: Khuyến cáo về mức độ hòa hợp HLA sử dụng trong ghép TBG tạo

máu đồng loài

nhận Anh, chị, em ruột cùng cha mẹ hòa hợp

HLA –A, -B, -C; HLA DRB1

Với không quá 2 điểm không tương thích mỗi locus

Người hiến không cùng huyết thống Hòa hợp 7/8;

HLA –A, -B, -C; HLA DRB1

HLA –A, -B; HLA DRB1

1.2 T ổng quan về bệnh nhân ghép TBG

Ghép TBG tạo máu là phương pháp chỉ định trên nhiều nhóm bệnh, bao gồm các bệnh lý về máu ác tính, lành tính hoặc rối loạn chuyển hóa [9] Trong đó, chỉ định ghép TBG tạo máu đồng loài phổ biến nhất là các nhóm bệnh lý bạch cầu và nhóm bệnh tăng sinh tủy [36]

Nguồn ghép TBG có thể từ tủy xương, máu dây rốn hoặc máu ngoại vi Việc

lựa chọn nguồn ghép phụ thuộc vào đặc điểm tương thích của người hiến và người ghép Với ưu điểm phục hồi hệ thống tạo máu nhanh, dễ dàng thu TBG nên lấy nguồn TBG từ máu ngoại vi có thể được ưu tiên trên bệnh nhân có nguy cơ thất bại cao, nhiễm trùng trong giai đoạn sớm sau ghép Ngược lại, nguồn từ tủy xương có

thể được ưu tiên trên những chỉ định bệnh có khả năng tái phát cao sau ghép [54] Nguồn máu dây rốn sẽ được cân nhắc trong trường hợp nguồn từ nguời hiến có cùng huyết thống không phù hợp Hạn chế của nguồn máu dây rốn bao gồm nguy

cơ thất bại cao, khả nang phục hồi miễn dịch chậm, thiếu các nguồn bổ sung từ nguời hiến (truyền tế bào lympho từ nguời hiến)[54] Trước khi ghép, bệnh nhân sẽ được đánh giá khả năng tương thích với nguồn ghép thông qua khả năng hòa hợp kháng nguyên HLA (Human Leucocyte Antigen) Hệ kháng nguyên bạch cầu người (Human Leucocyte Antigen – HLA) là một hệ thống gồm nhiều nhóm kháng nguyên có mặt trên bạch cầu, nhiều loại tế bào và mô của cơ thể Trong trường hợp

tế bào có HLA lạ, cơ thể sẽ sinh ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại tế bào ghép (chủ chống ghép) và ngược lại là hiện tượng tế bào truyền vào cơ thể chống lại

tế bào chủ (ghép chống chủ) [44]

1.3 T ổng quan về người hiến tế bào gốc

Người hiến TBG tốt nhất là anh chị em ruột có HLA phù hợp vì sẽ làm giảm nguy cơ ghép chống chủ, luôn sẵn có và có thể cho tế bào gốc bất cứ lúc nào Anh

em sinh đôi cùng trứng xét trên quan điểm miễn dịch là người hiến lý tưởng nhất Tuy nhiên tỷ lệ tái phát của những trường hợp này thường cao Điều này có thể giải thích là do khi ghép sinh đôi cùng trứng không có được hiệu ứng ghép chống lơ xê

mi

Anh chị em, bố mẹ, con cái với bệnh nhân, phù hợp HLA bán toàn phần, cũng là nguồn người hiến TBG, tuy nhiên bệnh nhân thường bị thất bại mọc mảnh ghép và tỷ lệ ghép chống chủ cao Trên thực tế chỉ có khoảng 30% bệnh nhân là có người hiến phù hợp HLA hoàn toàn trong số anh chị em ruột

Khó khăn này đã dẫn đến việc thực hiện ghép tế bào gốc tạo máu từ người

hiến không cùng huyết thống nhưng phù hợp HLA đó là những người hiến TBG tình nguyện Các ngân hàng tế bào gốc tạo máu đã được xây dựng với số lượng người đăng ký sẵn sàng hiến tế bào gốc lên đến khoảng 10 triệu người Theo đa số

các nghiên cứu trên thế giới, người hiến tối thiểu cần phù hợp với bệnh nhân ở mức 5/6: HLA A, B, DR và đây là những allens quan trọng Trong một số trường hợp, đặc biệt khi người hiến không cùng huyết thống, cần có thêm sự phù hợp của HLA

C, DQ và DP Sự không phù hợp của HLA C và DQ có thể dẫn đến hiện tượng thất

thống tạo máu và miễn dịch của nguời bệnh dần được tái tạo dẫn dến các chỉ số xét nghiệm trên bệnh nhân HSCT biến đổi nhiều sau khi ghép Ðồng thời, trong giai đoạn đầu sau ghép, hệ miễn dịch yếu khiến bệnh nhân rất dễ nhiễm khuẩn, nhiễm virus, nấm cung như gặp nhiều biến chứng khác như hội chứng mọc mảnh ghép,

bệnh ghép chống chủ, viêm loét niêm mạc miệng, hội chứng tắc mạch xoang gan,

biến chứng phổi không do nhiễm trùng [24]

1.5 B ệnh ghép chống chủ

Ghép chống chủ (Graft-versus-host disease GvHD) là biến chứng nặng, đe

dọa tính mạng của bệnh nhân ghép TBG tạo máu đồng loài, tần suất xảy ra khoảng 40-80% [29] Các tế bào bạch cầu trong hệ thống miễn dịch của người hiến phản ứng với kháng nguyên của người nhận trên màng tế bào trình diện kháng nguyên Khi đó, tế bào T của người hiến nhận ra là các kháng nguyên không thuận hợp của người nhận là “lạ” Các tế bào T này được hoạt hóa, phát triển, tấn công mô và gây

ra các triệu chứng lâm sàng của GvHD

Biến chứng của ghép chống chủ gặp trên cả bệnh nhân cả bệnh nhân không hòa hợp HLA và cả người cùng huyết thống hòa hợp HLA Theo thời gian tiềm tàng, GVHD được chia làm 2 loại: ghép chống chủ cấp tính và mạn tính Liệu pháp

dự phòng áp dụng chủ yếu cho nguy cơ ghép chống chủ cấp do đây là một trong

những yếu tố quan trọng nhất dẫn đến ghép chống chủ mạn Biểu hiện của bệnh ghép chống chủ cấp chủ yếu trên da, đường tiêu hóa và ít gặp hơn là trên gan [26]

Các yếu tố nguy cơ khiến xảy ra ghép chống chủ cấp bao gồm: sự khác biệt HLA, độ tuổi, giới tính, nguồn ghép, phác đồ điều kiện hóa và phác đồ dự phòng không hiệu quả [48]

1.5.1 B ệnh ghép chống chủ cấp [3]

Chẩn đoán aGVHD dựa vào triệu chứng lâm sàng ở da, gan và ống tiêu hóa

Biểu hiện ở da thường gặp nhất trong aGVHD, chiếm trên 75% người bệnh Các nốt sần ngứa gặp ở lòng bàn tay và lòng bàn chân Biểu hiện nặng hơn là khô

cứng da hoặc tróc vảy

Biểu hiện ở ống tiêu hóa bao gồm buồn nôn, nôn, đau bụng, rối loạn tiêu hóa

Nội soi ống tiêu hóa cho thấy niêm mạc phù nền hoặc tạo thành màng cứng Sinh thiết tổn thương giúp chẩn đoán phân biệt aGVHD với các bệnh lý khác

Biểu hiện ở gan ít gặp, chiếm 20% trong số các người bệnh có aGVHD; biểu

hiện vàng da, gan to và tăng men gan

1.5.2 B ệnh ghép chống chủ mạn

GVHD mãn tính thường bắt đầu hơn 3 tháng sau khi cấy ghép, và có thể kéo dài suốt đời Các triệu chứng mãn tính gây tổn thương trên các cơ quan như:

• Da: Dạng sừng hoá, xơ cứng; mất hoặc tăng sắc tố; ban sẩn;

• Móng: Loạn dưỡng, khía và dễ gãy

• Miệng: Dạng sừng hoá, hạn chế há miệng; khô miệng, teo niêm mạc miệng,

giả mạc và loét; ban đỏ, đau

• Mắt: Khô, viêm kết mạc, sợ ánh sáng, viêm bờ mi, tăng sắc tố quanh mắt

• Ống tiêu hoá: Ăn không ngon, buồn nôn, nôn; tiêu chảy; xơ hẹp thực quản

• Gan: Tăng bilirubin, tăng men gan

• Phổi: Viêm phế quản tắc nghẽn

• Cơ, khớp và dây chằng: Xơ cứng khớp, viêm cơ, viêm hoặc đau khớp

• Hệ máu và miễn dịch: Giảm tiểu cầu, tăng bạch cầu ưa acid; tăng hoặc giảm globulin