Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc tạo máu sau lưu trữ đông lạnh

Tổng quan về phân loại tế bào gốc, tế bào gốc tạo máu, các phương pháp thu thập, xử lý, lưu trữ tế bào gốc tạo máu; ứng dụng của tế bào gốc tạo máu trong điều trị bệnh lý ác tính; tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam; đối tượng và phương pháp nghiên cứu; kết quả và bàn luận.

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM TẠO CỤM CỦA MẪU TẾ BÀO GỐC

TẠO MÁU SAU LƯU TRỮ ĐÔNG LẠNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

V Ũ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM TẠO CỤM CỦA MẪU TẾ BÀO GỐC TẠO

MÁU SAU LƯU TRỮ ĐÔNG LẠNH

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi Các số liệu

sử dụng phân tích trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và đã được cho phép sử

dụng của cơ sở nơi tôi thực hiện nghiên cứu này Các kết quả của nghiên cứu là do tôi

thực hiện một cách trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào trước đây

H ọc viên

Vũ Thu Huyền

L ỜI CẢM ƠN

Trân trọng cảm ơn các thầy hướng dẫn: TS Trần Ngọc Quế (Giám đốc Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học – Truyền máu TW), PGS.TS Khuất Hữu Thanh (Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà

Nội) và các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại

học Bách khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong

suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Xin được bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết Truyền máu TW, nơi tôi công tác và cũng là nơi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu hoàn thành luận văn

học-H ọc viên

Vũ Thu Huyền

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT

AABB American Association of

BFU-E Burst forming unit-erythroid Đơn vị tạo cụm hồng cầu lớn

CFU-E Colony forming unit-erythroid Đơn vị tạo cụm hồng cầu nhỏ

CFU-G Colony forming unit-

CFU-GEMM

Colony forming unit- granulocyte, erythrocyte, monocyte, megakaryocyte

CFU-lympho Colony forming unit-lympho Đơn vị tạo cụm dòng lympho

CFU-Meg Colony forming unit-

CSF Colony stimulating factor Yếu tố kích thích tạo cụm

hạt-HPC Hematopoietic progenitor cell Tế bào đầu dòng tạo máu

DANH M ỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Sơ đồ sinh máu

Hình 2 C ấu trúc của phân tử CD34

Hình 4.1 M ột số hình ảnh cụm tế bào sau 14 ngày nuôi cấy

Hình 4.2 M ột số hình ảnh cụm tế bào sau 14 ngày nuôi cấy

DANH M ỤC BẢNG

B ảng 1 Các kháng nguyên b ề mặt biểu hiện trên tế bào gốc tạo máu

B ảng 2 Hướng dẫn nhận diện các loại cụm tế bào dưới kính hiển vi

B ảng 4.1 M ột số đặc điểm chung của mẫu nuôi cấy

B ảng 4.2 Đặc điểm cụm tế bào trong 1 đĩa nuôi cấy (d=35mm)

B ảng 4.3 S ố cụm tế bào trung bình trong 1 đơn vị lưu trữ

B ảng 4.4 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu thuộc nhóm bệnh nhân

B ảng 4.5 Đặc điểm chung theo nhóm bệnh lý

B ảng 4.6 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu thuộc nhóm người hiến

B ảng 4.7 Tương quan giữa một số yếu tố giữa nhóm người hiến và bệnh nhân

B ảng 4.8 S ố lượng cụm tế bào trung bình trong 1 đĩa nuôi cấy

B ảng 4.9 Tương quan về số lượng cụm tế bào gốc trung bình trong 1 đĩa nuôi cấy

(d=35mm) theo nhóm b ệnh trong nghiên cứu

B ảng 4.10 Ảnh hưởng của thời gian lưu trữ đến số lượng cụm tế bào của mẫu tế bào

g ốc máu dây rốn

B ảng 4.11 Tương quan giữa các yếu tố trong nghiên cứu và số lượng các loại cụm

trong m ẫu tế bào gốc máu dây rốn

B ảng 4.12 Tương quan giữa các yếu tố trong nghiên cứu và số lượng các loại cụm

trong m ẫu tế bào gốc máu ngoại vi

B ảng 4.13 Kh ả năng tạo cụm tế bào gốc của 1 tế bào CD34 giữa nhóm hai nhóm

nghiên c ứu

B ảng 4.14 Đặc điểm về thời gian lưu trữ và tỷ lệ tế bào sống sau rã đông

M ỤC LỤC

PH ẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PH ẦN 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Khái niệm và phân loại tế bào gốc 3

2.2 T ế bào gốc tạo máu 4

2.2.1 T ế bào gốc máu dây rốn 9

2.2.2 T ế bào gốc máu ngoại vi 10

2.3 Các phương pháp thu thập, xử lý, lưu trữ tế bào gốc tạo máu 11

2.4 Các phương pháp đánh giá chất lượng đơn vị tế bào gốc tạo máu 11

2.4.1 Các phương pháp chung 11

2.4.2 Nuôi c ấy cụm tế bào 13

2.5 Ứng dụng của tế bào gốc tạo máu trong điều trị bệnh lý ác tính 15

2.6 Tình hình nghiên c ứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam 17

PH ẦN 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 V ật liệu, thiết bị và hóa chất 20

3.2 Phương pháp nghiên cứu 21

3.2.1 Thi ết kế nghiên cứu: 21

3.2.2 Phương pháp chọn mẫu 21

3.2.3 Các thông số nghiên cứu 22

3.2.4 X ử lý số liệu trong nghiên cứu 22

3.2.5 Quy trình k ỹ thuật áp dụng trong nghiên cứu 22

3.2.5 Tính toán, bi ện luận và đọc kết quả 24

PH ẦN 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

4 1 K ết quả 28

4.1.1 Đặc điểm tạo cụm tế bào gốc máu dây rốn 28

4.1.2 Đặc điểm tạo cụm tế bào gốc máu ngoại vi 29

4.1.3 M ối liên quan giữa đặc điểm tạo cụm tế bào gốc và một số yếu tố 33

4.1.4 So sánh m ột số đặc điểm giữa hai nhóm nghiên cứu 35

4.2 Bàn luận 36

4.2.1 Đặc điểm cụm tế bào có nguồn gốc từ máu dây rốn 37

4.2.2 Đặc điểm cụm tế bào có nguồn gốc từ máu ngoại vi 38

4.2.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy cụm tế bào 40

4.2.4 So sánh đặc điểm tạo cụm giữa các nhóm nghiên cứu 42

PH ẦN 5 KẾT LUẬN 43

PH ẦN 6 KHUYẾN NGHỊ 44

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 45

1

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Tế bào gốc tạo máu (HSC: Hematopoietic Stem Cell) đã được nghiên cứu hơn

nửa thế kỷ nay và là một trong những lĩnh vực tiến bộ và nổi bật nhất trong y sinh học

hiện đại Tế bào gốc tạo máu là loại tế bào có thể thấy ở tủy xương, máu ngoại vi và máu dây rốn Chúng tạo ra những tế bào máu và tế bào có thẩm quyền miễn dịch, đáp ứng cho sự đổi mới hằng định về số lượng và chức năng của máu

Ghép tế bào gốc nói chung, hiện nay được coi là một liệu pháp tiềm năng, ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực Trong số đó nổi bật là ghép tế bào gốc tạo máu, đây là phương pháp điều trị các bệnh lý ung thư, di truyền có thể đưa lại cơ hội sống cho

những bệnh nhân bị mắc bệnh lý thuộc chuyên khoa huyết học Tế bào gốc có thể lấy được từ nhiều nguồn như: từ máu dây rốn, từ tủy xương hoặc từ máu ngoại vi Phương pháp thu thập tế bào gốc từ máu dây rốn và máu ngoại vi hiện nay đã trở nên phổ biến

và chiếm ưu thế hơn so với phương pháp lấy dịch tủy xương vì đây là các phương pháp

hiện đại, với nhiều ưu điểm: không cần gây mê, thủ thuật ít xâm lấn, tiết kiệm thời gian, dễ thực hiện, chủ động trong việc thu thập tế bào gốc, sản phẩm tinh sạch hơn, không lẫn những thành phần khác (như hạt mỡ, cặn xương…) Đối với tế bào gốc từ máu ngoại vi có thể thu thập từ người hiến cùng huyết thống (ghép đồng loài) hoặc từ chính bệnh nhân (ghép tự thân) Đối với tế bào gốc từ máu dây rốn được thu thập từ các sản phụ hiến tình nguyện máu dây rốn của con vào ngân hàng tế bào gốc máu dây

rốn cộng đồng (được xem là nguồn ghép phong phú và luôn sẵn sàng cho các bệnh nhân có nhu cầu ghép) hoặc thu thập theo hình thức lưu trữ cá nhân trong ngân hàng máu dây rốn dịch vụ

Các mẫu máu sau quá trình thu thập, sẽ trải qua quy trình xử lý để thu thập tế bào

gốc và sau đó các mẫu tế bào gốc được lưu trữ để chuẩn bị cho ghép Đối với nguồn máu dây rốn là 100% các mẫu đều được lưu trữ đông lạnh trước khi sử dụng Đối với nguồn tế bào gốc máu ngoại vi thì ngoại trừ các ca ghép có chỉ định truyền tươi (mẫu sau thu thập được truyền cho bệnh nhân trong vòng 48 giờ) còn đa số các mẫu sau thu

2

thập và xử lý cần được lưu trữ đông lạnh để chờ bệnh nhân hoàn thiện quá trình điều

kiện hóa trước ghép Chính vì trải qua thời gian lưu trữ đông lạnh nên việc kiểm tra

chất lượng của mẫu tế bào gốc là cần thiết và quan trọng Việc thực hiện đánh giá chất lượng mẫu tế bào gốc sau lưu trữ, giúp đem lại các thông tin cần thiết để hỗ trợ việc ứng dụng cũng như cải thiện các quy trình tạo nguồn tế bào gốc Một trong số những

phương pháp được giới chuyên môn Thế giới khuyến cáo dùng để đánh giá chất lượng

mẫu tế bào gốc sau lưu trữ là nuôi cấy mẫu tế bào gốc trên môi trường nuôi cấy chuyên

biệt Căn cứ vào đặc điểm của các cụm tế bào về hình thái (các tế bào trong cụm có hình thái rõ ràng hay dính sát hoặc chồng lấp vào nhau), tính chất (cụm hồng cầu, bạch

cầu, hỗn hợp), số lượng cụm mọc trên môi trường để đưa ra đánh giá sơ bộ về chất lượng của mẫu tế bào gốc đó

Tại Việt Nam, việc ứng dụng tế bào gốc trong điều trị đã được thực hiện thành công tại các bệnh viện như Viện Huyết học-Truyền máu TW, Bệnh viện Nhi TW, Bệnh

viện Bạch Mai, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học Tp Hồ Chí Minh, Bệnh viện TW

Huế Song song với đó các nghiên cứu về tế bào gốc cũng được đẩy mạnh và đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học được công bố trong lĩnh vực này Tuy nhiên, trong các nghiên cứu về đánh giá chất lượng mẫu tế bào gốc nói chung được công bố thì việc đi sâu nghiên cứu về đặc điểm tạo cụm tế bào còn rất hạn chế

Xuất phát từ thực tế đó, em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc tạo máu sau lưu trữ đông lạnh” với các mục đích sau:

1) Xác định đặc điểm cụm tế bào của mẫu tế bào gốc máu dây rốn và mẫu tế bào gốc máu ngoại vi;

2) Xác định mối tương quan giữa đặc điểm tạo cụm tế bào với một số chỉ số

về đặc điểm của mẫu tế bào gốc như: số lượng tế bào có nhân, số lượng tế bào CD34, tỷ lệ sống, thời gian lưu trữ

3

PHẦN 2: TỔNG QUAN 2.1 Khái ni ệm và phân loại tế bào gốc

Tế bào gốc là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, chúng có khả năng tăng sinh mạnh mẽ, có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới Có nhiều cách phân loại và gọi tên tế bào gốc khác nhau tuỳ theo tiêu chí phân loại, ví dụ như dựa trên nguồn gốc, thời điểm phân lập, tiềm năng biệt hoá Theo tác giả Phan Kim Ngọc (2008) có thể chia các tế bào gốc hiện đang được quan tâm thành các loại sau:1]

- Tế bào gốc phôi (enbryonic stem cell), chính xác là các tế bào gốc từ phôi, được phân lập từ phôi (bất kỳ phần nào của phôi, không giới hạn, chỉ vào các tế bào của khối

tế bào bên trong phôi nang), là các tế bào gốc toàn năng hoặc vạn tiềm năng

- Tế bào gốc nhũ nhi (infant stem cell) được phân lập từ thai nhi hoặc các phần

phụ của thai như dây rốn, nhau thai, màng ối, dịch ối… Các tế bào này thường là đa

tiềm năng hoặc vạn tiềm năng Tùy theo cách thu thập có thể ảnh hưởng hoặc không ảnh hưởng đến đối tượng cho tế bào

- Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) được phân lập từ các mô của người từ

trẻ em đến người già Các tế bào này rất đa dạng, từ đa tiềm năng đến tiềm năng Ví dụ thu thập tế bào gốc từ máu ngoại vi huy động; thu thập dịch tủy xương để có tế bào gốc

tủy xương

- Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPS: Induced pluripotent stem cell): được tạo ra

bằng cách cảm ứng các tế bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như tế bào

gốc phôi hay còn gọi là tế bào gốc nhân tạo Đây là kỹ thuật chủ yếu thao tác trong phòng thí nghiệm, người cho tế bào để cảm ứng (ví dụ tế bào da) bị ảnh hưởng rất ít, có

thể là sinh thiết để lấy một miếng da nhỏ

4

- Tế bào gốc ung thư (cancer stem cell) được phân lập từ các khối u Các tế bào

gốc này được coi là nguồn gốc của khối u

Theo tác giả Anna Hordyjewska (2014), tế bào gốc là những tế bào có khả năng tăng sinh, tái tạo và biến đổi thành những tế bào có hoạt động chức năng hoặc các loại

tế bào gốc khác Có nhiều loại tế bào gốc khác nhau, tương ứng với từng giai đoạn của

cơ thể và bộ phận liên quan Hợp tử và phôi là những tế bào gốc đầu tiên phát triển trong cơ thể con người Các tế bào này có khả năng biệt hóa thành bất kỳ tế bào nào trong cơ thể nên chúng còn được gọi là những tế bào gốc toàn năng hay vạn năng Trong các giai đoạn phát triển sau đó của phôi, khả năng biệt hóa của tế bào gốc bị giới

hạn dần Chúng chuyển thành nhiều nhóm tế bào gốc với các chức năng riêng để tăng sinh và biệt hóa thành các nhóm cơ quan của cơ thể như ngoại bì, trung bì và nội bì, do

đó chúng được gọi là các tế bào gốc đa năng Trong phôi thai, những tế bào này thường không biến đổi được trở lại thành các tế bào gốc toàn năng hoặc biến đổi thành các bộ

phận khác mà chỉ có thể tự nhân lên và biệt hóa tiếp tục thành các dòng tế bào nằm trong định hướng riêng dành cho chúng Những giai đoạn sau đó, các tế bào gốc đa năng biến đổi thành các tế bào gốc đầu dòng của các cơ quan cụ thể và từ đó biệt hóa thành các tế bào trưởng thành có nhiệm vụ chức năng

2.2 T ế bào gốc tạo máu

Tất cả tế bào máu trong cơ thể như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu… đều bắt nguồn

từ một nhóm tế bào gốc có khả năng tăng sinh, biệt hóa, gọi là tế bào gốc tạo máu (HSC: Hematopoietic stem cell) Các tế bào gốc tạo máu khi biệt hóa ở mức độ cao hơn, giảm hoặc không còn khả năng tự tái tạo nữa, được gọi là tế bào đầu dòng tạo máu (HPC: Hematopoietic progenitor cell) Quá trình các tế bào gốc tạo máu và tế bào đầu dòng tạo máu biệt hóa tạo thành các tế bào máu trưởng thành gọi là sự sinh máu [17]

Trong bậc thang của quá trình sinh máu, tế bào gốc tạo máu nằm ở đỉnh của quá trình và từ đó tạo nên các tế bào có chức năng.Vì hầu hết các tế bào trưởng thành có

5

đời sống khá ngắn nên sự sinh máu diễn ra gần như liên tục Người ta ước tính mỗi giây có khoảng 1,5 triệu tế bào máu mới được sinh ra trong cơ thể một người trưởng thành [2] Tế bào gốc tạo máu không chỉ có khả năng tăng sinh rất mạnh mà còn có đáp ứng rất tốt đối với cân bằng nội môi trong cơ thể Điều này dựa trên sự giải phóng các

yếu tố kích thích tăng trưởng để điều tiết sự sinh máu như EPO, G-CSF, TPO… tùy theo số lượng tế bào máu có trong cơ thể, giúp cho số lượng tế bào sinh ra và chết đi luôn ở trạng thái cân bằng

Hoạt động sinh máu diễn ra từ khi cơ thể bắt đầu hình thành phôi và trải qua mỗi giai đoạn phôi hoặc thai sẽ có một cơ quan đảm nhận nhiệm vụ sinh máu Các tế bào máu bắt nguồn từ một quần thể các tế bào gốc tạo máu có chức năng tự tăng sinh, tự đổi mới và biệt hóa thành các dòng tế bào riêng biệt như dòng tủy, dòng lympho…[8]

Sự tạo máu của thai bắt đầu khoảng 2-3 tuần sau khi thụ thai và ban đầu được đảm nhiễm bởi túi noãn Trong suốt quá trình phát triển của thai, vai trò tạo máu được dần

dần chuyển giao sang gan, lách và cuối cùng là tủy xương Mỗi tế bào gốc tạo máu mỗi

lần phân chia sẽ tạo thành 2 tế bào con, 1 tế bào là bản thân nó (vẫn là HSC) và một tế bào đầu dòng tạo máu (HPC) HPC khác với HSC ở chỗ chúng không giữ khả năng tự đổi mới như HSC mà chỉ có khả năng tiếp tục biệt hóa thành các dòng tế bào thế hệ

tiếp sau nó mà không có chiều ngược lại [3] HPC có thể biến đổi thành các đơn vị tạo

cụm của dòng tủy bao hàm tất cả dòng bạch cầu hạt, hồng cầu, đại thực bào và mẫu

tiểu cầu (CFU-GEMM) hoặc dòng lympho (CFU-lympho) Các đơn vị tạo cụm này lại

tiếp tục tăng sinh và biệt hóa thành các đơn vị tạo cụm của các dòng tế bào cụ thể hơn như dòng hồng cầu (CFU-E), dòng mẫu tiểu cầu (CFU-Meg), dòng hạt-đại thực bào (CFU-GM)… là những tế bào đầu dòng để biệt hóa thành các tế bào trưởng thành tương ứng như hồng cầu, bạch cầu hạt, tiểu cầu…[13] Đây là đặc điểm quan trọng giúp nhận diện sự có mặt của các tế bào gốc tạo máu trong môi trường nuôi cấy chuyên

biệt

6

Hình 1: Sơ đồ sinh máu [45]

Tế bào gốc tạo máu ở người nói chung có hình thái là một tế bào kích thước nhỏ

với nguyên sinh chất khá hẹp, khó xác định các bào quan như ti thể, lưới nội sinh

7

chất[3] Chúng có khả năng tăng sinh, tự đổi mới và biệt hóa đa dòng thành nhiều dòng

tế bào máu khác nhau Tế bào gốc tạo máu thường duy trì ở pha G0 của chu trình tế bào, không có hoạt động chuyển hóa và hầu như không sinh tổng hợp protein Do đó, khi nhuộm với một số chất màu huỳnh quang như Rhodamine 123 (nhuộm màng ti

thể), Hoechest 33342 (nhuộm dsADN nhân) hay Pyronin Y (nhuộm ARN), tế bào chỉ

bắt màu nhạt [3] Khi hoạt hóa, tế bào gốc tạo máu sẽ chuyển từ pha G0 sang pha G1,

thể hiện ở việc tăng dịch mã và tạo ARN thông tin Những tế bào này sẽ chuyển từ

dạng HSC sang dạng HPC với những đặc tính như kích thước lớn hơn, hình tròn, nhân

lớn, nguyên sinh chất hẹp [1]

Hình 2 C ấu trúc của phân tử CD34 [1]

Điểm đặc trưng của tế bào gốc tạo máu cũng như tế bào đầu dòng tạo máu là dấu

ấn CD34 trên bề mặt Đây là một glycoprotein có kích thước khoảng 104-120 kDa, là

8

một dạng phân tử bám dính còn được biết đến với tên gọi sialomucines [3] Nó bao hàm một phần nhân protein 40 kDa chứa 6-9 vị trí glycosyl hóa với gắn nitơ và 9 vị trí glycosyl hóa gắn oxy [1] Kháng nguyên CD34 tham gia vào chức năng điều hòa sự bám dính của tế bào gốc tạo máu với mô đệm của tủy xương [1] Tế bào càng biểu hiện

mạnh CD34 thì càng dự báo khả năng biệt hóa Gallacher và cs (2000) đã phân lập tế bào CD34- từ tủy xương của chuột và nhận thấy chúng có khả năng phân chia 300 lần

so với tế bào có CD34+ [1]

Các nguồn tế bào gốc tạo máu gồm: dịch tủy xương, máu ngoại vi huy động và máu dây rốn Tủy xương được coi là cơ quan tạo máu chủ yếu trong cơ thể người từ khi sinh ra Các thành phần tủy xương được sử dụng phổ biến nhất trong việc chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh lý của hệ thống tạo máu như dịch tủy xương, mô tủy xương… ,[15] Khi bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tạo máu trong điều

trị, dịch chọc hút tủy xương cũng được sử dụng sớm nhất và hiện nay vẫn đang là nguồn tế bào gốc được sử dụng mạnh mẽ nhất Trong tủy xương có đủ các thành phần

của tế bào tạo máu với tất các lứa tuổi biệt hóa khác nhau và số lượng khá dồi dào Thành phần tế bào gốc tạo máu có CD34+ chiếm tỷ lệ khoảng 0,5-5,0% [1] Từ những năm 1960, người ta đã nhận thấy trong máu ngoại vi có một tỷ lệ nhỏ tế bào gốc tạo máu lưu hành và cho đến năm 1986, nguồn tế bào gốc này lần đầu tiên được sử dụng

để thay thế cho dịch tủy xương [34] Tỷ lệ tế bào gốc tạo máu CD34+ trong máu ngoại

vi ở điều kiện bình thường khoảng 0,01-0,05% [3] Để có thể thu được tế bào gốc tạo máu từ nguồn này đủ liều dành cho ứng dụng, nhiều cơ sở đã thực hiện một số kỹ thuật

để tăng cường tỷ lệ tế bào gốc Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng các loại thuốc huy động tế bào gốc như G-CSF, GM-CSF Máu dây rốn cũng là một trong các nguồn

tế bào gốc tạo máu với tỷ lệ tế bào CD34+ khoảng 0,02-1,43% [1] So với các nguồn tế bào gốc kể trên, máu dây rốn được ứng dụng trong ghép muộn hơn Năm 1988, ca ghép

tế bào gốc đầu tiên được tiến hành để điều trị cho một trường hợp mắc bệnh thiếu máu Fanconi và chỉ sau 25 năm, nguồn tế bào gốc này đã được ứng dụng ngày càng rộng rãi

9

trên toàn thế giới trong nhiều lĩnh vực, có những nước phát triển mạnh mẽ về loại hình này, được biết đến nhiều nhất là Nhật Bản [19], [20]

2.2.1 T ế bào gốc máu dây rốn

Tế bào gốc trong máu dây rốn có sự khác biệt so với những nguồn tế bào gốc tạo máu phổ biến khác như máu ngoại vi hay dịch tủy xương về thành phần, số lượng cũng như các tính chất [24] Gao và cs (2006) cũng thấy rằng trong máu dây rốn có nhiều tế bào đầu dòng của mô đệm liên quan đến tạo máu [2] Những phân tích về khả năng tạo

cụm của tế bào gốc trong máu dây rốn của người thấy rằng 1 ml máu có khoảng 8000 đơn vị tạo cụm dòng hồng cầu lớn (BFU-E), cao gấp 3 lần so với dịch tủy xương và máu ngoại vi, còn đơn vị tạo cụm dòng hạt-đại thực bào (CFU-GM) thì nhiều gấp 15

lần (13000-24000), và khoảng 1000-10000 đơn vị tạo cụm hỗn hợp (CFU-GEMM) [3] Thêm vào đó, Smogorzewska và cs (1997) nhận thấy máu dây rốn còn chứa tỷ lệ các tế bào tạo máu non nhiều hơn so với dịch tủy xương [1] Tế bào thuộc về hệ miễn dịch trong máu dây rốn cũng có nhiều điểm khác biệt so với các tế bào trong dịch tủy xương

và máu ngoại vi [1] Khả năng đáp ứng miễn dịch của các tế bào hiệu ứng như bạch

cầu lympho và bạch cầu mono cũng như số lượng bạch cầu lympho B thì khá tương tự, tuy nhiên số lượng các dưới nhóm của tế bào B lại có sự khác biệt so với các nguồn tế bào gốc tạo máu trên Zeman và cs (1996) thấy rằng một nửa số quần thể tế bào B là tế bào chưa trưởng thành [1] Rất nhiều nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ tế bào NK trong máu dây rốn thấp hơn và hệ quả là hoạt tính gây độc tế bào cũng thấp hơn so với mẫu

từ người trưởng thành [1] Khả năng gây độc tế bào thấp của tế bào trong máu dây rốn được giải thích là do tính chất “nguyên sơ” của những tế bào miễn dịch, liên quan đến giai đoạn sơ sinh của con người, không chịu tác động bởi các yếu tố bên ngoài Sự có

mặt của các tế bào gốc trung mô (MSC) trong máu dây rốn, là tiền thân của nhiều loại

tế bào (xương, sụn, mỡ, cơ…) đã không còn là vấn đề bàn cãi [1] Chang và cs (2006)

thấy rằng bên cạnh HSC, máu dây rốn cũng chứa nhiều tế bào MSC hoặc tế bào đầu dòng trung mô (MPC-mesenchymal progenitor cell) [6] Lee và cs (2005) cũng nhận

10

định rằng máu dây rốn chứa nhiều quần thể MPC non đa năng có thể biệt hóa thành nhiều dòng tế bào của cả 3 nhóm tế bào mầm (nội bì, trung bì, ngoại bì) [2]

2.2.2 T ế bào gốc máu ngoại vi

Từ những năm 1960, người ta đã nhận thấy trong máu ngoại vi có một tỷ lệ nhỏ tế bào gốc tạo máu lưu hành và cho đến năm 1986, nguồn tế bào gốc này lần đầu tiên được sử dụng để thay thế cho dịch tủy xương Tỷ lệ tế bào gốc tạo máu CD34+ trong máu ngoại vi ở điều kiện bình thường khoảng 0,01-0,05% [3] Để có thể thu được tế bào gốc tạo máu từ nguồn này đủ liều dành cho ứng dụng, nhiều cơ sở đã thực hiện

một số kỹ thuật để tăng cường tỷ lệ tế bào gốc Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng các loại thuốc huy động tế bào gốc như G-CSF, GM-CSF Theo Anguita-Compagnon (2010), phác đồ huy động thường áp dụng hiệu quả trên thế giới ngày nay là sử dụng

liều G-CSF 10 µg/kg/ngày trong vòng 5 ngày và thu hoạch ở ngày thứ 5 Việc thu thập

tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi thường tiến hành trên các hệ thống máy gạn tách tự động theo nguyên lý ly tâm tỷ trọng để tách các thành phần hồng cầu, bạch cầu và tiểu

cầu, qua đó thu được lớp buffy coat giàu tế bào gốc và trả các thành phần còn lại cho

cơ thể Nhờ tính an toàn, đơn giản khi tiến hành thủ thuật gạn tách nên đây cũng ưu thế

của nguồn tế bào gốc này so với dịch tủy xương Theo Richard và cộng sự (2000), nhược điểm chính khi tiến hành thu thập tế bào gốc từ máu ngoại vi huy động là những

lo ngại về tác dụng lâu dài của các loại thuốc huy động cũng như việc tạp nhiễm nhiều

tế bào đã biệt hóa, trưởng thành như tế bào lympho T là căn nguyên của bệnh ghép

chống chủ khi tiến hành ghép Tuy nhiên, nghiên cứu trên 2408 trường hợp người hiến máu ngoại vi huy động của Pulsipher và cs (2009) đã nhận thấy các ảnh hưởng đối với người hiến tế bào gốc từ máu ngoại vi huy động thường có từ trước hoặc chỉ là ngẫu nhiên và không có mối liên quan có ý nghĩa đối với quá trình huy động Bên cạnh đó,

tế bào lympho T tạp lẫn cũng có thể được giải quyết bằng cách lọc bỏ trên hệ thống chọn

lọc từ tính Vì vậy, đây là nguồn tế bào gốc đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi trên toàn thế giới

11

2.3 Các phương pháp thu thập, xử lý, lưu trữ tế bào gốc tạo máu

Đối với nguồn từ tủy xương việc thu thập khá vất vả, thực hiện hoàn toàn thủ công và tiến hành thủ thuật có xâm lấn trên cơ thể người hiến Việc thu thập từ nguồn máu ngoại vi được thực hiện trên các máy thu tự động với bộ kít tương ứng, tuy phải

tiến hành thủ thuật nhỏ trên cơ thể người hiến nhưng không quá phức tạp, điểm hạn chế

của phương pháp này là mất thời gian để hoàn thiện một ca gạn tách tế bào gốc (thông thường từ 3-6 tiếng) Đối với máu dây rốn, việc thu thập dễ dàng hơn và quan trọng là không can thiệp đến cơ thể của sản phụ hay trẻ sơ sinh, thời gian thu thập nhanh chóng (3-5 phút ngay sau khi kẹp và cắt dây rốn)

Với sự phát triển của khoa học công nghệ, các phương pháp xử lý tế bào gốc đã được cải thiện từ thủ công sang bán thủ công và tự động hóa hoàn toàn Tuy nhiên, để

lựa chọn sử dụng phương pháp xử lý cần cân nhắc đến các tiêu chí về chất lượng khối

tế bào gốc sau xử lý, điều kiện cơ sở vật chất cũng như kinh tế của cơ sở thực hiện xử

lý Các mẫu tế bào gốc sau quá trình xử lý sẽ tiếp tục trải qua quá trình hạ nhiệt độ về khoảng -100oC Sau đó các mẫu tế bào gốc sẽ được chuyển sang bước lưu trữ lâu dài

bằng cách chuyển vào các bình chứa ni-tơ lỏng Tuy nhiên để đảm bảo chất lượng của đơn vị tế bào gốc, trong thời gian lưu trữ, ngoài việc theo dõi thiết bị lưu trữ, có thể sử

dụng hình thức lấy mẫu ngẫu nhiên để tiến hành đánh giá chất lượng mẫu định kì hàng năm bằng các xét nghiệm như đếm số lượng tế CD34+, nuôi cấy cụm tế bào gốc

2 4 Các phương pháp đánh giá chất lượng đơn vị tế bào gốc tạo máu

2.4.1 Các phương pháp chung

Thực hiện đánh giá về thành phần của đơn vị tế bào gốc, số lượng và tỷ lệ sống

của tế bào cho đơn vị tế bào gốc sau lưu trữ được xem là một trong những yêu cầu

nhằm đảm bảo chất lượng cho sản phẩm cũng như đánh giá chất lượng của những quy trình được thực hiện trước đó để tạo ra sản phẩm Dựa vào đặc điểm về điều kiện cơ sở

vật chất và yêu cầu của từng cơ sở lưu trữ mà áp dụng các phương pháp đánh giá khác nhau Các phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến cho quy trình đánh giá gồm

12

có: xác định tỷ lệ sống/chết của tế bào có nhân bằng kỹ thuật nhuộm xanh trypan và đếm tế bào dòng chảy; xác định số lượng tế bào có nhân, tế bào gốc CD34+ bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy trên hệ thống máy flowcytometry; xác định tiềm năng tăng sinh của tế bào bằng các phương pháp nuôi cấy invitro trên các môi trường chuyên biệt… Các hình thức xét nghiệm nuôi cấy cụm tế bào được sử dụng sẽ giúp các nhà khoa học, các bác sỹ lâm sàng hình dung cụ thể hơn về tính chất của mẫu tế bào

gốc

Quá trình hình thành nên các tế bào máu trưởng thành là sự biến đổi của các tế bào gốc tạo máu qua các giai đoạn trung gian: từ tế bào gốc tiền thân tạo máu đến tế bào đầu dòng tạo máu rồi trưởng thành Để nghiên cứu về quá trình này cần sự hỗ trợ

của nhiều xét nghiệm khác nhau Các xét nghiệm miễn dịch sử dụng các marker đặc trưng cho từng dòng tế bào và cho từng giai đoạn phát triển để nhận biết và theo dõi sự phát triển của các dòng tế bào, ví dụ như: CD34+ đặc trưng cho tế bào gốc tiền thân tạo máu - giai đoạn non trẻ nhất, CD45+ đặc trưng cho các tế bào đầu dòng tạo máu Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng kết quả từ các xét nghiệm miễn dịch sẽ là chưa đủ để kết luận

về chất lượng của mẫu tế bào gốc, đặc biệt là đối với những trường hợp cần đánh giá

tiềm năng tăng sinh của mẫu đã được lưu trữ đông lạnh Chính vì vậy mà nuôi cấy cụm được xem là hình thức đánh giá trực quan, gián tiếp đánh giá chất lượng về mặt chức năng biệt hóa của các tế bào gốc

Để đánh giá khả năng tăng sinh của những tế bào tạo máu đã định hướng dòng, người ta có thể sử dụng các xét nghiệm để đánh giá dòng tế bào hoặc nuôi cấy tạo cụm dài hạn Grskovic và cs (2004) cho rằng các cụm hình thành khi nuôi cấy thường bắt nguồn từ những tế bào CD34+ có độ biểu hiện CD117 thấp [1] Thêm vào đó, sự có

mặt của CD135 cũng ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh và biệt hóa của những tế bào này Smogorzewska và cs đã nhận thấy rằng các tế bào CD34+CD38- vẫn có khả năng

tạo cụm tới tận sau 60 ngày nuôi cấy khi có mặt các tế bào đệm tủy xương, trong khi

những tế bào CD34+CD38+ không thể tạo cụm tiếp tục sau ngày 40 [1]

13

B ảng 1 Các kháng nguyên bề mặt biểu hiện trên tế bào gốc tạo máu [3]

Kháng nguyên Các lo ại tế bào biểu hiện

CD34 Tế bào gốc, tế bào đầu dòng CD38 Tế bào gốc, tế bào đầu dòng sớm CD90 Tế bào non, tế bào đầu dòng sớm

CD45RA Tế bào đầu dòng muộn của CFU-GM CD135 Tế bào gốc, tế bào đầu dòng

2.4.2 Nuôi c ấy cụm tế bào

Ngoài những đánh giá về dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho các dòng tế bào thì việc đánh giá bằng trực quan tiềm năng tăng sinh của nhóm tế bào gốc có trong một khối tế bào gốc được lưu trữ bằng nuôi cấy cụm là rất cần thiết Nguyên lý của xét nghiệm này

dựa trên khả năng tăng sinh và biệt hóa của tế bào đầu dòng tạo máu, hình thành các khuẩn lạc (CFU) trên môi trường bán rắn với sự có mặt của các chất kích thích cytokine Môi trường phổ biến nhất trong nuôi cấy cụm là methylcellulose Đây là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và biệt hóa [18] Trên môi trường nuôi cấy, các khuẩn

lạc rời rạc có chứa các tế bào thế hệ sau với các đặc điểm về màu sắc, hình dạng dễ

nhận biết Số lượng và loại khuẩn lạc tạo thành trong quá trình nuôi cấy cung cấp thông tin về khả năng tăng sinh và tiềm năng biệt hóa của mẫu tế bào gốc đó Đối với tế bào

gốc tạo máu, môi trường nuôi cấy bán rắn có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng tương ứng với từng dòng tế bào khác nhau như erythropoietin (EPO) cho dòng hồng

cầu, G-CSF cho dòng bạch cầu hạt, ngoài ra còn có SCF, IL-3 Các loại cụm điển hình khi nuôi cấy tế bào gốc tạo máu là: CFU-E, BFU-E, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, CFU-GEMM [42]

14

Một số loại cytokine chính sử dụng để nuôi cấy tạo cụm tế bào bao gồm:

+ SCF: yếu tố tế bào gốc (stem cell factor) được sản xuất bởi tế bào đệm trong tủy xương, lympho T, tế bào gan và nguyên bào sợi Các tế bào gốc tạo máu là mục tiêu

chủ yếu của SCF, tuy nhiên tự thân nó chỉ thúc đẩy sự biệt hóa ở một tỷ lệ nhỏ các trường hợp Tác dụng chính của SCF là hiệp đồng với các yếu tố khác để kích thích tăng trưởng SCF có ảnh hưởng với các tế bào kém biệt hóa, đặc biệt là tế bào tạo máu, đang ở trong những giai đoạn sớm hoặc trung gian In vitro, SCF kết hợp hoạt động cùng các yếu tố khác có trong môi trường nuôi cấy như IL-3, GM-CSF, G-CSF, EPO

Cụ thể, người ta thấy rằng SCF tương tác với EPO và kích thích tạo cụm cho các nguyên hồng cầu, kết hợp với GM-CSF hoặc IL-3 để tạo cụm hỗn hợp các tế bào đầu dòng sớm, cùng với G-CSF để tạo cụm dòng bạch cầu hạt, với IL-7 để kích thích biệt hóa dòng lympho B

+ IL-3: Interleukin 3 được biết đến là một yếu tố kích thích tạo cụm đa dòng (multi-CSF), yếu tố kích thích tạo cụm tế bào mast (MC-GF) Đây là một glycoprotein

có trọng lượng phân tử 14-30 kDa Nó được sản xuất bởi tế bào T hoạt hóa, tế bào NK,

tế bào mast và một số dòng tế bào lơ xê mi IL-3 sinh ra hiệu ứng tác dụng qua thụ thể

của IL-3 (IL-3R hay CD123) Thụ thể của IL-3 cấu tạo gồm 2 chuỗi α và β, rất tương đồng với hình dạng thụ thể của GM-CSF IL-3 kích thích tăng sinh và biệt hóa bạch

cầu hạt, đại thực bào, hồng cầu, mẫu tiểu cầu, bạch cầu hạt ưa acid, tế bào đầu dòng

của dòng tế bào mast Tổng số CD123 trên bề mặt của các tế bào đầu dòng khoảng 200-13000 phân tử/tế bào và giảm dần theo mức độ biệt hóa của chúng, thể hiện rằng IL-3 là một cytokine có tác dụng tăng sinh nhiều hơn là tác dụng kích thích thích biệt hóa [3]

+GM-CSF: yếu tố kích thích tạo cụm dòng hạt-đại thực bào là một glycoprotein kích thước 14-35 kDa Nó được sinh ra bởi tế bào T hoạt hóa, tế bào nội mô, nguyên bào sợi và tế bào mast Theo Jinquan và cs (2001), thụ thể của GM-CSF thuộc về họ

thụ thể hematopoiethine không có tác dụng tyrosine kinase [1] Thụ thể của yếu tố này

thấy phần lớn ở dòng bạch cầu hạt và thay đổi tùy theo mức độ trưởng thành In vitro,

15

GM-CSF kích thích sự hình thành các cụm bạch cầu hạt và đại thực bào Những nghiên

cứu gần đây cho thấy rằng GM-CSF có tác dụng làm bộc lộ CXCR3 trên những tế bào CD34+ (CXCR3 là một thụ thể có mặt trên các tế bào T hoạt hóa và tế bào nhớ), và do

đó ảnh hưởng đến sự biệt hóa của những tế bào CD34+ sang các loại tế bào đầu dòng tương ứng cũng như các giai đoạn trưởng thành tiếp theo [1] In vivo, GM-CSF làm

giảm thời gian chuyển đổi từ pha nghỉ sang giai đoạn phân bào và thời lượng của pha

S, ảnh hưởng đến sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào đầu dòng lympho [1]

2.5 Ứng dụng của tế bào gốc tạo máu trong điều trị bệnh lý ác tính

Các tế bào gốc tạo máu có khả năng tự nhân lên và khả năng biệt hóa thành tất cả các dòng tế bào máu trưởng thành Các tế bào gốc tạo máu thường rất ít và chiếm tỷ lệ 1/104 đến 1/106 tế bào tủy xương Trong giai đoạn ổn định, đa số các tế bào gốc tạo máu thường ở trạng thái nghỉ ngơi và chỉ có một bộ phận nhỏ tham gia vào chu kỳ tế bào để sinh ra và biệt hoá thành các tế bào tiền thân của các dòng tế bào máu Tế bào

gốc tạo máu người có khả năng di chuyển từ máu ngoại vi đến cư trú ở tủy xương Sau khi định cư ở tủy xương, các tế bào gốc này tăng sinh và biệt hóa nhờ tiếp nhận các tín

hiệu phát ra từ môi trường tủy xương bao gồm tổ chức đệm ngoài tế bào, các tế bào nội

mô và trung mô, và tạo cốt bào Các tế bào gốc sẽ sinh ra các tế bào gốc đa năng Tế bào gốc đa năng sau đó sẽ sinh ra tế bào gốc dòng lympho và tế bào gốc dòng tủy [9]

Tất cả những kết quả nghiên cứu về khả năng di chuyển vào tủy xương, khả năng tái

tạo lại hệ thống sinh máu của tế bào gốc tạo máu đã hình thành một nền tảng vững chắc cho kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu

Trong những điều kiện sinh lý bình thường, hầu hết các tế bào gốc sinh máu CD34+ nằm trong tủy xương Tuy nhiên, hiện nay, có rất nhiều cách để “huy động” các tế bào này rời tủy xương đi ra máu ngoại vi: sử dụng các thuốc như G-CSF, GM-CSF… phối hợp các thuốc có bản chất cytokine hoặc phối hợp hóa trị liệu với các cytokine Trên thực tế, không có phương pháp nào thể hiện hiệu quả trội hơn hẳn so

với các phương pháp khác Yếu tố kích thích sinh dòng bạch cầu hạt G-CSF có tác

16

dụng tăng sản xuất dòng bạch cầu hạt trung tính và giải phóng các enzyme nhóm protease Các protease lại có tác dụng phân hủy một loại protein đóng vai trò như một móc treo các tế bào gốc CD34+ vào tổ chức đệm của tủy xương, và như vậy sẽ giải phóng các tế bào vào tuần hoàn [8] Hiệu quả huy động các tế bào CD34+ sẽ tăng lên

nếu G-CSF được chỉ định sau hóa trị liệu [7] Thông thường, lượng CD34+ sẽ đạt mức cao nhất trong khoảng ngày thứ 4 đến thứ 6 sau khi bắt đầu tiêm G-CSF Đa số các trung tâm trên thế giới đều tiến hành gạn tách và thu thập tế bào gốc máu ngoại vi khi

số lượng CD34+ đạt mức 10 - 20 tế bào/ml Khối tế bào gốc sau khi thu gom thường được lưu trữ ở nhiệt độ -196oC và được truyền trả lại cho bệnh nhân trong vài ngày cho đến vài tuần sau đó Tế bào gốc có thể vẫn giữ nguyên chất lượng trong vài năm ở điều

kiện bảo quản như vậy

Ghép tế bào gốc tạo máu tự thân là sử dụng chính tế bào gốc được huy động từ

bệnh nhân và được truyền trả lại sau khi bệnh nhân trải qua giai đoạn điều kiện hóa Hình thức này được xem như một phương pháp hỗ trợ cho đa hóa trị liệu liều cao nhằm

mục đích điều trị cho các bệnh nhân mắc bệnh máu ác tính không đáp ứng/kháng với các phác đồ đa hóa trị liệu chuẩn hoặc tái phát Ghép tế bào gốc tạo máu tự thân là một

biện pháp hỗ trợ hệ thống sinh máu của bệnh nhân phục hồi nhanh chóng sau đa hóa trị

liệu liều cao hay nói cách khác, giúp cho phương án đa hóa trị liệu liều cao trở thành

khả thi và không đe dọa tính mạng người bệnh Một trong những hạn chế của ghép tế bào gốc tạo máu tự thân là khả năng bị lẫn các tế bào ung thư trong khối tế bào gốc thu gom Cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về hiệu quả của các phương pháp “làm

sạch” khối tế bào gốc nhưng vẫn chưa có một nghiên cứu nào đảm bảo chắc chắn khối

tế bào gốc đã được “làm sạch” thực sự Tuy nhiên, ghép tế bào gốc tự thân vẫn được ứng dụng rộng rãi trong điều trị rất nhiều các bệnh khác nhau thuộc rất nhiều chuyên khoa: các bệnh máu ác tính như đa u tủy xương, u lympho ác tính các ung thư dạng đặc như ung thư vú, ung thư thận các bệnh tự miễn như: viêm khớp dạng thấp, xuất huyết giảm tiểu cầu, lupus ban đỏ

17

Ghép tế bào gốc đồng loài là phương pháp điều trị tiên tiến, hiệu quả và đem lại

hi vọng cho nhiều bệnh nhân Phương pháp này sử dụng nguồn tế bào gốc từ người

hiến cùng huyết thống hoặc không cùng huyết thống với bệnh nhân Tuy nhiên giữa

bệnh nhân và người hiến cần đạt mức độ hòa hợp hệ kháng nguyên bạch cầu người theo yêu cầu tương ứng với từng bệnh lý Tế bào gốc của người hiến sẽ được truyền vào cơ thể bệnh nhân sau khi bênh nhân được thực hiện điều kiện hóa Trên Thế giới, hàng năm có hàng ngàn bệnh nhân được điều trị bằng phương pháp ghép tế bào gốc đồng loài Ghép tế bào gốc đồng loài được áp dụng đối với nhóm bệnh cần hiệu ứng

của mảnh ghép chống chủ Đối với chuyên khoa huyết học chủ yếu là nhóm bệnh lý

cấp, chiếm ưu thế là lơ-xê-mi cấp; nhóm bệnh lý di truyền, nổi bật là thalassemia

2.6 Tình hình nghiên c ứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam

Tế bào gốc mang đến nhiều hi vọng cho liệu pháp tế bào, kỹ thuật mô và y học tái

tạo cũng như dược phẩm và ứng dụng công nghệ sinh học Dựa vào những đặc điểm về

khả năng tự tái tạo và khả năng có thể biệt hóa thành bất kì loại tế bào nào mà tế bào

gốc đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu ứng dụng để chữa một số bệnh của cơ quan tạo máu, ung thư máu, một số bệnh di truyền bẩm sinh liên quan đến chuyển hoá

và suy giảm miễn dịch, và có nhiều hứa hẹn dùng để chữa được nhiều bệnh nan y khác Năm 1959 được xem là một cột mốc quan trọng trong việc ứng dụng tế bào gốc vào trong điều trị y học sau khi Thomas ghép tủy xương thành công cho hai bệnh nhân

mắc bệnh bạch cầu cấp Thập niên đầu tiên của thế kỷ 21 được đánh dấu bằng sự bùng

nổ của một hướng nghiên cứu non trẻ nhưng đầy tiềm năng, đó là công nghệ tế bào

gốc, với khởi điểm là việc James Thomson phân lập được các tế bào gốc từ phôi người (1998) Vào năm 2006-2007 giáo sư Shinya Yamanaka đã thành công trong việc thử nghiệm biến tế bào trưởng thành trở thành tế bào gốc vạn năng Ông gọi đó là loại tế các tế bào gốc vạn năng cảm ứng, viết tắt là tế bào iPS Đến năm 2010, với sự tham gia

của công ty Ajinomoto trong việc nghiên cứu môi trường nuối cấy tế bào gốc StemFit

đã giúp trung tâm nghiên cứu của giáo sư Shinya Yamanaka tiếp tục phát triển những

18

nghiên cứu trên tế bào gốc iPS Các nhà nghiên cứu tại trung tâm UC Davis Vascular

đã nghiên cứu sử dụng tế bào gốc tự thân của bệnh nhân mắc tiểu đường hay bệnh động mạch nặng, để gia tăng tuần hoàn máu đến ống quyển với hy vọng không cần tiến hành phẫu thuật cắt cụt chi Công trình sử dụng liệu pháp tế bào gốc trong điều trị bệnh Pelizaeus-Merzbacher (PMD) được công bố tại hội nghị thường niên của ISSCR (International Society for Stem Cell Research) năm 2013 Nhóm nghiên cứu của TS.Ann Tsukamoto tại công ty StemCells Inc (California, Hoa Kỳ) đã thông báo bước

tiến của họ trong nghiên cứu điều trị thử nghiệm lâm sàng trên người với bệnh thoái hóa thần kinh di truyền dạng hiếm gặp Pelizaeus-Merzbacher (PMD) Hiện nay, thế

giới đang đẩy mạnh và nhanh nghiên cứu tế bào gốc vào ứng dụng Tế bào gốc và Y

học tái tạo trở thành một ngành học, đào tạo và công nghiệp Tế bào gốc đã được coi là trung tâm của sinh học và y – sinh học được ví như “công nghệ của Thế kỷ XXI” Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam thực sự được bắt đầu ngay từ

những năm 90 và đặc biệt được chú ý đến nhiều sau năm 2006-2007 Cho đến nay đã

có rất nhiều công bố về kết quả của những nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc trong điều

trị bệnh lý không chỉ riêng về các bệnh lý huyết học mà còn mở rộng với nhiều chuyên khoa khác Tương tự như trên thế giới, các hoạt động nghiên cứu về tế bào gốc ở Việt Nam cũng được khởi đầu từ những nghiên cứu thuộc lĩnh vực huyết học với tế bào gốc

tạo máu Các nhà huyết học Việt Nam đã có những bước tiên phong trên lĩnh vực tế bào gốc qua triển khai nghiên cứu ghép tuỷ xương (mà bản chất là ghép các tế bào gốc

tạo máu) để điều trị các bệnh lý huyết học Có thể nói, về phương diện nghiên cứu ứng

dụng tế bào gốc tạo máu trong lĩnh vực huyết học, các nhà huyết học Việt Nam đã triển khai được tất cả các kỹ thuật cơ bản từ ghép tế bào gốc tạo máu lấy từ tuỷ xương đến ghép tế bào gốc tạo máu được huy động từ tuỷ xương ra máu ngoại vi và ghép tế bào

gốc tạo máu lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh Để có được những thành tựu trong ứng

dụng không thể không nhắc đến những nghiên cứu về lĩnh vực cận lâm sàng mà chủ

yếu là các nghiên cứu đánh giá chất lượng của đơn vị tế bào gốc dùng cho lâm sàng

Từ đánh giá kết quả thu thập gạn tách, xử lý tế bào gốc máu dây rốn, máu ngoại vi để

19

đưa ra được những cải tiến về kĩ thuật giúp nâng cao hiệu suất thu hồi, đến các nghiên

cứu đánh giá chất lượng lưu trữ bảo quản đông lạnh nhằm phục vụ hoạt động của hệ

thống ngân hàng tế bào gốc Tất cả các nghiên cứu đều hướng đến mục tiêu tạo ra sản

phẩm chất lượng, phục vụ cho nhu cầu điều trị lâm sàng và làm tiền đề cho những nghiên cứu phát triển khác

Bên cạnh lĩnh vực huyết học, chúng ta cũng có những nhà khoa học có những nghiên cứu tiên phong về tế bào gốc và nhân bản vô tính như cố GS.TS Nguyễn Mộng Hùng với các nghiên cứu tế bào gốc trên đối tượng động vật, các nghiên cứu sau này

của ông và các cộng sự được triển khai tại Đại học Khoa học Tụ nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội về tế bào gốc phôi gà; các nghiên cứu về nhân bản vô tính Sao La, nhân bản

vô tính bò được triển khai tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam; các nghiên cứu nuôi cấy tinh tử tại Trung tâm Công nghệ phôi, nuôi

cấy nguyên bào sợi và tế bào sừng tại Viện Bỏng Quốc gia thuộc Học viện Quân y cũng là những nghiên cứu tiền đề cho nghiên cứu tế bào gốc sinh tinh, tế bào gốc trung

mô và tế bào gốc biểu mô của da sau này Cho đến thời điểm này, giới khoa học và các nhà quản lý, các nhà đầu tư trong nước hướng sự tập trung chú ý đến tế bào gốc khá

mạnh mẽ Ứng dụng tế bào gốc đã được dùng để điều trị một số bệnh lý như: bệnh lý giác mạc ở trẻ em, bệnh lý về tim Các kết quả bước đầu thấy có hiệu quả trên bệnh nhân và không thấy tai biến của việc sử dụng tế bào gốc trong điều trị

• Tủ nuôi cấy tế bào;

• Kính hiển vi quang học đảo ngược;

• Bình nước cất plastic có vòi

⁻ Hóa chất: môi trường nuôi cấy MethoCult™ H4434 Classic và nước cất

− MethoCult™là môi trường dựa trên Methylcellulose được sử dụng rộng rãi để phát hiện và xác định số lượng các tế bào gốc máu trong các tế bào hình thành (CFC) khảo nghiệm MethoCult™ dựa trên Methylcellulose có trong các công

thức , bao gồm cả người và chuột Môi trường MethoCult™ kiểm soát một cách chặt chẽ chất lượng để đảm bảo rất thấp sự biến đổi Các thành phần của môi trường được kiểm tra trước để đảm bảo rằng nó tối ưu cho nuôi cấy các tế bào tiền thân tạo máu MethoCult™ H4434 Classic được tối ưu hóa cho việc phát hiện và định lượng các tế bào đầu dòng tạo máu trong các mẫu tủy xương