Khảo sát hiệu quả của probiotic đến các điều kiện môi trường và sức khỏe tôm trong ao nuôi

Hiện nay, sử dụng chế phẩm vi sinh probiotic trong phòng trị bệnh AHPND trở thành hướng tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản [4], đặc biệt là đối với ngành nuôi tôm ở nước ta..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Huyền Diệu

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA PROBIOTIC ĐẾN CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG VÀ SỨC

KHỎE TÔM TRONG AO NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Huyền Diệu

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA PROBIOTIC ĐẾN

CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG VÀ SỨC

KHỎE TÔM TRONG AO NUÔI

Chuyên ngành : Sinh thái học

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS PHẠM CỬ THIỆN

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

phần trong đề tài khoa học công nghệ cấp quốc gia do ThS Võ Hồng Phượng làm

chủ nhiệm với đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp gây

bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng”

Những số liệu trong luận văn được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm

đề tài

Những thông tin tôi thu thập để sử dụng làm tài liệu tham khảo được ghi rõ

trong danh mục tài liệu tham khảo

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thị Huyền Diệu

chân thành cảm ơn TS Phạm Cử Thiện – người đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong

quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Võ Hồng Phượng – Phó

giám đốc Trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thủy sản Nam bộ, Viện nghiên

cứu và nuôi trồng thủy sản II, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện

và cho tôi những lời khuyên cùng kinh nghiệm quý báu cùng với nhiều kiến thức

trong thời gian vừa qua để hoàn thành đề tài luận văn

Qua đây, tôi xin cảm ơn anh Nguyễn Công Thành – Trung tâm tập huấn và

chuyển giao công nghệ nông nghiệp vùng đồng bằng sông Cửu Long, tỉnh Sóc

Trăng, anh Trần Minh Thiện, chị Nguyễn Thanh Trúc – Viện nghiên cứu và nuôi

trồng thủy sản II đã chia sẻ kinh nghiệm, khích lệ, hướng dẫn giúp đỡ tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô của Trường, Phòng Sau đại học, Khoa

Sinh học, bộ môn Sinh thái học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài

luận văn

Xin cảm ơn anh Thái Thanh Trung, bạn Trần Minh Trung, các bạn sinh viên

Cao Vĩnh Nguyên, Nguyễn Thị Minh Hiền, Lê Thị Thùy Trang đã nhiệt tình giúp đỡ

tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Sau cùng, xin cảm ơn gia đình, những người thân yêu của tôi

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019

TÁC GIẢ LUẬN VĂN Phạm Thị Huyền Diệu

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1.Tổng quan về tôm thẻ và tôm sú 4

1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.2 Một số kỹ thuật nuôi tôm 4

1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên tôm 9

1.2.1 Bệnh Vibriosis 9

1.2.2 Bệnh hoại tử gan tụy cấp AHPND 10

1.3.Một số biện pháp hạn chế dịch bệnh gan tụy cấp trên tôm 16

1.4.Chế phẩm vi sinh (probiotic) 17

1.4.1 Khái niệm về probiotic 17

1.4.2 Nghiên cứu ứng dụng probiotic 19

Chương 2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.Thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu 24

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 24

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 24

2.1.3 Các thiết bị, vật liệu dùng trong thí nghiệm 24

2.2.Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp xác định liều gây chết trung bình (LD50) của vi khuẩn V parahaemolyticus đối với tôm thử nghiệm 25

2.2.2 Phương pháp thử nghiệm sử dụng probiotic hiệu quả 27

2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 33

probiotic trong điều kiện phòng thí nghiệm 34

3.1.1 Đánh giá khả năng gây độc và gây bệnh hoại tử gan tụy của vi khuẩn V parahaemolyticus 34

3.1.2 Đánh giá hiệu quả sử dụng probiotic bằng phương pháp cho ăn và xử lý nước 37

3.1.3 Tần suất sử dụng hiệu quả probiotic bằng phương pháp xử lý nước 44

3.2 Bước đầu ứng dụng chế phẩm probiotic trên mô hình ao nuôi tôm sú, tôm thẻ 48

3.2.1 Diễn biến mật độ Vibrio sp tổng số trong nước ao nuôi thử nghiệm 48

3.2.2 Diễn biến mật độ Vibrio parahaemolyticus trong ao nuôi thử nghiệm 51

3.2.3 Các chỉ tiêu môi trường 56

3.2.4 Thông tin thu hoạch các ao thử nghiệm 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC

AHPND Acute hepatopancreatic necrosis

tôm 26 Bảng 2.2 Thí nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic bằng phương pháp cho ăn

và phương pháp xử lý nước 28 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm tần suất sử dụng probiotic 29 Bảng 2.4 Bố trí thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic mô hình ao nuôi tôm

thẻ thương phẩm 31 Bảng 2.5 Bố trí thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic mô hình ao nuôi tôm

sú thương phẩm 31 Bảng 2.6 Phương pháp phân tích môi trường 32

tôm thẻ 34

tôm sú 35 Bảng 3.3 Kết quả thu hoạch tôm 63

gan tụy nhạt, teo nhỏ, trống ruột 12

Hình 1.2 Tôm sú Penaeus monodon (Fabricius, 1798) bệnh AHPND cũng

có khối gan tụy nhạt, teo nhỏ và ruột không có thức ăn 12

Hình 2.1 Kết quả đối kháng khuếch tán đĩa của các chủng Bacillus B1,

Bacillus S5 và Streptomyces X285 với VP được tuyển chọn 25

Hình 3.1 Tỷ lệ chết cộng dồn của tôm thẻ trong thí nghiệm xác định liều

Hình 3.2 Tỷ lệ chết cộng dồn của tôm sú trong thí nghiệm xác định liều

Hình 3.3 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) tôm thẻ trong phương pháp cho ăn liên

tục 14 ngày trước khi gây cảm nhiểm V parahaemolyticus 38

Hình 3.4 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) tôm sú đã được cho ăn probiotic liên tục

14 ngày trước khi gây cảm nhiễm V parahaemolyticus 39

Hình 3.5 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) tôm thẻ trong phương pháp xử lý nước 2

lần/tuần trước khi công V parahaemolyticus 41

Hình 3.6 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) tôm sú trong phương pháp xử lý nước

2lần/tuần trước khi công V parahaemolyticus 43

Hình 3.7 Tỷ lệ chết cộng dồn tôm thẻ chân trắng sau 10 ngày gây cảm

Hình 3.13 Diễn biến tổng đạm amon trong các ao nuôi thử nghiệm tôm thẻ 57

Hình 3.14 Diễn biến tổng đạm amon trong các ao nuôi thử nghiệm tôm sú 58

Hình 3.15 Diễn biến nitrite trong các ao nuôi thử nghiệm tôm thẻ 59

Hình 3.16 Diễn biến nitrite trong các ao nuôi thử nghiệm tôm sú 60

Hình 3.17 Diễn biến COD trong các ao nuôi thử nghiệm tôm thẻ 61

Hình 3.18 Diễn biến COD trong các ao nuôi thử nghiệm tôm sú 62

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nước ta có hệ thống sông ngòi dày đặc, phân bố khắp cả nước, đường bờ biển

1 km bờ biển và gần 30 km bờ biển lại có cửa sông lạch Vùng đặc quyền kinh tế

trăm con sông lớn nhỏ và nhiều kênh rạch, kênh đào dẫn nước từ các con sông chính về các đồng ruộng cũng như ao, hồ Đây là điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các ngành kinh tế biển nói chung và phát triển thủy sản nói riêng [1]

Trong những năm gần đây, các hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản có

sự phát triển mạnh mẽ Báo cáo thống kê của Bộ NN & PTNT, sản xuất và xuất khẩu tôm liên tục phát triển trong nhiều năm qua từ thời kỳ đổi mới đến nay đã tạo một vị thế đáng kể của Việt Nam trong ngành tôm toàn cầu Việt Nam hiện đứng thứ ba về sản xuất tôm trên thế giới (sau Trung Quốc và Indonesia) Xuất khẩu tôm nước lợ giữ vai trò quan trọng trong ngành thủy sản với khoảng 45% tổng giá trị kim ngạch Nghề nuôi tôm đã trở thành ngành sản xuất hàng hóa có hiệu quả cao, động lực chủ yếu thúc đẩy sản xuất kinh doanh nuôi trồng thủy sản, góp phần quan trọng vào chiến lược phát triển kinh tế của đất nước Trong đó tôm sú và tôm thẻ chân trắng là hai đối tượng chủ lực được quan tâm nhiều nhất [2]

Tuy nhiên, cùng với sự phát triển về đối tượng cũng như phát triển kinh tế và góp phần xóa đói giảm nghèo là vấn đề dịch bệnh Dịch bệnh làm giảm sản lượng

và quy mô nuôi tôm Đặc biệt, trong những năm gần đây, ngành nuôi tôm của nước

ta đang phải đối mặt với sự bùng phát dịch bệnh đang tăng nhanh, chủ yếu là thiệt hại do bệnh hoại tử gan tụy cấp (acute hepatopancreatic necrosis, AHPND)

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) còn được gọi là hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) là nguyên nhân gây giảm sản lượng tôm nuôi đáng kể ở một số quốc gia [3] Theo báo cáo của Cục Thú Y Việt Nam, khu vực nuôi tôm bị ảnh hưởng ở Đồng bằng sông Cửu Long khoảng 39.000 ha trong năm

2011 và 2012 [4]

Việc nghiên cứu tìm ra các biện pháp phòng trị bệnh gan tụy cấp trên tôm có hiệu quả là một việc làm cần thiết nhằm hạn chế dịch bệnh cũng như giảm thiệt hại

và những tổn thất mà AHPND mang lại Đã có nhiều giải pháp phòng trị bệnh đã được áp dụng nhưng hiệu quả mang lại rất kém hoặc không rõ rệt

Hiện nay, sử dụng chế phẩm vi sinh (probiotic) trong phòng trị bệnh AHPND trở thành hướng tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản [4], đặc biệt là đối với ngành nuôi tôm ở nước ta Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic được sử dụng phổ biến như là phương tiện kiểm soát dịch bệnh, tăng cường miễn dịch, cung cấp dinh dưỡng, men tiêu hóa và cải thiện chất lượng nước Ngoài ra, chúng còn sử dụng thay thế hóa chất, kháng sinh, chất diệt khuẩn [5]

Vì vậy, để sử dụng probiotic trong việc phòng trị AHPND trên hai đối tượng

là tôm sú và tôm thẻ một cách hiệu quả cũng như an toàn đến môi trường và con

người, đề tài “Khảo sát hiệu quả của probiotic đến các điều kiện môi trường và sức

khỏe tôm trong ao nuôi” được thực hiện

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá hiệu quả các phương pháp sử dụng probiotic

- Đánh giá các yếu tố thủy lý, thủy hóa và vi sinh biến động trong các ao nuôi

thử nghiệm

3 Đối tượng nghiên cứu

Ảnh hưởng của probiotic trong việc quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

1 Hiệu quả ức chế AHPND trên tôm sú và tôm thẻ bằng chế phẩm probiotic trong điều kiện phòng thí nghiệm

parahaemolyticus

- Thí nghiệm thăm dò liều sử dụng sản phẩm (đơn hay hỗn hợp) phối trộn thức

ăn hoặc xử lý nước có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh V parahaemolyticus

- Tần suất sử dụng hiệu quả sản phẩm

2 Thử nghiệm probiotic mô hình ao nuôi tôm thẻ, tôm sú

5 Phạm vi nghiên cứu

1 Khảo sát các phương pháp sử dụng chế phẩm probiotic hiệu quả trên tôm sú

và tôm thẻ trong phòng thí nghiệm: từ tháng 09/2018 đến tháng 01/2019

2 Thử nghiệm sử dụng chế phẩm vi sinh trong mô hình ao nuôi tôm sú, tôm thẻ tại khu vực ao nuôi tôm Trung tâm tập huấn và chuyển giao công nghệ nông nghiệp vùng đồng bằng sông Cửu Long, ấp Nopoul, xã Vĩnh Tân, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng: từ tháng 02/2019 đến tháng 07/2019

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về tôm thẻ và tôm sú

1.1.1 Vị trí phân loại

 Vị trí phân loại của Tôm thẻ Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)

Giới (Kingdom): Animalia

 Vị trí phân loại của Tôm sú Penaeus monodon (Fabricius, 1798)

Giới (Kingdom): Animalia

1.1.2 Một số kỹ thuật nuôi tôm

1.1.2.1 Kỹ thuật ao nuôi tôm chung

Ứng dụng quy trình kỹ thuật kèm theo công văn số 298/TCTS-NTTS ngày 01 tháng 02 năm 2013 của Tổng cục thủy sản về việc hướng dẫn kỹ thuật nuôi tôm

nước lợ thâm canh, bán thâm canh [6] Bao gồm các bước như sau:

a Chuẩn bị hồ nuôi:

- Cải tạo ao nuôi lắng: Loại bỏ các địch hại có trong ao từ vụ nuôi trước Vét bùn đáy ao, tu sửa bờ, các cống cấp nước, thoát nước San đáy ao dốc về phía cống thoát Phải đầm nén kỹ bờ ao hoặc lót bạt để chống xói lở và hạn chế rò rỉ Rải vôi bột đều đáy ao để diệt khuẩn trong bùn, giải độc và trung hòa pH Phơi đáy ao

khoảng 5-7 ngày

- Xử lý nước và lấy nước ao nuôi: Lấy nước vào ao lắng qua túi lọc bằng vải dày để loại bỏ rác, ấu trùng, côn trùng, cá tạp; để lắng 3-4 ngày Diệt tạp, diệt khuẩn nước cấp trong ao lắng bằng Chlorine hoặc những chất diệt tạp được phép lưu hành tại Việt Nam Quạt nước liên tục trong 10 ngày để phân hủy dư lượng Chlorine Cấp nước từ ao lắng qua ao nuôi đến khi mức nước trong ao nuôi đạt từ 1,3-1,5m

- Gây màu nước: Hai ngày sau khi cấp nước vào ao nuôi, gây màu nước bằng mật đường, cám gạo, bột đậu nành hoặc có thể dùng các sản phẩm vi sinh theo hướng dẫn của nhà sản xuất; giúp phát triển vi sinh vật phù du, ổn định môi trường

nước, tạo môi trường thuận lợi hạn chế tôm bị sốc, tăng tỉ lệ sống

Lưu ý: Kiểm tra và điều chỉnh các yếu tố môi trường trong nước ao nuôi đảm

bảo trong ngưỡng thích hợp trước khi thả giống:

Yếu tố môi trường

nước ao nuôi tôm

Giới hạn tối ưu đối với tôm sú

Giới hạn tối ưu đối với tôm thẻ chân trắng

Hàm lượng oxy hòa

ngày không quá 0,5)

7,5 - 8,5 (dao động trong ngày không quá 0,5)

b Quạt nước và thời gian chạy quạt nước:

Bố trí hệ thống quạt nước và thời gian chạy quạt nước phải đảm bảo nhu cầu oxy cho tôm nuôi, đặc biệt thời điểm chiều tối/đêm/gần sáng khi hàm lượng oxy hòa tan giảm dần/xuống thấp nhất trong ngày Cần tăng cường thời gian chạy quạt hoặc bố trí thêm hệ thống quạt cho tôm nuôi, đặc biệt vào những thời điểm nắng nóng hoặc mưa kéo dài

- Vị trí đặt cánh quạt nước: Cách bờ 1,5m; khoảng cách giữa 2 cánh quạt nước 60-80cm Tùy theo hình dạng ao mà bố trí cánh quạt nước nhằm tạo được dòng

- Số lượng máy quạt nước:

+ Đối với tôm thẻ chân trắng; đòi hỏi oxy rất lớn Do đó, tùy theo mật độ thả nuôi có thể thiết kế hệ thống quạt nước bằng cánh quạt nhựa hoặc kết hợp cánh quạt nhựa và cánh quạt lông nhím hoặc các cánh quạt cung cấp oxy khác để cung cấp oxy cho ao nuôi Vòng tua của cánh quạt nhựa nên >120 vòng/phút Với mật độ 60-

+ Cách thả: Thả vào sáng sớm hoặc chiều mát; trước khi thả giống cần chạy

quạt nước từ 8-12 giờ để đảm bảo lượng oxy hòa tan trong ao phải lớn hơn 4 mg/L

d Chăm sóc và quản lý:

- Cho ăn: Cho ăn mỗi ngày 3 lần hoặc cho ăn theo hướng dẫn của nhà sản xuất thức ăn và chọn thức ăn có độ đạm, protein, chất béo phù hợp Ngoài ra, tùy vào thực tế (sức khỏe của tôm, chu kỳ lột xác, thời tiết) để điều chỉnh, quản lý thức ăn cho phù hợp, tránh tình trạng cho ăn thiếu hoặc thừa thức ăn sẽ ảnh hưởng đến tốc

độ phát triển và sức khỏe của tôm

- Lượng thức ăn:

+ Tháng nuôi thứ nhất: sử dụng thức ăn cỡ nhỏ cho giai đoạn mới thả

+ Ngày thứ 10 sau khi thả giống: cho ít thức ăn vào vó để tôm làm quen, dễ

cho việc kiểm tra lượng thức ăn dư sau này

+ Sau 15 ngày có thể sử dụng các chất bổ sung cung cấp vitamin, khoáng chất

theo chỉ dẫn của nhà cung cấp giúp tôm tăng cường sức khỏe

+ Tháng nuôi thứ hai đến khi thu hoạch: Điều chỉnh thức ăn trong ngày qua theo dõi lượng thức ăn thừa trên vó Chuyển đổi loại thức ăn phù hợp theo giai đoạn phát triển, cỡ miệng tôm và nhu cầu dinh dưỡng như hướng dẫn của nhà sản xuất ghi trên bao bì Khi chuyển đổi thức ăn, nên trộn lẫn 2 loại thức ăn cũ và mới cho ăn

ít nhất 3 ngày

- Quản lý môi trường ao nuôi:

+ Khắc phục tình trạng pH thấp: gây tảo và giữ màu nước thích hợp đảm bảo

độ trong đạt từ 30 – 40 cm Trong quá trình nuôi nếu pH < 7,5 cần bón vôi (CaCO3,

Dolomite)

+ Khắc phục tình trạng pH cao: sử dụng mật đường kết hợp sử dụng vi sinh

hoặc dùng Acid acetic

+ Tùy vào tình hình thực tế môi trường ao nuôi mà điều chỉnh và bón lượng

vôi cho phù hợp

+ Khi tảo trong ao phát triển mạnh, màu nước thay đổi, pH dao động trong ngày >0,5, cần: Thay tối thiểu 30% lượng nước trong ao; hòa tan 2-3 kg đường

trong vài giờ

(trộn vào thức ăn); tăng thời gian chạy quạt nước, sục khí

phải giảm thức ăn và tăng đề kháng ngay

+ Trong quá trình sinh trưởng, tôm cần rất nhiều khoáng nên thường xuyên bổ sung khoáng cho ao nuôi vào ban đêm 3 – 5 ngày/lần giúp tôm nhanh cứng vỏ và

lột xác đồng loạt

+ Chỉ diệt khuẩn khi cần thiết (tránh những trường hợp như: tôm đang suy

yếu, đang trong quá trình lột xác hay có các biểu hiện về bệnh gan)

e Thu hoạch: Tùy theo giá cả mà người nuôi chọn thời điểm thu hoạch cho phù hợp khi tôm đạt kích cỡ Trước khi thu hoạch cần theo dõi chu kỳ lột xác của

tôm và hạn chế thu khi tôm còn mềm vỏ để tránh tình trạng tôm bán bị rớt giá

1.1.2.2 Nuôi tôm ít thay nước, công nghệ biofloc được ứng dụng trong nuôi tôm với quy mô công nghiệp

Các loài tôm nuôi thường chỉ hấp thu 20-30% dinh dưỡng từ nguồn thức ăn, trong khi đó có đến 70-80% dinh dưỡng còn lại được bài tiết bởi vật nuôi và thức ăn thừa tích lũy trong ao [7]

Hệ quả là ảnh hưởng đến chất lượng môi trường nuôi nghiêm trọng Một trong những kỹ thuật nuôi tôm có thể cải thiện sản lượng cũng như chất lượng nước là kỹ thuật bioflocs thông qua việc kiểm soát tỉ lệ carbon và nitơ [8]

Công nghệ nuôi bioflocs đã được áp dụng và đánh giá thành công ở Nam Mỹ, Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan khi nuôi tôm thẻ chân trắng hoặc ở các trang trại nuôi tôm sú [9]

Ở hệ thống nuôi thủy sản thâm canh, amonia cùng với oxy là yếu tố cơ bản hạn chế sản lượng nuôi Hệ thống bioflocs tốt là một hệ thống mà thức ăn có hàm lượng thấp protein và các nguồn carbon nitơ vô cơ được cho vào ao sẽ được chuyển hóa thành sinh khối vi sinh vật Quần thể vi sinh vật sẽ phát triển và tập hợp lại và hình thành các khối nhỏ chứa vi sinh vật, với tên gọi là bioflocs Các bioflocs có thể trở thành nguồn thức ăn của vật nuôi trong ao [7] Trong một nghiên cứu khác trên

hệ thông nuôi tôm sú ít thay nước cho thấy sự phát triển của khuê tảo có kích thước lớn đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn một tuần tiên đầu để có thể thiết lập được sự bền vững môi trường cho mô hình này Nguồn carbon cần thiết cho sự phát triển sinh khối của vi sinh vật có trong ao có thể được bổ sung bằng carbon dioxide, bicarbonate hay mật rỉ đường Liều lượng và thời điểm bổ sung nguồn carbon phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thời điểm trong ngày, pH, nồng độ oxy, cường độ sáng,

và lượng thức ăn có trong ao Hệ thống biofloc kết hợp với quy trình nuôi ít thay nước cho thấy có thể giảm đến 70% lượng nước thay thế và giảm thất thoát đến 77% lượng nitơ khi so sánh với hệ thống nuôi thay nước truyền thống Đối với hệ

thống bioflocs trong nuôi tôm sú còn có thể tiết kiệm được từ 20-30% giá trị thức ăn cần thiết để sản xuất 10 tấn tôm thịt [10]

1.1.2.3 Ương tôm trước khi thả vào ao nuôi

Ương tôm trước khi thả nuôi hay nuôi tôm 2 giai đoạn (giai đoạn ương trong nhà kín từ 2-3 tuần và giai đoạn nuôi ngoài ao) được quan tâm trong trường hợp người nuôi muốn tăng số vụ nuôi trong ao hoặc trong trường hợp ở những nước có mùa lạnh, thời gian cho vụ nuôi tôm ngắn Theo Fegan và Cliffordm (2001), tôm ương trong nhà kín sẽ kiểm soát được điều kiện an toàn sinh học và giảm được rủi

ro do bệnh ở giai đoạn này Tảo khuê cũng có thể được cho vào bể ương nhằm làm tăng nguồn thức ăn tự nhiên và giúp ổn định môi trường [11]

Theo Sturmer và cộng sự (1992), Fegan và Clifford (2001), có thể giảm ảnh hưởng của rủi ro do bệnh trong ao nuôi bằng cách ương tôm trong điều kiện sạch không có mầm bệnh sau đó thả vào ao nuôi với cỡ tôm đã lớn nhất định và ở độ tuổi

mà hệ thống miễn dịch đã phát triển tốt hơn và từ đó làm gia tăng kháng lại các yếu

tố hữu sinh và vô sinh, làm tăng tỷ lệ sống và ổn định sản lượng [11], [12]

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên tôm

1.2.1 Bệnh Vibriosis

Bệnh Vibriosis là bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp Gram âm gây ra được

xem là một trong những bệnh vi khuẩn quan trọng có liên quan đến hiện tượng nuôi tôm chết hàng loạt trên nhiều quốc gia Dấu hiệu của Vibriosis bao gồm: bên ngoài

là các vết nâu hặc đen trên vỏ, hoại tử hoặc đục cơ, cơ quan lympho bị đen và các phụ bộ cũng bị melanin hóa Bằng phương pháp mô bệnh học cho thấy hoại tử và phản ứng viêm ở các cơ quan khác nhau như cơ quan lympho, mang, tim, gan, tụy, thường được tìm thấy trên các mẫu tôm bệnh

Vi khuẩn Vibrio spp là một trong những vi khuẩn nguy hiểm vì nó là vi khuẩn

gây ra nhiều bệnh trên các đối tượng thủy sản nuôi Hiện nay, bệnh truyền nhiễm do

nhóm vi khuẩn Vibrio spp trên thủy sản đặt biệt là trên tôm được xem là tác nhân

gây bệnh được quan tâm, làm ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng tôm nuôi hàng năm

Bên cạnh đó, cơ quan đích của vi khuẩn Vibrio spp thường là khối gan tụy của tôm

Đây cũng chính là nguyên nhân làm lây truyền nhiều bệnh đường tiêu hóa, trong đó

có bệnh dịch tả, cho người ăn các món ăn tái hoặc sống từ tôm [13]

Vibrio xâm nhập vào trại sản xuất giống từ các nguồn như: nguồn nước cấp,

dụng cụ sản xuất, sử dụng chế phẩm sinh học kém chất lượng Vibrio là tác nhân

gây ra một số bệnh trên tôm giống như bệnh phát sáng, bệnh đục thân và là nguyên nhân gây chết với tỷ lệ cao, làm giảm chất lượng đàn giống [14]

Vibriosis thông thường xảy ra trên tôm nuôi tháng đầu tiên và có thể gây chết

50% Theo Saulnier và cộng sự (2000) cho rằng Vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh

cơ hội, dịch bệnh trở nên nghiêm trọng hơn khi có mặt của các yếu tố gây sốc như

pH, độ mặn, ammonia, nhiệt độ hoặc theo sau sự nhiễm tác nhân gây bệnh tiên phát Theo Horowitz (2001) cho rằng nếu như không có yếu tố tiên phát, tổn thương vật

lý hoặc sốc thì sẽ làm tăng cường khả năng đề kháng với Vibrio [15], [16]

Ngoài ra, theo Saulnier và cộng sự (2000) cho rằng tỷ lệ chết của tôm ấu trùng

liên quan tối Vibriosis do các loài Vibrio gây ra như V harveyi, V alginolyticus, V

damsel, V parahaemolyticus, V vulnificus và V penaeicida Những loài vi khuẩn

này có khả năng gây bệnh cho tôm giống và tôm lớn Litopenaeus vannamei (Boone, 1931), Penaeus monodon Fabricus, 1798, Marsupenaeus japonicas (Spence

Bate,1888)[15]

1.2.2 Bệnh hoại tử gan tụy cấp AHPND

Trong những năm gần đây, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (acute hepatopancreatic necreosis - AHPND) cũng được gọi là hội chứng chết sớm (early mortality syndrome - EMS) là một loại bệnh ảnh hưởng đến ngành nuôi trồng thủy sản

AHPND xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, lan sang Việt Nam năm

2010, sang Malaysia năm 2011 và năm 2012 bùng phát ở Thái Lan Ở Trung Quốc AHPND xuất hiện đầu tiên vào năm 2009, nhưng chưa được người nuôi chú ý Đến năm 2011 bệnh trở nên trầm trọng hơn ở những trại nuôi trên 5 năm và gần biển Các trạng trại nuôi tôm ở Hainan, Guangdong, Fujian và Guangxi bị thiệt hại trong

6 tháng đầu năm 2011 với khoảng 80% [17]

Ở Malaysia, AHPND được báo cáo đầu tiên vào giữa năm 2010 tại 2 bang Pahang và Joho sau đó lan rộng sang các vùng khác làm giảm sản lượng tôm thẻ chân trắng từ 70.000 tấn trong năm 2010 xuống 40.000 tấn trong năm 2011 Sản lượng đến tháng 05/2012 chỉ còn 30.000 tấn [18]

Dịch bệnh này đã khiến tôm Thái Lan mất 5,01 tỷ USD tính đến năm 2016 Năm 2011, trước khi dịch bệnh bùng phát, Thái Lan sản xuất trên 600.000 tấn tôm thẻ chân trắng và là nước xuất khẩu tôm lớn nhất thế giới Nhưng sau đại dịch bệnh, sản lượng tôm của Thái Lan sụt giảm còn 189.080 tấn tôm thẻ chân trắng, giảm 65% sản lượng [19]

Riêng ở Việt Nam, AHPND làm mất khoảng 500 triệu USD hằng năm trong năm trong năm 2011 và 2012.Theo báo cáo của Cục Thú Y Việt Nam, khu vực nuôi tôm bị ảnh hưởng ở Đồng bằng sông Cửu Long khoảng 39.000 ha trong năm 2011

và 2012 Tôm bệnh có dấu hiệu giảm ăn, khối gan tụy có nhiều biến dạng bất thường như trương to và nhũn hoặc teo nhỏ, màu sắc nhợt nhạt, dấu hiệu khác cũng được ghi nhận bao gồm mềm vỏ, sậm màu Tỷ lệ tôm chết có thể lên đến 100% trong vài ngày hoặc kéo dài hơn [4], [20]

Năm 2014, dịch bệnh AHPND xảy ra tại 237 xã, 63 huyện thuộc 22 tỉnh/thành phố Tổng diện tích tôm nuôi bị bệnh là 5.552,76 ha Bệnh xảy ra trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng có độ tuổi từ 10 – 100 ngày sau khi thả Trong năm 2015 bệnh hoại tử gan tụy cấp tính xảy ra tại 297 xã, 82 huyện, thị xã thuộc 23 tỉnh/thành phố Tổng diện tích bị thiệt hại là 9.420,68 ha Năm 2016, tổng diện tích tôm bệnh AHPND là 6.032,68 ha

Trong năm 2017, bệnh AHPND xảy ra tại 294 xã, 86 huyện, thị xã thuộc 25 tỉnh/thành phố Trong số các địa phương báo cáo dịch bệnh, tỉnh Bạc Liêu có tổng diện tích cao nhất, chiếm 34,2% tổng số diện tích nuôi tôm bệnh của cả nước (tổng cộng là 2.136 ha diện tích nuôi bán thâm canh), sau đó là tỉnh Sóc Trăng chiếm 22,2% Tổng cộng 2.700 ha diện tích nuôi tôm thẻ bị bệnh (chiếm 39,9%) so với tổng cộng 4.075 ha diện tích nuôi tôm sú bị bệnh (chiếm 60,1%) Trong số diện tích tôm bệnh có 6.335 ha diện tích nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh (chiếm 94% tổng diện tích bị bệnh của nước), 409 ha tôm nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến

(chiếm 21%) Tôm bị bệnh từ 7-100 ngày sau khi thả, tổng diện tích nuôi tôm bị bệnh AHPND tấng 11% so với năm 2016 [21]

Hình 1.1 Tôm thẻ Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) bệnh AHPND có gan

tụy nhạt, teo nhỏ, trống ruột

Hình 1.2 Tôm sú Penaeus monodon (Fabricius, 1798) bệnh AHPND cũng có

khối gan tụy nhạt, teo nhỏ và ruột không có thức ăn [4]

Khoa học đã có nhiều nghiên cứu tác nhân gây bệnh:

 Thế giới:

Theo Flegel (2012), nghiên cứu trên tôm bệnh thu từ các vùng khác nhau đã

phát hiện vi khuẩn thuộc 2 giống Delftia và Ralstonia Ngoài ra tác giả còn phát

hiện sự hiện diện của thể thực khuẩn bacteriophage trên mẫu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Tuy nhiên vẫn chưa có kết luận cuối cùng vì cần phải có kết quả từ các thí nghiệm kiểm chứng [22]

Theo Lightner và cộng sự (2013), bệnh hoại tử gan tụy cấp do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây ra Kết quả nghiên cứu định hướng bước đầu cho thấy chỉ có

phương pháp gây nhiễm bằng cách ngâm hay nuôi chung tôm bệnh và tôm khỏe

mới thấy được sự lây nhiễm của AHPND Hơn nữa, chỉ có Vibrio parahaemolyticus

được phân lập từ dạ dày của tôm bệnh khi gây bệnh thực nghiệm mới cho tỷ lệ chết

và các dấu hiệu bệnh lý như AHPND xuất hiện ngoài tự nhiên Nhóm tác giả này cho rằng dạ dày của tôm bệnh là nguồn chứa tác nhân gây bệnh [23]

Bệnh AHPND đã gây thiệt hại các loài tôm nuôi ở châu Á năm 2009, sau đó lan sang Tây bán cầu và nổi lên ở Mexico vào đầu năm 2013 Sự lây lan sang Tây bán cầu là một mối quan tâm lớn cho các ngành tôm trong khu vực Vì thế vào năm

2014, Linda Nunan và cộng sự đã nghiên cứu các phương pháp phát hiện bệnh AHPND được công bố qua công trình “Phát hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) ở Mexico”, Nghiên cứu này nêu chi tiết các phương pháp phát hiện sự hiện diện của AHPND ở Mexico bằng kiểm tra mô học và phương pháp PCR Từ

đó có thể giúp phát hiện sớm và giúp ngăn ngừa sự lây lan của AHPND sang các nước khác [24]

Tác nhân gây ra bệnh hoại tử gan tụy cấp tính được chứng minh là vi khuẩn V

parahaemolyticus có chứa plasmid pVPA3-1 và mang hai gen gây độc PirA và PirB [25] Các gen này tạo ra độc tố PirAB ảnh hưởng đến chức năng gan tụy tôm

[26]

Tuy nhiên, một công bố mới đây theo Han và cộng sự (2017)phân lập 4 chủng

Vibrio từ dạ dày tôm bị bệnh và các mẫu bùn đáy ao ở các nông trại trị bệnh

AHPND ở châu Mỹ Latin trong năm 2016 Vi khuẩn được định danh là V

campbelli có cả gen pirApv và pirBpv tương tự như gen gây độc trong V

parahaemolyticus Khả năng này cho thấy plasmid mang gen gây độc có khả năng

được truyền từ vi khuẩn V parahaemolyticus sang V campbelli [27]

Manan và cộng sự (2015) nghiên cứu bệnh tại Malaysia cho rằng bệnh hoại tử gan tụy ở tôm có thể liên quan đến sự lột xác, sự thiếu hụt các khoáng chất trong ao nuôi và sự lạm dụng của hóa chất và chế phẩm vi sinh trong quá trình nuôi [28]

 Việt Nam:

Báo cáo tại hội nghị phòng chống bệnh tôm nước lợ tại bến Tre (2012), Phạm Anh Tuấn đã báo cáo về “Hoại tử gan tụy ở tôm nuôi nước lợ: nguyên nhân và giải

pháp phòng ngừa” như sau: Vibrio là tác nhân gây ra một số bệnh trên tôm giống

như bệnh phát sáng, bệnh đục thân và là nguyên nhân gây chết với tỷ lệ cao, làm giảm chất lượng đàn giống Đặc biệt trong năm 2011 - 2013, dịch hội chứng gan tụy cấp đã xảy ra trong cả nước gây thiệt hại không nhỏ tới nghề nuôi tôm thương phẩm

và nguyên nhân của hội chứng này được xác định là do vi khuẩn Vibrio và Vibrio mang phage Để làm cơ sở để khẳng định vai trò của Vibrio và Vibrio mang phage

tới hậu ấu trùng (PL) tôm sú và tôm thẻ chân trắng, một số thực nghiệm đã tiến hành trên PL của hai loài tôm này trong điều kiện thí nghiệm [29]

Năm 2014, tác giả Võ Văn Nha và Trần Thị Hương đã nghiên cứu “Ảnh

hưởng của Vibrio và Vibrio mang phage lên hậu ấu trùng (postlarvae) tôm sú và

tôm thẻ chân trắng trong điều kiện thí nghiệm” Nghiên cứu này đã trình bày kết

quả nghiên cứu ảnh hưởng của Vibrio và Vibrio mang phage tới hậu ấu trùng (PL)

tôm sú và tôm thẻ chân trắng làm cơ sở để quản lí, rà soát từ khâu chất lượng tôm

bố mẹ, nguồn nước cấp, sử dụng chế phẩm, chất tẩy trùng, quy trình quản lý trại giống đảm bảo tôm giống sản xuất được có chất lượng tốt, không nhiễm vi rút và vi

khuẩn Vibrio [14]

Theo Trần Hữu Lộc và cộng sự (2013), bệnh hoại tử gan tụy cấp do vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus, vi khuẩn này đã bị nhiễm bởi một thể thực khuẩn

(bacteriophage, virus kí sinh trong vi khuẩn) làm tăng cường độc lực và gây chết trên tôm Vi khuẩn được lây truyền qua đường miệng, sau đó chúng xâm nhập vào đường tiêu hóa tôm, sinh độc tố gây phá hủy mô và làm rối loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm Nghiên cứu đang được tiếp tục nhằm phát triển các

kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán để phát hiện nhanh chóng bệnh hoại tử gan tụy, từ

đó cho phép nâng cao công tác quản lý các trại giống và ao nuôi tôm [30]

Theo kết quả nghiên cứu viện NCNTTS I (2013) thì ngoài V

parahaemolyticus gây hoại tử gan tụy cấp tính còn có 2 chủng V vulnificus cũng

gây nên bệnh này Kết quả đã được kiểm chứng bằng gây bệnh thực nghiệm cho tỷ

lệ chết và dấu hiệu đặc trưng của hoại tử gan tụy cấp Chủng vi khuẩn V

parahaemolyticus gây chết tôm ở nhiều kích cỡ khác nhau (PL15, tôm thẻ nuôi 30 ngày, tôm thẻ 60 ngày tuổi) trong điều kiện thí nghiệm Điều này cho thấy AHPND

có thể được tìm thấp ở các gia đoạn nuôi Cũng theo kết quả nghiên cứu của Viện NCNTTS I, chưa phát hiện phage trong mẫu tôm thu tự nhiên cũng như tôm thí nghiệm gây nhiễm có biểu hiện AHPND Chưa có bằng chứng về vai trò của phage

đối với AHPND Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Đại học Cần Thơ thì chủng V

parahaemolyticus có mang phage gây AHPND khi gây bệnh thực nghiệm cho tỷ lệ

chết cao hơn Nhìn chung, vai trò của phage chưa rõ ràng và cần nghiên cứu thêm

để khẳng định Cùng năm 2013, Viện NCNTTS II triễn khai theo dõi 11 ao nuôi

Vibrio tổng số và V paraharmolyticus theo định kỳ 2 ngày/lần để xem sự phát triển

của Vibrio trong ao nuôi đồng thời có biện pháp can thiệp kịp thời Mật độ Vibrio

trong nước bắt đầu tăng từ tuần nuôi thứ 2 Nếu dùng chất diệt khuẩn hoặc chế

phẩm vi sinh thì có thể kiểm soát phần nào mật độ Vibrio Tuy nhiên tổng số Vibrio

vẫn cao ở các tuần cuối vụ nuôi có thể do lượng chất thải và lượng sinh khối tăng

Mật độ V parahaemolyticus trong nước ao tăng ở các tuần nuôi cuối

Năm 2014, tác giả Nguyễn Thu Tâm và cộng sự đã tiến hành điều tra “Tình

hình nhiễm vi khuẩn Vibrio spp Trên tôm bạc, tôm sú và tôm Rảo Đất tại một số

chợ thuộc quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ” Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp trên tôm bạc khá cao 60%; tôm sú 33,33%; tôm Rảo Đất 49,98% Tỷ lệ nhiễm này là khá cao, chứng tỏ tôm sú, tôm bạc, tôm Rảo Đất sống trong môi

trường nước có sự biến động về nồng độ muối Vi khuẩn Vibrio spp là loài ưa

muối, cần muối để phát triển, chúng phân bố rộng ở các khu vực nước mặn, vùng nước ven biển, cửa sông và các khu vực nuôi trồng thủy hải sản Tuy nhiên, mẫu trong đề tài hầu hết lấy từ chợ đầu mối và không biết hết được nguồn gốc của số tôm này cũng như chưa xác định được được hết nguyên nhân gây bệnh Có thể nói,

tôm cũng có thể bị vấy nhiễm vi khuẩn Vibrio từ một số loài thủy hải sản khác [13]

Năm 2017, tác giả Nguyễn Hồng Lộc và Lê Hồng Phước đã thực hiện đề tài

“Sự hiện diện của WSSV, Vibrio parahaemolyticus gây AHPND và EHP trên tôm

giống và tôm nuôi theo mô hình QC/QCCT vùng chuyên tôm nước lợ ở ĐBSCL năm 2017” Kết quả nghiên cứu đưa ra tỷ lệ nhiễm các mầm bệnh trên 141 tôm nuôi

QC/QCCT thu tại các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang trong năm

2017 như sau: tỷ lệ nhiễm V.parahaemolyticus gây AHPND trong mùa khô là 6,45% và mùa mưa là 2,53% So với năm 2015 và 2016 thì tỷ lệ nhiễm Vibrio

parahaemolyticus trên tôm giống trong năm 2017 cao hơn (2,42% trong năm 2016;

0,2% trong năm 2015) Tiếp tục khảo sát tình trạng nhiễm WSSV, EHP và V

parahaemolyticus trên tôm giống và tôm thương phẩm ở các tỉnh thuộc ĐBSCL để

có thông tin cảnh báo kịp thời đồng thời cũng làm cơ sở dự liệu cho so sánh tỷ lệ

nhiễm bệnh hằng năm [31]

1.3 Một số biện pháp hạn chế dịch bệnh gan tụy cấp trên tôm

Tại Thái Lan, một số quy định được đưa ra như thường xuyên tầm soát sự hiện

diện của V parahaemolyticus trong nước, đất Nước trước khi sử dụng nên được

chứa trong ao lắng và tiệt trùng kỹ trước 1 tháng Các dòng chế phẩm vi sinh có

chứa Bacillus có thể sử dụng để ngừa AHPND Kiểm soát oxy hòa tan trong ao ở

mức từ 5 mg/L trở lên, ngừng cho ăn khi phát hiện tôm bị AHPND sau đó cho ăn từ

từ nếu thấy tôm tốt hơn Cũng có thể áp dụng biện pháp nuôi kết hợp với cá rô phi hay cá chẽm Các chất kích thích miễn dịch hay acid hữu cơ cũng có thể áp dụng Một số kháng sinh có thể sử dụng ở Thái Lan như oxytetracyclin, florfenicol, enrofloxacin và Romet 30 [21]

Một nghiên cứu được thực hiện bởi Yi và cộng sự (2003) tại Thái Lan nuôi kết

lượng cao hơn và có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (tăng 21%) [32]

Ở Mexico (2014), Công ty INVE Aquaculture đã thử nghiệm đánh giá hoạt

động của chất diệt khuẩn và chế phẩm sinh học có chứa các dòng vi khuẩn Bacillus

có khả năng chống lại vi khuẩn gây bệnh V parahaemolyticus Các dòng vi khuẩn

Bacillus này được phân lập bởi nhóm nghiên cứu của TS Bruno Gomez-Gill tại

Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thực phẩm Đặc biệt, một trong những chế

phẩm sinh học đó có khả năng ức chế sự phát triển của 10 dòng vi khuẩn V

parahaemolyticus Việc sử dụng một cách có chọn lọc hỗn hợp từ vi khuẩn Bacillus đã mang đến sự cải thiện rõ rệt tỷ lệ sống Trong giai đoạn nuôi đầu tiên, tỷ

lệ sống của tôm gia tăng từ 32% lên 36% Cuối giai đoạn hai, sự cải thiện trong tỷ lệ sống dẫn đến việc tăng tỷ lệ tôm có thể được thu hoạch 1,3 triệu con giống PL đại diện cho tỷ lệ tăng 39% về sản lượng [33]

Khi dịch bệnh AHPND bùng phát tại các ao ương tôm giống ở Thái Lan (2015), các hộ nuôi đã tăng cường sử dụng probiotic AquaStar Pond và AquaStar,

tỷ lệ chết và tiến triễn bệnh giảm đáng kể Tất cả những tôm sống được hồi phục và gan tụy thể hiện khỏe mạnh Ngoài ra, axit hữu cơ cũng được nghiên cứu cho khả

năng ức chế V parahaemolyticus, axit hữu cơ được thêm vào thức ăn để tăng cường

khả năng miễn dịch của hệ tiêu hóa Kết quả cho thấy tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng

củaV parahaemolyticus đến 80-95%, với liều lượng là 5.000 ppm [34]

Năm 2014, tác giả Nguyễn Văn Phúc và cộng sự đã phân lập và thử khả năng đối kháng của các chủng thu được trong các mẫu đất, nước, mẫu tôm trên 31 ao ở Bến Tre, trong đó chọn ra được 17 chủng có khả năng sinh enzyme ngoại bào và

khả năng kháng với V paraharmolyticus Trong đó có 2 chủng có khả năng kháng

V paraharmolyticus và sinh enzyme mạnh nên được định danh và phân nhóm thuộc

B sublitis Đây là bước cơ bản làm cơ sở cho việc nghiên cứu làm chế phẩm sinh

học nhằm hạn chế bệnh hoại tử gan tụy trên tôm nuôi ở Việt Nam [35]

Nguyễn Thị Trúc Linh và cộng sự (2017) đã nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn lactic bổ sung vào thức ăn lên khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính

trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của

tôm rất cao từ 82,23 đến 92,23% ở các nghiệm thức có bổ sung LAB vào thức ăn có

sự khác biệt ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng [36]

Trương Hồng Việt và cộng sự (2017) đã thử nghiệm cao chiết khổ sâm (Croton tonkinensis) và đơn châu chấu (Aralia armata) trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) ở điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy tỷ lệ sống trung bình với hai dịch chiết trên ở các nồng độ 2% và 4% đều lớn hơn 60% có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với đối chứng [37]

1.4 Chế phẩm vi sinh (probiotic)

1.4.1 Khái niệm về probiotic

Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic được định nghĩa như là một vi sinh vật có những khả năng sau: là sản phẩm sống; không mang mầm bệnh và độc tố; tạo ra tác dụng có lợi trên vật chủ; có khả năng tồn tại và phát triển trong đường ruột của vật chủ; duy trì ổn định và tồn tại lâu dài để được sử dụng sau điều kiện lưu trữ và điều kiện ngoài hiện trường [21], [38]

Theo FAO và WHO mở rộng định nghĩa chế phẩm sinh học bao gồm một loạt

vi khuẩn Gram âm, Gram dương, thể thực khuẩn bacteriophage, vi tảo, nấm men được sử dụng qua đường miệng hoặc bổ sung vào môi trường nước [4]

Probiotic phát triển qua đường ruột có đặc tính đối kháng với vi khuẩn bởi vì chúng có thể tạo ra acid hữu cơ và các hoạt chất kháng sinh (bacteriocins) Chúng thay đổi cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn để tạo ra chuỗi acid béo, tăng hấp thụ nước, muối và giảm tính di động Bên cạnh đó, chúng cũng kích thích tăng cường sức khỏe tốt cho vật chủ, cung cấp hệ thống bảo vệ ức chế sự lây nhiễm bởi việc kích thích hệ thống miễn dịch, làm giảm bớt sự không dung nạp đường lactose, giảm cholesterol, cải thiện trọng lượng và tỷ lệ chuyển đổi thức ăn Probiotic được phân lập từ ruột động động vật như là sản phẩm đầy tiềm năng nhằm ức chế vi khuẩn gây bệnh thông qua hệ thống tiêu hóa [39]

Các chủng probiotic được sử dụng trong thủy sản hầu hết những vi khuẩn

lactic acid (Lactobacillus plantarum, L acidophilus, L casei, L rhamnosus, L

bulgaricus, Carnobacteriu, …), giống Bacillus (Bacillus subtilis, B licheniformis,

B megaterium, B polymyxa, …), Actinomycetes, Nitrobacteria, … được áp dụng

trong các bể ương nuôi, trong ao nuôi nhằm hạn chế sự nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh [40]

Cũng theo nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và cộng sự (2007) một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase, một số vitamin thiết yếu

và chất khoáng Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học giúp xử lý nước và nền đáy

ao thường bổ sung thêm các chủng nấm sợi và xạ khuẩn (thuộc

nhóm Aspergillus, Streptomyses ) [41]

Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic đã được áp dụng để cải thiện chất lượng nước và kiểm soát vi khuẩn liên quan đến các bệnh mới nổi Một số loại chế phẩm sinh học có hiệu quả trong việc ức chế sự tăng trưởng của một số vi khuẩn bao gồm sản phẩm thương mại INVE Sanolife® (INVE, Bỉ) có chứa vi khuẩn Gram dương

Bacillus sp cũng như Procreatin 7 (Safmex, Mexico) có chứa nấm men S cerevisia

và Debaryomyces hansenii Một nghiên cứu cho thấy rằng các giải pháp probiotic

có chứa Streptomyces kết hợp với vi khuẩn thuộc giống Bacillus cải thiện các thông

số tăng trưởng và đáp ứng miễn dịch ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

(Litopenaeus vannamei) Nghiên cứu này cho thấy rằng sự kết hợp của một số chế

phẩm sinh học có thể là một bước hiệu quả để giảm thiểu tác động bất lợi của bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trong nuôi tôm [42], [43]

1.4.2 Nghiên cứu ứng dụng probiotic

 Thế giới:

Nhìn chung, men vi sinh đã được áp dụng trong bể nuôi, trong ao để hạn chế sự nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh, mặc dù ảnh hưởng về dinh dưỡng cũng đóng vai trò trong men vi sinh, đặc biệt là việc sử dụng dinh dưỡng mang lại tác dụng làm sạch môi trường Hầu hết men vi sinh sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học

trong nuôi trồng thủy sản là vi khuẩn lactic acid (Lactobacillus, Carnobacterium, ), rgiống Vibrio (Vibrioalginolyticus, ), giống Bacillus hoặc giống Pseudomonas

Verschuere và cộng sự (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp

đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước, do vi khuẩn này đạt

giúp giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan [44]

Boyd và cộng sự (1996) đã công bố việc thử nghiệm thành công khi sử dụng

kết hợp các chủng vi sinh vật: Bacillus subtilis, Nitrobacter, Aerobacter,

Cellulomonas và Rhodopseudomonas trong các ao nuôi thủy sản Kết quả là các ao

nuôi thử nghiệm không còn mùi hôi, giảm hàm lượng mùn bã hữu cơ, giảm lượng

tôm cá nuôi, đồng thời hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh trong ao nuôi [40]

Hossain và cộng sự (2013), nghiên cứu thực hiện trong 138 ngày đánh giá tỷ

lệ tăng trưởng và tỷ lệ sống của P monodon bằng chế phẩm sinh học Độ trong

suốt, độ mặn, pH, oxy hòa tan (DO), nhiệt độ, tổng đạm amon (TAN) được ghi lại bằng các phép đo chuẩn Trọng lượng cơ thể cuối cùng trung bình của tôm thu hoạch là 37,67 ± 1,15 g trong ao probiotic và 27,33 ± 0,58 g trong ao đối chứng Tỷ

lệ sống trung bình là 90,67 ± 1,15% trong ao probiotic và 71,00 ± 3,0% trong ao đối chứng Tăng trọng trung bình hàng ngày (ADG) là 0,27 ± 0,01 g trong ao probiotic

và 0,19 ± 0,01 g ao đối chứng Kết quả cho thấy rằng probiotic đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì các thông số chất lượng nước, chất lượng đất và quản

lý sức khỏe cũng như tăng sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm [45]

Theo Kumar và cộng sự (2016), hiệu quả probiotic phụ thuộc vào nhiều yếu tố như liều lượng sử dụng, thời gian sử dụng và chu trình sử dụng được thể hiện qua

nghiên cứu ở tôm nuôi, L Plantarum kích thích tăng cường hệ thống phenoloxidase (PO), prophenoloxidase (ProPO), superoxide dismuatase (SOD) và loại bỏ V

alginolyticus khi vi khuẩn có lợi này được cho vào thức ăn 1010 CFU/kg trong 168 giờ [39]

Gustavo Pinoargote and Sadhana Ravishankar (2018)đưa ra báo cáo về “Đánh

giá hiệu quả của probiotic trong thí nghiệm đối với vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm” Probiotic có

thể cung cấp một phương pháp hiệu quả để giảm tác động bất lợi của căn bệnh này trong ao nuôi tôm Nghiên cứu này đã được tiến hành để xác định tác dụng ức chế

của probiotic đối với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra AHPND Các giải pháp probiotic bao gồm: Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, và

Rhodopseudomonas palustris riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau thử nghiệm với V parahaemolyticus

Kết quả từ thử nghiệm cho thấy các giải pháp probiotic bao gồm L casei, sự kết hợp của L casei và R palustris, và sự kết hợp của L casei, S cerevisiae và R

palustris có khả năng ức chế AHPND trong nuôi tôm Nghiên cứu hiện tại cho thấy

rằng sự kết hợp của một số chế phẩm sinh học có thể có hiệu quả bước hướng tới giảm thiểu tác động bất lợi của cấp bệnh hoại tử gan tụy trong nuôi tôm Theo đó, mục tiêu của nghiên cứu này là xác định tác dụng ức chế của probiotic cũng như sự

chuyển hóa của chúng đối với chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND trong

thí nghiệm [42]

 Việt Nam:

Theo Võ Thị Thứ và cộng sự (2004) thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nước nuôi của tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi Tác dụng của chế phẩm lên sự tăng trưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống của tôm và tôm tăng trưởng nhanh [46]

Theo Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cộng sự (2010), nghiên cứu cho ra sản phẩm

BioShrimp-RIA2 và BioFish-RIA2 bao gồm 4 chủng vi khuẩn Achromobacter

xylosoxidans, Bacillaceae bacterium, Enterobacter cancerous, Pantoea stewartii có

khả năng ức chế giảm độc lực của nhóm vi khuẩn Vibrio và giảm mật độ Vibrio khi thử nghiệm trên ấu trùng cá chẽm và tôm sú Kết quả cho thấy nâng cao tỷ lệ sống của cá chẽm từ 7 – 10% và tôm sú 10% [47]

Nguyễn Ngọc Vĩnh (2012) với đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm sinh học EM đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và khả năng kháng bệnh của tôm chân

trắng (Penaeus vannamei) nuôi tại huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng” Kết quả thấy

rằng các yếu tố pH, nhiệt độ và độ mặn khá ổn định ở các ao nuôi sử dụng chế phẩm sinh học ổn định hơn so với đối chứng không sử dụng chế phẩm sinh học Tại những thời điểm kiểm tra khác nhau sau 30 ngày, 45 ngày và 60 ngày nuôi, tốc độ tăng trưởng về trọng lượng và chiều dài của tôm trong ao nuôi tôm có bổ sung chế phẩm sinh học tăng nhanh hơn so với ao nuôi không sử dụng chế phẩm sinh học Điều này được thể hiện rõ nhất trong lần kiểm tra cuối cùng với trọng lượng (16,93g/con) và chiều dài (13,22 cm/con), trong khi đó ao nuôi không sử dụng chế phẩm sinh học đạt trọng lượng thấp hơn (13,84 g/con) và chiều dài (12,76 cm/con) [40]

Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự (2014), Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM nghiên cứu chế phẩm Probact dùng trộn thức ăn của tôm và Ecobact dùng để xử lý

môi trường nước trong ao nuôi tôm Kết quả làm giảm vi sinh vật gây bệnh Vibrio

cho tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong ao nuôi tôm, tăng tính miễn dịch cho tôm Các chế phẩm này được sử dụng tại các nông hộ nuôi tôm ở Cần Giờ, Nhà

Bè và các tỉnh ĐBSCL cho kết quả tôm ít bệnh, tăng trưởng tốt năng suất thu hoạch tăng từ 30 – 45% [48]

Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cộng sự đã tiến hành đề tài

“Đánh giá tình hình sử dụng chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long” tại 93 hộ nuôi tôm ở 3 tỉnh Cà Mau, Bến Tre và Bạc Liêu Kết quả khảo sát cho thấy đa số các hộ đều nhận thức được tầm quan trọng của việc sử dụng chế phẩm vi sinh (CPVS) trong nuôi tôm Đa số các hộ đánh giá việc sử dụng CPVS có hiệu quả tốt Các dòng CPVS sử dụng trong nuôi tôm bao gồm CPVS xử lý chất

hữu cơ CPVS xử lý khí độc ở đáy ao, CPVS đối kháng Vibrio gây bệnh, CPVS bổ

sung vào thức ăn Tuy nhiên, những kết quả ở 93 hộ nuôi tôm cho thấy chế phẩm vi sinh không phải là yếu tố duy nhất quyết định đến năng suất và tỉ lệ sống của các

mô hình nuôi tôm Các yếu tố khác cần phải lưu ý bao gồm chất lượng con giống,

kỹ thuật nuôi và các biện pháp quản lý môi trường và sức khỏe tôm nuôi, nhằm đảm bảo cho sự thành công của nghề nuôi tôm [49]

Kể từ khi tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp được xác định, đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đối với bệnh này nhưng thực tế cho thấy các giải pháp ức chế bệnh AHPND chưa cụ thể và rõ ràng Theo tổng cục thủy sản thì 5 tháng đầu năm 2017 diện tích nuôi tôm cả nước bị bệnh gan tụy cấp là 1.557 ha, chiếm khoảng 13,6% trong đó các tỉnh thiệt hại là Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Bến Tre, Kiên Giang, Điều này cho thấy bệnh hoại tử gan tụy cấp vẫn còn xuất hiện ở một tỷ lệ đáng lo ngại đòi hỏi cần phải sớm có giải pháp cho bệnh nguy hiểm này nhằm góp phần làm ổn định năng cho nghề nuôi tôm của Việt Nam

Trong những năm gần đây, việc sử dụng chế phẩm vi sinh (probiotic) trở thành hướng tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản để giảm thiểu các tác động của AHPND [4], đặc biệt là đối với ngành nuôi tôm ở nước ta Bên cạnh đó,

dù đã có nhiều nghiên cứu bài bản để đưa ra các sản phẩm có khả năng ức chế với

vi khuẩn Vibrio sp nhưng chưa có công trình nghiên cứu nào đưa ra kết quả ứng

dụng sản phẩm vi sinh có khả năng ức chế đặc hiệu với vi khuẩn gây bệnh AHPND Hơn thế nữa, chế phẩm vi sinh cũng có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật bản địa nếu không được quản lý, giám sát chặt chẽ Các vi sinh vật trong chế phẩm tạo ra một hệ thống vi sinh thái khác nhau, hỗ trợ lẫn nhau Chính vì thế hoạt động tổng hợp của chúng sẽ đem lại hiệu quả cao nhằm kiểm soát dịch bệnh, tăng cường miễn dịch, men tiêu hóa, góp phần cải thiện chất lượng nước, ổn định pH, hạn chế ô nhiễm môi trường nước, đất giúp người nuôi tôm được hiệu quả kinh tế cao và bền vững

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2018 -09/2019.Bao gồm thời gian nghiên cứu tài liệu, khảo sát các phương pháp sử dụng chế phẩm probiotic hiệu quả trên tôm sú và tôm thẻ (09/2018 - 01/2019), ứng dụng chế phẩm probiotic trên mô hình

ao nuôi tôm sú, tôm thẻ (02/2019 - 07/2019), phân tích mẫu, phân tích số liệu và viết báo cáo

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thủy sản Nam bộ - Viện Nghiên cứunuôi trồng thủy sản II: 116 Nguyễn Đình Chiểu, Phường Đa Kao, Quận 1, TP.Hồ Chí Minh và Cơ sở nghiên cứu thực nghiệm: 2171 Lê Đức Thọ, Phường 13, Quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh

Mô hình ao nuôi tôm ở Trung tâm tập huấn và chuyển giao công nghệ nông nghiệp vùng đồng bằng sông Cửu Long, ấp Nopoul, xã Vĩnh Tân, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng

2.1.3 Các thiết bị, vật liệu dùng trong thí nghiệm

Các thiết bị tăng sinh vi khuẩn và phân tích chất lượng nước: Bình erlen, tủ hấp, tủ lắc, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm, quang phổ kế UV-VIS

Các bể composite và bể nhựa dùng cho thí nghiệm, máy sục khí, các thiết bị công trình trong ao nuôi thử nghiệm như hệ thống quạt, hệ thống sục khí, máy bơm các loại, …

Tôm sú và tôm thẻ chân trắng được dùng để nuôi thử nghiệm trọng lượng 1-

nghiệm

Chế phẩm sinh học chứa từng loại vi khuẩn có lợi Bacillus licheniformis B1

CFU/g); vi khuẩn gây AHPND Vibrioparahaemolyticus thuộc phạm vi đề tài

“Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp gây bệnh hoại tử gan tụy

cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng” – Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II

Chủng B1 có nguồn gốc từ ruột cá đối (Mugil cephalus) cá tự nhiên, S5 phân lập từ mẫu bùn ao nuôi quảng canh cải tiến tỉnh Sóc Trăng, X285 phân lập được từ

mẫu bùn ao nuôi tôm lúa Bạc Liêu Các chủng này cho kết quả vòng kháng V

parahaemolyticus đạt trên 15 mm và ổn định trong 24 giở khảo sát bằng phương

pháp khuếch tán trên giếng thạch; như Hình 2.1 cho thấy Bacillus B1, S5 có vòng kháng V parahaemolyticus khoảng 15 mm; Streptomyces dao động từ 30 đến 50

mm ổn định 48 giờ

Hình 2.1.Kết quả đối kháng khuếch tán đĩa của các chủng Bacillus B1, Bacillus

S5 và Streptomyces X285 với VP được tuyển chọn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định liều gây chết trung bình (LD 50) của vi khuẩn

V parahaemolyticus đối với tôm thử nghiệm

Trước tiên tôm được chọn lọc 15 con/ bể, trọng lượng trung bình 3g/ con, làm thuần và ổn định trong bể thí nghiệm có dung tích 90L có sục khí liên tục trước thời gian thí nghiệm 1 tuần Siphon cấp thêm nước hằng ngày Cho tôm ăn bằng 2,5% trọng lượng cơ thể với thức ăn viên Đài Loan có thành phần đạm 55%, béo 8%, xơ 2,5%, tro 13%, độ ẩm 8% Tôm được kiểm tra các tác nhân gây bệnh thông thường

như: WSSV, TSV, YHV, IMNV, IHHNV, Vibrio phát sáng và V parahaemolyticus

trước khi thí nghiệm Dựa theo phương pháp mô tả của Reed và Muench (1983) [50]

Thí nghiệm được bố trí với các nghiệm thức khác nhau được thể hiện bảng 2.1, mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm xác định LD 50 của V.parahaemolyticus đối với tôm

Nồng độ vi khuẩn gây bệnh (CFU/mL)

Tôm được gây nhiễm bằng phương pháp ngâm [30] Chuẩn bị vi khuẩn V

parahaemolyticus gây cảm nhiễm: V parahaemolyticus gây AHPND được cấy

parahaemolyticus được khảo sát trong thí nghiệm thì 1 OD550nm= 5,58 x 108 tế

bào/ mL (Phụ lục 2).Mật độ vi khuẩn V parahaemolyticus được gây cảm nhiễm

Thí nghiệm được thực hiện với các nghiệm thức nồng độ khác nhau Mỗi nghiệm thức thử nghiệm với 15 tôm trong 20L nước, vi khuẩn được điều chỉnh đúng với mật độ khảo sát Thí nghiệm ghi nhận biểu hiện tôm, số lượng tôm chết hằng ngày Tôm chết được loại ra khỏi bể nuôi kịp thời để tránh trường hợp tôm chết lâu làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước thí nghiệm

Ngoài ra, thu mẫu tôm lờ đờ có dấu hiệu ngoài đặc trưng của bệnh AHPND cấy ria trực tiếp trên môi trường TCBS hoặc Chromagar kiểm tra lại sự hiện diện

của V parahaemolyticusgây AHPND bằng phương pháp PCR Ngoài ra, các mẫu

tôm lờ đờ ở các nghiệm thức được cố định trong dung dịch Davidson chuyển về phòng thí nghiệm phân tích mô bệnh học

theo công thức:

2.2.2 Phương pháp thử nghiệm sử dụng probiotic hiệu quả

2.2.2.1 Phương pháp tăng sinh các chủng vi sinh trong chế phẩm sinh học Bacillus B1, S5 và Streptomyces X285

Chế phẩm Bacillus B1 và Bacillus S5 có mật độ Bacillus ban đầu khoảng

sử dụng được hoạt hóa và tăng sinh theo công thức sau: bột đậu nành (2g/L), mật rỉ

Hai nhóm vi sinh này được nhân sinh khối từng mẻ trong đó sản phẩm

Bacillus được tăng sinh thời gian 18-24 giờ; nhóm Streptomyces được tăng sinh thời

gian 60-72 giờ sục khí liên tục trước khixử lý nước định kỳ trong các thí nghiệm

Với công thức môi trường nhân sinh khối từ sản phẩm trên thì thu được dịch

2.2.2.2 Thí nghiệm thăm dò liều sử dụng chế phẩm hiệu quả bằng phương pháp cho ăn và phương pháp xử lý nước

Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá phương pháp cho ăn hay xử lý nước

mang lại hiệu quả trong phòng bệnh gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng

Tôm sú/ tôm thẻ (tôm) được bố trí thí nghiệm trong các bể composite thể tích

50 lít chứa 30 lít nước biển sạch độ mặn 20 ‰ Tôm khỏe (2-3 gram) được thuần tại trại giống Vũng Tàu sau đó đưa về phòng thí nghiệm nuôi trong bể sục khí liên tục Tôm được bố trí vào các nghiệm thức một cáchngẫu nhiênBảng 2.2 Tôm được

cho ăn probiotic như Bảng 2.2 liên tục trong 14 ngày trước khi gây nhiễm với V

parahaemolyticus đối với phương pháp cho ăn Phương pháp xử lý nước thì các

nghiệm thức thí nghiệm được xử lý 2 lần/ tuần trước khi gây nhiễm Các nghiệm thức được lặp lại 03 lần và các bể được theo dõi liên tục 10 ngày sau khi gây nhiễm

Chuẩn bị vi khuẩn V parahaemolyticustương tự mục 2.2.1

Vi sinh trước khi sử dụng được lên men theo công thức trongmục 2.2.2.1

Bảng 2.2 Thí nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic bằng phương pháp cho ăn

Streptomyces X285 10

BacillusS5 105 CFU/mL 2 lần/tuần

Streptomyces X285 104 CFU/mL 2 lần/tuần Bac B1-Strep X

(B1-X285)

Bac S5- StrepX (S5-X285)

Ghi chú: nghiệm thức đối chứng: tôm được cho ăn thức ăn và nuôi trong điều kiện không sử dụng chế phẩm vi sinh

Tôm cảm nhiễm sẽ được ghi nhận tỷ lệ chết hằng ngày và liên tục trong 10

ngày đến khi không còn hiện tượng chết

Sau đó đánh giá tỷ lệ bảo hộ (relative percent survival – RPS) dựa theo công

B: là phần trăm tôm chết ở nhóm đối chứng V parahaemolyticus

2.2.2.3 Phương pháp khảo sát tần suất sử dụng chế phẩm probiotic trong điều kiện phòng thí nghiệm

Mục tiêu: đánh giá thời gian xử lý nước hiệu quả nhằm kiểm soát được V

parahaemolyticus gây bệnh AHPND

Tôm thẻ, tôm sú khỏe trọng lượng 1,5-2 g/con được bố trí vào các bể nhựa (composite) tròn (500 lít) chứa 350 lít nước biển (độ măn 15-20 ‰) có sục khí liên tục Mỗi nghiệm thức bố trí 100 tôm/bể cho ăn 3 lần/ ngày, được lặp lại 3 lần Định

thức sau khi xử lý probiotic một ngày theo bố trí Bảng 2.2, tiến hành gây cảm

Phương pháp chuẩn bị vi khuản V parahaemolyticus gây nhiễm và phương pháp

lên men các sản phẩm probiotic được miêu tả mục 2.2.2 và 2.2.2.1

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm tần suất sử dụng probiotic

2.2.2.4 Thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic trong mô hình ao nuôi tôm

Dựa vào kết quả thử nghiệm hiệu quả xử lý nước ao nuôi 2 lần/tuần kết hợp giữa các chủng vi sinh vật có lợi (probiotic) trong phòng AHPND trong phòng thí nghiệm xây dựng dự thảo quy trình sử dụng probiotic nhằm ứng dụng quy mô ao

nông nghiệp vùng đồng bằng sông Cửu Long, ấp Nopoul, xã Vĩnh Tân, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng

Ao nuôi thẻ được thiết kế phủbạt toàn bộ ao và ao sú chỉ phủ bạt bờ Hệ thống cấp và thoát nước riêng biệt, hệ thống thu gom chất thải được bố trí giữa ao nhằm định kỳ đưa lượng thức ăn dư thừa và chất thải ra khỏi hệ thống nuôi Ngoài

ra, hệ thống sục khí và quạt được thiết kế nhằm đảm bảo duy trì đủ lượng oxy cho tôm và thu gom chất thải tại các vị trí hố chứa thải trước khi siphon

(YHD), bệnh còi (MBV), bệnh AHPND, và các mầm bệnh khác trước khi thả

Số lượng ao thử nghiệm cho đối tượng:

Tôm sú: 2 ao dùng sản phẩm probiotic từ đề tài và 1 ao đối chứng (sản phẩm thương mại)

Tôm thẻ chân trắng: 2 ao dùng sản phẩm probiotic từ đề tài và 2 ao đối chứng (sản phẩm thương mại)