Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)​

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN GP5 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ... glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyênmạnh và c

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sựhướng dẫn của PGS.TS Lê Văn Sơn các số liệu, kết quả nêu trong luận văn làtrung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Sơn đã tận tìnhchỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoànthành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo – Các nhàkhoa học đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thứckhoa học quý báu

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tậntình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này Tôi luôntrân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng Côngnghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn Tôicũng xin cám ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã cung cấpkinh phí, thiết bị cũng như cho phép tôi sử dụng các kết quả nghiên cứuthuộc đề tài NV07-PTNTDD2015

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạothuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạođiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trìnhthực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP Deoxynucleoside Triphosphate

E.coli Escherichia coli

EtBr Ethidium Bromide

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GP5 Glycoprotein 5

IPTG Isopropylthio-β-Galactoside

kDa Kilodalton

bản nuôi cấy vi khuẩnMES 2-(N-morpholino)Etansulfonic acid

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PRRS Porcine Reproductive and Hội chứng rối loại hô hấp

Respiratory Syndrome và sinh sản ở lợn

PRRSV Porcine Reproductive and Virus gây hội chứng rối loại

Respiratory Syndrome virus hô hấp và sinh sản ở lợnRNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

TAE Tris-Acetate-EDTA

X-gal

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Beta-D-Galacto-Pyranoside

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu: 2

3 Nội dung nghiên cứu: 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về PRRS 3

1.1.1 Khái niệm PRRS 3

1.1.2 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn 3

1.1.3 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) 8

1.2 Protein tái tổ hợp 11

1.2.1 Giới thiệu 11

1.2.2 Glycoprotein (GP5) 12

1.2.3 Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 13

1.2.4 Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất và môi trường 18

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Tạo dòng gen gp5 19

2.2.2 Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5 21

2.2.3 Phương pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 29

3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 32

3.3 Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen của virus PRRS 10Hình 2.1 Sơ đồ vector tách dòng pBT 16Hình 2.2 Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) 17

Hình 3.1 Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen GP5 30Hình 3.2 Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 31Hình 3.3 Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới hạn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tên thiết bị thí nghiệm 19

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 20

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 20

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 22

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) 22

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối gen 24

Bảng 2.7 Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE) 26

âm ỉ gây rối loạn sinh sản như động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đốivới lợn đực giống, PRRS làm giảm số lượng tinh dịch, chất lượng tinh dịchkém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con [9] “Lợn tai xanh”

là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ

Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều

lợn nhiễm bệnh [1]

Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nước trên thế giới,gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế PRRS lần đầu tiên được phát hiện ởHoa Kỳ vào năm 1987, châu Âu tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991 vàtại châu Á vào đầu những năm 1990 [36] Tại Việt Nam, PRRSV được pháthiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 bằng phản ứng huyết thanh học Gầnđây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiềuđịa phương trong cả nước, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chănnuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [7]

Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi

Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dương, có cấu trúc tương tự

cấu trúc của Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau mã hóa cho 7

protein của virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N Trong số đó,protein GP5 (glycoprotein 5) được mã hoá bởi ORF5, là một protein được

glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyênmạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus.

Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào

cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăncản hiện tượng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tếbào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và quatrung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity) Ngoài ra, GP5 còn thamgia hiện tượng “chết theo chương trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơthể bị nhiễm PRRSV Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhânlàm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnhdịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của cácvaccine phòng bệnh đang lưu hành

Chính vì vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 của PRRSV là thực

sự cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh và sản xuất vaccine tái tổ hợpthế hệ mới nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại do virus PRRSV gây ra

Từ những cơ sở lý luận khoa học và những nghiên cứu của các nhà khoa

học trong và ngoài nước chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5 Biểu hiện và

tinh sạch được protein tái tổ hợp GP5 của Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus.

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo dòng vector mang gen gp5: Dựa trên thông tin vềtrình tự nucleotide của gen gp5 đã công bố, thiết kế các cặp mồi phù hợp đểphân lập kiểm tra và nhân gen bằng PCR

- Nghiên cứu thi ết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5.

- Biểu hiện GP5 trong E coli BL21 và tinh sạch protein tái tổ hợp

Bệnh còn được gọi bằng một số tên khác như:

Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Disease Syndome) Hội chứng vô sinh và

hô hấp ở lợn, viết tắt là SIS (Swine Infertility and Respiratory Syndromde) Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn, viết tắt là PEARS (Porcine Endemic and Respiratory Syndrome) Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) Bệnh lợn tai xanh (Blue-ear Disease).

Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St Paul,Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ởlợn (PRRS) và được tổ chức Thú Y thế giới công nhận Bệnh được gây rabởi virus PRRS, tồn tại dưới dạng hạt virion gây nhiễm

1.1.2 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

* Cơ chế gây bệnh và các phương pháp lan truyền

Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu củalợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn đựcgiống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh Ở lợn cái mang thai, virus cóthể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh.

Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đường hô hấp, tiêuhóa và đường âm đạo Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của virus làcác đại thực bào ở phế nang Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấutrúc hạt của virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trongloại tế bào này và phá hủy nó Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ lớn các tế bào đại thựcbào trong nang phổi bị virus xâm nhập rất sớm và phá hủy làm giảm khả năngphòng vệ của phổi Lúc đầu, PRRSV có thể kính thích sự tăng sinh của đại thựcbào nhưng sau 2-3 ngày, virus này sẽ giết chết chúng, các virion được giảiphòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác, tiếp tục quá trình nhân lên và pháhủy đại thực bào Trong cơ thể lợn ốm do mắc PRRS có tới 40% tế bào đại thựcbào bị virus giết chết [17] Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bàođóng vai trò vô cùng quan trọng, cả trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và khôngđặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu Khi đại thực bào

bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho quá trình miễn dịch không xảy ra được, cơthể lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễmtrùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giếtthịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do

những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp như Mycoplasma hyopneumoniae, P multocida, S suis, A pleuropneumoniae Tiêu Quang An

và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác định một số vi khuẩn kế phát gây chết

lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên năm 2010 đã chothấy lợn mắc PRRS thường kế phát bệnh do các nhóm vi khuẩn đường hô hấp

và đường ruột như A.

pleuropneumoniae, P multocida, S.suis, Escherichia coli, Salmonella sp, Clostridium perfringens Kết quả phân lập được vi khuẩn A pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63.33% và thấp nhất là P multocida

10%[2] Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm chodịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn

* Các biện pháp phòng bệnh

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việcphòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiệnđang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn Để chủ độngphòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng,chống dịch như: Phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công táctuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và người dân thamgia chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từTrung ương tới các địa phương Trường hợp có tỷ lệ lợn trong đàn kiểm trahuyết thanh dương tính cao thì tiêu hủy là phương pháp hiệu quả Tuynhiên, phương pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi nhữnggiống thuần Điều này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớmnhững con lợn mang trùng mà chưa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết vàcấp bách Các biện pháp quản lý không được kết hợp để cải thiện điều kiệnchăn nuôi thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn sẽ tồn tại [35]

* Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam

+ Trên thế giới

Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả cácchâu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định pháthiện có bệnh Tai xanh lưu hành

Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nướctrên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà

Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức và đã gây ra những tổn thất rất lớn vềkinh tế cho người chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [27] Như hàngnăm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD.Các nước trong khu vực có tỷ lệ bệnh Tai xanh lưu hành rất cao Ở TrungQuốc là 80% Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%[5].

Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyêngia của Trung Quốc đã được phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006,đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốtcao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loạimầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy Kết quảnghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virusPRRS gâybệnh tại nước này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus(thiếu hụt 30 acid amin trong gen) Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan,Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hưởngnặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lâylan Trước diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp TrungQuốc đang thực hiện chương trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêngchương trình nghiên cứu, sản xuất vaccine đã được cam kết chi khoảng 280triệu Nhân dân tệ tương đương với 36,5 triệu USD [25]

Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu vàBắc Mỹ cùng lưu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đãxác định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng được thông báo ởThái Lan từ các năm 2000 - 2007 Thông báo cho biết các virus gây bệnh Taixanh được phân lập từ nhiều địa phương thuộc nước này gồm cả chủngdòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ Trong đó, số virus thuộc chủng dòngchâu Âu chiếm 66,42%, còn các virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm

33,58% Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lưu hành virus gâybệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điểnđộc lực thấp [13].

Tháng 9/2007, Nga là nước thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnhTai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây [16]

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đànlợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanhdương tính với PRRS và cả đàn được tiêu hủy ngay [6] Tuy nhiên, theođiều tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cậncho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu)

và 5/15 trại (chiếm 33%) có lưu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh Năm

2003, tỷ lệ huyết thanh dương tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung

ở Cần Thơ là 66,86% Như vậy, PRRS đã được phát hiện ở Việt Nam từ năm

1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trước tháng 3 năm 2007 chưa phát hiện

các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnhphía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nước láng giềng Theo thôngbáo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ởmột số nước trong khu vực Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy racác đợt dịch bệnh ở nhiều địa phương trong cả nước, gây thiệt hại hàng trăm

tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặnnguồn virus lây nhiễm Mặc dù chưa có những nghiên cứu cụ thể về tốc độlây lan của virus, nhưng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần thứ nhất (tháng 3,

4 năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dương có dịch thìsáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hưng Yên, Quảng Ninh,Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng Số lợn mắc bệnh 31.750 con,

số lợn chết và xử lý 7.296 con [15]

1.1.3 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV)

Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấycác chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tương đồng về amino acid từ 99%đến 99,7% so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều

bị mất 30 axít amin Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nước ta hiệnnay thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc [16]

Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nước từ năm 2009 đến nay đãnhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay được xác định thuộc chủng Bắc

Mỹ dòng Trung Quốc [3], [8], [10], [14]

 Đặc tính sinh học của virus

Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thựcbào hoạt động ở vùng phổi Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau

đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) Đại thực bào bị giết chết nênsức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn mắcPRRS thường dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát Virus không gây ngưng kết vớicác loại hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của người Virus pháttriển tốt trên môi trường tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng

CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào

co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra [17] Tuy

có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhưng các chủng virus Bắc Mỹ

và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hôhấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổnthương đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, người ta chia ra hainhóm virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp.Nhóm virus có độc lực cao thường gây ra các tổn thương ở tổ chức phổi lợnbệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp Năm 2007, Kegong Tian và Yukhi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho

rằng virus đã có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ

lệ chết cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [34]

 Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus

+ Sức đề kháng của virus.

Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70

oC; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đềkháng kém ở 37oC chịu được 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thíchhợp ở pH 5 -7 Với các chất sát trùng thông thường và môi trường có pHaxit, virus dễ dàng bị tiêu diệt Dưới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia

tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [10], [12]

+ Khả năng gây bệnh của virus

Người và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loàithuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm Virus có thể nhânlên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộngnên rất khó khống chế [18] Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhưnglợn con và lợn cái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Lợn rừng là động vậtmang trùng và có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên [12] Về độc lực, các nghiêncứu cho thấy virus gây PRRS tồn tại dưới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạngbiến thể độc lực cao Dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắcbệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn Dạng biến thể độc lựccao gây nhiễm bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và chết nhiều [34]

+ Cấu trúc và chức năng của virus Cấu trúc:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen của virus PRRS

Dưới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kíchthước từ 45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thước từ 25 - 35 nm,trên bề mặt có gai nhô ra rõ, có vỏ là lipid [17] Virus gây PRRS là ARNvirus với bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dương, có những đặc điểmchung của nhóm Arterivirus Sợi ARN này có kích thước khoảng 15kilobase, có chín ORF (open reading frame) mã hoá cho chín protein cấutrúc Tuy nhiên, có sáu phân tử protein chính có khả năng trung hoà khángthể bao gồm bốn phân tử glycoprotein, một phân tử protein xuyên màng (M)

và một protein nucleocapsid (N) [12] Qua các nghiên cứu cho thấy sợi đơnRNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs [7]

Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen ORF1a và ORF1b là polymerase và bẩygen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6 và 7 ORF1a và ORF1b cấu thànhkhoảng 75% bộ gen của virus và được đặc trưng bởi một quá trình khungribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà sự phân tách làm phátsinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc

Polymerase Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các proteinglycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tương ứng Các ORF2b mới được địnhnghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus được chỉ định GP2b ORF7

mã hóa các protein nuclocapsid không glycosyl hóa (N) [24]

ORF1a và ORF1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba

bộ gen và mã hóa cho RNA Polymerase của virus được xem là protein chịutrách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus

ORF2 đến ORF7 nằm ở phía sau của ORF1b, ở đầu 3’ của genome,

mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion

Sản phẩm của các ORF 5, 6, 7 bao gồm các protein chính của virus.Cho đến nay người ta đã xác định được 3 protein cấu trúc chính của PRRS

đó là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lượng phân tử khoảng 15 kDađịnh bởi ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDaquy định bởi ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọnglượng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5 Những nghiên cứu gần đâycho thấy rằng ORF 2, 3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu củaPRRS virus có lẽ mã hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là:29-30 kD GP2, 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4 [22], [23], [33]

1.2 Protein tái tổ hợp

1.2.1 Giới thiệu

Hiện nay nhu cầu sử dụng kháng nguyên là protein trong chuẩn đoánbệnh lý cũng như sản xuất vaccine là rất cao Tuy nhiên, PRRSV thường khónuôi trên môi trường tế bào Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trường đại thựcbào túi phổi heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi Hiện tại

người ta chưa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôicấy nhân tạo Các dòng tế bào thận khỉ thường không nhạy cảm cho tất cả cácchủng virus PRRS Chính vì thế phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp choPRRSV là hướng đi đúng và mang lại nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất proteintái tổ hợp mã hóa bởi ORF5 mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm nhưdùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán, tạo vaccine tái tổ hợp thế hệ mới…Sản xuất protein tái tổ hợp mở ra khả năng tạo số lượng lớn kháng nguyên dùnglàm vật liệu trong chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng phát Sản xuất proteintái tổ hợp cũng góp phần khắc phục được nhược điểm hiện tại là khó nuôi cấyPRRSV trên môi trường tế bào như đã nêu ở trên.

1.2.2 Glycoprotein (GP5)

ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thước khoảng

25 kDa GP5 nằm trên bề mặt màng virus chính là vị trí tiếp xúc của PRRSVkhi nó nhiễm vào vật chủ GP5 là một trong những glycoprotein vỏ phongphú và đa dạng nhất, là một tác nhân gây cảm ứng chính của kháng thể trunghòa trong cơ thể Nó bao gồm ba vị trí glycosylation được cho là N-linkedN34, N44, N51 nơi mà vị trí trung hòa virus được đặt tại đó [21] Plagemann

và cs (2002) đã sử dụng bản đồ peptit để chỉ ra rằng các vị trí trung hòa viruschính của PRRSV được đặt tại vị trí giữa của GP5 từ acid amin 36 đến 52.GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại PRRSV Vì vậyGP5 rất được quan tâm nghiên cứu trong việc phân tích dịch tễ học và tiếnhóa phân tử cũng như biến đổi vật liệu di truyền của chủng virus này Điểnhình là các peptide tín hiệu, vùng ngoại bào virus, vùng xuyên màng và vùngnội bào virus, các điểm trung hòa virus và những đột biến quan trọng: 13 (R

 Q), 151 (R  G) Đây là những mô hình có vai trò quan trọng làm thay đổiyếu tố ảnh hưởng đến độc lực virus Hai đột biến trên OFR5 được xem là

chỉ thị cho độc lực của chủng vaccine, đó là đột biến R13 thành Q13 và

R151 thành G151 Đột biến Q13 nằm trên trình tự peptide tín hiệu giả định làtrình tự sẽ bị loại bỏ sau dịch mã Đột biến này có thể ảnh hưởng đến sự vậnchuyển GP5 đến màng của mạng lưới nội chất Sự thay đổi G151 nằm trênphần ưa nước của glycoprotein, đây là một trong những dấu hiệu đột biếnliên quan đến sự suy yếu của PRRSV.

Protein GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết, xâm lấn,phản ứng miễn dịch của bệnh lợn tai xanh Đây là một đối tượng được dùng

để nghiên cứu và đã được một số công trình phân lập, thiết kế biểu hiện

thành công trên E.coli [27], [32].

1.2.3 Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5

Protein tái tổ hợp được sản xuất bằng cách chèn gen ORF5 mã hóacho protein GP5 vào sau promoter của pET 32a(+) Kết quả tạo ra plasmidtái tổ hợp là pET 32a(+)/GP5, có thể biểu hiện được protein có kích thước

25kDa trong tế bào E.coli chủng BL21 Protein này có kích thước tương tự

với kích thước protein GP5 biểu hiện trong tế bào túi phổi heo và vẫn giữđược cấu trúc kháng nguyên của Protein GP5 tự nhiên Hiện nay người tatập trung hướng nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 củavirus PRRS trong sản xuất vaccine vì protein GP5 được quy định bởi ORFnày có chứa những epitope trung hòa chính quan trọng của PRRSV [25]

Để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyêncủa PRRSV, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus được gắnvới các protein khác nhau hoặc cùng biểu hiện nhiều protein của virus cùnglúc Chuột tiêm GP5 và M biểu hiện từ vector replication-defectiveadenovirus có hàm lượng kháng thể trung hòa cao hơn đáng kể so với chuộtchỉ tiệm vector biểu hiện GP5 hoặc M riêng rẽ [35]

1.2.4 Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21

- Vector biểu hiện pET 32a(+)

Hệ thống vector hiểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện proteintái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homo oligohistidine (6xHis) trong tế bào

E coli Sự biểu hiện của gen mục tiêu đƣợc kiểm soát bởi promotor T7 và

nhờ hoạt tính của T7 RNA Polymerase của tế bào chủ đƣợc biến đổi bởi

phage T7 Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligohistidine gọi là

His-tag, đoạn này có thể chứa 6, 8 hoặc 10 acid amin Vector biểu hiện pET32a(+) có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản của mộtplasmid nhƣ: sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào.Ngoài ra, hệ vector pET 32a(+) còn có nhiều đặc điểm quan trọng, vƣợt trộihơn so với các hệ biểu hiện khác

Gen ngoại lai đƣợc điều khiển bởi promoter T7 – đây là promotermạnh và có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai lớnchiếm 10 – 30 % tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứngnên có thể điều khiển dễ dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai Không giống

nhƣ các promoter khác có nguồn gốc từ tế bào E coli, T7 RNA Polymerase

là một enzyme hoạt động rất mạnh, có tốc độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần

so với các RNA Polymerase có nguồn gốc từ E coli.

Trên vector đã thiết kế một đoạn gen Trx mã hóa protein Thioredoxin

Thioredoxin đƣợc phân lập đầu tiên từ E coli và tìm thấy ở nấm, virus, vi khuẩn, thực vật…Trong hệ biểu hiện E coli, Thioredoxin chiếm khoảng

40% tổng protein của tế bào, là một protein oxi hóa khử có khối lƣợng phân

tử 19,5kDa, đƣợc biết đến trong tất cả các sinh vật, đóng vai trò quan trọngtrong nhiều quá trình sinh học bao gồm cả tín hiệu oxi hóa khử

Thioredoxin góp phần làm tăng khả năng biểu hiện của gen ngoại laikhi dung hợp Ngoài ra vị trí cắt của enterokinase được thiết kế trước vùng

đa điểm cắt tách protein tái tổ hợp ra khỏi Thioredoxin

Tất cả các ưu điểm trên cho thấy pET 32a(+) không chỉ thiết kế riêngcho việc biểu hiện gen ngoại lai mà còn thuận lợi cho việc tinh sạch trongquá trình thu nhận protein tái tổ hợp

- Chủng biểu hiện E.coli BL21 [31]

Hệ gen của chủng E coli BL21 đã được cải biến một số gen là opmT,

hsdS, gal, dcm, λ DE3:

Gen ompT: là một gen mã hóa cho protease nằm trên màng ngoài tế

bào, chủng khuyết gen ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị pháhủy ngay trong tế bào

Gen hsdS: là một gen có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm

nhập tế bào chủ, chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổhợp được hiệu quả hơn

Gen gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gen gal giúp tránh việc tế bào sử

dụng galactose làm nguồn cacbon cho sinh trưởng

Gen dcm: là gen methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng

khuyết gen dcm tránh việc trình tự gen ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến saikhác trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp

T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoterlacUV dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là promoter đã được độtbiến, và được tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của

hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên nào

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Gen mã hóa cho glycoprotein (GP5) của vius Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome (PRRSV) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật –Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – ViệnCông nghệ sinh học cung cấp

Hình 2.1 Sơ đồ vector tách dòng pBT

Vector biểu hiện pET 32a(+) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Hình 2.2 Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+)

Tế bào khả biến E.coli chủng DH5 (α) và chủng BL21 (DE3) do Viện ) và chủng BL21 (DE3) do Viện

công nghệ sinh học cung cấp

2.1.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học phân tử củaBiolabs, Invitrogen, Sigma và Fremantas gồm:

Hóa chất phục vụ cho tách plasmid: Sol I (Tris-HCL 1M pH8, EDTA0,5M ph8, Glucose, H2O khử ion), sol II (NaOH 3M, SDS 10%), sol III(CH3COOK 3M, CH3COOH, H2O khử ion), isopropanol, ethanol,chloroform, RNase…

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: MgCl2, các loại đệm cho enzyme

khác nhau, Taq Polymerase, dNTP.

Hóa chất trong điện di DNA, protein: agarose 0,8%, polyacrylamid,EtBr, nước cất 1 lần…

LB lỏng (g/l): 5 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g yeast extract

LB đặc (g/l): 5 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g yeast extract, 15 g agar

Bộ kit thôi gel (binding buffer, washing buffer, elusion buffer) –GenJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific

Hóa chất dùng cho phản ứng ghép nối gen (buffer T4 ligase 10X, T4 ligase).

Vector tách dòng và biểu hiện: Vector pBT, pET 32a(+)

Kháng sinh Carbenicilin

Hóa chất dùng cho phản ứng lai Western blot…