Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan hoàng thảo thạch hộc tía (dendrobium nobile lindl)​

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY..... ĐẶT VẤN ĐỀ Bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu dân gian đang trở thành vấn đề c

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN NGỌC NAM

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA

(DEDROBIUM NOBILE LINDL)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN NGỌC NAM

NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA

(DEDROBIUM NOBILE LINDL)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

Thái Nguyên - 2018

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Thị Hải Yếngiảng viên Khoa Công nghệ sinh học đã rất nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôihoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ Phòng thí nghiệm sinh họcKhoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện về thời gian cũng như cơ sở vật chấtcho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đề tài này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luônluôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN 3

1.1.1 Phân loại và nguồn gốc 3

1.1.2 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 4

1.2 MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC 7

1.2.1 Lan Thạch hộc 7

1.2.2 Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme 9

1.2.3 Dendrobium officinale 9

1.2.4 Các Dendrobium khác 10

1.3 GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC 10

1.3.1 Đặc điểm thực vật học 10

1.3.2 Thu hái và chế biến 11

1.3.3 Công dụng và thành phần hóa học 12

1.3.4 Các vị thuốc chứa thạch hộc 13

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM 16

1.4.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 16

1.4.2 Một số nghiên cứu tại Việt Nam 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 VẬT LIỆU 19

2.1.1 Vật liệu thực vật 19

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Thu và xử lý mẫu 20

2.2.2 Khử trùng mẫu hạt đưa vào nuôi cấy 20

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 20

2.2.4 Bố trí thí nghiệm 21

2.2.5 Điều kiện nuôi cấy 22

2.2.6 Các chỉ tiêu đánh giá 22

2.2.7 Xử lý số liệu 22

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU 23

3.2 KẾT QUẢ TÁI SINH TẠO PROTOCORM 25

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tăng sinh protocorm 25

3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến quá trình nhân nhanh protocorm 26 3.2.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình phát sinh chồi protocorm 28

3.2.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ protocorm 29

3.3 KẾT QUẢ NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH IN VITRO 31

3.3.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc 31

3.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh nghiền đến sự phát triển chồi lan Thạch hộc 33

3.3.3 Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc 35

3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khử trùng đoạn thân lan Thạch hộc 23

Bảng 3.2 Kết quả khử trùng hạt lan Thạch hộc 24

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng phát sinh Protocorm 26

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến khả năng nhân nhanhprotocorm 27

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng phát sinh chồi từcụm protocorm 28

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụmprotocorm 30

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát triển cụm chồi lan Thạch hộc 31

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền đến sựphát triển lan Thạch hộc 33

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc 35Bảng 3.10 Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển lan Thạch hộc 37

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây và hoa lan Thạch hộc 11

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu thân lan thạch hộc sinh trưởng trên môi trường bổ sungBAP 1mg/l 23

Hình 3.2 Hình ảnh protocorm phát sinh từ hạt Thạch hộc trong môi trường nuôicấy sau 40 và 60 ngày 25

Hình 3.2 Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường có nồng độ BAPkhác nhau 26

Hình 3.3 Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường có bổ sung

saccharose sau 8 tuần nuôi cấy 28

Hình 3.4 Chồi phát sinh từ cụm protocorm trong môi trường chứa 100ml/lnước dừa 29

Hình 3.5 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụmprotocorm 30

Hình 3.6 Ảnh hưởng của BAP tới sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc 32Hình 3.7 Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự phát triển lan Thạch hộc 34Hình 3.8 Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc 35

Hình 3.9 Hình ảnh cây lan thạch hộc con sinh trưởng trên các loại giá thể khácnhau sau khi ra chai và huấn luyện tại vườn ươm 37

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

III

BAP 6 - Benzyl adenin purine

IAA Indol - 3 - acetic acid

IBA Indol - 3 - butyric acid

Kinetin 6 - furfurryl - aminopurin

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu dân gian đang trở thành vấn

đề cấp thiết, do tình trạng khai thác bừa bãi, thiếu khoa học cũng như sự giảmnhanh diện tích rừng tự nhiên, điều đó đã và đang làm giảm trầm trọng nguồncây thuốc trong tự nhiên trong đó bao gồm cả các loài lan làm thuốc, đại diệnđiển hình là dược liệu lan Thạch hộc thuộc chi lan Hoàng thảo

Trên thế giới, chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 loài,

chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia,Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia Ở Việt Nam có 107 loài và

1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển Tuynhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị tuyệt chủnghoặc bị đe dọa Tình trạng khai thác đến cạn kiệt hầu hết các loài phong lan rừng

ở nước ta đang xảy ra mạnh, điển hình như vùng Tây Nguyên và các tỉnh phíaBắc như Hà Giang, Yên Bái, Thái Nguyên gây nguy cơ tuyệt chủng cao một

số loài phong lan quý hiếm

Hoa Phong Lan không chỉ có tác dụng làm đẹp cho không gian sống màcòn là bài thuốc có tác dụng chữa bệnh thần kỳ Trong đó có thể kể đến lan Kimtuyến được dùng trong điều trị các bệnh như trị đau bụng, sốt cao, rắn cắn, bệnhtiểu đường, bệnh viêm thận, huyết áp cao, yếu sinh lý, phòng ngừa u bướu vàchữa các bệnh tim mạch; Lan Phi Điệp, Hoàng thảo đùi gà trị các chứng suynhược cơ thể, thần kinh suy nhược, đau họng và yếu sinh lý ở nam giới LanThạch hộc được dùng chữa ho lao, sốt nóng, khô cổ, ho, đau họng, khát nướcthuộc chứng âm hư, nóng trong, đau lưng, chân tay nhức mỏi, ra mồ hôi trộm,thiểu năng sinh dục ở nam giới, di tinh, đau dạ dày, viêm ruột…

Hiện nay, lan rừng đang bị khai thác cạn kiện do nhu cầu chơi hoa cũngnhư nhu cầu thu hái làm thuốc Các thương lái Trung Quốc đã tràn sang các tỉnhphía bắc Việt Nam và săn lùng, thu mua số lượng lớn các loại lan có tác dụnglàm thuốc Vì vậy việc bảo tồn nguồn dược liệu tự nhiên là rất cần thiết

Thông qua phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với hệ số nhân

giống cao có thể tạo ra rất nhiều cây con in vitro đồng đều mang các đặc điểm

ưu việt mong muốn mà không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết… góp phần thựchiện công tác bảo tồn nguồn gen phong lan tốt hơn Thêm vào đó, phương phápnuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thực vật có thể tạo ra các cây con sạch virus từ cây

mẹ đã bị nhiễm bệnh (phục tráng giống cây trồng) Hơn nữa, nuôi cấy mô, tế bàocòn cung cấp nguyên liệu cho việc tạo ra giống mới bằng công nghệ gen, laisoma, chọn dòng tế bào… mang các đặc điểm tốt như có hoạt tính sinh học cao,

có khả năng kháng bệnh virus, chịu hạn, chịu các yếu tố bất lợi từ môi trường

Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu nhân giống

in vitro lan Hoàng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.)"

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan rừng

Dendrobium nobile Lindl, góp phần cho công tác bảo tồn và cung cấp giống lan

Thạch hộc

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu đối với lan Thạch hộc

2 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình

tái sinh chồi, sự phát triển chồi và ra rễ của lan Thạch hộc in vitro.

3 Nghiên cứu giá thể phù hợp để ra cây đối với lan Thạch hộc

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN

1.1.1 Phân loại và nguồn gốc

Họ lan hay họ Phong lan (Orcchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc

bộ măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm (monocotylendons) HọPhong lan là một trong những họ thực vật lớn nhất và phân bố khắp nơi trên thếgiới Phong lan chủ yếu mọc bám trên các cây cao trong rừng và ở các khu rừngnhiệt đới Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất và được gọi là địa lan và

có một số loài mọc trên đá tức thạch lan Họ lan đã biết khoảng 28.000 loài tựnhiên và 100.000 lai ghép, 850 chi chiếm khoảng 10% của các loài thực vật cóhoa

Danh sách dưới đây liệt kê sự phân bố của họ này:

• Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi

• Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi

• Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi

• Châu Đại Dương: 50 - 70 chi

• Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 - 60 chi

phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các thân cây mọc từgốc ban đầu [6].

1.1.2 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)

a Phân loại chi lan Hoàng thảo

Chi lan Hoàng thảo có tên khoa học là Dendrobium thuộc họ thực vật

Orchidacea, là một chi hoa rất lớn bao gồm trên 1500 loài, sinh sống tự nhiêntrong một khu vực trải rộng từ Triều Tiên, Nhật xuống Mã Lai, Indonesia, đến

Úc và New Zealand Dendrobium là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan đứng sau

lan lọng Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ởcác vùng châu Úc, châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á Lan

Dendrobium là một họ lan nhiều sắc thái bao gồm cả những loài rụng lá và loài

có lá xanh quanh năm Đa số lan tự nhiên thuộc loài cộng sinh, sống bám trên

cây hoặc trên đá, có những giả hành dài từ vài cm (D leucocyanum) đến vài thước (D discolor), thân gầy, uốn cong khi phát triển hoặc mập mạp và đứng thẳng Lan Dendrobium có thể có lá thon nhỏ, mọc chéo theo suốt chiều dài của

thân Lá nơi gốc có thể mọc bao kín chồi.Cần hoa cũng dài hay ngắn khác nhau,

từ vài cm đến 1m Cây mang từ 1-4 hoa (D nobile) nhưng cũng có thể đến cả

100 hoa (D speciosum) Những cây rụng lá, thường mất lá sau 1-2 năm và hoa

mọc ra từ các thân trơ trụi, trong khi đó những cây không rụng lá thường trổ hoa

từ thân sau khoảng 1 năm và tiếp tục ra hoa trong nhiều năm kế tiếp Do sự đa

dạng nên các nhà sưu tập và trồng Dendrobium đã tạm phân loại chúng dựa theo

một số điểm tương đồng, về cách sống, mùa nghỉ và mùa hoa Một số nhóm tiêubiểu như:

(1) Callista : Không rụng lá, đa số có giả hành Có từ 1-6 lá mọc phía

trên đỉnh giả hành Cần hoa xuất hiện vào mùa Xuân, thường cong vòng và mangnhiều hoa màu vàng, trắng, tím nhạt Trong nhóm này có những loài như

Den chrysotoxum (Hoàng lạp), Den densiflorum (Thủy tiên vàng), Den

farmeri (Thùy tiên trắng), Den Lindleyi và Den Thyrsiflorum

(2) Spatulata : thường được gọi là nhóm lan 'Hoàng thảo-sừng sơn

dương', do hoa có đôi cánh dài và mọc xoắn như sừng antelope Không rụng lá,

giả hành to, cao Ra hoa một lượt với nhiền cành hoa, hoa lâu tàn Được xem là

nhóm dễ trồng Trong nhóm có Den antenatum, Den canaliculatum, Den discolor, Den gouldii, Den johannis, Den lineale, Den sratiotes, Den strebloceras và Den Laurinum.

(3) Dendrobium : Rụng lá và giả hành mọc rũ xuống Hoa mọc ra gần

đầu các cành già không còn lá Cây cần có mùa đông lạnh để trổ hoa Nhóm này có

Den Anosmum (Phi điệp), Den chrysanthum, Den.falconeri, Den fimbriatum, Den findlayanum, Den.friedricksianum, Den heterocarpum, Den.loddigesti, Den moniliforme, Dem Nobile (Thạch hộc), Den Parishii (Trầm), Den primulinum, Den transparent và Den wardianum

(4) Formosae: Lá không rụng, hẹp; giả hành mọc thẳng đứng có những

đám lông đen nơi nối kết của lá Hoa trắng, lớn đến 10 cm, có những điểm vàng,

cam, lục hoặc tím Trong nhóm có Den bellatulum (Bạch hỏa hoàng), Den draconis (Nhất điểm hồng), Den formosum (Bạch nhạn), Den infundibulum,

Den lowii, Den.lyonii, Den margaritaceum, Den sanderae

(5) Latura : Không rụng lá, có giả hành dày, to cỡ trung bình Hoa thường màu vàng-xanh đến xanh lục gồm Den atroviolaceum, Den johnsoniae, Den macrophylum, Den spectabile.

(6) Oxyglossum : Nhóm lan rừng, nhỏ, không rụng lá, gặp tại vùng núi cao Hoa lâu tàn , nhiều màu sắc Gồm Den bellwigianum, Den cuthbersonii, Den laviefolium, Den vexillarius

Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan

Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính là (1) Nhóm thân mềm: Có đặc điểm

là các giả hành buông lõng hoặc rủ xuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh,gồm các giống được lấy ở vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao

1000 m; (2) Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn(Malaysia, Indonexia…).[8]

b Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium

- Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời nhưngcần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng Khi thấy cây quặt quẹo, đó

là dấu hiệu thiếu nắng, hãy đưa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn nhất là vào mùa đông, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa.

- Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C tuy nhiên lan có thểchịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C Ngoài ra nếu vào mùa đông lạnhdưới 15,6°C trong vòng 4 - 6 tuần lan sẽ khó ra nụ

- Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 - 70% Nếu độ ẩmquá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi Cây cũng không mọc mạnh nếukhông thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi

- Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinhtrưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn Giá thể của lan gồmnhững thứ dễ kiếm, nhiều khi không cần mất tiền mua vì có sẵn trong tự nhiên.Những chất liệu này không phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọntùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và qui mô sản xuất Những loạigiá thể thường sử dụng như vỏ thông, mùn cưa, vụn dớn, vỏ dừa, rêu

- Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 - 3 lầnmột tuần Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa đi, mỗituần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại Vào mùa đông, đây là thời gianlan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước Nếu độ ẩm quá thấp nên phunsương mỗi tháng 1 - 2 lần [26]

c Sâu bệnh và các vấn đề khác

Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và

môi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiệncho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị:

+ Bệnh hại trên lan

- Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium sp gây nên, cách phòng trị là

tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vàothuốc trị nấm Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm nhưCarboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000

- Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora sp gây nên, bệnh thường phát sinh mạnh trên cây lan Dendrobium sp., gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có

độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb

3/2000; Benlat 1/2000

- Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum sp gây ra Bệnh phát triển

mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốcdiệt nấm 5 - 7 ngày/1 lần

- Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra Vết

bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiềurộng của lá Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnhkhô tóp có màu trắng xám

Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng

và tỷ lệ N:P:K cân đối Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ nhiễm bệnh.Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay dothiếu ánh sáng Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và thối Phun thuốcphòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phunnhiều hơn (1 tuần 2 - 3 lần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phuntheo cách phòng ngừa

+ Sâu hại lan:

- Rệp vảy: Rệp thường bám trên các thân giả hành còn non, phòng trị bằngcách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng

- Bọ trĩ: Gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1 tuần/lần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [26]

1.2 MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC

dùng làm 'cây gốc' để lai tạo thành nhiều chủng loại cho hoa có mùi thơm và đủmàu sắc.

Loài lan Thạch hộc thuộc chi Dendrobium bao gồm một số loài quý hiếm

đang cạn kiệt trong thiên nhiên Tên Thạch hộc, theo Trung Hoa, “thạch” là đá;

“hộc” là đơn vị đo lường, “Thạch hộc” có nghĩa là lan mọc trên những tảng đá to

cỡ một hộc Đây là cây lan được dùng làm thuốc lâu đời nhất tại Trung Quốc,Nhật Bản và cũng là cây được nghiên cứu sâu rộng nhất về dược tính và ứngdụng làm thuốc kể cả các thuốc đặc chế

Thạch hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã

đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy

cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạnkiệt, cấm thu hái và buôn bán Một số loại Thạch hộc thường gặp bao gồm:

- Thạch hộc Rỉ sắt (Thiết bì Thạch hộc - Dendrobium nobile Lindl.) với

đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía nên còn được gọi là thạch hộc tía, là cây thảobản phụ sinh lâu năm, sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm caohoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí hậu ẩm và râm mát, có giá trị độc đáo về dượcphẩm

- Thạch hộc Lưu tô (đuôi ngựa) phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Vân Nam,Quảng Châu ở độ cao 600 - 1700 m, phụ sinh trên cây gỗ rừng kín hoặc vách đá

ẩm ướt, phân bố ở nhiều nước Ấn Độ, Nê Pan, Xích Kim, Bu Tan, Myanma, TháiLan, Việt Nam Loài này rất dễ sinh trưởng, mọc nhanh, năng suất cao, cũng có tácdụng nhất định về công năng dược liệu

- Thạch hộc Kim thoa cũng là cây thảo bản lâu năm, mọc thành bụi, phân

bố chủ yếu ở Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Tây (Trung Quốc), cũng có công dụnglàm thuốc chữa một số bệnh

- Thạch hộc Cầu hoa thân đứng hoặc nghiêng, mọc trên cây gỗ rừng độ cao 750 - 1.800 m, hoa rất đẹp, thường dùng làm cây cảnh

- Thạch hộc Cổ chùy là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, mọc bám vào cây

gỗ rừng thường xanh hoặc vách đá rừng thưa, độ cao 500 - 1600 m, phân bố ở Ấn

Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam

- Thạch hộc Hooc sơn phân bố ở huyện Hooc Sơn, An Huy - Trung Quốc,

có công dụng làm dược liệu để chữa một số bệnh

- Thạch hộc Thủy thảo rất dễ trồng, sinh trưởng nhanh, năng suất cao, cũng có công năng làm dược liệu

Trong đó Thạch hộc rỉ sắt là quý nhất được đánh giá là tuyệt phẩm củaThạch hộc Thạch hộc rỉ sắt là loài cây có nguy cơ tuyệt chủng, được ghi vào sách

đỏ, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt Quý tộc thời TrungHoa cổ đại coi Thạch hộc rỉ sắt là “nàng tiên” hay “cỏ cứu mệnh”, được dùng trongnhiều vị thuốc và chữa được nhiều bệnh theo kinh nghiệm của dân gian [22]

1.2.2 Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme

Phong lan với thân cao khoảng 30 - 40 cm gồm nhiều đốt, mỗi đốt dài chừng2.5 cm, màu vàng tươi Lá mọc cách hình thuôn chừng 3-5 cm x 0.5 - 1.2 cm Hoamọc từng chùm 2-3 chiếc, ở các đốt trên thân cây già đã rụng lá Hoa có nhiều màunhư trắng, hồng, tím, vàng nhạt và xanh Hoa lớn cỡ 3-4 cm, lâu tàn và rất thơm.Cây phân bố rất rộng: Trung Hoa, Taiwan, Bhutan, Ấn, Nhật, Hàn, Myanmar,Nepal, Việt Nam Trong cây có những hợp chất phenanthrene-quinones nhưdenbinobin, có hoạt tính chống sưng và tạo tiến trình apoptosis nơi tế bào Cây còn

có những sesquiterpene glucosides và phenolic glycosides như copacamphane,picrotoxane có những hoạt tính kích ứng miễn nhiễm Dendroside A, C vàvaniloside có hoạt tính kích thích sự sinh sản tế bào B, đồng thời ức chế sự bội sinh

tế bào T Dịch chiết bằng methanol toàn cây cho những alkyl ferulates có hoạt tínhchống oxy-hóa Dịch chiết bằng methanol từ rễ có hoạt tính hạ nhiệt khi thử [8]

1.2.3 Dendrobium officinale

Cây lan hầu như ít được nhắc đến trong các sách vở nghiên cứu, nuôi trồng lan

và chỉ được mô tả trong các bài viết y dược tại Trung Hoa Theo Ủy Ban Chế dược thư

(Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010) thì D officinale được xếp vào loại cây thuốc giúp đề kháng ung thư và tăng tuổi thọ Những nghiên cứu khoa học ghi nhận D.

officinale có polysaccharides trong cây cải thiện, tăng cường sức đề kháng tế bào khi

thử trên chuột, hoạt tính chống oxy-hóa của các polysaccharides tổng cộng và

polysaccharide tinh chế DCPP3c-1 (trích từ môi trường cấy mô D officinale) đã được

chứng minh qua các thử nghiệm 'in vitro' Dịch chiết từ D officinale có hoạt tính làm

hạ đường khi thử trên chuột bị gây tăng đường trong máu bằng adrenaline và bằng streptozotocin do cách tác động kích thích sự bài tiết insulin từ tế bào beta, đồng thời ngăn sự bài tiết glucagon từ tế bào alpha, ngoài ra còn làm giảm sự phân hủy của

glycogen trong cơ thể, làm tăng tổng hợp glycogen trong gan D officinale là một

trong 5 dược thảo có chứa chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt

tính diệt bào khi thử (in vivo và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau [8].

1.2.4 Các Dendrobium khác

Một số Dendrobium khác đã được nghiên cứu về hoạt chất cùng khả năng

trị bệnh như:

- Dendrobium densiflorum: Trong cây có Scopoletin và Scoparone có hoạt

tính ngăn chặn sự kết tụ tiểu cầu

- Dendrobium chrysanthum: Trong đọt có erianin có hoạt tính diệt bào

chống sự bội sinh của tế bào ung thư máu HL-60 do khả năng tạo tiến trình tự hủy(apoptosis) và gây trở ngại cho sư phân lập bcl-2 và gen bax trong HL-60 Erianincòn có tác động làm teo bướu ung thư , gây hoại tử tế bào ung thư và chặn sựchuyển vận dưỡng chất qua vi mạch tế bào ung thư khi thử trên tế bào ung thư ganhepatoma Bel7402 và melanoma A375 [8]

- Dendrobium amoenum var denneanum: Hợp chất loại dihydrostibene,

isoamoenylin có hoạt tính chống oxy-hóa khá mạnh

1.3 GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC

1.3.1 Đặc điểm thực vật học

Thạch hộc rỉ sắt (Dendrobium nobile Lindl.) thuộc nhóm cây đa thân, thân

mọc khỏe chia nhiều đốt ngắn, có nhiều rễ khí sinh Cây biểu sinh trên cây gỗhay vách đá, cao 30-60 cm, đường kính 1,3 cm, thường mọc thành khóm Thânhơi dẹt có rãnh dọc, khi khô có màu vàng rơm Lá mọc so le hai bên thân dài 6-

12 cm, rộng 1-3 cm, không lông, dễ rụng Hoa to xếp thành bó 1-4 cái ở sát nách

lá, hoa dài 4-4,5 cm, rộng 3-3,5 cm, màu hồng tía ờ chót đầu của cánh hoa,chuyển sang trắng vào phía trung tâm; ở họng của cánh môi có một chấm to màuhạt dẻ Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở theo các rãnh dọc

Hình 1.1 Cây và hoa lan Thạch hộc [28]

Lan Thạch hộc phân bố khá rộng từ vùng Himalaya, Assam, Nepal,Bhutan, Myanmar, Trung Hoa, Thái Lan, Lào, Việt Nam Cây được dùng làm'cây gốc' để lai tạo thành nhiều chủng loại cho hoa có mùi thơm và đủ màu sắc

Ở Việt Nam loài này phân bố rộng trên toàn quốc tập trung ở vùng núiphía bắc, ngoài ra loài này còn phân bố ở các tỉnh như Thanh Hóa, Nghệ An, LâmĐồng…

Thạch hộc rỉ sắt thường mọc ở những cây cao, cổ thụ hoặc ở những hốc

đá nhỏ ẩm ướt Cũng như các loài lan khác chúng ưa nơi có độ ẩm trong khôngkhí cao và cường độ ánh sáng vừa phải [23]

1.3.2 Thu hái và chế biến

Trữ lượng Thạch hộc của ta rất phong phú, nhu cầu làm thuốc và xuấtkhẩu cũng rất nhiều nhưng ở thị trường không có bán vì Thạch hộc là một loạidược liệu hiếm gặp, khai thác khó khăn tốn kém, trong thân cây có chất dịch keoquánh, vỏ dày, phơi rất lâu khô, nếu không được nắng mà bị mốc đen mất phẩmchất thì không bán được Do đó ít người thu hái chế biến để bán

Vậy thu hái Thạch hộc phải chọn thời gian nắng lâu để có điều kiện phơikhô Nên tổ chức phơi, sấy tại chỗ nơi có dược liệu, vừa sẵn củi để sấy khô, vừa

đỡ phải chở cây tươi về, tốn nhiều công sức cước phí

Thạch hộc thu hái về, cắt bỏ lá rễ, lấy thân trước trên luộc lên rồi phơinắng cho chóng khô, sau sấy thêm và xông diêm sinh cho vàng và khô đều Ở

những nơi có nhiều dược liệu và có điều kiện tập trung thì nên xây lò sấy nhưmột gian chuông kín, làm giàn nhiều tầng để rải mỏng dược liệu từng lớp, đốtthan củi mà sấy, và trở luôn cho đều, thì không cần phải luộc trước Tiện nhất làlàm lò sấy bằng tôn, để lưu động Và nếu khai thác với quy mô lớn thì tốt nhấtxây lò gạch chịu lửa kiểu như lò bánh mỳ, đốt lò để sấy với hơi nóng hẩm đềuthì phẩm chất đảm bảo và sau không cần xông diêm sinh nữa.

Cao Thạch hộc: Để khỏi phải phơi sấy phức tạp và chuyên chở công kềnhtốn công, ta nên nấu cao thạch hộc tại chỗ: đập dập thân cây, cắt khúc nấu, lọc,

cô thành cao, 100kg dược liệu tươi cho 8 lít cao lỏng như mật ong, dùng rất tốt

và rất tiện trong việc trị bệnh cũng như tẩm bổ [1]

1.3.3 Công dụng và thành phần hóa học

Thạch hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý Thạchhộc tía giàu polysacharide Thạch hộc, alkaloid Thạch hộc, các acid amine vànhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vilượng, trong đó polysacharide Thạch hộc tới 22%, hàm lượng các acid aminenhư glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amine

Ngoài ra, Thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như este và cácchất phenanthryn, bibenzyl, keton, nhầy, hợp chất amidon Trong thân Thạchhộc tía có hàm lượng alkaloid sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chấtamine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine,dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N-methyl-dendrobium, các chất này có vị hơi đắng Thân Thạch hộc có dầu bayhơi, trong đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%

Giá trị: Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách đây hơn 1.000 năm đã xácđịnh ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc,Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô, Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai, Đôngtrùng hạ thảo, trong đó Thạch hộc xếp đầu bảng Giá trị của thạch hộc có 2 loạicông năng chủ yếu:

- Làm thuốc: Thạch hộc tía có giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sứckhỏe, đã trở thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời Nghiên cứu về dược lý hiện đại,Thạch hộc tía có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơthể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng

và làm các bài thuốc Thạch hộc tía có thể dùng đơn độc hoặc phối trộn với cácdược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch hộc được thị trường đón nhận.Trong dược điển có đề cập đến nhiều loài Thạch hộc nhưng tốt nhất vẫn là Thạchhộc tía

- Làm thực phẩm: Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súpvới hồng sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân Ngoài ra có thể nấu cháo Thạchhộc, trà Thạch hộc và nhiều món ăn khác Những năm gần đây công năng làm thựcphẩm chức năng đã được khám phá thêm, là sản phẩm thiên nhiên an toàn và bổdưỡng Thạch hộc tía có vị hơi ngọt hơi đắng vào 3 kinh phế, vị, thận, công năng tư

âm, thanh nhiệt, chỉ khát, hư hao, gầy yếu, miệng khô [22]

1.3.4 Các vị thuốc chứa thạch hộc

Thạch hộc giúp tiêu hóa, bổ âm sinh tân dịch, giúp tiêu hóa khỏi nôn ọe,háo khát, chữa bệnh sốt âm kéo dài, người gầy khô do tinh dịch hao kém, dùng12-20g phối hợp với các vị khác

Chữa bệnh ôn nhiệt, nóng ẩm khô rát, mất nước: dùng Thạch hộc, Mạch môn, Huyền sâm, Sa sâm nam mỗi vị 20g sắc uống Hoặc dùng cao thạch hộc

uống một thìa 3ml, ngày uống 3-4 lần

Chữa bệnh âm hư hỏa bốc, người gày sạm đen, khô khát, thổ huyết, ra máu

mũi, dùng phương “Tư âm giáng hỏa” của Lãn Ông: Thạch hộc, Sinh địa, Thục địa,

Đơn sâm, Sa sâm, Thiên môn, Ngưu tất mỗi vị 16g, Ngũ vị tử 3g sắc uống.

Chữa lao phòng quá độ, hao nhiều tinh khí, hoặc thức đêm mất ngủ, ngồi lâulàm việc trí óc sinh đau lưng mệt mỏi, hỏa bốc nhức đầu ù tai, đỏ mồ hôi trộn, khó

ngủ, chán cơm dùng cao Thạch hộc uống mỗi lần 4ml, ngày uống 3-4 lần.

Chữa di tinh, đái đường: Thạch hộc, Kim anh tử mỗi vị 16g sắc uống với bột Hoài sơn, củ Súng mỗi vị 12g, chia làm 3 lần [1].

Các dụng chính của Thiết bì thạch hộc

- Bổ dưỡng tân dịch

“Đại từ điển dược học Trung Quốc” gọi Thiết bì thạch hộc là “chuyên bổ khídịch phế vị, khí dịch xung vượng, thận thủy tự sinh”, tốt cho bổ âm sinh dịch, trịchứng thiếu âm dịch, giúp cải thiện rõ rệt triệu chứng tinh thần ủ rũ, sắc diện nhợtnhạt, mắt khô thần sắc trì trệ, đau lưng mỏi gối, chóng mặt lao lực, táo bón [23]

- Tăng cường thể chất

Thiết bì thạch hộc có công dụng tư dương dưỡng huyết, “Dược tính luận”của đời Đường có ghi chép thiết bì thạch hộc có thể bổ thận tích tinh, dưỡng vị âm,ích khí lực, trong thạch hộc có chứa nhiều polisaccharide, nghiệm chứng chứngminh polisaccharide trong thạch hộc có tác dụng tăng cường miễn dịch, có thể tăng

cường khả năng nuốt tế bào hồng cầu của đại thực bào (macrophage) [23].

-Bổ ích tỳ vị

Thiết bì thạch hộc là vị thuốc ích vị sinh dịch Trong “Thần nông bổnthảo kinh”, “Bổn thảo tái tân” đều có ghi chép, gọi là “thuốc trường vị”, là thuốcthường dùng để trị đau dạ dày, đau thượng vị Thực nghiệm y học hiện đại cho

thấy, thiết bì thạch hộc có tác dụng ức chế hiệu quả vi khuẩn Hecolibacter pylori gây bệnh thường gặp trong bệnh tỳ vị, giúp ích cho việc trị liệu các chứng

bệnh dương tính với Hecolibacter pylori như viêm dạ dày teo, viêm dạ dày bềmặt nông, loét tá tràng,… Bên cạnh đó, sử dụng thiết bì thạch hộc còn thúc đẩytiết dịch vị, tăng cường chức năng dạ dày [23]

- Bảo vệ gan, lợi mật

Thiết bì thạch hộc có tác dụng lợi mật khá tốt Nhiều thế hệ thầy thuốcđều cho rằng “Thiết bì thạch hộc” có tác dụng bổ gan âm, là vị thuốc quan trọng

để trị liệu các loại bệnh gan mật, có thể dùng để chữa viêm gan, viêm túi mật ,sỏi mật [23]

Khi chúng ta bước vào tuổi trung niên, âm dịch bắt đầu suy yếu, chứcnăng gân cốt dần giảm sút, thiết bì thạch hộc có thể bồi bổ âm dịch, âm dịch cóthể bôi trơn khớp xương, nhờ đó đạt hiệu quả mạnh gân cường cốt, khớp xương

linh hoạt, tăng khả năng chống phong thấp Nghiên cứu dược lý hiện đại còn chothấy, thiết bì thạch hộc còn tăng khả năng loại bỏ stress, có tác dụng chống mệtmỏi, bảo vệ chống giảm oxy mô; thúc đẩy tuần hoàn, mở rộng huyết quản, qua

đó thúc đẩy tuần hoàn huyết dịch Kết quả thực nghiệm cho thấy, thiết bì thạchhộc cải thiện rõ rệt huyết tắc, giảm cholesteron máu và lipit, chữa bệnh tim mạchhuyết quản [23]

Đông Y cho rằng, bệnh tiểu đường phát sinh chủ yếu là do cơ bệnh thận

âm hư, tỳ vị táo nhiệt, với đặc điểm bệnh lý là khí âm đều hư Thiết bì thạch hộc

có thể dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận táo, từ cổ đến nay chính là thuốc chuyêndùng để trị liệu bệnh tiểu đường Nghiên cứu lâm sàng cho thấy, thiết bì thạchhộc không chỉ tăng cường hoạt tính insulin, đồng thời hạ rõ rệt mức đường huyết,khôi phục đường huyết bình thường [23]

Đông Y cho rằng “gan thông với mắt”, sinh lý bệnh lý của mắt có quan

hệ mật thiết với sự thịnh vượng âm tinh của gan, Thạch hộc có công dụng bổ âmdưỡng mắt, được nhiều thế hệ thầy thuốc xem là thuốc quý để bồi bổ đôi mắt.Nghiên cứu dược lý học hiện đại chứng minh, thiết bì Thạch hộc có tác dụnglàm chậm đục thủy tinh thể ở người già, có thể duy trì 36% độ trong của thủytinh thể, có tác dụng ức chế và sửa chữa với những biến đổi bất thường của hoạttính enzyme do galatoza tạo ra, bên cạnh đó còn có hiệu quả rõ rệt với việc bảo

vệ thị lực của thanh thiếu niên nhi đồng [23]

- Đẹp da

Con người sau khi bước vào tuổi trung niên, do âm dịch trong cơ thểngày càng giảm sút, từ đó đẩy nhanh tốc độ lão hóa da, khiến da trở nên khô sạmhoặc nhăn nheo Thiết bì Thạch hộc có chứa đa lượng chất bạch huyết, có tácdụng dưỡng ẩm, cung cấp dinh dưỡng cho làn da [23]

-Kéo dài tuổi thọ

“Thần nông bổn thảo kinh” liệt thiết bì thạch hộc là thần dược có tácdụng “khinh thân diên niên” Nghiên cứu dược lý học hiện đại chứng minh, thiết

bì thạch hộc có chứa nhiều loại nguyên tố vi lượng, có quan hệ mật thiết với sứckhỏe và tuổi thọ con người, có tác dụng chống lão hóa với cơ thể người rộng rãi,toàn diện hơn các loại dược liệu thông thường [23]

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM

1.4.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

Bijaya Pant and Deepa Thapa (5/2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống

Dendrobium primulinum Lindl có nguy cơ tuyệt chủng đã nhận thấy: Thông qua

việc nuôi cấy các đỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5mm trên môi trường MS

cơ bản và môi trường MS bổ sung kết hợp các chất kích thích tăng trưởng NAA,BAP ở các nồng độ khác nhau, các protocorm hình thành đã tạo chồi và rễ Sau 5tuần nuôi cấy số lượng chồi tăng nhanh nhất trên môi trường MS + 1,5mg/l BAP+ 0,5mg/l NAA Trong thí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy thấytrên môi trường MS + IAA 0,5mg/l, cây lan ra rễ tốt nhất Khi ra cây trên giá thểđất sạch và rêu (dớn) tỷ lệ 2:1 thì gần 70% cây con sống sót [19]

Tháng 4 năm 2011, Sana A & CS đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh

chồi giống lan Dendrobium nobile var Emma từ chồi nách, sử dụng môi trường

có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 mg/l vàkinetin Qua nghiên cứu họ nhận thấy, ở môi trường có chứa 1,5 mg/l BAP kếthợp với kinetin cho kết quả nhân chồi cao nhất Tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất trênmôi trường chứa 2 mg/l IBA với tỷ lệ phần trăm tạo rễ (97,5%), số lượng rễ(4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA Nồng độ cao hơncủa IBA và NAA (3,0mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ kém [20]

Tháng 8 năm 2010, Maridass M & CS đã tiến hành nhân giống in vitro phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ Nghiên cứu

này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010) Vật liệu thân rễđược rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử trùngvới hypo natri 3% (bổ sung 2 - 3 giọt Tween 80 EAC) trong 20 phút và sau đórửa sạch cho 4 - 5 lần bằng nước cất vô trùng Thân rễ được trẻ ra cắt miếng nhỏ(5mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của MS bổ sung các chấtkích thích tăng trưởng như NAA, BAP và kinetin Các mẫu hình thànhprotocorm tốt trên môi trường MS + 1,2μMkinetin + 2,0μM NAA Sau đóMkinetin + 2,0μMkinetin + 2,0μM NAA Sau đóM NAA Sau đóprotocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + 0,5μMkinetin + 2,0μM NAA Sau đóM BAP [21]

1.4.2 Một số nghiên cứu tại Việt Nam

Nguyễn Thanh Tùng và CS (2010) đã áp dụng phương pháp nuôi cấy lát

mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum) Trong nghiên cứu của nhóm tác giả này, vật liệu khởi đầu là chồi in vitro được cắt lát mỏng theo chiều ngang Kết quả cho thấy mẫu cảm ứng tốt

trên môi trường ½ MS + 0,5 mg/l BA và tái sinh tốt trên môi trường MS + 3mg/lkinetin + 0,3 mg/lNAA Từ protocorm tỷ lệ chồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [10]

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra môi trường thích hợp cho sự

nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS + 20 g/l đường saccharose+ 8 g/lagar + 150 ml/l nước dừa + 2,0 mg/l BAP Môi trường nhân nhanh protocormtốt nhất là MS + 20 g/l đường saccharose+ 8 g/l agar + 150 ml/l nước dừa + 2,0mg/l BAP Môi trường MS + 20 g/l đường saccharose+ 8 g/l agar + 150 ml/lnước dừa + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ

protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS + 20 g/l đường

saccharose+ 8 g/l agar + 150 ml/l nước dừa + 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho

sự ra rễ của chồi in vitro [11].

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo Long nhãn (Dendrobium fibriatum), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định môi trường thích

hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS + 10 g/l đường saccharose

+ 6 g/l agar + 100 ml/l nước dừa Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất làKnud + 10 g/l đường saccharose+ 6 g/l agar + 100 ml/l nước dừa + 60 g/l khoai tây.Môi trường MS + 20 g/l đường saccharose+ 6 g/l agar + 100 ml/l nước dừa + 60 g/l

chuối chín là thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là

RE + 10 g/l đường saccharose+ 1 g/l than hoạt tính + 6 g/l agar [12]

Bùi Thị Tường Thu và CS (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của chấtđiều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ra một số kết

quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồi non, được cắt

thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + 20 g/l đường saccharose+ 100ml/l nước dừa + 1 g/l peptone + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 1 g/l AC Sau thờigian nuôi cấy 30 ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt, tỷ lệ tạo soma là 100%trên các mẫu nuôi cấy Tế bào soma màu trắng sáng, được tiến hành nhân sinhkhối trên 6 môi trường thực nghiệm và kết quả thu được tế bào soma tăng sinhmạnh mẽ trên môi trường VW + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l nướcdừa [13]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Chúng tôi sử dụng loài phong lan Thạch hộc tía (Dendrobium nobile

Lindl.) được người dân khai thác từ rừng thuộc địa bàn tỉnh Hòa Bình để làm vậtliệu nghiên cứu Thu mẫu (thân và quả) vào tháng 10, 11 Quả còn xanh hoặc già

nếu chưa mở đều sử dụng để cho hạt nuôi cấy in vitro được Chọn những quả và

các cây to khỏe và lành lặn

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất

• Dụng cụ dùng trong nuôi cấy chủ yếu gồm:

- Bình tam giác 250ml hoặc ống nghiệm

- Cân phân tích, máy đo pH và quỳ tím

- Lò vi sóng

- Nồi hấp vô trùng

- Box cấy vô trùng

- Dao, kéo, kẹp, panh, khay cấy, đũa thủy tinh, bông không thấm nước, giấy lọc, đèn cồn và bật lửa…

- Phòng nuôi cấy, phòng chuẩn bị môi trường

• Dụng cụ dùng cho ra cây

- Cốc nhựa, kéo, túi bóng nilon và ghim

- Giá thể: vụn dớn, mùn cưa

• Hóa chất

- Môi trường nuôi cấy: các thành phần vô cơ và hữu cơ theo môi trường

MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung một số chất kích thích sinh trưởngnhư kinetin, BAP, IBA, NAA… và các thành phần than hoạt tính, agar, nước dừa,khoai tây, chuối xanh

- Hóa chất khử trùng là cồn (C2H5OH) 70%, hydrogen peroxide (H2O2), thủy ngân clorua (HgCl2)

- Dung dịch tưới: ½ MS, nước lã