Phân lập và tuyển chọn lactobacillus sp từ thực vật ủ chua có tiềm năng sản xuất probiotic​

Những chủng vi sinh vật probiotic thường được nghiên cứu và ứng dụng chủ yếu là vi khuẩn lactic LAB, nhờ chúng có các đặc tính ưu việt phù hợp cho việc sửdụng tạo chế phẩm probiotic cho

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN LACTOBACILLUS sp.

TỪ THỰC VẬT Ủ CHUA CÓ TIỀM NĂNG SẢN

XUẤT PROBIOTIC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS Hoàng Quốc Khánh Sinh viên thực hiện

MSSV: 1311101070

: Trần Quang Huy Lớp: 13DSH05

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu, kếtquả nêu trong đồ án này đều trung thực và bắt nguồn từ thực tiễn nghiên cứu Cáctài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác thực

Người thực hiệnTrần Quang Huy

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS Hoàng Quốc Khánh,người đã tận tình hướng dẫn,chia sẻ những khó khăn và chỉnh sửa đồ án cho emtrong thời gian em thực hiện đồ án tại viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh.Xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hoài Hương, người đã động viên và giúp em

có thêm động lực để hoàn thành đồ án này

Xin cảm ơn thầy Ngô Đức Duy, đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quátrình định danh bằng sinh học phân tử

Xin cảm ơn các anh, chị và các đồng nghiệp tại viện sinh học nhiệt đới đã giúp đỡtôi trong quá trình thực hiện đồ án

Xin cảm ơn viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh, đã tạo mọi điều kiện thuậnlợi cho em thực hiện các thí nghiệm để hoàn thành đồ án này

Xin cảm ơn trường ĐH Công nghệ TP Hồ Chí Minh nói chung và các thầy côtrong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm và Môi Trường nói riêng đã tận tìnhdạy dỗ, cung cấp các kiến thức vững vàng cho em trong bốn năm học tập tại trường.Cuối cùng xin cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con và cho con điều kiện để học tập để trởthành người như hôm nay

Xin chân thành cảm ơn!

Người thực hiện Trần Quang Huy

M C L C Ụ Ụ Phiếu giao đề tài ĐATN.

Lời cam đoan.

Lời cảm ơn.

Mục lục.

Danh mục các từ viết tắt.

Danh mục các bảng.

Danh mục biểu đồ, đồ thị, sơ đồ, hình ảnh.

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1Tổng quan về rau quả lên men

1.2Tổng quan về probiotic

1.3Lịch sử nghiên cứu về probiotic

1.4Các vi sinh vật probiotic thường gặp

1.4.1Chi Lactibacillus .

1.4.2Chi Bifidobacterium .

1.4.3Chi Sacharomyces .

1.4.4Chi Bacillus .

1.5 Hướng dẫn lựa chọn các chủng probiotic

1.5.1Chi, loài và chủng probiotic

1.5.2Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic

1.5.3 Nguồn phân lập probiotic 15

1.5.4 Probiotic an toàn 15

1.6 Vi khuẩn lactic 17

1.6.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 17

1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại 17

1.6.3 Chi Lactobacillus 18

1.6.4 Quá trình lên men lactic 22

CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Hóa chất 24

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 24

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn 27

2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc 27

2.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh acid lactic 27

2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram 27

2.2.5 Phương pháp khảo sát khả năng di động 28

2.2.6 Phương pháp xác định kiểu hô hấp 28

2.2.7 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính catalase 29

2.2.8 Phương pháp xác định hoạt tính protease 29

2.2.9 Phương pháp xác định hoạt tính amylase

2.2.10 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn

2.2.11 Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Phân lập LAB từ nguồn thực vật ủ chua

3.2 Đặc điểm sinh học của 2 chủng LAB được tuyển chọn

3.2.1 Đặc điểm hình thái của 2 chủng CP1 và MC3

3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 2 chủng CP1 và MC3

3.3 Phổ kháng khuẩn của hai chủng lactic nghiên cứu

3.4 Định danh chủng Lactobacillus CP1và Lactobacillus MC3 phân tử

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

4.2 Kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic 12

Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm 19

Bảng 3.1 Kết quả hình thái khuẩn lạc của 11 chủng đƣợc phân lập 32

Bảng 3.2 Kết quả xác định hình thái tế bào 34

Bảng 3.3 Tổng hợp các đặc điểm sinh lý sinh hóa của hai chủng nghiên cứu 38-39 Bảng 3.4 Kết quả thử phổ kháng khuẩn của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 41

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống

Hình 1.2 Hướng dẫn lựa chọn chủng probiotic của FAO & WHO

Hình 1.3 Quá trình lên men lactic

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số mẫu sau khi làm thuần

Hình 3.2 Định tính aicid lactic bằng thuốc thử Uphemen

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng CP1 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng MC3 nhuộm Gram trên kính hiển vi x100

Hình 3.5 Cây phát sinh loài của hai chủng Lactobacillus CP1 và Lactobacillus MC3 và các loài có liên quan

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, khi chất lượng cuộc sốngkhông ngừng được nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe con người ngày càng đượcchú trọng Do vậy, việc tạo ra các chế phẩm sinh học nhằm cải thiện và tăng cườngsức khỏe con người được tạo ra ngày càng nhiều Một trong những chế phẩm sinhhọc đó chính là probiotic, chúng được tạo ra từ việc ứng dụng vi sinh vật có lợi bổsung vào hệ tiêu hóa của con người Việc sử dụng vi sinh vật probiotic thực tế đãmang lại nhiều ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe con người, thông qua các đặctính probiotic vốn có của chúng Điển hình là điều trị các chứng bệnh rối loạnđường tiêu hóa, khắc phục một số hạn chế do việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúpđồng hóa lactose trong sữa uống đối với các bệnh nhân không có khả năng dung nạplactose trong sữa Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tínhbiến dưỡng như đồng hóa cholesterol, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme

có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn, hấp thu các chất dinh dưỡng cầnthiết, khử các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại, kích thích điềuhòa hệ miễn dịch, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,

Những chủng vi sinh vật probiotic thường được nghiên cứu và ứng dụng chủ yếu

là vi khuẩn lactic (LAB), nhờ chúng có các đặc tính ưu việt phù hợp cho việc sửdụng tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi Những đặc tính đó là:khả năng sống sót và phát triển tốt trong điều kiện bất lợi ở đường tiêu hóa củangười như acid mật, pH thấp, kháng sinh, Đồng thời, chúng còn có khả năng sảnsinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn như acid lactic, bacteriocin, H2O2, diacetyl,… tạomôi trường bất lợi, từ đó ức chế vi sinh vật gây bệnh và thiết lập sự cân bằng hệ visinh vật đường ruột Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều enzymethúc đẩy quá trình tiêu hóa hấp thu các chất của cơ thể vật chủ

Xuất phát từ lí do trên nên người thực hiện đã chọn đề tài “ Phân lập và tuyển

chọn Lactobacillus sp từ nguồn thực vật ủ chua, tiềm năng sản xuất probiotic”.

2. Mục tiêu của đề tài: Phân lập và khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi

khuẩn phân lập từ các nguồn thực vật ủ chua

3. Nhiệm vụ của đề tài:

Phân lập được ít nhất 01 chủng Lactobacillus

Tìm hiểu các đặc tính sinh lý, sinh hoá của chủng phân lập được

Khảo sát phổ kháng khuẩn của chủng Lactobacillus phân lập được với các VSV

gây bệnh đường ruột ở người

Phân loại chủng nghiên cứu đến loài bằng sinh học phân tử

4.Đối tượng nghiên cứu: các chủng Lactobacillus.sp được phân lập từ rau , củ lên

men trong khu vực thành phố Hồ Chí Minh

1 CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Tổng quan về rau quả lên men

Lên men thực phẩm là một trong những công nghệ bảo quản thực phẩm được conngười phát minh ra từ rất sớm, những người ở vùng ven biển của Châu Á được cho

là đã lên men rau quả trước khi phát triển nền nông nghiệp cây trồng Lên men sữa

ở Trung Đông xuất hiện sau khi thuần hoa vật nuôi Bia ở Ai Cập và rượu gạo ởĐông Bắc Á được cho là xuất hiện vào 4000 năm trước công nguyên Người ta đãcho rằng dưa chuột là nguyên liệu đầu tiên được lên men, sau đó là các sản phẩmkhác như kim chi, bắp cải…và cho đến ngày nay đã và đang có rất nhiều các sảnphẩm lên men với sự đa dạng về chủng loại

Thực phẩm lên men được phân loại dựa vào sản phẩm của quá trình lên menchẳng hạn như cồn ( rượu, bia), acid hữu cơ bao gồm acid lactic và acid axetic(trong rau củ lên men), cacbondioxide (CO2) ( trong bánh mì), các acid amin và cácpeptide từ protein

Trong các sản phẩm lên men thì rau, củ, quả lên men như kim chi, cà pháo, bắpcải là những sản phẩm có từ lâu đời và mang đặc trưng bản sắc dân tộc của từngvùng miền và từng quốc gia Quá trình lên men có thể giúp bảo quản rau quả lâuhơn 1 năm mà không cần sử dụng bất kì một phương pháp bảo quản nào khác.Trong rau, củ, quả hoặc nước ép rau củ có chưa rất nhiều dinh dưỡng giúp cho các

vi sinh vật bao gồm cả các loại gây hư hỏng như Pseudomonas, Erwinia, Enterobacter, nấm men và nấm mốc có thể phát triển được Các vi sinh vật gây hư

hỏng khi phát triển tới số lượng từ 104-106 cfu/g Tuy nhiên có thể ức chế hoặc tiêudiệt các vi sinh vật gây hư hỏng này bằng phương pháp lên men Rau quả sau khilên men sẽ có vị chua là do các acid hữu cơ được tiết ra bởi các vi khuẩn lên menđường trong rau quả, đặc biệt là các vi khuẩn thuộc nhóm lactic

Vi khuẩn lactic tồn tại trong rau quả hoặc nước ép trái cây với số lượng rất thấp

từ 102-103 cfu/g Trong quá trình lên men, các acid hữu cơ sẽ tạo vị chua và làmgiảm pH của môi trường, từ đó ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây hư hỏng,riêng vi khuẩn lactic không chịu ảnh hưởng của việc giảm pH này là do nhóm vikhuẩn này có khả năng sống sót trong điều kiện acid cao hơn so với các loại vi sinhvật khác, nên sự phát triển của chúng sẽ chiếm ưu thế hơn

Ngoài hương vị đặc trưng, các sản phẩm rau quả lên men còn được chứng minh

là có tác động tốt đến sức khỏe như giúp tiêu hóa tốt và phòng bệnh đường ruột.Đặc biệt vi khuẩn lactic còn tạo nên hệ vi khuẩn có ích cho đường tiêu hóa Rauquả muối chua tuy không phải là thuốc thuần túy nhưng làm thức ăn rất tốt chongười bị bênh béo phì, tiểu đường vì nó ít glucid và ít sinh năng lượng

Chính vì những tác động có lợi ,gần gũi với con người và có hệ vi sinh vật đadạng nên rau, củ, quả lên men là một trong những nguồn nguyên liệu được các nhàkhoa học quan tâm nhằm phân lập các dòng vi sinh vật có lợi đối với sức khỏe củacon người và vật nuôi, từ đó sản xuất các chế phẩm probiotic

Hình 1.1 Kim Chi và một số loại rau củ lên men truyền thống

1.2 Tổng quan về probiotic

Ruột người được định cư bởi một loạt các loài vi khuẩn, mang tầm quan trọngtrong chức năng trao đổi chất cũng như chức năng miễn dịch, tất cả đều dẫn đếnnhững ảnh hưởng rõ rệt đến tình trạng dinh dưỡng và sức khoẻ của vật chủ [19]

Các probiotics được định nghĩa là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một sốlượng nhất định có lợi cho sức khoẻ ngoài dinh dưỡng cơ bản”[6],[ 32].

Ngoài ra, probiotic còn được biết đến là vi sinh vật sống tự nhiên có ít hoặckhông gây bệnh, nhưng có chức năng quan trọng đối với sức khỏe, tình trạng chungcủa vật chủ và được chú trọng để sử dụng làm thuốc [10],[ 25] Probiotics ban đầuđược sử dụng để tác động đến sức khoẻ con người thông qua sự thay đổi hệ vi sinhđường ruột Hiện nay, các probiotic và những ảnh hưởng của chúng đối với sứckhoẻ con người đã được chứng minh bằng cách kết hợp chúng vào các loại thựcphẩm truyền thống như chế phẩm nuôi vi sinh đơn hoặc hỗn hợp, tức là sản xuấtcác thực phẩm chức năng / dinh dưỡng hoặc chế phẩm dược để có được nhiều lợiích về sức khoẻ [25] Tác động của probiotic đến sức khoẻ con người được khẳngđịnh và xác định rõ trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh khác nhau nhưnhiễm trùng đường tiêu hóa cấp tính hoặc mãn tính (tiêu chảy, không tiêu hóalactose, bệnh viêm ruột [7], các triệu chứng dị ứng [16],[ 30], ung thư [18] và AIDS(hội chứng suy giảm miễn dịch)[8], hô hấp và nhiễm trùng đường tiết niệu Chế độ

ăn uống phù hợp, bao gồm các loại thực phẩm dinh dưỡng / thực phẩm chức năng /thực phẩm bổ sung với probiotic, prebiotic và synbioitcs, với những lợi ích về dinhdưỡng và điều trị là kết quả của một hệ thống tiêu hóa (Gastro Integinal) hoạt độngtốt, tác động đến sinh lý của con người, từ đó tác động đến sức khỏe

Trong những thập kỷ qua, ngành công nghiệp thực phẩm đã được cách mạng hoáhướng tới sản xuất thực phẩm chức năng do nhận thức ngày càng cao của ngườitiêu dùng về vai trò tích cực của thực phẩm và sức khoẻ [26] Một số lợi ích cóđược là do sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn trong quá trình sản xuất thức ăn

và một số do sự phát triển và hoạt động của một số loài vi khuẩn lactic trong đườngruột sau khi ăn các thực phẩm có chứa chúng (Ali, 2010).(Trích tài liệu [32])

Để hệ thống miễn dịch và đường tiêu hóa của con người hoạt động tốt, đòi hỏiphải có sự hiện diện đa dạng và số lượng lớn của các vi sinh vật Hệ vi sinh cộng

sinh cư trú và duy trì sự cân bằng trong hệ thống đường tiêu hóa con người, bất kì

sự thay đổi nào về số lượng hoặc thành phần của hệ vi sinh điều ảnh hưởng trựctiếp đến sức khỏe của vật chủ Ví dụ khi sử dụng kháng sinh làm giảm số lượng củamột số vi khuẩn, các mầm bệnh có cơ hội để phát triển và gây nhiễm trùng Phươngpháp thay thế hệ vi sinh đường ruột bằng các vi khuẩn có lợi đã khai sinh ra lĩnhvực khoa học chuyên nghiên cứu về probiotic Probiotics được định nghĩa là 'Các visinh vật sống mà khi được bổ sung với số lượng thích hợp sẽ đem lại lợi ích chosức khoẻ của vật chủ” [13]

Probiotic đang dần dần đóng vai trò quan trọng trong chức năng miễn dịch, hôhấp và giảm các bệnh truyền nhiễm ở con người Vi khuẩn lactic acid (LAB) là các

vi sinh vật thường được sử dụng như probiotic và có những lợi ích nhất định trongứng dụng công nghiệp và y tế [32] Thuật ngữ "probiotic" có nguồn gốc từ từ HyLạp "probios" có nghĩa là "cho sự sống" (trái ngược với "antibiotic", có nghĩa là

"chống lại sự sống") [22] Trong nhiều thế kỷ, LAB đã được sử dụng để bảo quảnthực phẩm cho người tiêu dùng LAB là một nhóm lớn các vi sinh vật thuộc Gram

âm, hiếu khí hoặc vi hiếu khí, không sinh bào tử, lên men và sinh acid, thường cótrong ruột của người và các động vật khác, rau sống, thịt và các sản phẩm từ thịt,

ngũ cốc [9] LAB và Bifidobacteria được sử dụng như là probiotic Nhưng một số loại nấm men và bacilli cũng được sử dụng trong sản xuất probiotic Ngày nay có

rất nhiều sản phẩm probiotic đang có mặt trên thị trường như kem probiotic,probiotic uống,v.v

Để được sử dụng làm probiotic, các vi sinh vật phải tồn tại được trong đườngtiêu hóa, bằng cách kháng acid và mật, ngoài ra chúng còn phải có khả năng nhânnhanh số lượng Việc sử dụng các sản phẩm probiotic giúp duy trì sự cân bằng hệ visinh trong đường ruột từ đó giúp ngăn ngừa các bệnh như đái tháo đường type 2,rối loạn chuyển hóa, gan nhiễm mỡ và bệnh mạch vành [32]

Lợi ích của các thực phẩm lên men có được là do sự phát triển của các vi khuẩntrong suốt quá trình sản xuất Vai trò của vi khuẩn probiotic trong việc lên men sữa

là để hổ trợ: bảo quản sữa bằng cách tạo ra acid lactic và các hợp chất kháng khuẩn,tạo hương vị (ví dụ acetaldehyde trong sữa chua và phô mai) và cung cấp một sốchất hữu cơ khác (như polysaccharide ngoại bào) mà người tiêu dùng mong muốn,cải thiện giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, ví dụ như giải phóng các acid amin tự

do hoặc tổng hợp các vitamin và cung cấp các chất đặc biệt có khả năng điều trịhoặc phòng ngừa ung thư, cũng như kiểm soát nồng độ cholesterol [27] Các lợi íchcủa việc tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men có được chủ yếu là do sự thay đổi theohướng có lợi của hệ sinh thái trong đường tiêu hóa

Trên khắp thế giới, có khoảng 20 dòng probiotic, trong đó chủ yếu là các

Lactobacilli như: Lactobacillus acidophilus, L casei, L reuterii và các loài khác, Bifidobacteria, các bào tử vi khuẩn sinh acid lactic như Lactospore, nấm men như Saccharomyces boulardii, được sử dụng trong thực phẩm bổ sung, thực phẩm chức

và Enterococcus faecium là những loài chính được sử dụng làm probiotic.

1.3 Lịch sử nghiên cứu về probiotic

Thuật ngữ probiotic có nghĩa là “ cho sự sống” hiện đang được sử dụng để chỉcác vi khuẩn có lợi đến sức khỏe của con người và động vật Các sản phẩm sữa lên

men được con người sử dụng từ thời Vedic ( Ấn Độ cổ), những khái niệm khoa học

về probiotic được phát triển vào khoảng năm 1900, khi Henry Tissier, một bác sĩnhi khoa người Pháp đã nhận xét sự hiện diện với số lượng rất ít các vi khuẩn cóhình thái chữ Y trong phân của trẻ em bị tiêu chảy Những vi khuẩn này ngược lại

có rất nhiều ở trẻ em khỏe mạnh [32] Ông ta đặt tên cho vi khuẩn này là Bacillus bifidus communis và sau này được đổi tên thành chi Bifidobacterium. Khái niệm

probiotic được báo cáo lần đầu tiên bởi nhà khoa học Nga và đoạt giải Nobel, ElieMetchnikoff vào năm 1907 , người đã cho rằng tuổi thọ và sức khỏe của ngườiBungari là kết quả của việc tiêu thụ sữa lên men, và đề xuất rằng việc sử dụng sữalên men sẽ cung cấp cho ruột các vi khuẩn lactic, làm giảm độ pH của đường ruột

sẽ ức chế các vi khuẩn gây hại [29] Ông cũng chỉ ra rằng tiêu thụ Lactobacillli giúp

kiểm soát nội độc tố sinh ra bởi các loại thành phần khác trong hệ sinh thái ruột [24]Thuật ngữ probiotic ban đầu được đề xuất như một từ trái ngược với kháng sinh,

và được dùng để mô tả sự hổ trợ tăng trưởng cho các vi sinh vật bởi Lilley andStillwell vào năm 1965 [21],[32] Fuller sau đó miêu tả probiotic là “các vi sinh vậtsống được bổ sung vào thức ăn có tác động có lợi đến động vật chủ bằng cách cảithiện sự cân bằng vi sinh đường ruột” [14] Định nghĩa về probiotic đã được làm rõhơn nữa vào năm 1998 là "các vi sinh vật sống, khi tiêu hóa với một số lượng nhấtđịnh, có ảnh hưởng đến sức khoẻ ngoài dinh dưỡng cơ bản”[15] Tiến sĩ Minoru

Shirota năm 1930 đã phân lập Lactobacillus casei Shirota (LcS) với các tính chất

probiotic và đưa ra thị trường thức uống sữa lên men có chứa probiotic ( Yakult)này trong hơn bảy thập kỷ để cải thiện sức khoẻ đường ruột [20] Các công trìnhnghiên cứu của Tissier và Metchnikoff là tiền đề trong việc sử dụng vi khuẩnprobiotic Từ đó có rất nhiều các nghiên cứu về vai trò probiotic của LAB và ứngdụng các tế bào sống

Những quan sát của Tissier và Metchnikoff thu hút được nhiều sự chú ý và đượcthương mại hóa Tuy nhiên, không phải kết quả lúc nào cũng được như mong đợi,

và hầu hết các quan sát này điều trở thành giai thoại Do đó, khái niệm probioticđược coi là không có cơ sở khoa học và ít được quan tâm trong nhiều thập kỉ vớimột số nghiên cứu về chất thay thế cho chất tăng trưởng sử dụng cho động vật Tuynhiên trong 20 năm qua, nghiên cứu về probiotic đã có những bước tiến đáng kể vàchú trọng vào việc lựa chọn,mô tả cụ thể các môi trường nuôi cấy probiotic, chứngminh các lợi ích của chúng đối với sức khỏe, và đảm bảo sự sống sót của các loại vikhuẩn này khi ở trong dạ dày-ruột [32].

Các chủng trong chi Lactobacillus và Bifidobacterium được sử dụng chủ yếu,

nhưng không phải là duy nhất, số lượng các probiotic và các sản phẩm chứaprobiotic luôn không ngừng gia tăng

1.4 Các vi sinh vật probiotic thường gặp

Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như VK, xạkhuẩn, nấm men, nấm mốc Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của LAB phù hợpvới việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần củahầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB

Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp

1.4.1 Chi Lactibacillus

Chi Lactobacillus bao gồm các chủng thuộc Gram âm, hiếu khí bắt buộc hoặc vi hiếu

khí, tế bào hình que Chúng là một phần chủ yếu trong nhóm vi khuẩn lactic (LAB)

(bao gồm Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus,

Streptococcus và Leuconostoc) có thể chuyển đổi đường hexose thành acid lactic rồi

tiết ra môi trường để ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại Trong cơ thể người,

Lactobacilli thường được tìm thấy trong cơ quan sinh dục, đường tiêu hóa, và một số

nơi khác cùng với Bifidobacterium Trình tự gen hoàn chỉnh của một số chủng

Lactobacillus thường gặp đã được công bố như: Lactobacillus plantarum, L johnsonii, L acidophilus, L sakei, L bulgaricus, L salivarius.

Một vài chủng Lactobacilli được sử dụng để sản xuất yogurt, phô mai, nước

tương, kim chi, rượu và một số thực phẩm lên men khác Trong tất cả các trườnghợp trên, đường sẽ được chuyển hóa thành acid lactic, tạo thành môi trường ức chếcác vi sinh vật gây hư hỏng và cho phép bảo quản thực phẩm

Các loài Lactobacilli thường được chọn là probiotic vì chúng biểu hiện nhiều đặc

tính quan trọng như: khả năng chịu acid và mật cao, khả năng bám dính vào bề mặtruột, chống lại pH thấp, dịch dạ dày, ức chế các vi khuẩn gây bệnh, kháng khángsinh, sản xuất exopolysaccharides và loại bỏ cholesterol [28]

1.4.2 Chi Bifidobacterium

Chi Bifidobacterium thuộc Gram âm, không di động, hô hấp hiếu khí.Chúng sống

cộng sinh trong đường tiêu hóa và âm đạo của động vật có vú bao gồm cả con

người.Các dòng thuộc chi Bifidobacterium được sử dụng làm probiotic vì sự đa

dạng trong cơ chế kháng muối mật của chúng, điều này là rất quan trọng vì để thểhiện được đặc tính có lợi thì trước tiên vi sinh vật phải tồn tại được trong dịch sinh

học này Một vài chủng thuộc chi Bifidobacteria được coi là các probiotic quan trọng bao gồm: Bifidobacterium infantis, B adolescentis, B animalis subsp animalis, B animalis subsp lactis, B bifidum, B longum, B breve.

Bifidobacterium cùng với các probiotic khác đã được chứng minh là có khả năng

chữa táo bón, tiêu chảy du lịch, tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, giảm hoạt độngcủa bệnh viêm đại tràng và viêm loét đại tràng, cũng như điều trị viêm ruột hoại tử

ở trẻ sơ sinh, giảm sự phát triển của bệnh eczema, dị ứng thực phẩm, giảm

cholesterol [28]

1.4.3 Chi Sacharomyces

Các chủng thuộc chi Saccharomyces bao các các chủng nấm như: Saccharomyces

cerevisiae ( sử dụng cho làm rượu, bánh mì, bia), Saccharomyces bayanus ( được sử

dụng để làm rượu), và Saccharomyces boulardii được sử dụng để tạo chế phẩm

probiotic dưới dạng đông khô để điều trị bệnh tiêu chảy, trong khi vẫn đảm bảo antoàn tuyệt đối [28].

Saccharomyces boulardii: được dùng như probiotic từ năm 1950 Là thành phần

chính của một số chế phẩm probiotic như ultralevure (Pháp), florastor, bioflora(Pháp) Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp Ngừa tiêu chảy

do kháng sinh và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H pylori, S boulardii tác động

thông qua cơ chế [1]

1. Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E coli tiết ra.

2. Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và aminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗingắn cần thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải

N-Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bàoT

1.4.4 Chi Bacillus

1.4.4.1 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là vi khuẩn ứng dụng làm probiotic từ rất sớm Chúng được sử

dụng qua đường uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi

dùng kháng sinh Bacillus subtilis có tác dụng hồi phục hệ vi sinh vật tự nhiên trong đường tiêu hóa của người sau khi dùng kháng sinh kéo dài Các chế phẩm B subtilis được bán ở hầu hết các nước Châu Âu, mặc dù người ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng Bào tử của B.subtilis có thể vượt qua rào chắn

đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường

ruột Một số tác dụng lâm sàng của B subtilis đã được biết như làm tác nhân kích

thích miễn dịch trong một số bệnh [1]

1.4.4.2 Bacillus clausii

Thuộc giống Bacillus, Gram dương, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi

trường dinh dưỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp vi khuẩn tồn tại trong

điều kiện khắc nghiệt Bào tử của B.clausii có thể qua dạ dày với tỷ lệ sống sót cao,

có thể sống được trong môi trường dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ Chúng đềkháng rất tốt với nhiều loại kháng sinh Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian

điều trị kháng sinh Khi vào ruột non, bào tử B clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh

trưởng (ST) và tiếp tục sinh sôi nảy nở trong ruột Nhờ đó lấp đầy lại được khoảng

trống rối loạn hệ vi khuẩn trong đường ruột Đồng thời sự sinh trưởng của B claussi sẽ tái lập được điều kiện kị khí, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đường ruột (như Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác nhau B clausii thường được dùng tạo chế phẩm probiotic cho người như chế phẩm Enterogermina ở dạng lỏng.

Bào tử được bào chế dưới dạng hỗn dịch không màu, không mùi, không vị trongtừng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho trẻ em [1],[ 5]

Ngoài ra còn rất nhiều chủng vi khuẩn khác được cho rằng có tiềm năng probiotic(Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic

VSL#3 (Lactobacillus casei, Lactobacillus

plantarum, Lactobacillus acidophilus,

Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium

longum, Bifidobacterium breve,

Bifidocacterium infantis and Streptococcus

tiêu chí trên hay không Dựa trên các tiêu chí đó để sàng lọc các dòng vi khuẩn cótiềm năng probiotic Có thể kiểm chứng thêm trên người và động vật.

1.5.1 Chi, loài và chủng probiotic

Cần phải biết chi, loài và chủng probiotic Được công nhận là có tác dụngprobiotic Việc xác định chủng loại được thực hiện bằng phương pháp kiểu hình vàkiểu gen Danh pháp của vi khuẩn phải chính xác với tên khoa học được công bốhiện nay Việc sử dụng các danh pháp cũ hoặc gây hiểu nhấm trên nhãn bao bì củasản phẩm là không thể chấp nhận được [12].DNA là phương pháp được sử dụng đểxác định chủng nào thuộc loài nào và phương pháp phân tích trình tự gen 16SrRNA được sử dụng phố biến để xác định

1.5.2 Các thử nghiệm invitro để sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic

Thử nghiêm in vitro rất quan trọng để đánh giá sự an toàn của vi sinh vậtprobiotic Các thử nghiệm này rất hữu ích trong việc xác định các chủng và cơ chếcủa các tác dụng probiotic Probiotic được sử dụng cho con người cần phải có cácthử nghiệm chứng minh hiệu quả đối con người Các thử nghiệm này cần có kết quảphù hợp với các kết quả đã công bố Ví dụ- khả năng kháng muối mật tương đồngvới khả năng sống sót trong dạ dày Hiện nay, các thử nghiệm in vitro được sử dụngtrong nghiên cứu probiotic [12],[ 13]

1. Khả năng kháng acid trong dạ dày

2. Kháng muối mật

3. Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh

4. Kháng acid mật

5. Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột

6. Khả năng cạnh tranh vị trí bám trên bề mặt với mầm bệnh

Kĩ thuật gen

Việc sử dụng công nghệ gen để cải tiến vi sinh vật hứa hẹn cho sự phát triển củacác chủng probiotic trong tương lai Có thể phân lập các gen quy định một yếu tố cụthể và chuyển các gen này sang các chủng probiotic mà không làm thay đổi các đặctính có lợi khác [13]

1.5.3 Nguồn phân lập probiotic

Nguồn phân lập có thể có nguồn gốc từ con người như ruột già, ruột non, hoặcsữa mẹ; nguồn gốc từ động vật, thực phẩm như sữa hoặc thực phẩm lên men Cácchủng probiotic được phân lập từ con người có khả năng bám dính vào thành ruột

và an toàn hơn so với các chủng từ nguồn khác Các chủng được sử dụng đóng vaitrò quan trọng trong việc [12]

1. Định cư trong đường ruột, hô hấp, cơ quan sinh dục

2. Chuyển hóa cholesterol, ngăn ngừa ung thư

3. Chuyển hóa lactose, hấp thu canxi và tổng hợp các vitamin

4. Điều trị nhiễm trùng và nhiễm nấm âm đạo

5. Táo bón và tiêu chảy

6. Viêm loét dạ dày

7. Mụn trúng cá và các vấn đề về da

8. Sản xuất các kháng sinh tự nhiên, acid lacitc, hydrogen peroxide

1.5.4 Probiotic an toàn

Các dòng probiotic như Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus có lịch sử

lâu dài về sử dụng an toàn và được công nhận đạt tiêu chuẩn GRAS Các vi sinh vậtkhác cần được nghiên cứu độc tính trước khi được sử dụng Các vi sinh vật từ đấthoặc bào tử cần có các dữ liệu an toàn trước khi được sử dụng như probiotic Các

nghiên cứu về an toàn bao gồm: phân loại, xét nghiệm invitro, thử nhiệm trên động vật, thử nghiệm trên con người, xác định trình tự gen [12].

Quy trình chọn lọc chủng probiotic được tóm tắt trong hình 1.1

Tuyển chọn và xác định chủng dựa trên kiểu hình và kiểu gen

 Tên chi, loài, ký hiệu chủng

 Đăng kí trong bảo tàng giống quốc tế nào?

•

•

Pha 2:Thử nghiệm lâm sàng ở người, thử nghiệm mù kép,

kiểm soát giả dược (DBPC) để xác định xem chủng/sản phẩm

Pha 3: kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người So sánh hiệu

quả điều trị 1 bệnh đặc trưng bằng probiotic với phương pháp PROBIOTIC thông

thường

DÁN NHÃNTên chi,loài, kí hiệu chủng

Số lượng tối thiểu vi khuẩn có thể tồn tại cuối thời hạn

sử dụngĐiều kiện bảo quản thích hợpThông tin liên hệ với khách hàng

Hình 1.2 Hướng dẫn lựa chọn chủng probiotic của FAO & WHO

1.6 Vi khuẩn lactic

1.6.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

Lactic acid bacteria (LAB) thường được tìm thấy trong các sản phẩm thực phẩm,đất, nước, thực vật, ruột, bộ phận sinh dục và đường hô hấp của người và động vật.Mặc dù LAB được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm để sảnxuất thực phẩm lên men bao gồm sữa, thịt, cá, ngũ cốc, trái cây và rau cải, nhưngchúng cũng được tìm thấy trong thực phẩm không lên men và được công nhận là antoàn (GRAS) bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA)[11].LAB được sử dụng để đảm bảo an toàn, bảo quản chất lượng thực phẩm, pháttriển các hương vị mới đặc trưng, cải thiện khả năng dinh dưỡng và điều trị củathực phẩm và để ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh và làm hư hỏng (Calo Mata vàcộng sự 2008) Hoạt động ức chế đa hình của LAB được ghi nhận do giảm độ pH,

sự cạnh tranh về vị trí bám trên bề mặt và nhiều hợp chất kháng sinh được sản xuấtnhư axit lactic, axit axetic, hydrogen peroxide, carbon dioxide bên cạnh cácbacteriocin (Indira và cộng sự, 2011) Trong số các hợp chất chống vi khuẩn,bacteriocin có ý nghĩa đặc biệt vì sử dụng an toàn và hiệu quả để kéo dài hạn sựdụng cũng như sự an toàn của sản phẩm thực phẩm [32]

1.6.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, phân loại

Nhìn chung LAB là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí tùy ý và hầuhết không di động Chúng thuộc loại đa khuyết dưỡng, được tìm thấy trong nhiềuloại thực phẩm lên men như sữa chua, kim chi, dưa muối chua, nem chua,… LABtồn tại khá hạn chế trong một số MT do nhu cầu dinh dưỡng cao của nó

Về mặt hình thái, các nhóm LAB tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hình que hoặc hìnhcầu

Về mặt sinh lí, chúng tương đối đồng nhất: thu nhận năng lượng nhờ phân giảicarbohydrat và tiết ra acid lactic Khác với các vi khuẩn đường ruột sinh acid lactic,

LAB là nhóm kị khí không bắt buộc, chúng không có cytochrome và enzymecatalase Tuy nhiên, chúng vẫn có thể ST được khi có mặt oxy do có enzymeperoxidase [1]

Theo khóa phân loại Bergey (2001), LAB được xếp vào 4 họ: Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, Streptococcaceae, thuộc

Giống: Lactobacillus; Pediococcus

Họ II: Enterococcaceae Giống: Enterococcus

Họ III: Leuconoscaceae

Giống: Leuconostoc

Họ IV: Streptococceae

Giống: Streptococcus; Lactococcus

Nhóm LAB được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm thuộc về các chi

như Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus Trong đó Lactobacillus chiếm vị trí quan trọng nhất.

1.6.3 Chi Lactobacillus

Giống Lactobacillus có dạng hình que, thường tồn tại từng tế bào riêng rẽ hay

dạng chuỗi, kích thước tế bào dao động từ 0,5-1,2 x 1-10 µm Tế bào không diđộng, G+, không sinh bào tử Chúng là dạng kị khí không bắt buộc, có thể tăngtrưởng ở nhiệt độ từ 50C – 530C và tăng trưởng tối thích từ 300C đến 400C Chúng

có thể sống ở pH nhỏ hơn 5

Nhu cầu dinh dƣỡng của Lactobacillus rất phức tạp cần phải có nguồn

cacbonhydrat, acid amin, peptit, các este của acid béo, dẫn xuất của các acid

nucleic, vitamin và khoáng chất Lactobacillus có thể sử dụng glucose để lên men

đồng hình (sản phẩm cuối cùng có hơn 85% là acid lactic) hay lên men dị hình (sảnphẩm cuối cùng gồm acid lactic, CO2, ethanol) Sự hiện diện của oxy hay các tácnhân oxy hoá khác nhƣ acetat có thể tạo thành lactat Một số chất nhƣ citrat, malat,tartrat, quinolat, nitrat, nitrit,… cũng đƣợc chúng sử dụng nhƣ nguồn năng lƣợngtrong quá trình trao đổi chất hoặc đóng vai trò nhƣ chất nhận electron

Lactobacillus bao gồm 25 loài đƣợc chia thành 3 nhóm chính dựa vào sản phẩm

cuối cùng tạo thành là:

Nhóm I: lên men đồng hình bắt buộc

Nhóm II: lên men dị hình tuỳ ý

Nhóm III: lên men dị hình bắt buộc

Bảng 1.3 Phân loại Lactobacillus dựa vào sản phẩm

Một vài đại diện

Ghi chú: -: không có khả năng +: có khả năng

Một số loài thuộc chi Lactobacillus thường sử dụng để tạo chế phẩm probiotic cho người như: L acidophilus, L bulgaricus, L casei, L kefir, L.delbruckii, L sporogenes,…

Lactobacillus acidophilus

Là vi khuẩn probiotic có mặt trong hầu hết các men tiêu hóa Có dạng hình que,kích thước từ 0,5-1 x 2-10 µm, vi khuẩn Gram dương, đi theo cặp hoặc dạng chuỗingắn Đây là LAB ưa nhiệt, có thể phát triển ở 450C Chúng có khả năng sống 2ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết và 8 ngày trong dịch ruột.Chúng có khả năng tạo ra các bacteriocin như lactocidin, acidophilin, có thể đềkháng được nhiều loại KS

L acidophilus như là một probiotic lên men đồng hình và dị hình sống trong

đường ruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài lên

men đồng hình, tạo thành nhóm gọi là phức hợp L acidophilus Các thành viên của

nhóm này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển bình thường của hệ VSV trongđường ruột Cơ chế tác động bao gồm:

1. Duy trì hệ VSV bình thường trong đường ruột

2. Tác động lên hệ VSV gây bệnh

3. Điều hoà khả năng miễn dịch

4. Hoạt tính chống đột biến và chống ung thư

5. Làm mất sự liên kết của các acid mật

6. Tạo enzyme lactase

7. Làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh

Lactobacillus bulgaricus

Đây là loài VK quen thuộc, cư trú thường xuyên trong ruột người và động vật,

cùng với các loài VK khác tạo thành một khu hệ VSV không thể thiếu L bulgaricus

đã được ứng dụng cho lên men sữa chua từ rất lâu

Lactobacillus casei

Trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn Chúng có thể tạo thành chuỗi,khôngchuyển động, G+ Chúng có khả năng lên men được các loại đường glucose,fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, salicin Trong quá trình lên menchúng tạo thành acid L-lactic với nồng độ khoảng 180 g/l trong tổng số 210 g/l acidlactic

Lactobacillus delbruckii

L delbruckii có thể lên men được các loại đường glucose, maltose, fructose,

galactose và dextrin Chúng không có khả năng lên men xylose, arabinose,rhamnose, lactose, raffinose, trehalose, inulin, mannitol

L. delbrukii sản xuất 90% là acid L- lactic từ nguồn đường glucose Trong thành

phần tế bào có chứa các chất khoáng, acid amin quan trọng giúp cơ thể nhanh chónghồi phục sức khỏe

1.6.4 Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy acid lactictrong MT Có thể tóm tắt theo phương trình sau:

Hình 1.3 Quá trình lên men lactic

Các loài LAB khác nhau về cơ chế lên men glucose Căn cứ vào sản phẩm lênmen chia LAB thành hai nhóm

Nhóm VK lên men đồng hình: sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic

Nhóm VK lên men dị hình: sản phẩm tạo ra ngoài acid lactic còn có ethanol, CO2,

…

1.6.4.1 Lên men lactic đồng hình

Các LAB lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP(EmbdenMeyerhof Parnas) và cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (90 - 98%) Chỉmột phần nhỏ pyruvate được decacboxyl hóa và chuyển thành acid acetic, ethanol,aceton và CO2 Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ thuộc vào sự có mặt của oxy

Phương trình tóm tắt

C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP

Một số LAB lên men đồng hình thường gặp là Lactococcus lactis, L acidophilus, L casei, L cremoris, L hevelticus, L delbrueckii, S lactis, S thermophilus, P cerevisiae.

1.6.4.2 Lên men lactic dị hình

Vi khuẩn lactic lên men dị hình do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP

là aldolase và triozophosphat – merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giảiglucose xảy ra theo con đường PP (pentose - phosphat) Quá trình chuyển hóatrizophosphat thành acid lactic giống như lên men đồng hình

Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài acid lactic (40%), còn có cácsản phẩm khác như acid succinic, ethanol (20%), acid acetic (10%), các chất khícòn lại (20%)

Phương trình tóm tắt

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 +

xKcal Glucose Acid lactic Ethanol

Một số LAB lên men dị hình thường gặp là L mensenteroides, L cremoris, L.brevis, L fementum,….