Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại vườn quốc gia bidoup núi bà, tỉnh lâm đồng​

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆPKHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƯỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC DÂN GIAN TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP – NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng v

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT NƯỚC CỦA MỘT SỐ LOẠI CÂY THUỐC DÂN GIAN TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP – NÚI BÀ,

TỈNH LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

MSSV: 1151110516

Th S Phạm Minh Nhựt Phạm Thị Thảo Lớp: 11DSH01

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS PhạmMinh Nhựt Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng đượccông bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm vềlời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viênPhạm Thị Thảo

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thựcphẩm – Môi trường đã truyền đạt những kiến thức thật quý báu cho tôi trong suốtquá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

Đặc biệt xin chân thành cảm ơn thầy Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt đã tận tìnhhướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Thầy đã luôn ở bên,quan tâm, và giúp đỡ tôi trong việc gợi ra các ý tưởng trong quá trình làm luận văncũng như cung cấp các tài liệu và sách vở liên quan trong suốt quá trình nghiên cứu

Ngoài ra tôi cũng xin cám ơn các bạn sinh viên trong nhóm của thầy nhưTâm, Hằng, Hồng Vân, Nhân, Vân Anh, Tuấn, Trí, Hiền và tất cả các bạn trongphòng thí nghiệm của trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trìnhhoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên connhững lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng nhưtrong cuộc sống

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viênPhạm Thị Thảo

MỤC LỤC

TRANG

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… ……… 3

1.1 Sơ lược về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại vườn quốc gia Bidoup 3

1.1.1 Cây Podocarpus sp 3

1.1.2 Cây Polygala sp 4

1.1.3 Cây Medinilla sp 5

1.1.4 Cây Elephantopus sp 6

1.1.5 Cây Eupatorium sp 7

1.2 Đại cương về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nước 8

1.2.1 Carbohydrate 8

1.2.2 Flavonoid 9

1.2.3 Tannin 10

1.2.4 Alkaloid 11

1.2.5 Saponin 12

1.2.6 Anthraglycoside

1.3 Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật

1.3.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật .

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật .

1.4 Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

1.4.1 Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột .

1.4.2 Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy .

1.4.3 Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da .

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu .

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị .

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.3.1 Thiết bị và dụng cụ .

2.3.2 Hóa chất .

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc .

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị .

2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực vật

2.4.4 Phương pháp xử lí số liệu .

2.5 Bố trí thí nghiệm

2.5.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của các loại cây thuốc

2.5.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc .

2.5.3 Thí nghiệm 3: Định tính thành phần hóa học của cao chiết nước một số loại cây thuốc dân gian

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian

3.1.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước một số loại cây

thuốc dân gian 39

3.2 Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại cây thuốc 50

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Đề nghị 54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

DMSO: Dimethyl sulfoxide

pABA: p – aminobenzoic acid

mRNA: RNA thông tin

tRNA: RNA vận chuyển

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao nước của một số loại câythuốc đối với một số chủng vi sinh vật 48Bảng 3.2 Kết quả định tính thành phần hóa học cao chiết nước của một số loại câythuốc 51

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây Podocarpus imbricartus 3

Hình 1.2 Cây Polygala paniculata 4

Hình 1.3 Cây Medinilla septentrionalis 5

Hình 1.4 Cây Elephantopus mollis 6

Hình 1.5 Cây Eupatorium odoratum 7

Hình 1.6 Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm 16

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm 30

Hình 2.2 Sơ đồ chung đánh giá hiệu suất thu hồi cao nước của một số cây thuốc dân gian 31

Hình 2.3 Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian 32

Hình 2.4 Định tính sơ bộ thành phần hóa học cao chiết nước của các loại cây thuốc Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi cao nước của một số loại cây thuốc dân gian 38

Hình 3.2 Màu sắc dịch lọc cao chiết nước cây Elephantopus sp qua các lần ngâm mẫu 38

Hình 3.3 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết nước cây Podocarpus sp 39

Hình 3.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Polygala sp 41

Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Medinilla sp 43

Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước cây Eupatorium sp 45

Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước cây Elephantopus sp 47 Hình 3.8 Kết quả kháng khuẩn cao nước của cây Medinilla sp đối với chủng SD (A1) và ShB (A2), cây Polygala sp đối với VH (B1) và EC (B2), cây Eupatorium

sp đối với chủng VH (C1) và LM (C2), cây Podocarpus sp với chủng ST (D1) và cạy Elephantopus sp đối với chủng ShF (D2) 49

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngay từ những ngày đầu khi xã hội loài người còn chưa phát triển, con người

đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để phục vụ vào cuộc sống hằng ngàynhư làm thực phẩm,… và đặc biệt là trong chữa bệnh Tài nguyên cây thuốc là mộttrong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người Gần 150000loài cây thuốc trong số 250000 – 300000 loài thực vật có hoa ở vùng nhiệt đới được

sử dụng làm cây thuốc, gần 5 % trong số cây thuốc đó được nghiên cứu thành phầnhóa học

Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiêncứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có trong các bàithuốc dân gian Từ đó chiết suất tạo ra các dược phẩm có giá trị chữa bệnh có hiệuquả Do đó, việc điều tra các loại cây cỏ có tác dụng chữa bệnh theo kinh nghiệmdân gian là rất cần thiết

Trong dân gian người ta thường sử dụng các loại cây cỏ để chữa bệnh bằngcách sử dụng trực tiếp hoặc nấu nước uống để chữa các bệnh thông thường như tiêuchảy, cảm mạo Đối với các mẫu cây này người ta thường rửa sạch, sau đó cắt nhỏhoặc xay nhuyễn rồi đem đi nấu với nước trong nồi kín cho đến khi gần cạn rồi chắtdịch cạn thu được để dùng Do đó, người dân chủ yếu tách chiết các hợp chất trongcây thuốc bằng dung môi là nước Tuy nhiên, hiệu quả mang lại thật sự của phươngpháp này chưa thể chứng minh được hoạt tính thật sự của cây thuốc vì trong câythuốc có khá nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao không hòa tan được trongnước Vì thế, việc đánh giá hoạt tính của cao chiết nước của một số cây thuốc dângian đóng vai trò rất quan trọng

Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài "Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của một số loại cây thuốc dân gian tại Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng" Đề tài

này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm –Môi trường, Trường ĐH Công nghệ Tp.HCM.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của các loại cây thuốc đốivới một số chủng vi sinh vật gây bệnh và bước đầu định tính thành phần hóa họccao chiết nước của một số loại cây thuốc

3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước của một số loại cây thuốcdân gian

Bước đầu định tính thành phần hóa học cao chiết nước một số loại cây thuốcdân gian

4 Phạm vi nghiên cứu

Chỉ khảo sát một số cây thuốc dân gian như Podocarpus sp., Polygala sp.,

Medinilla sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp thu được ở vườn quốc gia Bidoup

núi Bà – tỉnh Lâm Đồng

Chỉ sử dụng một loại dung môi là nước

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Sơ lược về một số loại cây thuốc dân gian có khả năng trị tiêu chảy tại

vườn quốc gia Bidoup

Chi Podocarpus trong tiếng việt được gọi là chi thông tre Có khoảng 105

loài thuộc chi này, thân của các loài trong chi có chiều cao từ 1 – 25 m, có thể lêntới 40 m Trong thân thường có nhựa mủ, lá của các loài thường là lá kim thon dàinhư hình liềm hoặc tre trúc, dài từ 0,5 – 15 cm ( Farjon, 1998)

Podocarpus imbricatus là dạng cây gỗ lớn thuộc họ Kim giao

(Podocarpaceae), chi podocarpus Cây cao tới 35 m, đường kính 50 – 70 cm có khi

tới 200 cm, thân thẳng, tròn, có nhiều cành xòe rộng, quả hơi vuông cạnh Vỏ cây

có màu nâu đỏ, ghồ ghề, khi chặt chảy nhựa màu nâu nhạt, thịt vỏ màu da cam Hoađực mọc ở nách lá dài 1 cm, hoa cái màu đỏ mọc trên đế nạc (Laub D, 1969)

Cây mọc rải rác trong rừng thường xanh ở các tỉnh Quảng Bình, Nghệ An,

Hà tĩnh, Gia Lai, Phân bố ở độ cao từ 300 – 1000 m, có khi xuống dưới 200 m

Cây ưa sáng, nhưng lúc non cần che bóng, ưa ẩm ướt, tốt nhất là đất cát pha

1.1.1.3 Công dụng

Cây có vị nhạt chát, có tác dụng tán nhiệt, sát trùng, chỉ dương Có thể dùng

để trị cảm mạo và bệnh ngoài da… Ngoài ra lá thông còn có tác dụng trừ phong

thấp, sát trùng, kích thích mọc tóc nhanh, chữa bệnh cước khí (phù do thiếu vitamin B1).

Gỗ nhẹ, không bền thường dùng để đóng đồ trong nhà, làm bột giấy…

Polygala paniculata L là một loài thuộc họ viễn chí Polygalaceae Cây còn

được gọi là cây dầu nóng, cây thảo nhỏ hay bụi mảnh cao 30 – 40 cm Đặc điểm dễnhận của cây là khi nhổ cây lên ngửi phần gốc rễ cây sẽ thơm mùi tinh dầu salicylatmethyl, thân cây mảnh không lông Lá có phiến nhỏ hẹp 1,5 x 0,15 cm, đầu nhọnmỏng không lông Hoa có màu trắng nhỏ, cao 2 mm, không lông (Đỗ Tất Lợi,2004)

Trên thế giới, Viễn chí lá nhỏ phân bố ở Nam Mỹ, châu Đại Dương, châuÁ… Ở nước ta thường gặp ven đường đi, đất hoang và có số lượng lớn ở Lâm Đồng

Thành phần hóa học: Rễ chứa nhiều tinh dầu có salicylat methyl nên có mùirất thơm, saponin…

1.1.2.3 Công dụng

Cây có vị đắng the, có tác dụng an thần, ích trí, khan đàm, hoạt huyết, trị sổmũi Ngoài ra saponin có trong dược liệu sẽ kích thích sự bài tiết niêm dịch ở khíquản, có tác dụng chữa ho, kích thích sự bài tiết nước bọt, bài tiết các tuyến ở da…

Medinilla là chi có khoảng 150 loài thực vật nở hoa trong họ

Melastomataceae, chủ yếu nằm trong các vùng nhiệt đới Chúng là cây thườngxanh, cây bụi hoặc dây leo

Medinilla thường mọc thành bụi nhỏ, cao khoảng từ 1 – 2 m, với những lá

đơn mọc đối với cụm hoa dạng chùm lớn với những hoa nhỏ li ti Chùm hoa mọc từnách lá, cành hoa kéo dài khoảng 25 cm, hoa có màu tím hồng (Renner, 2004)

Medinilla septentrionalis thuộc loại cây bụi cây cao khoảng 1 – 7 m, cây có

nhiều nhánh Cuống lá có bề dày từ 0,4 – 0,9 mm, có dạng hình trứng bản rộng rấtmỏng, kích thước lá 7 – 8,5 x 2 – 2,5 cm Hoa của cây mọc theo từng chùm, dạnghình chuông, cuống hoa mọc từ lá nách kéo dài khoảng 1 – 2,5 cm, hoa có màuhồng hoặc đỏ tía (Chen Cheih và ctv, 1984)

Phân bố: Cây được phân bố chủ yếu ở các rừng rậm, lề rừng, các khu vực ẩmướt trong độ cao từ 200 – 1800 m Cây mọc chủ yếu tại các vùng Quảng Đông,

Quảng Tây, Vân Nam của Trung Quốc, ngoài ra còn có ở các nước như Thái lan, Việt Nam

Elephantopus mollis có tên thường gọi là cúc chỉ thiên hoa trắng hay cúc

chân voi mềm Là loại cây thân thảo lâu năm cao từ 0,5 – 1 m, cây phủ đầy lông Lámọc dài theo thân, không cuống dài từ 10 – 15 cm Cụm hoa dài theo thân, nhánhmang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung (Mercadante, 2013)

Phân bố: Loài này có nguồn gốc ở Trung và Nam Mĩ, thường gặp ở các vùng

nhiệt đới Ở nước ta, cây Elephantopus mollis mọc ở rừng thưa, rừng thông, dọc

đường đi ở các tỉnh Tây Nguyên

1.1.4.3 Một số nghiên cứu dược liệu về cây E mollis

Tại Brazil lá cây được sử dụng như một chất làm mềm, làm lành vết thương,

ra mồ hôi và để điều trị viêm phế quản, ho, cảm cúm trong y học dân gian(Empinotti và Duarte, 2008)

Chiết xuất E mollis chứng minh tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc gan do

β – D –galactosamine và acetaminophen, bằng cách giảm nồng độ trong huyết thanhglutamate – oxalate – transaminase và huyết thanh glutamate – pyruvate –

transaminase Các biến đổi chất béo ở gan và hoại tử của lobule trung tâm rõ ràng

đã được cải thiện bằng cách xử lí với E mollis (Lin và ctv, 1995)

Tabopda và ctv, (2008) đã xác định được một sesquiterpene lactone mới

trong E mollis Nó thể hiện tác động gây độc tế bào quan trọng chống lại tế bào

Cây Eupatorium odoratum có tên thường gọi là cây cỏ hôi, cây cỏ lào… Là

một loại cây nhỏ, mọc thành bụi, thân hình trụ thẳng cao tới hơn 2 m, có nhiều cành.Khi cây trưởng thành lá có hình dạng quả trám lệch, mép có răng cưa thưa, có lôngthưa và ngắn ở cả hai mặt lá Nếu vò lá và cành non có mùi thơm hắc Cụm hoa đầu,hình trụ dài 9 – 11 mm, đường kính 5 – 6 mm Lúc nở hoa có màu tím nhạt, sautrắng (King, R M and H Robinson, 1987)

Phân bố: Cây mọc ở khắp nơi và trên mọi địa hình

Thành phần hóa học: Tinh dầu 0,7 – 2,0 % màu vàng nhạt, ageratochromen,demethoxy, cadinen, caryophyllen Ngoài ra còn có saponin, alkaloid…

1.1.5.3 Công dụng

Có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, chữa rong huyết sau đẻ…

1.2 Đại cương về một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết nước

1.2.1 Carbohydrate

1.2.1.1 Khái niệm

Carbohydrate là nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinhvật, là hợp chất có chứa nhiều nhóm chức OH và một nhóm CHO (aldehyde) hoặcmột nhóm CO (ketone)

Cây xanh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng để tổng hợpcarbohydrate từ CO2 và H2O Carbohydrate thực vật là nguồn dinh dưỡng quantrọng của người và động vật Là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố C,

H, O

Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n

1.2.1.2 Phân loại

Carbohydrate được chia làm 3 nhóm chính:

 Monosaccharide: Hay còn gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giảnnhất của carbohydrate và không bị thủy phân như glucose, fructose,galactose Monosaccharide đầu tiên được tìm thấy là glucose với cấu trúc 5nhóm hydroxyl, (Alexander Kolli, 1869)

 Oligosaccharide: Khi thủy phân cho từ 2 – 8 đường đơn như sucrose,

maltose, lactose

 Polysaccharide: Do nhiều gốc monosaccharide kết hợp với nhau, có khốilượng phân tử lớn, do đó polysaccharide không có tính khử như tinh bột,glycogen…

1.2.1.3 Vai trò

 Cung cấp năng lượng cho cơ thể, carbohydrate đảm bảo khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống

 Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglycan )

 Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide)

 Góp phần bảo đảm tương tác đặc hiệu của tế bào (polysaccharide trên màng

tế bào hồng cầu, thành tế bào một số vi sinh vật)

1.2.1.4 Tính chất

 Các monosaccharide là những chất không màu, phần lớn có vị ngọt Chúnghoà tan tốt trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực,tan trong dung dịch ethanol 80%

 Ðộ tan không giống nhau

 Flavonoid glycosides, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước, cồn

 Aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước

1.2.2.4 Vai trò

 Là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản 1

số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…)

 Tham gia lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa

1.2.3.1 Khái niệm

Là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bềnvững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit vàalkaloid)

1.2.3.2 Phân loại

 Tannin thủy phân được(Tannin pyrogalic)

o Thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo ra phần đường (glucose) và phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este

o Tủa xanh đen với muối sắt III

o Dễ tan trong nước

o Ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn…

 Tannin không thủy phân được(Tannin pyrocatechic)

o Dễ tạo thành chất phlobaphen không tan

o Thường là chất trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng hợp của hai loại)

o Tủa xanh với muối sắt III

o Ví dụ: Vỏ Quế, Canhkina, Ðại hoàng…

1.2.3.3 Tính chất

 Có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và acetone

 Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ

 Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)

1.2.3.4 Vai trò

 Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu

 Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng

 Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy

1.2.4 Alkaloid

1.2.4.1 Khái niệm

Là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số

có nhân dị vòng, thường gặp chủ yếu ở thực vật

1.2.4.2 Phân loại

 Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử

 Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:

o Nhóm pyridine: piperin, coniin, cytisin,…

o Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin

o Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine

o Nhóm quinolin: quinine, quinidin, brucin…

o Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như morphin, codein…

o Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, serotonin

o Nhóm indol: serotonin, ergin, reserpin…

o Nhóm purin: caffeine, theobromin, theophyllin

o Nhóm terpenoid: cholin, aconitin,…

1.2.4.3 Tính chất

 Đa số các Alkaloid đều có tính base yếu

 Alkaloid trong tự nhiên thường tồn tại ở dạng thể rắn như morphine(C17H17NO3), quinine (C20H24N2O2)… Tuy nhiên nó cũng có thể tồn tại ở dạng lỏng như coniin (C8H17N)…

 Đa số alkaloid không có mùi, không có màu, có vị đắng và một số ít có vị cay như piperin…

 Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi,…) tạo ra muối phức

o Ví dụ: Asiaticosid có trong rau má là saponin của nhóm ursan…

o Saponin triterpenoid tetracyclic gồm có các nhóm drammaran, lanostan, cucurbitan Đặc điểm của nhóm này là phần aglycon có 4 vòng

o Ví dụ: Đại diện cho nhóm drammaran là saponin của nhân sâm, lanostan có trong các loài hải sâm…

 Saponin steroid gồm có các nhóm spirostan, furostan, aminofurostan,spirosolan Đặc điểm chung của nhóm này là gồm có 27 carbon nhưcholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20 – 27 tạo thành hai vòng có oxy Một

là hydrofutan (vòng E), và vòng còn lại là hydropyran (vòng F) Các nhóm trên chỉ khác nhau ở sự biến đổi ở vòng F

1.2.5.3 Tính chất

 Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch

 Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

 Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làmmất các chất điện giải cần thiết…

 Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu…

 Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với một số các chất khác…

 Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc,abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vịngọt

 Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ete, hexan

1.2.5.4 Vai trò

 Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng)

 Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt

 Anthranoid hay anthraquinon khi tồn tại dưới dạng glycosid thì được gọi làanthraglycosid hay anthracenosid Cũng như các loại glycosid khácAnthraglycosid là những glycosid khi bị thuỷ phân sẽ cho phần đường vàphần aglycon (genin).

 Đa số các anthraglycosid là các polyoxy anthraquinon Gắn vào nhân thường

có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH Tuỳ theo vị trí các nhómchức đính vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau

 Ở thể glycosid dễ tan trong nước, có thể tan trong ether, chloroform và một

số dung môi hữu cơ khác

 OH ở vị trí α thì có tính acid yếu hơn ở vị trí β do tạo dây nối hydro với nhóm carbonyl

 Dẫn chất có 1,4-dihydroxy sẽ có huỳnh quang trong dung dịch acid acetic Ngoài ra các dẫn chất này còn cho màu xanh dương với H2SO4.

 Các dẫn chất thuộc nhóm nhuận tẩy khi ở trong dung dịch kiềm tạo phenolat

có màu đỏ và dưới ánh sáng UV (365 nm) cho huỳnh quang tím hoặc đỏ nâu

 Các dẫn chất anthranol có phản ứng với p-nitroso dimethylanilin để tạo thànhazomethin có màu

1.2.6.4 Vai trò

 Các dẫn chất anthraglycoside, chủ yếu là các β-glucoside dễ hoà tan trongnước, không bị hấp thu cũng như bị thủy phân ở ruột non Khi đến ruột già,dưới tác dụng của β-glucosidase của hệ vi khuẩn ở ruột thì các glycoside bịthủy phân và các dẫn chất anthraquinon bị khử tạo thành dạng anthron vàanthranol là dạng có tác dụng tẩy xổ, do đó có thể giải thích lí do tác dụngđến chậm sau khi uống thuốc Dạng genin thì bị hấp thu ở ruột non nênkhông có tác dụng

 Do tác dụng làm tăng nhu động ruột nên với liều nhỏ các dẫn chất dihydroxyanthraquinon dưới dạng heteroside giúp cho sự tiêu hoá được dễdàng, liều vừa nhuận, liều cao xổ

1,8- Các dẫn chất anthraglycoside có tác dụng thông mật

 Hỗn hợp các dẫn chất anthraquinon có trong rễ cây Rubra tinctoria L có tác dụng thông tiểu và có khả năng tống sỏi thận

 Chrysophanol có tác dụng kháng nấm dùng để trị nấm, hắc lào, lang ben

 Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất quinon đặc biệt là các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư

1.3 Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thực vật

1.3.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của thực vật

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thựcvật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triên của vi sinh vật Các chất kháng

khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độthường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010)

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật

Cơ chế kháng khuẩn chung của các hợp chất từ thực vật bao gồm việc phá vỡmàng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùngchức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gâyđông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của

tế bào Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plantsecondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồitác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạtđộng tế bào (Radulovíc và ctv, 2013)

Hình 1.6 Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm

 Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn Do tác động lên quátrình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ dothay đổi áp suất thẩm thấu

 Ức chế chức năng của màng tế bào: Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có kích thước lớn và các ion bị thoát ra ngoài

 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:

o Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác

o Nhóm chlorarnphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzymepeptidyltransferase ngăn cản việc gắn các aid amin mới vào chuỗipolypeptide

o Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

 Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid:

o Nhóm rifampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA

o Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạchđơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi củaDNA

o Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụngcạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid

o Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo nucleic acid

1.4 Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

1.4.1 Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột

1.4.1.1 Khái niệm

Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn gram

âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có lên men oxidase, lên men đườngglucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di độnghoặc không và không sinh nha bào

1.4.1.2 Đặc điểm hình thể và tính chất nuôi cấy

Tất cả vi khuẩn họ này đều là trực khuẩn gram âm, kích thước trung bình 2 – 4

µm x 0,4 – 0,6 µm Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi.Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở xung quanh tế bào

Họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường, trênmôi trường lỏng có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường

Trên môi trường đặc có 3 dạng khuẩn lạc:

1.4.2 Một số vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

o Salmonella do Daniel E Salmon phát hiện ra năm 1885 Năm 1880 Grafhy

đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và là người đầu tiên

phân lập được S.typhi vào năm 1884.

o Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Salmonella là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước khoảng 0,6 – 2,0 μm,

kị khí tùy nghi, có tiên mao, có thể di động (trừ S gallinarum và S.

pullorum) không tạo bào tử, có khả năng sinh hơi, lên men dextrose và sinh

khí H2S

b, Khả năng gây bệnh

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện trong thực phẩm, đến

mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm Các triệu chứng do Salmonella gây

ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh kể từ tiêu thụ thực phẩm

bị nhiễm khuẩn đến khi có các triệu chứng biểu hiện là 12 – 36 giờ Không phải tất

cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm salmonella đều bị ngộ độc Các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng…

Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải

thức ăn bị nhiễm khuẩn như thực phẩm, sữa, nước uống… Sau khi qua hàng ràoacid dạ dày, vi khuẩn di chuyển về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục đi quamàng nhày và vào thành ruột

c, Một số chủng salmonella gây bệnh cho người

 S typhi: Loài này chỉ gây bệnh cho người, nó là vi khuẩn quan trọng nhất

trong các căn nguyên gây bệnh thương hàn

 S paratyphi A: Chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn

 S paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở người, nhưng có thể gây bệnh cho động

vật

 S paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả năng gây

viêm dạ dày, ruột và nhiễm khuẩn huyết

 S typhimurium và S enteritidis: Có khả năng gây bệnh cho người và động

vật

 S choleraesuis: Là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do Salmonella

1.4.2.2 Nhóm Escherichia coli

a, Đặc điểm của E coli

Escheriachia coli do Escherich phân lập 1885 từ phân trẻ em E coli là trực

khuẩn hình que ngắn kích thước 2 – 3 x 6µm, hai đầu tròn, tế bào đứng riêng lẻ, đôikhi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, khôngtạo bào tử, gram âm, thỉnh thoảng có hiện tượng bắt màu ở hai đầu

E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ

từ 15 – 44oC (tối ưu ở 37oC), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4) Trên môi trường EMB

E coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, thường có ánh kim, bờ tròn đều.

Có phản ứng lên men đường với các loại đường như Lactose, Glucose,… Ngoài

ra còn có phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứn H2S, VP, Urea âm tính

b, Khả năng gây bệnh của vi khuẩn

E coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở

đường tiêu hóa Tuy là vi khuẩn cộng sinh với người nhưng E coli có thể gây bệnh

cơ hội Chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục… Nhưng nguyhiểm nhất là gây viêm dạ dày ruột ở trẻ em

Trước hết vi khuẩn E coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng

kháng nguyên F Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập vào tế bào biểu mô của thànhruột ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá vỡ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột,đồng thời sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin, gây ra hiện tượng tiêu chảy

1.4.2.3 Nhóm Shigella

a, Đặc điểm chung

Là trực khuẩn gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi,tăng trưởng ở nhiệt độ 10 40oC, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có khángnguyên K, không có kháng nguyên H

Shigella lên men glucose, không sử dụng nitrat, không sinh hơi

Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có cấu trúc

kháng nguyên phức tạp Shigella có kháng nguyên O, không có kháng nguyên H,

một số có kháng nguyên K

b, Khả năng gây bệnh trên người

Các loài shigella có tính chuyên biệt ký chủ cao, chúng chỉ xâm nhiễm và

tăng trưởng trong người và các loài linh trưởng Trong môi trường nước các loài này

có thể tồn tại hơn 6 tháng Ngộ độc thực phẩm do shigella chủ yếu là do ăn phải thực phẩm kém vệ sinh Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp từ người qua người Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ trong 1 – 7 ngày sau khi sử dụng

thực phẩm bị nhiễm khuẩn Biểu hiện bệnh lý có thể thay đổi từ tiêu chảy nhẹ đến đitiêu ra máu, mất nước, sốt cao… Các triệu chứng trên có thể kéo dài trong nhiềungày

Một số chủng shigella: Shigella dysenteriae, shigella flexneri, shigella sonnei,

Là vi khuẩn gram âm, sống kỵ khí tùy nghi, có phản ứng catalase và oxidasedương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S và vi khuẩnkhông phát triển trên môi trường không muối (NaCl) (Trần Linh Phước, 2008)

b, Khả năng gây bệnh

Các loài vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na+ để

phát triển Nhóm vibrio là tác nhân gây ra bệnh tả, được lan truyền rất nhanh qua

đường nước, gây nhiễm thực phẩm, và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ

sinh kém Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống,rau quả… Ngoài khả năng gây nhiễm các bệnh về đường ruột, một số chủng củanhóm này còn có khả năng gây nhiễm trùng máu cho người.

Một số chủng gây bệnh của nhóm vibrio: V alginolyticus, V harveyi, V.

parahaemolyticus…

1.4.2.5 Nhóm Listeria

a, Đặc điểm chung

 Đại diện của nhóm Listeria là L monocytogenes, là trực khuẩn gram dương,

kỵ khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ 1 – 45oC, không tạo bào tử nhưng có diđộng

 Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 1

- 2µm Cho phản ứng Catalase dương tính

 Giống Listeria bao gồm 6 loài: L monocytogens, L innocua, L ivanovii, L

seeligeri, L welshimeri, L grayi

b, Khả năng gây bệnh

Bệnh do nhóm Listeria gây ra ít gặp ở người tuy nhiên các triệu chứng của bệnh

rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cao Việc tiêu thụ các thực phẩm nhiễm khuẩn là

nguyên nhân gây ra bệnh viêm dạ dày – ruột với triệu chứng sốt L monocytogenes

là nguyên nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tuổi, phụ nữ mang thai, những

người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch kém

Sự nhiễm trùng là một dạng bệnh khác do Listeria gây ra tác động đến các bệnh

nhân mang bệnh về miễn dịch Ngoài ra nhóm này cũng là nguyên nhân gây ra cácbệnh như viêm màng kết, bệnh về hạch bạch huyết… Phần lớn người bị nhiễm bệnhđều có các dấu hiệu lâm sàng nhẹ, và triệu chứng không rõ ràng

1.4.3 Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên da

1.4.3.1 Staphylococcus

a, Đặc điểm chung của staphylococcus

Là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính từ 0,5 – 1,5 µm, có thể đứngriêng lẻ, từng đôi hoặc từng chùm Vi khuẩn không di động và không sinh bào tửthường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máu nóng (Koch, 1878;Pasteur, 1880)

Là những vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có cả sự trao đổi chất, hôhấp và lên men Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể sử dụng nhiều

loại carbohydrate khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi Staphylococcus

có thể mọc ở nhiều điều kiện và môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở nhiệt độ từ

30 – 37oC và pH gần trung tính Chúng kháng được với các chất diệt trùng, độ khônóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 1,5% NaCl (Scott EMartin và John J Iandolo, 2000)

b, Khả năng gây bệnh cho người

Các bệnh ngoài da: trên mặt da có những vết xây xát, tụ cầu xuống tổ chức dưới

da gây các bệnh mụn nhọt, viêm da, đầu đinh…

Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: Thường xảy ra ở những người có sức đề khángyếu hoặc trẻ em

Trong tự nhiên staphylococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay móng của các động vật máu nóng Staphylococcus aureus sản sinh một số loại

độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị thủy phân ở 100oC trong 30 phút.Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này thì sau 4 – 6 giờ người bệnh có nhữngtriệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ Các loại thực phẩm nhưjambon, nước súp… thường nhiễm các loài vi sinh vật này Con đường lây nhiễmchủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trính chế biến

b, Khả năng gây bệnh

Mặc dù streptococcus có khả năng gây nhiễm trùng trong cộng đồng và bệnh

viện Nhưng phải đến sau những năm 1970 mới được biết đến như tác nhân gâybệnh nhiễm trùng bệnh viện Nhóm vi khuẩn này trở thành tác nhân phổ biến đứngthứ hai nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm trùng vết thương

Một số nghiên cứu cho thấy nhóm vi khuẩn này cũng là nguyên nhân của viêmmàng trong tim Nhiễm trùng hô hấp hay hệ thần kinh trung ương cũng như viêmkhớp, hạch, viêm xoang cũng có thể do nhóm này gây ra nhưng rất hiếm gặp

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm thu mẫu: Vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

 Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ Sinh học –Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ ChíMinh

 Thời gian nghiên cứu: 2/2015 – 8/2015

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Các loại cây thuốc dân gian bao gồm: Podocarpus sp., Medinilla sp.,

Elephantopus sp., Eupatorium sp., Polygala sp.

 Nhóm vi khuẩn Listeria: L innocua (LI), L monocytogenes (LM).

 Nhóm vi khuẩn Samonella: S dublin (SD), S enteritidis (SE), S typhi (ST),

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.3.1 Thiết bị và dụng cụ

 Tủ sấy, bình hút ẩm

 Đĩa petri, que trang, đèn cồn, dây cấy vòng

 Máy say mẫu

 Máy lọc, giấy lọc

 Bình tam giác, cốc thủy tinh

 Máy lắc

 Máy nước cất (Branstead USA)

 Máy đo quang phổ

 Tủ ấm 30oC, 37oC (Memmert mermany)

 Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

 Micropipette loại 100 – 1000 l, đầu tipe

 Cân phân tích (Orbital Germany)

 Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn

 Ống eppendorf, parafirm

 Nồi hấp autoclave (Huxky Đài Loan)

 Bông không thấm, dây cấy vòng

2.3.2 Hóa chất

 Cồn, nước cất, muối NaCl

 Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ)

 Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ)

 Thuốc thử Fehling A, Fehling B, Ninhydrin, Gelatin 1%, NaOH 10%,Ferric chloride 10%, thuốc thử Hager, Wagner, chì acetate 10%, thuốc thửMolisch, Barfoed, Dragendroff, Benzene, bột Magnesium

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tách chiết cao nước của cây thuốc

Khái niệm: Chiết xuất là tách các chất hòa tan trong dược liệu nhưng vẫn giữ đủthành phần và bản chất của của các hợp chất có trong cây

Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau.Phương pháp chiết bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kĩ thuật chiết,mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi

Phương pháp tiến hành: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn,sau đó đem phơi khô rồi nghiền thành dạng bột Bột cây thuốc sẽ được ngâm đểtrích ly các hợp chất có trong mẫu cây, tiến hành ngâm trong 24 giờ rồi đem lọc, quátrình lặp lại từ 3 – 5 lần cho đến khi dịch lọc trong thì thôi Tiến hành cô quay dịchlọc ở nhiệt độ thấp hơn 50oC Cao chiết thu được sẽ bảo quản lạnh ở - 4oC (Atta vàMouneir, 2004)

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật chỉ thị

2.4.2.1 Phương pháp tăng sinh

Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường

vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinhdưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng không chỉ cần thiết đối với hoạt độngsống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thíchhợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường

Phương pháp tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và cácgiống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hànhtăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trườngTSB Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang,2013)

2.4.2.2 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng

và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng này đượcchuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản

Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo visinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Tuỳ từngnhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiêngiới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần

Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấychuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảoquản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.7.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, cóthể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu

Mục đích:

o Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn hay bị mất hoạt tính Vìvậy việc bảo quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng trong thí nghiệmcũng như sản xuất

o Làm cho các giống vi sinh vật có tỉ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật khác

Phương pháp bảo quản lạnh sâu (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

o Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt

độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log

o Pha dịch tế bào với glycerol 40% đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106

o Dịch huyền phù tế bào được đưa vào eppendoff và đóng

o Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suấtthẩm thấu trong và ngoài tế bào.

o Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định Và được tiến hành giữgiống ở - 15oC

2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước của thực vật

Nguyên tắc: Mẫu thử được nhỏ vào các giếng thạch đã cấy vi sinh vật kiểmđịnh Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào môi trườngagar và tác động lên vi sinh vật chỉ, khi đó nó sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vậtchỉ thị tạo thành vòng vô khuẩn

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dựa trên phương phápkhuếch tán trên đĩa thạch của (Murray và ctv, 1995; Olurinola, 1996)

Phương pháp được thực hiện trên môi trường TSA, vi khuẩn sau khi đượctrang đều trên mặt đĩa, khi đó sẽ tiến hành đục lỗ với đường kính d = 6 mm Chuẩn

bị các các loại dịch chiết khác nhau với nồng độ thích hợp Hút 100 µl các loại dịchchiết khác nhau vào trong từng giếng thạch, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng khoảng

2 giờ Tất cả các đĩa petri sau đó sẽ được đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 – 24 giờrồi đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn thu được

2.4.4 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey

2.5 Bố trí thí nghiệm