Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ một số loại thực vật tại vườn quốc gia bidoup núi bà, tỉnh lâm đồng​

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆPĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ MỘT SỐ LOẠI THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH H

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT

SỐ LOẠI CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ MỘT SỐ LOẠI THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP NÚI

BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện

MSSV: 1211100332

: Trịnh Tuấn Anh Lớp: 12DSH02

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan tất cả nội dung trong đồ án này đều do tôi trực tiếp thực hiệndưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm– Môi trường Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực vàochưa được công bố dưới bất kì hình thức nào Mọi tài liệu tham khảo dùng trong đồ

án này đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công

bố Những số liệu của các bảng phân tích, biểu đồ, đánh giá được thu thập từ nhiềunguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo và chú thích nguồn gốc

Tất cả nội dung, sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trungthực, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Sinh viênTrịnh Tuấn Anh

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học CôngNghệ Tp Hồ Chí Minh, cùng các thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học Thực phẩm Môi trường đã quan tâm và giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em trongquá trình học tập tại trường

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em chân thành gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt

đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nóichuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng nghiêncứu Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy

Em cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô khoa Công nghệ sinh học Môi trường Thực phẩm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM đã tận tình truyền đạtkiến thức và kinh nghiệm cũng như niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho em Điềunày không chỉ giúp em thực hiện đồ án này tốt nhất có thể mà còn là nền tảng kiếnthức cho công như việc sau này

Em cảm ơn các bạn, anh, chị đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong thời gian thực hiện

đề tài tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng, em xin cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng phản biện đã dành thờigian đọc và nhận xét đồ án Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên đồ án tốtnghiệp của em còn nhiều thiếu sót, mong các thầy cô chỉ dạy đề em hoàn thiện đồ ánnày tốt hơn cũng như thu nhận thêm được kiến thức Em xin gửi lời chúc sức khoẻ đếcác thầy cô

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Sinh viênTrịnh Tuấn Anh

MUC̣ LUC̣

MỞ ĐẦU 4

1 Đặt vấn đề 9

2 Mục tiêu nghiên cứu 10

3 Nội dung nghiên cứu 10

4 Phạm vi nghiên cứu 11

5 Nội dung Đồ án tốt nghiệp 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 12

1.1 Giới thiệu 12

1.1.1 Vai trò của cây thuốc trong đời sống 12

1.1.2 Lợi ích sử dụng cây thuốc 13

1.1.3 Tình hình sử dụng cây thuốc 13

1.2 Thành phần hóa học của thực vật 14

1.2.1 Carbohydrate 14

1.2.1.1 Khái niệm 14

1.2.1.2 Tính chất 14

1.2.1.3 Vai trò 15

1.2.2 Amino acid 15

1.2.2.1 Khái niệm 15

1.2.2.2 Tính chất 16

1.2.2.3 Vai trò 16

1.2.3 Alkaloid 16

1.2.3.1 Khái niệm 16

1.2.3.2 Tính chất 16

1.2.3.3 Vai trò 17

1.2.4 Glycosides 17

1.2.4.1 Khái niệm 17

1.2.4.2 Tính chất 18

1.2.4.3 Vai trò 18

1.2.5 Steroids 19

1.2.5.1 Khái niệm 19

1.2.5.2 Tính chất 19

1.2.5.3 Vai trò 19

1.2.6 Tannin 19

1.2.6.1 Khái niệm 19

1.2.6.2 Đặc điểm 20

1.2.6.3 Vai trò 20

1.2.7 Isoprenoid (Terpene) 20

1.2.7.1 Khái niệm 20

1.2.7.2 Tính chất 21

1.2.7.3 Vai trò 21

1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật 21

1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 21

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 22

1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật 23

1.3.3.1 Alkaloids 23

1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu 25

1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic 25

1.3.3.4 Lectin và polypeptide 27

1.3.3.5 Saponin 27

1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình 28

1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 28

1.4.1.1 Escherichia coli 28

1.4.1.2 Shigella 29

1.4.1.3 Salmonella 30

1.4.1.4 Vibrio 31

1.4.1.5 Listeria 32

1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa 33

1.4.2.2 Staphylococcus aureus 34

1.4.2.3 Enterococcus feacalis 35

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Địa điểm và thời gian 36

2.1.1 Địa diểm 36

2.1.2 Thời gian 36

2.2 Vật liệu 36

2.2.1 Nguồn mẫu phân tích 36

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 37

2.2.3 Hóa chất, môi trường 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 38

2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 38

2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào VSV bằng đo mật độ quang 39

2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống 39

2.3.5 Phương pháp tách chiết cao 40

2.3.6 Chuẩn bị dung dịch cao thuốc kháng sinh 40

2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) 40 2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học 41

2.3.8.1 Carbohydrate 41

2.3.8.2 Alkaloid 42

2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) 42

2.3.8.4 Cardiac glycosides 42

2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) 43

2.3.8.6 Flavonoid 43

2.3.8.7 Phenolic 44

2.3.8.8 Tannin 44

2.3.8.9 Steroid 44

2.3.8.10 Amino acid 45

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 45

2.4 Bố trí thí nghiệm 46

2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của các mẫu cây thuốc. 47

2.4.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết ethanol 49 2.4.5 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi 52

3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ các mẫu cây khảo sát 53

3.2.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 53

3.2.2 Đối với nhóm vi khuẩn Listeria 54

3.2.3 Đối với nhóm vi khuẩn Salmonella 55

3.2.4 Đối với nhóm vi khuẩn Shigella 57

3.2.5 Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 58

3.2.6 Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác 59

3.3 Kết quả xác định thành phần hoá học 63

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MUC̣ HÌNH ẢNH

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate 15

Hình 1.3.Alanine 15

Hình 1.4 Epherdin và Hyoscyamin 16

Hình 1.5 Cardenolic và Bufadiennolid 18

Hình 1.6 Steroid 19

Hình 1.7 Tannin 20

Hình 1.8 Limonene và Ocimene 21

Hình 1.9 Một số cơ chế kháng sinh 22

Hình 1.10 Solamargine 24

Hình 1.11 Berberine 24

Hình 1.12.Một số Terpenenes và Terpenoid 25

Hình 1.13.Một số Quinones thông thường 26

Hình 1.14 Gallotannin 26

Hình 1.15 Một số Flavonoid 27

Hình 1.16 Saponin 28

Hình 1.17 Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 dưới kính hiển vi 28

Hình 1.18 Ảnh chụp của Shigella sp trong một mẫu phân 29

Hình 1.19 Hình ảnh của S typhii và S typhimurium 30

Hình 1.20 Hình ảnh Vibrio cholerae và Vibrio harvey i 31 Hình 1.21 Hình ảnh Listeria monocytogenes 32

Hình 1.22 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 33

Hình 1.24 Hình ảnh Enterococcus feacalis 35

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu 38

Hình 3.1 Hiệu xuất tách chiết của ethanol 70% với các mẫu cây thuốc 52

Hình 3.2 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Escherichia coli 53

Hình 3.3 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Listeria 55

Hình 3.4 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối với nhóm Salmonella 56

Hình 3.5 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối

với nhóm Shigella 57

Hình 3.6 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối

với nhóm Vibrio 58

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của cao chiết ethanol 70% các mẫu cây khác nhau đối

với nhóm vi sinh vậy gây bệnh 59

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu

DANH MUC̣ BẢNG

Bảng 1.1 MôṭsốGlycosides phổbiến 17

Bảng 3.1 Kết quảkháng khuẩn của các mẫu cao chiếtethanol 70% đối với 20 chủng

vi khuẩn 64Bảng 3.2 Kết quảxác đinḥ thành phần hóa hoc ̣ 67

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nhân loại đã có những bước phát triển vượt bậc, tạo điều kiện chăm sóc sứckhoẻ cộng đồng, phòng chống bệnh lây nhiễm, nhất là các bệnh do vi khuẩn gây ra.Tiếp nối sự thành công của một trong những phát hiện lớn nhất của y học trong trongthế kỉ 20 đó là việc tìm ra kháng sinh Penicillin vào năm 1928 của AlexanderFleming Đến nay đã có nhiều loại thuốc kháng sinh được tạo ra Hiện nay, ở ViệtNam, cũng như các nước trên thế giới việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnhcũng trở nên phổ biến Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh chưa được quản líchặt chẽ “Phần lớn kháng sinh được bán mà không có đơn, 88% thành thị và 91%nông thôn Mua kháng sinh để điều trị ho 31,6% thành thị và sốt 21,7% nông thôn Baloại kháng sinh được bán nhiều nhất là ampicillin/amoxicillin 29,1%, cephalexin12,.2% và azithromycin 7,3% Người dân thường yêu cầu được bán kháng sinh mà

không có đơn 49,7% thành thị và 28,2% nông thôn.”( Khánh Linh, 2015) Đây là một

thực trạng đáng báo động không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới

Việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo đơn của bác sĩ gây hậu quả nghiêmtrọng khi bệnh nhân không chữa khỏi hoàn được bệnh mà nghiêm trọng hơn, điều nàydẫn đến việc kháng thuốc kháng sinh Hiện nay, đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩnkháng thuốc kháng sinh “Kháng với thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ ba, xảy ra

ở Áo, Úc, Canada, Pháp, Nhật Bản, Na Uy, Slovenia, Nam Phi, Thụy Điển và Vươngquốc Anh Thuốc kháng sinh cephalosporin không còn hiệu nghiệm trong việc điều trịbệnh lậu trong khi mỗi ngày trên thế giới có hơn 1 triệu người nhiễm bệnh lậu ;”( Nguyễn Thị Hồng Mến, 2015) “Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae một trong những nguyên nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp khángpenicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong

số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP)năm 20002001.” ( TS Nguyễn Văn Kính, 2010) Điều này đặt ra gánh nặng về kinh

tế trong điều trị bệnh khi thay thế bằng các loại

kháng sinh mới đắt tiền hơn hoặc không có kháng sinh thích hợp trong điều tri bệnh.

Trước thực trạng kháng thuốc kháng sinh hiện nay đã có nhiều hướng nghiêncứu được tiến hành Trong đó, bắt nguồn từ việc phát hiện ra các hợp chất kháng sinh

có nguồn gốc tự nhiên Cây thuốc từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y họcphương Đông và ở Việt Nam “Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọchoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đạihành, lá Móng tay,… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn,chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản

và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác” (Liên Hồng,CTQ25,2016) Với khả năng khángsinh, đặc biệt là ít gây ra các tai biến có hại như các loại thuốc kháng sinh tổng hợptrong qua trình điều trị và nhiều ưu điểm khác

Nắm được vấn đề đó, chúng tôi đã áp dụng tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết ethanol 70% từ môṭsốloaịthực vật tại vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cây thuốc dân gian với dung môi là ethanol 70%

- Xác định thành phần hoá học có trong một số loại cao chết ethanol 70% từ các cây thuốc dân gian

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của dung môi ethanol 70% đến hiệu suất thu hồi từ các cây thuốc dân gian

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% của các cây thuốc dân gian

- Xác định thành phần hoá học của cao chiết ethanol 70% của một số loại cây thuốc dân gian

4 Phạm vi nghiên cứu

Tiến hành thử nghiệm và khảo sát trên một số cây thuốc dân gian

5 Nội dung Đồ án tốt nghiệp

Nội dung của Đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương:

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu

1.1.1 Vai trò của cây thuốc trong đời sống

Từ hơn 3000 năm trước, ông cha ta đã biết đến nguồn dược liệu phong phú, từđộng vật, thực vật đến khoáng vật trong khắp đất nước Trong đó, phải kể đến cácloại dược liệu có nguồn gốc từ thực vật Qua thời gian, cây thuốc dần có vai trò quantrọng trong đời sống của nhân dân Từ các gia vị như gừng, tỏi, như một gia vị trongbếp, đã được sử dụng để trị các chứng bệnh thường gặp như hạ sốt, đầy hơi khó tiêu,hay sử dụng lá tía tô kèm cháo trắng có tác dụng giải cảm…” Gừng tươi, lá tía tôcùng một số thảo dược khác rất có ích cho người bị ảnh hưởng của khí phong hàn(gió và lạnh), mắc một số bệnh mùa lạnh như: Cảm lạnh, ho, lạnh bụng, tiêu chảy,hoặc đau nhức xương khớp do phong hàn thấp.” (Huỳnh Châu,2014).“Cây vẩy ốcchữa phong thấp, kiết lị, quả chín bổ thận; cây mảnh trấu chữa u xơ tiền liệt tuyến;cây hẹ có tác dụng cầm máu, ăn thay rau thơm có tác dụng bổ dương”(Minh Hường,2015)

Với kinh nghiệm, kiến thức thu thập được qua nhiều thế hệ Các bài thuốc từcây thuốc ngày càng trở nên đa dạng và phong phú, góp phần vào kho tàng y học tolớn của dân tộc.

1.1.2 Lợi ích sử dụng cây thuốc

Ngày nay, các cây thuốc có giá trị to lớn đối y học dân tộc cũng như đời sốngnhân dân Các cây thuốc thường là những cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện khí hậuViệt Nam Việc chữa bệnh bằng các cây thuốc tuy chậm hơn các loại thuốc khángsinh tổng hợp nhưng mang lại hiệu quả tốt hơn, không xuất hiện các tác dụng phụ.Bên cạnh đó, có thể sử dụng lâu dài các loại cây thuốc như một thực phẩm hỗ trợ vàkhông gây hại cho cơ thể con người Có thể sử dụng như nước giải khát: nước tràgừng, nước lô hội, nước lá vối… “Lá vối có tác dụng kiện tỳ, giúp ăn ngon, tiêu hoátốt Mỗi khi ăn một bữa có nhiều thịt, mỡ, người ta thường nấu một nồi nước vối thậtđặc để uống cả ngày Chất đắng trong vối sẽ kích thích tiết nhiều dịch tiêu hóa, chấttanin bảo vệ niêm mạc ruột, còn chất tinh dầu có tính kháng khuẩn nhưng không hại

vi khuẩn có ích trong ruột.” (Trần Thị Hải, 2015)

1.1.3 Tình hình sử dụng cây thuốc

Việt Nam là một nước nhiệt đới, có diện tích rừng bao phủ trải dài khắp cảnước Điều này tạo điều kiện cho thuận lợi cho các cây thuốc phát triển đa dạng vàphong phú.”Ở nước ta có 3.948 loài cây thuốc thuộc 307 họ của 9 ngành thực vật bậccao cũng như bậc thấp (kể cả nấm), cũng theo kết quả điều ta này, trong số 3.948 loàicây thuốc đã biết ở trên, phần lớn loài là được ghi nhận từ kinh nghiệm sử dụng cảucồng đồng các dân tộc khắp các địa phương”.(Viện Dược LiệuBộ Y tế, 2004) “ViệtNam có hơn 12.000 loài thực vật thì có gần 4.000 loài thức vật cho công dụng làmthuốc, vùng phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loàiquý và hiếm trên thế giới, như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Báchhợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạcVĩnh Phú…” (Nguồn: Minh Tuấn, 2014.) Tuy nhiên việc chặt phá rừng bừa bãi vàkhai thác tràn lan đang làm cho nhiều loại cây thuốc tuyệt chủng.” Việc khai thácdược liệu quá mức mà không đi đôi với việc tái tạo, bảo tồn

dược liệu đã dẫn đến số lượng loài cây dược liệu có khả năng khai thác tự nhiên cònrất ít (trên cả nước hiện chỉ còn khoảng 206 loài cây dược liệu có giá trị có thể khaithác tự nhiên), nhiều loài cây dược liệu quý hiếm trong nước đang đứng trước nguy

cơ cạn kiệt” (Minh Tuấn 2014) Để không lãng phí nguồn tài nguyên quý báu đó,chúng ta cần phải nhanh chóng có những biện pháp nghiên cứu để bảo tồn và pháttriển giá trị của các cây thuốc Đưa cây thuốc, kinh nghiệm dân gian vào nghiên cứu,

áp dụng với khoa học công nghệ hiện đại để phục vụ sức khoẻ và đời sống con người

Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhấttrong bốn nhóm phân tử sinh học chính Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ởthành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ

Một số trường hợp ngoại lệ tồn tại, ví dụ: deoxyribose, một thành phần đườngDNA, có công thức C5H10O4 (John M Coulter, C R Barrnes, H C Cowles, 1930).Carbohydrate có thể chia thành 4 nhóm:

1.2.1.2 Tính chất

Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh

để tạo glycogen Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt Ở thực vật, carbohydratechiếm khoảng 75% khối lượng, nằm trong hầu hết các bộ phận như: củ, quả, lá, thân,

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate

1.2.1.3 Vai trò

- Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật.

1.2.3.2 Tính chất

Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như

yếu như caffein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phảnứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản ứngacid yếu như arecaidin, guvacin.

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằngnhững kiềm trung bình và mạnh như: NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH

Khi định lượng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức

1.2.3.3 Vai trò

- Tác động lên hệ thần kinh trung ương: morphin, codein, strychnin, cafein

1.2.4 Glycosides

1.2.4.1 Khái niệm

Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợpchất này gồm hai thành phần – phần đường và phần không đường Phần đường củaglycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin

Glycosides là những sản phẩm ngưng tụ của đường

Bảng 1.1 Một số Glycosides phổ biến

Solamin Cà chua xanh, cà Vị đắng Khi vào cơ thể bị thuỷ phân tạo(C45H17O15) tím, khoai tây HCN rất độc

Amygdadin Hạt mơ, hạt hạnh Vị đắng Trong cơ thể người bị thuỷ phân(C20H27O11) nhân đắng, mận tạo HCN rất độc

1.2.4.2 Tính chất

Glycoside là dạng tinh thể không màu

Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậyphân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men)

có chứa trong cây

Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid,thường là glucose, rhamnose, galactose Trong thành phần của một số glycoside cóđường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong glycosid tim)

Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau ví

dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen…đôi khi có các aglycon có chứanitơ, lưu huỳnh song thường chứa cacbon, hydro, oxy

Do đặc tính dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiêncứu cấu trúc thường gặp nhiều khó khăn

Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tácdụng của chúng

1.2.6.3 Vai trò

- Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu

- Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Katie E Ferrell và Thorington và Richard W, 2006)

1.2.7 Isoprenoid (Terpene)

1.2.7.1 Khái niệm

Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng Bộ khung carbon được tạo thành

từ đơn vị cơ bản isopreneC5H8 Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn xuất củachúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen

Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúngthành các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen,polyterpen Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid Nó có cấu trúcmạch hở, mạch vòng.

Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảomộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh

Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoids đadạng của các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụngtrong các chất phụ gia thực phẩm Vitamin A là một terpene (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.3 Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật

1.3.2 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn

Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật cókhả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bằng cách tác động ở mức

khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng, thường có tác dụng đặc hiệuvới một nồng độ rất nhỏ.

Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid, flavonoid,tanin và một số loại tinh dầu

1.3.3 Cơ chế kháng khuẩn

Hình 1.9 Một số cơ chế kháng sinh

Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: vách tế bào của vi khuẩn

(đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp peptidoglycan,phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases Các kháng sinh nhóm

b – actamin gắn chọn lọc vào các transpeptidases này làm cho vách tế bào của vi

khuẩn bị tan rã khiến chúng bị tiêu diệt

Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): kháng sinh gắn

lên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm chọn lọc khiến một số chất cần thiết cho vikhuẩn (nucleotid, pyrimidin, purin ) lọt ra ngoài, làm tổn hại và chết vị khuẩn Cáckháng sinh nhóm Polymycin, aminosid

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với

receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác.Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cảnquá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm refampin

gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNAthông tin) Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho haimạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnhtranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid Nhóm trimethoprim tácđộng vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acidnucleic (Amoros, M., F Sauvager, L Girre và M Cormier, 1992)

Cạnh tranh đối kháng: đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit Acid folic giữ

vai trò cần thiết trong quá trình tổng hợp acid nucleic Để tổng hợp ra acid folic, một

số vi khuẩn phải sử dụng acid paraminobenzoic (PAB) có trong môi trường.Sunfonamit có cấu trúc hoá học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫnđến ngừng tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn

Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan

trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

Hình 1.10 Solamargine

Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella spp, tụ cầu khuẩn,

nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn axit Ngoài ra có còn chốnglại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh Berberine khángkhuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét Cơ chế kháng khuẩn Berberine là dokhả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn Đặc biệt khi dùng berberin điều trị cácnhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vikhuẩn có ích ở ruột Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một sốthuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởicác thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột

Hình 1.11 Berberine

1.3.4.2 Terpenoids và tinh dầu

Các loại terpenoids tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả nănghòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic Phá vỡ vách tếbào Terpenenes và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và độngvật nguyên sinh

Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khảnăng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn Các acid betulinictriterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được HIV

Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện

trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogenes.

Hình 1.12. Một số Terpenenes và Terpenoid

1.3.4.3 Phenol đơn và acid phenolic

Phenolics được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp chấtoxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương táckhông đặc hiệu của các chất này với protein

 Quinones

Quinones có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhântrong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein Vì lí do đó, khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn

Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành

tế bào và các enzyme trên màng

Hình 1.13 Một số Quinones thông thường

Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các proteinchức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin

 Flavonoid

Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phứcvới thành tế bào vi khuẩn Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tếbào vi sinh vật Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩnkhi có mặt glucose Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tốđảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng hợpaxit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vikhuẩn

Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae

Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn

Hình 1.16 Saponin 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

Phần lớn các vi khuẩn E.coli không ảnh hưởng đáng kể dến sức khoẻ trừ một số

có thể gây bệnh tiêu chảy và tuỳ và từng địa phương, tuỳ và độ tuổi mà ảnh hưởngcủa vi khuẩn này cũng khác nhau

Hình 1.17. Hình ảnh Escherichia coli O15:H7 dưới kính hiển vi

 Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli

tiểu chảy ra máu

- EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột.

- EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở trẻ

em, cơ chế gây bệnh chưa rõ

- EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào.

- EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột (Cao

Minh Nga, 2014)

1.4.2.2 Shigella spp.

Shigella spp là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký

sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trườngnhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose vàchuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Shigella spp gây bệnh ở động vật sinh trưởng, nhưng không gây bệnh ở động vật có vú khác Nó chỉ được tìm thấy tự nhiên trong cơ thể người và khỉ đột Shigella spp là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Ước

tính mỗi năm có từ 80165,000,000 trường hợp nhiễm bệnh và 600,000 ca tử vong

Hình 1.18. Ảnh chụp của Shigella sp trong một mẫu phân

 Khả năng gây bệnh của một số Shigella spp.: Gây bệnh lỵ trực trùng, có

4 nhóm:

- Nhóm A: S dysenteriae: tiết độc tố shiga, là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh kiết

lị ở những nơi tập trung các trại tị nạn trên thế giới

- Nhóm B: S flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga like toxin), là chủng phổ biến

nhất thế giới, gây 60% ca bệnh ở các nước đang phát triển

- Nhóm D: S sonnei: tiết độc tố giống shiga, là nguyên nhân gây ra 77% số ca

bệnh kiết lị ở các nước đang phát triển

Nhóm A – C về mặt sinh lý tương tự nhau S.sonnei có thể khác biệt trên cơ sở

xét nghiệm chuyển hoá sinh hoá

1.4.2.3 Salmonella spp

Salmonella spp là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, sống ký sinh ở

đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhântạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyểnhoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính

Salmonella spp, được tìm thấy trên toàn thế giới và có cả trong động vật máu nóng , động vật máu lạnh và ngoài môi trường Các chủng vi khuản Salmonella spp

gây ra các bệnh như thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu và ngộ độc thựcphẩm

Hình 1.19. Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium

 Khả năng gây bệnh của một số Salmonella

- S choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp xe khu trú ở các cơ quan nội tạng

1.4.2.4 Vibrio spp.

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và

catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate

Hình 1.20. Hình ảnh Vibrio cholerae và Vibrio harveyi

Một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác nhân gây bệnh Hầu hết các chủng

gây bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết

thương hở và gây nhiễm trùng huyết Tiêu biểu như Vibrio alginolyticus gây nhiễm trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc V cholera là tác nhân gây bệnh tả V harveyi là một tác nhân gây bệnh của một số loài động vật thủy sinh Vibrio parahaemolyticus ăn phải vi khuẩn có trong hải sản sống

hoặc nấu chưa chín, thường là hàu, là nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính,

nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản gây ra.

1.4.2.5 Listeria spp.

Listeria spp là một vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử.

Có thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, tráicây, thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến

1.4.3 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

1.4.3.1 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiềumôi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Trong số những

loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ

sinh học

Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có

bào tử Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng,không quang hợp hoặc cố định nitrogen

Pseudomonas là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và

con người Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ thể,nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người

bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây

ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiếtyếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử vong cao; bởi vì

thể Bên cạnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồmcatheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch Đây cũng là nguyên nhângây ra viêm chân lông.

1.4.3.2 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi.

Hình 1.23. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus S.aureus có rải rác trong tự nhiên như đất, nước, không khí, đặc biệt người là

nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu ở vùng mũi họng ( chiếm khoảng 30%),nách, mụn dưới da, các vùng da trầy xướt và tầng sinh môn Tỷ lệ mang vi khuẩn caohơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, người bị bệnh tiểu đường type 1, ngườinhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính

Trong đa số trường hợp, tụ cầu khuẩn không gây ra vấn đề gì, hoặc chỉnhiễm khuẩn nhẹ như nổi mụn hay bóng nước, nhưng trong một số trường hợp, tụ cầu

khuẩn có thể nghiêm trọng hơn Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông thường

nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu Nó là một phần của hệ vi sinh vật sốngthường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da (Ogston A, 1984)

1.4.3.3 Enterococcus feacalis

Enterococcus feacalis: Gram dương, lên men glucose, sinh acid làm giảm pH

môi trường Không tạo độc tố, không tạo ra một phản ứng catalase với hydrogenperoxide Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase nếu trên môi trường thạchmáu

Hình 1.24. Hình ảnh Enterococcus feacalis

E faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng

đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm: phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học Thực phẩm Môitrường, trường Đại học Công nghệ TpHCM

2.1.2 Thời gian

Tháng 11/2015 đến tháng 6/2016

2.2 Vật liệu

2.2.1 Nguồn mẫu phân tích

Các mẫu cao chiết từ các mẫu cây được lựa chọn từ các đề tài khảo sát trướcđây và từ kinh nghiệm dân gian Các mẫu cao chiết ethanol 70% được lựa từ mẫu câythuốc dân gian thu tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng Đây là nhữngmẫu cây thuốc có khả năng điều trị một số bệnh tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu

về các mẫu cây thuốc này Có 6 mẫu cây thuốc được lựa chọn trong thí nghiệm lầnnày, bao gồm :