Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trọng xử lyus nước thải hữu cơ​

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phânloại một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza phân lập từ nước thải sau hầm biogas.. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học củ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

THẢI HỮU CƠ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thế Trang

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Đà, Phạm Thị

Thu Phương, Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thúy Nga, Lê QuangSáng, Phạm Văn Duy (2014) Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phânloại một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza

phân lập từ nước thải sau hầm biogas Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30,6S.

2. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thúy Nga, Phạm Văn

Duy (2014) Ứng dụng một số chủng vi khuẩn xử lý nước thải giàu

hữu cơ sau hầm biogas, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội thảo khoa học quốc tế “Năng lượng và tăng trưởng xanh khu vực ASEAN”, Hà Nội 2014 Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ.

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của các nhà máy chế biến nông sản (đồ hộp từ dứa, dưa chuột bao tử, cà chua, ngô ngọt ) một vấn đề đang làm bức xúc các nhà sản xuất đó là: nước thải, phế thải từ các quá trình chế biến Chất thải của các nhà máy chế biến đồ hộp rau quả có hàm lượng các chất hữu cơ rất cao (các loại đường đơn, axit hữu cơ, protein, xenluloza …), đây là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật sinh trưởng Sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong môi trường nước thải giàu hữu cơ từ nông sản khi không có sự kiểm soát của con người thường tạo ra các sản phẩm có mùi hôi thối tác động xấu tới môi trường sinh thái Do vậy, các chất thải cần phải được xử lý trước khi thải ra môi trường tự nhiên Có nhiều phương pháp xử lý nước thải hữu cơ khác nhau như: Phương pháp cơ học, hóa học, hóa lý và sinh học Đối với nước thải hữu cơ thì phương pháp xử lý sinh học sẽ có hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường hơn, có nhiều ưu điểm cả về hiệu quả kinh tếvà kỹ thuật Trong các nghiên cứu xử lý nước thải thì việc dùng biện pháp sinh học đang là ưu tiên hàng đầu Viêcc̣ phân hủy chất hữu cơ dưạ trên các vi sinh vâṭtư c̣ nhiên cósẵn trong nước thải còn găpc̣ nhiều haṇ ch ế như thời gian phân hủy lâu, quá trình phân hủy chưa triêṭđể Do đó, cần tuyển choṇ những chủng vi sinh vật (VSV) thích hợp bổ sung vào bên cạnh những VSV có sẵn để có thế giúp cho quá trình xử

lý đạt kết quả tốt hơn [1] Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý nước thải hữu cơ” được thực hiện là cần thiết.

PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.1.1 Tình hình nghiên cứu xử lý nước thải hữu cơ trên thế giới

Sự phát triển của phương pháp thứ cấp để xử lý nước thải trong những nămđầu thế kỷ XX được cho là cải tiến đáng kể nhất đối với y tế công cộng và môitrường trong suốt thời gian này, đó là việc phát minh ra "bùn hoạt tính" cho quytrình xử lý nước thải Gilbert Fowler và cộng sự tại Đại học Manchester được tiếnhành tại Trạm Thí nghiệm Lawrence ở Massachusetts liên quan đến việc sục khí vàonước thải trong bình đã được phủ một lớp tảo Các đồng nghiệp của Fowler, EdwardArdern và William Lockett, những người đã triển khai nghiên cứu cùng với Vănphòng công ty đường sông Manchester ở công trình xử lý nước thải Davyhulme

Thí nghiệm trên được thực hiện trong một lò phản ứng bằng cách hút ra và thu vào,việc xử lý cho hiệu quả cao hơn Họ sục khí liên tục cho nước thải trong khoảngmột tháng và kết quả đạt được là nitrat hóa hoàn toàn các nguyên liệu mẫu Điều đóchỉ ra rằng bùn đã hoạt hóa các chất (một cách tương tự như than hoạt tính) quátrình được đặt tên là bùn hoạt tính Kết quả đã được công bố trong công trình tại Hộithảo 1914, và lần đầu tiên một hệ thống quy mô đầy đủ với dòng chảy liên tục đượclắp đặt tại Worcester hai năm sau đó Do hậu quả của chiến tranh thế giới thứ nhấtphương pháp xử lý mới được truyền bá nhanh chóng, đặc biệt là Hoa Kỳ, ĐanMạch, Đức và Canada [26] Vào cuối những năm 1930, việc xử lý nước thải bằngbùn hoạt tính là quá trình chủ yếu được sử dụng trên toàn thế giới Trong

bùn hoạt tính có nhiều chi vi sinh vật khác nhau : Actinomyces, Arthrobacer, Bacillus, Bacterium, Corynebacterium, Desulfotomacillium, Micrococcus, Pseudomonas, Sarcina … Chúng oxy hóa rượu , axit béo, paraffin, hydrocacbon và

các hợp chất khác

Ở Mỹ, hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 ÷

85 mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 ÷ 35 mg/l, hàm lượng

NH3 từ 12 ÷ 50 mg/l Hàm lượng photphat trong nguồn nước không ô nhiễm nhỏhơn 0,01 mg/l Theo quy định của Hà Lan, tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng

photphate trong nước uống không được vượt quá 6 mg/l Theo tiêu chuẩn của cộngđồng chung châu Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphat không được vượtquá 2,18 mg/l [4].

Xử lý nước thải của quá trình chế biến rau quả các nhà khoa học Thái Lan đã

sử dụng chủng nấm men Candida utilis CBS1517 có khả năng đồng hóa tốt các loại

đường và axit hữu cơ có nhiều trong thành phần nước thải, kết quả thu được cho thấy sau 96 giờ xử lý trong điều kiện phòng thí nghiệm là COD giảm 89,9 % và pH tăng từ 3,5 lên 8,5 [36] Môṭsốkết quảnghiên cứu xử lýnước thải chăn nuôi lơṇ bằng

quátrinh̀ SBR hoăcc̣ tương tư c̣ đươcc̣ tổng hơpc̣ : Trong nghiên cứu của Bortone

G. (1992) hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR cấp nước một lần đạt khácao, tương ứng là khoảng 93 % và 88 ÷ 93 % Tải trọng COD và T-N cũng đạt caolần lượt là 0,37 kg/(m3.ngày) và 0,13 kg/(m3.ngày) [28] Nghiên cứu của ChangWon Kim (2000) hiệu quả xử lý COD ở chế độ cấp nước một lần đạt 57 ÷ 87 % Tảitrọng COD và T-N lần lượt là 1,0 kg/(m3.ngày) và 0,2 kg/(m3.ngày) [29] Quá trìnhsục khí luân phiên cấp nước liên tục trong nghiên c ứu của Jiang Cheng (2011) chohiệu quả xử lý khá cao, của COD là 57 %, T-N là 91 % [31] Nghiên cứu củaMohammad N (2011) với quá trình SBR cấp nước một lần cho hiệu quả xử lý COD

và T-N lần lượt là 80,3 % và 61 % [34] Trong nghiên cứu của Zang và đồng tác giả(2006) cho hiệu quả xử lý cao hơn cả, đối với cả COD và T-N tương ứng là 96,3 %

và 97,5 %; tải trọng COD và T-N cũng đạt rất cao lần lượt là 2,1 kg/(m3.ngày) và0,28 kg/(m3.ngày), nước thải trong nghiên cứu này có COD và tỉ lệ COD/T-N rấtcao và các tác giả đã đưa thêm các giai đoạn kỵ khí vào trước và giữa các giai đoạnthiếu khí/hiếu khí, do đó đã nâng cao được tải trọng xử lý COD Mặt khác, các tácgiả đã thực nghiệm ở thời gian lưu tương đối lớn, tỉ lệ COD/T-N và tỉ lệ lưu nước(n=9) rất cao, vì vậy cũng đã nâng cao được hiệu suất xử lý T-N [38]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu xử lý nước thải hữu cơ ở Việt Nam

Xử lý nước thải hiện nay luôn là vấn đề thời sự nóng bỏng và nổi cộm ở ViệtNam hiện nay, theo dự báo của Tổ chức Kinh tế thế giới thì Việt Nam sẽ là mộttrong những nước có tốc độ phát triển kinh tế vào loại nhanh trên thế giới với tốc độtăng trưởng được dự báo là 7 % trong thập kỷ tới Tuy nhiên, việc tăng trưởng kinh

tế một cách nhanh chóng và mạnh mẽ cũng đồng thời tạo nên những thách thức áplực tác động về mặt môi trường, trong đó, tác động của chất thải rắn và nước thảiđang là vấn đề nổi cộm ở Việt Nam.

Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ởViệt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới Theo báo cáo môi trường Quốc gianăm 2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễmmôi trường nước mặt ở tất cả các chỉ số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theoQCVN 40:2011/BTNMT Các chỉ số COD, BOD đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 ÷ 10lần Hàm lượng NH4+ trong môi trường nước mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sôngCầu đều vượt quy chuẩn cho phép QCVN 40:2011/BTNMT cho nước mặt phù hợpvới việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là là 0,2 mg/l [17]

Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồnnước Hàm lượng nitơ tổng số nước thải chăn nuôi nằm trong khoảng từ 512 ÷ 594mg/l, trong đó NH3 từ 304 ÷ 471 mg/l, hàm lượng photpho tổng số từ 13,8 ÷ 62mg/l [6] Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày mộtgia tăng, nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớnđến đời sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nướcngầm quanh khu vực Tổng hàm lượng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trongkhoảng từ 200 ÷ 2000 mg/l, hàm lượng amoni cao, trung bình 200 mg/l, trong khi

đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l [11]

Với xu hướng hội nhập nền kinh tế quốc tế, đặc biệt từ khi Việt Nam gianhập WTO, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của quá trình công nghiệp hoá đấtnước, chất thải công nghiệp cũng đang ngày một gia tăng về khối lượng, đa dạng vềchủng loại và đang là vấn đề cấp bách của xã hội, đòi hỏi phải có nhận thức đúngđắn và đầu tư thích đáng cho vấn đề xử lý nước thải Hiện nay công nghệ xử lýnước thải bị ô nhiễm các hợp chất hữu cơ trên thế giới và Việt Nam chủ yếu là sửdụng các biện pháp sinh học, trong đó phương pháp xử lý hiếu khí và xử lý kị khí làphổ biến nhất, với nguồn nước thải có mức độ ô nhiễm cao thông thường người ta

xử lý kết hợp kị khí và hiếu khí Kết quả nghiên cứu của Vũ Thúy Nga và các cộng

sự cho thấy có thể cải thiện chất lượng nước thải chế biến tinh bột sắn bằng chế

phẩm vi sinh vật Để nhằm khắc phục tình trạng ô nhiễm do nước thải chế biến tinhbột sắn, công trình nghiên cứu tập trung tuyển chọn bộ giống vi sinh vật có hoạt tínhsinh học cao, sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để nâng cao hiệu quả xử lýnước thải sau biogas của nhà máy chế biến tinh bột sắn Kết quả nghiên cứu đã

tuyển chọn được 3 chủng vi sinh vật gồm Bacillus velezensis, Streptomyces fradiae

và Nitromonas sp có khả năng chuyển hóa tốt hợp chất hữu cơ trong nước thải chế

biến tinh bột sắn [15] Nghiên cứu về ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly-photphattrong xử lý nước thải của Lê Quang Khôi và các cộng sự cho thấy các dòng vikhuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn có hiệu suất loại bỏ photphat hòa tan cao

Hai dòng vi khuẩn Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp.TGT025L

có hiệu quả loại bỏ PO43- cao nhất trong môi trường tổng hợp sau 25 giờ thínghiệm Sự loại bỏ PO43- được thực hiện bởi hoạt động của gen ppk 1 dạng IIA

trong quá trình chuyển hóa photphat thành dạng poly-P tích lũy trong tế bào Kếtquả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-Ptrên để xử lý photpho hòa tan trong nước thải chăn nuôi [14]

Với mục đích nghiên cứu phát triển công nghệ xử lý hiệu quả đồng thời hữu

cơ và chất dinh dưỡng trong nước thải ngành chăn nuôi lợn, trong nghiên cứu củaPhạm Thị Hải Thịnh và đồng tác giả, đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điềukiện vận hành như tỷ lệ COD/T-N (tỉ lệ giữa nhu cầu oxy hóa học và tổng nitơ) vàchế độ sục khí đến hiệu quả xử lý COD và T-N của quá trình SBR đối với nước thảichăn nuôi đã qua xử lý kị khí Với chế độ hai chu trình thiếu - hiếu khí thích hợp,hiệu quả xử lý COD và T-N đạt khá cao, tương ứng là khoảng 90 % và 80 ÷ 85 %[12] Tuy nhiên nồng độ T-N trong nước thải chăn nuôi lợn là rất cao và thay đổitrong khoảng khá rộng, vì vậy nghiên cứu nâng cao hiệu quả xử lý nitơ của quátrình nhằm đáp ứng một cách ổn định các quy chuẩn xả thải là rất cần thiết TheoPhan Đỗ Hùng và cộng sự cho thấy ảnh hưởng của tỉ lệ cấp nước thải đến hiệu quả

xử lý của quá trình SBR hai chu trình thiếu - hiếu khí cấp nước hai lần và so sánhvới chế độ cấp nước một lần Với quá trình SBR hai chu trình thiếu-hiếu khí, cấpnước hai lần là một giải pháp để nâng cao hiệu quả xử lý T-N của quá trình Thựcnghiệm cho thấy, khi tăng tỉ lệ cấp nước (tỉ lệ giữa lượng nước thải cấp lần thứ nhất

và tổng lượng nước thải xử lý trong một mẻ), lúc đầu hiệu suất xử lý T-N sẽ tăng,tuy nhiên đến một giới hạn nhất định hiệu suất xử lý T-N sẽ giảm trở lại Hiệu suất

xử lý T-N ở cả ba tỉ lệ cấp nước nghiên cứu đều khá cao, trong đó ở tỉ lệ 2/3 đạt caonhất, trong khoảng 85 ÷ 90 % Hiệu suất xử lý T-N thực nghiệm ở các tỉ lệ cấpnước thấp 1/2 và 2/3 khá phù hợp với hiệu suất lý thuyết Hiệu suất xử lý COD ởchế độ cấp nước hai lần cũng khá cao, 85 ÷ 90 % ở tỉ lệ cấp nước 2/3, xấp xỉ vớitrường hợp cấp nước một lần [5]

1.2 THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA NƯỚC THẢI HỮU CƠ

1.2.1 Xenluloza trong nước thải

Trong nước thải hữu cơ hàm lượng chiếm xenluloza là thành phần chủ yếucủa các tổ chức thực vật Trong xác thực vật (nhất là trong thân và rễ) thành phầnhữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất bao giờ cũng là xenluloza Hàm lượng xenluloza trongthực vật thường thay đổi trong khoảng 30 ÷ 80 % (tính theo trọng lượng khô), trongsợi bông hàm lượng này thường vượt trên 90 % [30]

Xenluloza là polysaccarit rất bền vững, được cấu tạo bởi rất nhiều gốcanhydroglucoza, liên kết với nhau nhờ dây nối β-1,4-glucozit Mỗi phân tửxenluloza thường chứa từ 1.400 đến 10.000 gốc glucoza Khối lượng phân tửxenluloza rất khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực vật (ở bông 150.000 ÷1.000.000, ở sợi gai lên tới 1.840.000) Trên mỗi chuỗi glucan đơn vị lặp lại không

phải là glucoza mà là xenlobioza Mỗi phân tử glucoza có dạng “ghế bành”, phân tử

này quay 180o so với phân tử và vị trí β của các nhóm hydroxyl đều ở mặt phẳngnằm ngang của phân tử

Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song, các phân tử và các chuỗi xenlulozagắn với nhau nhờ mạng lưới liên kết hydro, còn các lớp gắn với nhau nhờ lực Van-der-Van Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn

vị sợi nhỏ nhất có đường kính khoảng 3 nm Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi cóđường kính từ 10 ÷ 40 nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sátdưới kính hiển vi quang học Toàn bộ lớp sợi này có một lớp vỏ hemixenluloza vàlignin rắn chắc bao bọc bên ngoài Phân tử xenluloza có cấu trúc không đồng nhất

gồm hai vùng: Vùng kết tinh có trật tự cao, rất bền vững và vùng vô định hình kémtrật tự và bền vững hơn Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, cònvùng kết tinh mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này Xenluloza cócấu trúc đặc, bền chắc cùng với sự có mặt của lớp vỏ hemixenlulo-lignin khiến cho

sự xâm nhập của enzym vào cấu trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kỵ nước củachuỗi β-1-4-glucan, làm cản trở tốc độ của phản ứng thủy phân

Xenluloza là hợp chất cacbon chiếm tỷ lệ trọng lớn nhất (50 %) trong tổng sốhydratcacbon tự nhiên và là thành phần hữu cơ chủ yếu của rác, trong giấy, gỗ, thâncây, cành cây, lá cây, rơm rạ, sợi đay, vải bông, vv…

Hình 1.1 Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza [30]

Mầu nâu - cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro

Xenluloza có cấu trúc rất bền vững Không tan trong nước, không bị tiêu hóatrong đường tiêu hóa của người và động vật Trong dạ dày của động vật nhai lại vàtrong đất có nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải được xenluloza

1.2.2 Hemixenluloza trong nước thải

Trong tế bào thực vật hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng Trongthành phần của hemixenluloza có nhiều loại đường khác nhau, chính vì vậy tên củachúng thường được gọi theo tên của một loại đường chủ yếu nào đó có trong thànhphần của chúng Khối lượng phân tử của hemixenluloza nhỏ hơn rất nhiều so vớixenluloza, thường chúng chỉ có khoảng 150 gốc đường Các gốc đường đơn nàyđược nối với nhau bằng các liên kết β-1-4, β-1-3, β-1-6 glucozit Các hemixenlulozathường tạo mạch ngắn và phân nhánh, so với xenlulo thì hemixenluloza có cấu trúckhông chặt chẽ dễ bị phân giải bởi axit yếu và kiềm yếu, đôi khi còn bị phân giảitrong nước nóng [30]

1.2.3 Protein trong nước thải

Protein là hợp chất cao phân tử chứa nitơ (15 ÷ 17 % tính theo trọng lượngkhô) Protein là thành phần quan trọng của cơ thể động, thực vật Sự phân giảiprotein trải qua các quá trình thuỷ phân protein thành các polypeptit, sau đó là cácaxit amin, tiếp theo là các quá trình amon hoá, nitrat hoá và phản nitrat hoá Quátrình amon hoá là quá trình chuyển hoá các hợp chất nitơ hữu cơ thành nitơ dạngkhoáng Quá trình nitrat hoá là quá trình chuyển hoá các chất ammoniac ban đầuthành axit nitơ sau đó thành axit nitric Quá trình khử nitrat thành nitơ gọi là phảnnitrat hoá[ 16]

1.2.4 Tinh bột trong nước thải

Tinh bột là một cacbonhyđrat cao phân tử bao gồm các đơn vị D-glucoza nốivới nhau bởi liên kết α-glucozit Công thức phân tử gần đúng là (C6H10O5)n trong

đó n có giá trị từ vài trăm đến khoảng mười nghìn Tinh bột có dạng hạt màu trắngtạo bởi hai loại polyme là amiloza và amilopectin Amiloza là polime mạch thẳnggồm các đơn vị D-glucoza liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucozit Amilopectin

là polime mạch nhánh, ngoài chuỗi glucoza thông thường còn có những chuỗinhánh liên kết với chuỗi chính bằng liên kết α-1,6-glucozit

Trong tự nhiên, tinh bột là thành phần chủ yếu của các loại ngũ cốc, củ, quả.Hàm lượng tinh bột có trong hạt và củ là 40 ÷ 70 %, trong các phần khác của cây là

4 ÷ 25 % Chúng đóng vai trò là nguồn dự trữ năng lượng cho quá trình nảy mầmcủa hạt, và là nguồn lương thực chủ yếu của con người Enzym thủy phân tinh bộtphân hủy chủ yếu liên kết α-glucozit Nhóm enzym này gồm các enzym: α-amylaza,β-amylaza, glucoamylaza, dextrinaza [16]

1.2.5 Một số vi sinh vật gây bệnh khác trong nước thải

Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong nước thải: Salmonella spp., một vài loài Salmonella có thể hiện hiện trong nước thải đô thị, kể cả S typhi (gây bệnh thương hàn) Doran và cộng sự cho rằng số lượng 700 Salmonella/l; khoảng chừng

đó Shigellae và khoảng 1.000 Vibrio cholera/l thường phát hiện trong nước thải đô thị của khu vực nhiệt đới Shigellae và Vibrio cholera nhanh chóng chết đi khi thải

ra môi trường Do đó nếu chúng ta sử dụng một biện pháp xử lý nào đó để loại được

Salmonella thì cũng có thể bảo đảm là phần lớn các vi khuẩn kia đã bị tiêu diệt Enteroviruses: Có thể gây các bệnh nguy hiểm như sởi, viêm màng não Số lượng

của chúng tương đối thấp hơn enteroviruses Người ta đã chứng minh được rằngviệc loại bỏ các loài vi rút có quan hệ mật thiết với việc loại bỏ các chất rắn lơ lửng.Ngoài vi sinh vật gây bệnh còn có một số ký sinh trùng: thường thì các bệnh ký sinh

trùng chủ yếu là do Ascaris lumbricoides, trứng của loài ký sinh trùng này có kích

thước lớn (45 ÷ 70 µm × 35 ÷ 50 µm)

1.3 VI SINH VẬT PHÂN GIẢI NƯỚC THẢI HỮU CƠ

1.3.1 Vi sinh vật phân giải xenluloza

Xenlulaza đươcc̣ thu từ nhiều nguồn nguyên liêụ khác nhau như đôngc̣ vâṭ (cácnhóm thân mềm, lơṇ, bò, gà); thưcc̣ vâṭ(trong haṭngũcốc nảy mầm làđaịmacḥ , yếnmạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sơị, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn ).Tuy nhiên, vi sinh vâṭlànguồn thu enzym chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đươcc̣ nhiều lần trong năm vàchủđôngc̣ sử dungc̣ nguồn nguyên liêụ rẻtiền để nuôi cũng như dễ dàng điều khiể n cóđinḥ hướng nguồn enzym hoăcc̣ gia tăng lươngc̣enzym Có rất nhiều chủng vi khuẩn , xạ khuẩn , nấm mốc vàmôṭsốloài nấm men

có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza

Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lâñ ki khị́đều cókhảnăng sinh xenlulaza như

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis, Acidothermus

cellulobuticus Ngoài ra còn có các loài ưa kiềm như Cephalosporium sp.RYM-202

[9]

1.3.2 Vi sinh vật phân giải hemixenluloza

Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza Các vi sinhvật có khả năng phân giải xenluloza khi sản sinh ra xenlulaza thường sinh rahemixenlulaza Một số loại vi sinh vật có khả năng phân giải hemixenluloza như:

Bacillus, Aspergillus, Clostridium, Streptomyces

1.3.3 Vi sinh vật phân giải protein

Dưới tác dụng của các vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành cácaxit amin Các axit amin này lại được một số nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3

hoặc NH4+ gọi là nhóm vi khuẩn amin hóa Quá trình này gọi là sự khoáng hóa chấthữu cơ vì qua đó, nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng Dạng NH4+ sẽđược chuyển hóa thành dạng NO3-nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa

Nhóm vi khuẩn nitrat hóa bao gồm bốn chi khác nhau: Nitrosomonas, Nitrozocystic, Nitrozolobus và Nitrosospira, chúng đều thuộc loại dị dưỡng bắt buộc

[3]

1.3.4 Vi sinh vật phân giải tinh bột

Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột, đó là vi khuẩn

Bacillus, Pseudomonas, Athrobacter, Achromobacter, Agrobacterium … Một số vi

sinh vật có khả năng tiết ra các loại enzym trong hệ enzym amylaza Ví dụ như một

số vi nấm bao gồm một số loại trong các chi Aspergillus, Fusarium Xạ khuẩn

cũng có một số chỉ có khả năng phân hủy tinh bột Đa số các vi sinh vật đều không

có khả năng tiết ra một hoặc vài enzym trong hệ đó, chúng chỉ có khả năng tiết ramôi trường [3]

1.4 THÔNG SỐ CƠ BẢN ĐÁNH GIÁ NƯỚC BỊ Ô NHIỄM

Để đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ ô nhiễm của nước nói chungthì có rất nhiều các thông số Tuy nhiên, mỗi loại nước với thành phần các chất cótrong đó mà ta chọn những thông số thích hợp nhất rồi so sánh với tiêu chuẩn chophép về thành phần hóa học và sinh học đối với từng loại nước sử dụng cho các mụcđích khác nhau Các thông số cơ bản để đánh giá chất lượng nước thải hữu cơ là:

pH, độ đục, các chất rắn lơ lửng, oxy hòa tan … Đặc biệt hai chỉ số BOD và COD

có ý nghĩa rất quan trọng Theo QCVN 40:2011/BTNMT - Quy chuẩn kỹ thuật quốcgia về nước thải công nghiệp, một số thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp(bảng 1.1)

Bảng 1.1 Một số thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp [9]

Màu của nước là do:

+ Các chất hữu cơ và phần chết của thực vật gọi là màu thực vật, màu này rấtkhó xử lý được bằng phương pháp đơn giản Ví dụ rong tảo làm nước có màu xanh

+ Các chất vô cơ là những hạt rắn có màu gây ra, màu này có thể xử lý

Có nhiều phương pháp xác định màu của nước, nhưng thường dùng ở đây làphương pháp so màu với các dung dịch chuẩn là Chlophantinat coban Cường độmàu của nước xác định theo phương pháp so màu khi lọc bỏ các chất vẩn đục [16]

 Mùi của nước

Có thể xác định mùi của nước theo phương pháp đơn giản sau: Mẫu nướcchứa trong bình có nắp đậy kín, lắc trong khoảng 10 ÷ 20 giây, sau đó mở nắp, ngửimùi và đánh giá: không mùi, mùi nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng [16]

 Độ pH

pH của nước thải có một ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý Các công trình xử lý nước thải áp dụng các quá trình sinh học làm việc tốt khi pH nằm tronggiới haṇ từ 7 ÷ 7,6 Môi trường thuâṇ lơị nhất đểvi khuẩn phát triển l à môi trường

có pH từ 7 ÷ 8 Các nhóm vi khuẩn khác nhau có giới hạn pH hoạt động khác nhau

Ví dụ vi khuẩn nitrit phát triển thuận lợi nhất với pH từ 4,8 ÷ 8; còn vi khuẩn nitrat

với pH từ 6,5 ÷ 9,3 Vi khuẩn lưu huỳnh cóth ể tồn tại trong môi trường có pH từ 1

÷ 4 Ngoài ra pH còn ảnh hưởng đến quá trình tạo bông cặn của các bể lắng

bằng cách tạo bông cặn bằng phèn nhôm [21]

Nước thải sinh hoaṭcópH từ 7,2 ÷ 7,6

 Nhu cầu oxy sinh hóa - BOD

BOD là nhu cầu oxy sinh hóa hay nhu cầu oxy sinh học, là lượng oxy cầnthiết để oxy hóa các chất hữu cơ dễ phân hủy có trong nước bằng VSV (chủ yếu là

vi khuẩn) hoại sinh, hiếu khí [19]

Chỉ tiêu BOD là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để xác định mức ônhiễm của nước Nó chỉ biểu thị lượng chất hữu cơ có thể bị phân hủy bởi VSV

Trong thực tế không thể xác định lượng oxy cần thiết để VSV oxy hóa hoàntoàn chất hữu cơ có trong nước, mà chỉ cần xác định lượng oxy cần thiết khi ủ ở nhiệt

độ 20 oC trong 5 ngày ở phòng tối để tránh quá trình quang hợp, khi đó có khoảng 70

÷ 80 % nhu cầu oxy được sử dụng và kết quả được biểu thị là BOD5 [19]

 Nhu cầu oxy hóa học - COD

COD là nhu cầu oxy cần thiết để oxy hóa toàn bộ chất hữu cơ và các chất khử có trong nước thành CO2 và H2O [19]

 Hàm lượng các chất rắn

Các chất rắn có trong nước là: Các chất vô cơ là dạng các muối hòa tan hoặckhông tan như đất đá ở dạng huyền phù lơ lửng Các chất hữu cơ như xác các visinh vật, tảo, động vật nguyên sinh, động vật phù du …, các chất hữu cơ tổng hợpnhư phân bón, các chất thải công nghiệp.

Chất rắn ở trong nước gồm có: Tổng chất rắn (TS) được xác định bằng trọnglượng khô phần còn lại sau khi cho bay hơi nước trên bếp cách thủy rồi sấy khô ở

105 oC cho đến khi trọng lượng không đổi Đơn vị tính bằng mg (hoặc g/l) Chất rắn

lơ lửng ở dạng huyền phù (SS) Hàm lượng các chất huyền phù là trọng lượng khôcủa chất rắn còn lại trên giấy lọc sợi thủy tinh Chất rắn hòa tan (DS) Hàm lượngchất rắn hòa tan chính là hiệu số của tổng chất rắn với huyền phù: DS = TS – SS.Đơn vị tính bằng g (hoặc mg) [22]

 Hàm luợng nitơ

Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH4+),nitrat (NO3-), ít hơn ở dạng nitrit (NO2-) và trong một số hợp chất hữu cơ khác.Thành phần được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môitrường là khí nitơ (N2)

Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạngkhác đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy nănglượng hoặc để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của chúng Cácdạng nitơ hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni hóachuyển hóa thành dạng NH4+ ; sau đó NH4+ được chuyển hóa thành NO2- nhờ vikhuẩn nitrit hóa; NO2- sinh ra được nhóm sinh vật nitrat hóa chuyển hóa thành NO3;cuối cùng nitrat được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ quátrình khử nitrat

Hiện nay, kết hợp phương pháp sinh học trong xử lý đối với cả nitơ, photphotrong nước ô nhiễm đang là một hướng nghiên cứu mới Trong nghiên cứu củaJorgensen và Pauli, một số chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho cũng cókhả năng khử nitrat [18]

 Hàm lượng photpho

Các hợp chất chứa photpho trong tự nhiên thường khó phân giải [7] Cácnguồn nước thải chăn nuôi, biogas thường có hàm lượng photpho cao Theo tiêuchuẩn Việt Nam về nước thải, hàm lượng photpho trong nước thải vượt quá 6 mg/l

có thể dẫn đến hiện tượng phú dưỡng (dư thừa các chất dinh dưỡng), gây tác độngtrực tiếp đến động vật, thực vật và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái Việc xử

lý nước thải giàu photpho thường khó thực hiện bằng còn đường sinh học do trong

tự nhiên số lượng loài vi sinh vật phân giải chuyển hóa photpho không nhiều Một

số chủng vi sinh vật phân lập trong tự nhiên có khả năng tích lũy photphat cao thuộc

các chi: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, … [8,9].

Kết quả nghiên cứu của Bao và cộng sự về khả năng thu nhận tích lũy photpho của

các chi vi khuẩn cho thấy sau 20 giờ vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng thu nhận 14,34 mg/l khi tiến hành ở điều kiện yếm khí, chi Enterobacteriaceae có khả năng thu nhận 8,91 mg/l, chi Alcaligenes là 6,43 mg/l, Staphylococcus là 6,23 mg/l, Bacillus là 4,41 mg/l ở điều kiện hiếu khí [8] Sự tích lũy photphat cung cấp

nguồn năng lượng cho vi sinh vật phát triển Trong cơ thể vi sinh vật, photpho tíchlũy ở dạng chủ yếu là photphat Photphat chiếm đến 12 % trọng lượng tế bào đối với

vi khuẩn có hoạt tính tích lũy photphat, trong khi ở vi khuẩn không tích lũyphotphat chỉ có khoảng 1 ÷ 3 % Xử lý nước thải có chứa các hợp chất photphobằng phương pháp sinh học dựa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tích lũylượng photpho nhiều hơn mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí Thôngthường hàm lượng photpho trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 ÷ 2,5 % khối lượng tế bàokhô, một số loài có khả năng hấp thu cao hơn, từ 6 ÷ 8 % [3], [14]

Nghiên cứu Van Bethum và cộng sự, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh vậtđược tích lũy dưới dạng chủ yếu là photphat Trong cơ thể của chúng, photphat cóthể chiếm đến 12 % trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy polyphotphat, vàvới vi khuẩn không tích lũy polyphotphat, chỉ chiếm khoảng 1÷ 3 % trọng lượng tếbào [3]

 Chỉ số vệ sinh (E coli)

Nước làm lan truyền các nguồn bệnh và trong thực tế các bệnh lây lan qua môi trường nước là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh có thể dẫn đến tử

vong, nhất là ở các nước đang phát triển Các tác nhân gây bệnh thường được bài tiết ra trong phân của người và động vật bị bệnh, bao gồm các nhóm chính sau: Các

vi khuẩn, virus, động vật đơn bào, giun kí sinh Chất lượng về mặt vi sinh của nước

thường được sử dụng rộng rãi nhất là chỉ số E coli [20].

1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SƯỰSINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VÂṬ TRONG QUÁTRÌNH XƯỬLÝNƯỚC THẢI

1.5.1 Ảnh hương cua nươc va nồng đô Ựcac chất dinh dương

Nươc đong vai tro rất quan trongc̣ trong hoaṭđôngc̣ sống cua vi sinh vâṭ Nươc

́ ́

hòa tan các chất dinh dưỡng nhờ đó mà chất dinh dưỡng dễ dàng

màng tế bào để cho vi sinh vật sử dụng

thải phải phù hợp với đặc điểm sinh lý của tế bào Nồng đô c̣các chất dinh dưỡng caoquá mức giới hạn tế bào sẽ mất nước, nguyên sinh chất trong tếbào bi keọ tu c̣laịlàmhoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ Ngươcc̣ laị, trong nươc cất tếbao bi c̣trương lên

do xay ra hiêṇ tươngc̣ thẩm thấu cua nươc qua mang tếbao lam cho tếbao bi c̣vơ

lê c̣cac chất dinh dương co anh hương lơn đến hoaṭđôngc̣ sống cua vi sinh vâṭ

loài vi sinh vật cũng có nhu cầu khác nhau về tỷ lệ các chất dinh dưỡ ng Tỷ lệ C : N

:P phổbiến cho nhiều loài là100 : 10 : 1

50 ÷ 60 oC (vi sinh vâṭưa nhiêṭ ) Trong xử lýnước thải hầu như viêcc̣ điều chinh̉ nhiêṭđô c̣không thểthưcc̣ hiêṇ đươcc̣ màthường xử lýởnhiêṭđô c̣tư c̣nhiên của môi

trường Vì vậy, người ta thường choṇ các loaịvi sinh vâṭcósẵn trong tư c̣nhiên của khu vưcc̣ đểchúng cókhảnăng thich́ nghi với nhiêṭđô c̣môi trường tư c̣nhiên [27]

1.5.4 Ảnh hưởng của oxy hòa tan

Mối quan hê c̣của vi sinh vâṭđối với o xy rất khác nhau Vi sinh vâṭhiếu khí

cần oxy đểsinh trưởng Vi sinh vâṭyếm khíoxy laịlàtác nhân gây đôcc̣ Nhóm vi sinhvâṭtrung gian giữa hai nhóm này lànhóm hiếu khítùy tiêṇ

Trong xử lýnước thải ởcác bểa eroten cần cung cấp đủoxy đểvi sinh vâṭ hiếu khíoxy hóa các chất hữu cơ cótrong nước thải Còn xử lý yếm khí thì tiến hành trong các bể kín để oxy không tan được vào trong nước thải gây ức ch ế các vi sinh vâṭyếm khí[23]

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU HỮU CƠ

Có nhiều biện pháp xử lý nước thải: Xử lý cơ học, xử lý hóa học, xử lý sinhhọc, xử lý cơ-lý-hóa, và xử lý nhờ kết hợp các biện pháp sinh học và cơ-lý-hóa

Trong các phương pháp trên thì phương pháp xử lý sinh học được sử dụngnhiều với hiệu quả cao, đặc biệt là đối với nước thải chứa nhiều chất hữu cơ dễ bịphân hủy, nhưng không mang hiệu quả đối với nước thải công nghiệp có chứa cácchất vô cơ độc hại (kim loại nặng, axit, kiềm) hoặc các chất hữu cơ bền vững (cácclobenzen, phenol …) và ít hiệu quả đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh Trongcác trường hợp này phải kết hợp phương pháp xử lý sinh học với các phương pháp

xử lý cơ-lý-hóa [29]

1.6.3 Phương pháp xử lý sinh học

Phương pháp phổ biến và kinh tế nhất để xử lý nước thải giàu chất hữu cơ làphương pháp sinh học Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng hoạt động của các

vi sinh vật để phân hủy các chất hữu cơ gây ô nhiễm trong nước thải

Các vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số khoáng chất làm nguồndinh dưỡng và tạo năng lượng Trong quá trình phát triển, chúng nhận các chất dinhdưỡng để xây dựng tế bào, sinh trưởng và sinh sản nên sinh khối của chúng đượctăng lên Quá trình phân hủy các chất hữu cơ nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxyhóa sinh hóa [8]

Nước thải có thể xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bởi chỉtiêu COD hoặc BOD Để có thể xử lý bằng phương pháp này, nước thải cần khôngchứa các chất độc và tạp chất, các muối kim loại nặng hoặc nồng độ của chúngkhông được vượt quá nồng độ cực đại cho phép, đồng thời thỏa mãn: BOD/COD ≥0,5

1.7 TIÊU CHÍ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỮU CƠ

Xử lýnước thải bằng phương pháp sinh hocc̣ chủyếu dưạ vào hoaṭđôngc̣ sốngcủa các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng phâ n giai chất hưu cơ Các vi sinh vật dị

dưỡng cót hểchia thành ba nhóm nhỏ: Vi sinh vâṭhiếu khí, vi sinh vâṭyếm khívà

vi sinh vâṭtùy nghi Khu hê c̣vi sinh vâṭsử dungc̣ trong quátrinh̀ xử lýnước thải gồm

vi khuẩn, nấm me n, nấm mốc , xạ khuẩn Trong đó, vi khuẩn chiếm sốlươngc̣ lớn

nhất Trong các bểxử lýsinh hocc̣ , vi khuẩn đóng vai tròquan trongc̣ hàng đầu vìnó chịutrách nhiệm phân hủy các thành phần hữu cơ trong nước thải Do vâỵ, bên cạnh viêcc̣ lơị dụng những tính năng ưu viêṭcủa các loài vi sinh vâṭthì chúng ta cần phải lưạ chọnnhững chủng vi sinh vâṭthích hơpc̣ vừa có khả năng làm sạch, vừa tạo đô c̣ kết lắng tốt vừa không gây đôcc̣ hại cho môi trường Các tiêu chí đươcc̣ xét: Có hoạt

tính sinh học cao: Có phức hệ enzym phân giải hữu cơ cao, ổn định Sinh trưởng tốttrong điều kiện thực tế của nước thải hữu cơ, cạnh tranh được với vi sinh vật có sẵntrong nước thải Nuôi cấy dễ dàng, sinh trưởng tốt trong môi trường tự nhiên, thuậnlợi cho quá trình nhân giống thu sinh khối

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng được tuyển chọn: Vi khuẩn NT01, NT03 và NT05 được lưu giữtrong Bộ sưu tập giống Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinhhọc thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nước thải sau hầm biogas tại hộ gia đình ông Bùi Vinh Nghê, xóm VănMiếu, thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng, huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị chính

Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo pH,Metter Toledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ); máy lắc ổnnhiệt (Hàn Quốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng ướt (TrungQuốc); tủ sấy khô (Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD; lò vi sóng; ốngđong: 100 ml, 500 ml, 1.000 ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml, 1.000 ml, 2.000 ml; máysục khí; các dụng cụ khác …

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merck - Đức);thạch (Merck- Đức); bột xenlulo (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại đường: D-glucoza, saccaroza, D-fructoza, …(Merck- Đức); các hóa chất vô cơ khác: NaCl,

KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3 …

+ Bộ Kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB

+ Bộ kit TOPO TA Cloningđ bao gồm các thành phần cần thiết cho quá trìnhtách dòng: Vectơ pCRđ2.1-TOPOđ, enzym, tế bào khả biến chủng TOP 10, và dungdịch đệm cho từng loại enzym

+ Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, sử dụng

bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit [2]

+ Cặp mồi cho phân loại vi khuẩn:

Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

- Cặp mồi tổng hợp gene 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng GENSET(Singapore BioTech pte, Ltd)

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất 1.000ml; pH 7

Môi trường Winogradsky (g/l): NaNO21; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,3;

Na2CO3 1; NaCl 0,5; FeSO4 0,1; nước cất 1.000 ml

Môi trường Pikoskaya (g/l): Glucoza 10; Ca3(PO4)2 5; (NH4)2SO4 0,5; NaCl0,2; MgSO4.7H2O 0,1; KCl 0,2; Cao nấm men 0,5; MnSO4 vết ; FeSO4 7H2O vết;nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2

Môi trường xenlulo (g/l): NH4NO3 0,2; ure 0,1; cazein 0,2; KH2PO4 0,2;MgSO4.7H2O 0,3; CaCO3 0,2; FeSO4.7H2O 0,05; bột giấy 20; cao nấm men 0,1;cazamino axit 0,1; agar 20; nước cất 1.000; pH 7

Môi trường xenlulo Glovina (g/l): CMC1,5; KNO3 0,5; KH2PO4 0,85;MgSO4.7H2O 0,0625; cao nấm men 0,025; nước cất 1.000 ml; pH 7 ÷ 7,2

Môi trường Gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở 121 oCtrong 20 phút

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp nghiên cưứu vi sinh vâṭ

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn

 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm hình thái tếbào c ủa vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện

tử và được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủtịch Hồ Chí Minh

 Nhuộm Gram vi khuẩn [3]

Xác định các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ vào màuthuốc nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn Nếu vi khuẩn bắt màu hồng là Gr (-),màu tím là Gr (+)

 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

 Khả năng sinh tổng hợp enzym

Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sungthêm 1 % tinh bột Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol.Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xungquanh chỗ vi khuẩn sinh trưởng [3]

Thủy phân xenlulo: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1 % bộtgiấy Nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol Nếu vi khuẩn

có khả năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vikhuẩn sinh trưởng

Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng, nuôi ởnhiệt độ 30 oC, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4 oC để trong 2 giờ Sau 2 giờ môitrường trong ống nghiệm không bị đông thì chủng đó có khả năng làm loãng gelatin

 Khả năng sử dungc̣ các nguồn cacbon

Nuôi vi sinh vâṭtrên môi trường cóbổsung

đinḥ khảnăng phát triển của chúng

1 % nguồn đường, cacbon Xác

 Khả năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH

Thay đổi nồng đô c̣NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ , pH khác nhau Theodõi khả năng sinh trưởng của chúng

*Phương pháp phân tích nitơ tổng số

Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng

vô cơ và hữu cơ về dạng nitrat nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ởbước sóng 220 nm [9]

K16

*Phương pháp phân tích hàm lượng amoni NH 4 +

Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn được phân tích dựa trênnồng độ amoni trong môi trường theo các khoảng thời gian nuôi Phản ứng của

NH4+ và hypochlorit với sự có mặt của xúc tác phenol tạo thành hợp chấtindophenol blue So màu ở bước sóng 640 nm [9]

*Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrit

Khả năng chuyển hóa nitrit (NO2-) thành nitrat (NO3-) của các chủng đượcđánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrit trong môi trường nuôi cấy Phản ứng giữanitrit và hỗn hợp sulfanylamit với naphtylendiamin tạo phức màu hồng ở pH 2 Somàu ở bước sóng 540 nm [9]

*Đánh giá khả năng tích lũy photpho

Đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật thông qua hàm lượngphotphat còn lại trong môi trường Hàm lượng photphat được đánh giá dựa trênnguyên tắc tạo phức giữa gốc phosphat, amonium molypdat và kali antimon tatratthành một phức chất màu xanh đậm và được đo ở bước sóng 710 nm [11]

2.2.1.2 Phương pháp đánh giá tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn

Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấygiao nhau trên môi trường MPA, nuôi ở 37 oC sau 24 giờ quan sát sinh trưởng củacác chủng ở các đường giao nhau [3]

2.2.1.3 Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn

+ Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay đổi

môi trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sự thay đổi của các tế bào vi sinh vật

Vì vậy, sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng thời điểmlượng enzym sinh ra cũng khác nhau Tiến hành thí nghiệm bằng cách nuôi cấy vikhuẩn trong môi trường MPA, nuôi ở 37 oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút trong 60giờ Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm) [4]

+ Ảnh hưởng của nhi ệt độ: Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng vi

khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể Sau đó, cấy cácchủng vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở cácthang nhiệt độ: 25; 30; 35; 45 và 55 Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định khả năng sinhtrưởng (OD620 nm)

+ Ảnh hưởng của pH : Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3; 4; 5;

6; 7; 8; và 9 Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37 oC, sau 48 giờ xác định khả năng sinh trưởng bằng cách đo OD620 nm

+ Ảnh hưởng của nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường MPA

sau đó bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1; 3; 5; 7 và 9

và 11 nuôi ở 37 oC trong 48 giờ Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số (OD620nm)

+ Ảnh hưởng của ngu ồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh

trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn trêncác nguồn cơ chất khác nhau Trên môi trường cơ sở có bổ sung tinh bột, CMC-Na,glucoza, saccaroza, lactoza, rỉ đường Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPAtrong 48 giờ Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm)

+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi trường

cơ sở có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao thịt, KNO3 và(NH4)2SO4 Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ Sau khoảng thờigian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm)

2.2.1.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzym

Phương pháp đường khử : Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ: 0.5; 1;1.5; 2 và 3 (mg/ml) Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ đến khi xấp

xỉ nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng bằng 1 ml) Bổ sung 1

ml cơ chất, mix đều và ủ ở 37 oC trong 10 phút, sau đó thêm 3 ml DNSA, mix đềurồi đun sôi các mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S cùng nhau (khoảng 30 phút) Sau

đó làm lạnh bằng cách ủ vào đá rồi đo OD (540 nm) Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫutiếp

Công thức pha hóa chất: Spectro zero: 1 ml cơ chất, 1 ml đệm, 3 ml DNSA.Đường chuẩn: 1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 0,5 ml đường Enzym blank: 1 ml cơ chất,

3 ml DNSA, 1 ml enzym Đệm PBS 6,8: (a): NaH2PO4 0,2 M: cân 27,8 g và địnhmức đến 1.000 ml, (b) NaH2PO4.7H20 0,2 M: cân 53,05 g và định mức đến 100 ml,dung dịch đệm bằng tổng của 51 ml (a) và 49 ml (b) định mức đến 200 ml DNSA:DNSA 10,6 g, NaOH 19,8, Na2S2O5 8,3 g, N-K-tatarat 306 g, phenol 7,6 ml Kếtquả thu được áp vào đường chuẩn hình 2.1 tính hoạt độ xenlulaza

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld [26]

2.2.2 Phương pháp phân loại

2.2.2.1 Phân loại theo Bergey ’ s

Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa đối chiếu với chủng chuẩn

đã được nghiên cứu theo khóa phân loại Bergey’s [32]

2.2.2.2 Phân loại vi khuẩn theo kit chuẩn API 50 CHB

Chủng vi khuẩn cấy sau 24 giờ trên thạch nghiêng, lấy 2 ÷ 3 vòng que cấyhoà tan vào nước muối sinh lý, dùng pipet vô trùng hút 2 ml từ nước muối sinh lý đã

có vi sinh vật vào môi trường API 50 CHB, lắc đều Dùng pipet hút dịch từ môitrường API 50 CHB cho vào các chíp (vạch 1), tiếp theo nhỏ parafin khoảng 5 ÷ 6giọt cho đầy Nuôi 37 oC, sau 24 giờ và 48 giờ ghi kết quả Trong suốt quá trìnhnuôi cấy, các đường lên men tạo thành axit làm giảm pH, được nhận biết bằng sựđổi màu chất chỉ thị [8]

2.2.2.3 Phân loại theo sinh học phân tử dựa trên trình tự gene 16S rRNA

% (lạnh) hoặc 0,7 V isopropanol (lạnh), mix đều (9) Để lạnh ở -20 oC ít nhất 4 giờ.(10) Ly tâm 12000 vòng/ 20 phút thu cặn (11) Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm

12000 vòng/ 10 phút, thu cặn (12) Làm khô (13) Hòa cặn trong 40 ÷ 60 µl TE ARNaza, ủ ở 37 oC/ 1 giờ (14) Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng máy đo quangphổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãngmẫu Tỉ lệ ADN/protein > 1,8 là mẫu sạch (15) Điện di kiểm tra trên gel agaroza0,8 %, điện thế 100 V Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromit 1 %/ 10phút

-Nhân bản đoạn ADN thuộc gen 16S rARN bằng PCR

Thu nhận đoạn gen 16S ARN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi:

Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT

PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µl/ mẫu: ADN tổng số (1 µl), 16F (1µl), 16R (1 µl), dNTPs 10 mM (2 µl), Taq polymeraza (0,25 µl), đệm Taqpolymeraza 10 X (5 µl), nước khử ion (bổ sung cho đủ 25 µl)

Chu trình nhiệt: (1) 94 oC - 3 phút, (2) 94 oC - 1 phút, (3) 55 oC - 1 phút, (4) 72

o

C - 2 phút Lặp lại 30 chu kỳ từ bước 2 ÷ 4; 72 oC - 7 phút Giữ ở 4 oC

b. Thu nhận ADN thuộc gen 16S rARN bằng cách thôi gel

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza 0,8 %, phân đoạn ADN có độ dài

~ 1500 bp được thu nhận, tiến hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm bằng kit

QiaQuick PCR Purification (Qiagen, Hilden, Đức)

(1) Thêm 3 lần thể tích của dung dịch đệm ADB (Agarose Dissolving Buffer)vào mỗi thể tích gel Ủ trong bể ổn nhiệt 55 oC trong 5 ÷ 10 phút, đến khi tan hếtgel (2) Chuyển dung dịch gel đã hoà tan vào cột Zymo-Spin, sau đó ly tâm 12.000vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây (3) Thêm 200 µl dung dịch đệm rửa (Wash Buffer)vào cột, ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây, lặp lại bước này hai lần (4)Thêm trực tiếp 6 ÷ 8 µl nước khử ion vào màng của cột, đặt cột vào trong ống 1,5

ml và ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 1 phút Thu sản phẩm ADN tinh sạch

c. Xác định trình tự gen 16s rARN

(1) Trình tự ADN được xác định bằng kit Dyedeoxy Terminator CycleSequencing (Applied Biosystems, Weiterstadt, Đức), sản phẩm được phân tích trênmáy đọc trình tự tự động ABI 377 (Perkin-Elmer, Mỹ) (2) Chuỗi nucleotit được xử

lý bằng chương trình Bioedit (3) Truy cập dữ liệu ngân hàng genEMBL(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh bằng chương trình GENDOC 2.5(Nicholas, 1999) (4) Sử dụng chương trình phân tích phả hệ và tiến hóa MEGA 2.1

để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng được phân tích [24]

2.2.3 Phương pháp lên men, xử lý nước thải hữu cơ sau hầm biogas

2.2.3.1 Phương pháp lên men vi khuẩn

Nhân giống cấp 1: Nhân giống trong môi trường MPA cho vi khuẩn, nuôi lắctrong bình tam giác, nhiệt độ và thời gian nuôi thích hợp cho từng chủng, số lượng

tế bào đạt khoảng 109/ml dịch nuôi

Nhân giống cấp 2: Tiếp tục nhân giống lớn trong thiết bị lên men trên môitrường MPA cho vi khuẩn, số lượng tế bào đạt 109/ml dịch nuôi

2.2.3.2 Thiết kế thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas

Thí nghiệm xử lý nước thải sau hầm biogas quy mô phòng thí nghiệm đượcthực hiện quy mô 2,5 m3/mẻ sục khí liên tục, tại thôn Đại Phùng, xã Đan Phượng,huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội

2.2.3.3 Phương pháp đánh giá mức độ ô nhiễm

+ Phương pháp xác định pH theo TCVN 6492 - 1999 (ISO 10523 - 1994) [21]

+ Xác định BOD theo TCVN 6001 - 1995 (ISO 5815 - 1989) [19]

Thử nghiệm BOD được thực hiện bằng cách hòa loãng mẫu nước thử vớinước đã khử ion và bão hòa về oxy, thêm một lượng cố định vi sinh vật mầm giống,

đo lượng oxy hòa tan và đậy chặt nắp mẫu thử để ngăn ngừa oxy không cho hòa tanthêm (từ ngoài không khí) Mẫu thử được giữ ở nhiệt độ 20 °C trong bóng tối đểngăn chặn quang hợp (nguồn bổ sung thêm ôxy ngoài dự kiến) trong vòng 5 ngày

và sau đó đo lại lượng ôxy hòa tan Khác biệt giữa lượng DO (oxy hòa tan) cuối vàlượng DO ban đầu chính là giá trị của BOD Giá trị BOD của mẫu đối chứng đượctrừ đi từ giá trị BOD của mẫu thử để chỉnh sai số nhằm đưa ra giá trị BOD chínhxác của mẫu thử [2]

+ Xác định COD theo TCVN 6491 - 1999 (ISO 6060 - 1989) Xác định nhu cầu oxy

hóa học [21]

Phạm vi áp dụng : Đối với nước có hàm lượng COD cao từ 30 ÷ 700 mg/l,nếu giá trị COD vượt quá 700 mg/l mẫu nước cần pha loãng Giá trị COD nằmtrong khoảng 300 - 600 mg/l đạt được độ chính xác cao nhất, hàm lượng Cl- < 1000mg/l Nguyên tắc: Trong môi trường axit sunfuric đặc, Với sự có mặt của xúc tác

Ag2SO4 thì khi đun nóng K2Cr2O7 oxi hoá các hợp chất hữu cơ Chuẩn độ lượng dư

K2Cr2O7 bằng dung dịch muối Morh với chỉ thị feroin, tại điểm cuối chuẩn độ, màucủa dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu nâu đỏ

+ Xác định chất rắn lơ lửng (SS) theo TCVN 6625 – 2000

Lấy 10 ml nước đem lọc qua giấy lọc đã được sấy khô ở trọng lượng

không đổi (105 oC)

T1 – T2 1000

AS (mg/l) =

-VTrong đó: T1: Khối lượng cặn và giấy lọc

T2: Khối lượng giấy lọc (mg)

V: Thể tích mẫu nước

+ Xác định chất rắn lơ lửng (SS) theo TCVN 6625 - 2000 [14]

Lấy 10 ml nước đem lọc qua giấy lọc đã được sấy khô ở trọng lượng

không đổi (105 oC) Công thức: SS (mg/l) = (T1 – T2 1000)/ V

Trong đó: T1: Khối lượng cặn và giấy lọc; T2: Khối lượng giấy lọc (mg); V: Thể tíchmẫu nước

+ Xác định P tổng theo Hach DR2800-10127

Nguyên tắc xác định: Trong môi trường axit, amonimolipdat phản ứng vớidung dịch octophotphat tạo thành axit tạp (Axit molipdophtphoric) Với sự có mặtcủa vannadat axit vannadomolipdophotphoric màu vàng được hình thành Cường độmàu thể hiện nồng độ photphat trong dung dịch Nồng độ tối thiểu có thể phát hiệnđược là 10-4 g/l

+ Xác định N tổng theo TCVN 5988-1995 (ISO 5664-1984)

Nguyên tắc chung của phương pháp này là dùng axit sunfuric đậm đặc oxyhóa toàn bộ các hợp chất hữu cơ có nitơ về amoniac (NH3) Do vậy, không để lẫnvới lượng amoni mới được hình thành phải phân tích xác định NH3 tự do có sẵntrong mẫu nước thải trước để hiệu chỉnh về sau NH3 mới sinh ra và NH3 tự do đềukết hợp với axit sunfuric đậm đặc để chuyển thành muối amoni sunfat Sau đó lạitách toàn bộ NH3 từ amoni sunfat (vừa hình thành) bay ra khỏi dung dịch bằng cáchđun nóng dung dịch với NaOH

+ Phương pháp xác định giá tri ̣SV30 (solid value)

nươc thai đa đươcc̣ xư l ý lắc đều rót vào ống đong 500 ml Đểlắng tư c̣nhiên , sau 30

phút ghi lại thể tích bùn lắng (Vtb) Giá tri SṾ30 đươcc̣ tinh́ như sau:

SV30 = (Vtb/500)×100

+ Xác định Coliforms theo TCVN 6187 - 2 : 1996 (ISO 9308 - 2:1990) [20]

Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần (3 ÷ 10 lần) Các độ phaloãng được lựa chọn sao cho trong các lần lặp lại có số lần dương tính và có số lần

âm tính Số lần dương tính được ghi nhận và so với bảng thống kê Mac Crady

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình IRISTAT 5.0 và EXCEL

PHẦN III KÊƣ́

T QUẢVÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Khả năng phân giải cơ chất của các chủng nghiên cứu

Ba chủng vi khuẩn được ký hiệu NT01, NT03 và NT05 được phân lập từnguồn nước thải giàu hữu cơ tại Công ty Cổ phần thực phẩm xuất khẩu Đồng Giao -Ninh Bình, các chủng được xác định khả năng phân giải cơ chất là CMC và tinhbột: Môi trường MPA có bổ sung CMC và tinh bột 1 % khử trùng ở 0,8 atm trong

30 phút, sau đó đổ ra đĩa Petri Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa, ủ ởnhiệt độ 37 oC trong 48 giờ Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol Nếu vikhuẩn có khả năng thủy phân xenlulo chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ

vi khuẩn sinh trưởng Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1

NT01

NT05 NT03

Hình 3.1 Vòng phân giải CMC của 3 chủng vi khuẩn

Từ hinh̀ 3.1 cho thấy 3 chủng vi khuẩn NT 01, vi khuẩn NT 03, vi khuẩn NT05 đều có hoạt tính và được đo vòng phân giải tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Khả năng phân giải CMC và tinh bột của các chủng

STT

123

Từ hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy chủng vi khuẩn NT01 có vòng phân giải

xenlulaza cao, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.

+ Khả năng tích lũy phân giải photphat của các chủng có hoạt tính xenlulaza: Khả năng sử dụng photpho của các chủng có hoạt tính xenlulaza được

đánh giá thông qua hàm lượng photphat được tích lũy trong vi sinh vật dẫn đến việcgiảm hàm lượng của hợp chất này trong môi trường nuôi cấy

Bảng 3.2 Hàm lượng photpho còn trong môi trường sau 7 ngày nuôi cấy

STT

123

Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 3 chủng vi sinh vật có hoạt tính xenlulazatuyển chọn đều có khả năng tích lũy photpho nhanh và mạnh Với hàm lượngphotpho là 6 mg/l trong môi trường nuôi cấy, cả 3 chủng NT01, NT03 và NT05 sau

7 ngày nuôi cấy đã không còn phát hiện được photphat còn trong môi trường, tiếptục bổ sung và tăng hàm lượng photpho trong môi trường nuôi cấy lên gấp 3 lần ởmức 18 mg/l Tại nồng độ này kết quả nghiên cứu cho thấy chủng NT01 có khảnăng sử dụng photphat tốt nhất so với các chủng còn lại Lượng photphat trong dịchnuôi của chủng NT01 giảm đi 29,12 % sau 7 ngày trong khi với các chủng NT03 vàNT05 lượng giảm tương ứng là 25,77 % và 22,94 %

+ Đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ: Các chủng NT01, NT03

và NT05 được nuôi lắc ở 37 °C trong các khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15 và 20ngày Môi trường nuôi lắc là dung dịch môi trường Winogradsky có bổ sung 1 %pepton và kết quả thu đươc như sau

Bảng 3.3 Hàm lượng nitơ còn trong môi trường sau thời gian nuôi cấy

Ký hiệu chủng

K16

Kết quả cho thấy, sau 5 ngày, ba chủng NT01, NT03 và NT05 làm nồng độ

NH4+ giảm nhiều Sau 15 ngày, chủng NT01 có hàm lượng NH4+ có trong mẫu đãgiảm xuống 66,66 % và 2 chủng còn lại hàm lượng NH4+ trong dung dịch giảmxuống 69,03 % so với mẫu ban đầu với chủng NT03 và 71,28 % với chủng NT05nhưng sau 20 ngày các chủng đều chuyển hóa nitơ chậm Từ kết quả trên cho thấy

cả 3 chủng đều có khả năng chuyển hóa nitơ nhưng chủng NT01 có khả năngchuyển hóa tốt nhất và thời gian tối ưu là khoảng 15 ngày

+ Khả năng làm loãng gelatin của các chủng phân lập: Các chủng vi khuẩn

nghiên cứu được cấy trong môi trường MPA lỏng bổ sung 10 % gelatin, nuôi ởnhiệt độ 37 oC Sau 2 ngày, trước khi quan sát giữ mẫu ở 20 oC trong khoảng 4giờ, kiểm tra kết quả với vi khuẩn Dịch môi trường loãng chứng tỏ chủng có khảnăng làm loãng gelatin

Hình 3.2 Khả năng làm loãng gelatin của các chủng nghiên cứu

Kết quả được trình bày ở hình 3.2 cho thấy các chủng nghiên cứu đều có khảnăng làm loãng gelatin rất tốt so với đối chứng không cấy vi sinh vật

3.1.2 Khả năng đối kháng của các chủng nghiên cứu

Để xử lý nước thải hữu cơ một cách tốt nhất thì hệ vi sinh vật tuyển chọn cầnphải có sự tương trợ lẫn nhau, nếu chúng đối kháng với nhau thì việc cùng bổ sungchủng vào nước thải là vô nghĩa Vì vậy, cần kiểm tra khả năng đối kháng của cácchủng nghiên cứu với nhau Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giao nhau trên

môi trường MPA, nuôi ở 37 oC sau 48 giờ quan sát sinh trưởng của các chủng ở cácđường giao nhau.

NT01 NT03

NT05

Hình 3.3 Khả năng đối kháng của các chủng nghiên cứu

Kết quả hình 3.3 cho thấy các chủng nghiên cứu không đối kháng nhau Cả

ba vi khuẩn đều phát triển bình thường tại các điểm giao nhau , không cósư c̣ức chếgiữa các chủng Như vậy, chúng hoàn toàn có thể sinh trưởng trong cùng một môitrường cũng như phối hợp chúng trong xử lý nước thải hữu cơ

3.1.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn nghiên cứuđược xác định khi nuôi cấy trên môi trường MPA, ở nhiệt độ 37 oC, sau 48 giờ quansát hình thái khuẩn lạc và hình ảnh tế bào được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69thuộc Bộ Tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh Kết quả hình 3.4 cho thấy 2 chủng

vi khuẩn NT01 và chủng vi khuẩn NT03 đều có tế bào hình que dài, kích thước từ 1

÷ 3 µm Hình thái tế bào của 2 chủng tương tự nhau nhưng hình thái khuẩn lạc thìkhác nhau hoàn toàn, chủng NT01 khuẩn lạc lồi, không bóng, nhầy, hơi nhăn,

chủng vi khuẩn NT03 khuẩn lạc màu trắng sữa, hơi lồi, mép răng cưa Chủng vikhuẩn NT05 có tế bào hình que ngắn hơn, kích thước 1 ÷ 2 µm Hình thái khuẩn lạctròn, màu trắng kem