Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất bằng phương pháp kết tủa nước chua​

LỜI CÁM ƠNQua hơn 3 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua” đến nay đã

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan toàn bộ nội dung đồ án tốt nghiệp là của riêng em Các kếtquả nghiên cứu đƣa ra trong đồ án này do em tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan, không sao chép của bất kỳ kết quả nghiên cứu nào của các tác giảkhác Nội dung của đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các nguồn sách, tạp chí đƣợc liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo

Sinh viên thực hiệnNguyễn Thị Linh Chi

LỜI CÁM ƠN

Qua hơn 3 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua” đến nay đã được hoàn thành.

Em xin cám ơn BGH trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minhcùng tất cả quý Thầy Cô, bạn bè trong phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học –Thực phẩm – Môi trường đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt

đề tài

Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn đến TS Nguyễn Lệ Hà, Cô đã tận tình giúp

đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Bên cạnh những nỗ lực của bản thân thì đây vẫn là một lĩnh vực khá mới, đòihỏi chuyên môn sâu và kinh nghiệm thực tế Song, do bản thân còn nhiều hạn chế

về kiến thức, kinh nghiệm cũng như gặp phải một số khó khăn trong việc sưu tầmtài liệu và những thông tin cần thiết có liên quan đến đề tài nên những thiếu sóttrong việc phân tích, trình bày đồ án là không thể tránh khỏi Em rất mong nhậnđược sự chỉ dẫn thêm từ quý Thầy Cô

Kính chúc mọi người luôn dồi dào sức khỏe, vui vẻ và luôn thành công trongcông việc

Tp Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 07 năm 2014

Sinh viên thực hiệnNguyễn Thị Linh Chi

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích và nội dung nghiên cứu 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đậu hũ 3

1.1.1 Giới thiệu về đậu nành 3

1.1.1.2.1 Tính tan 4

1.1.2 Quy trình sản xuất đậu hũ 6

1.1.3 Các chỉ tiêu chất lượng của đậu hũ 11

1.1.4 Những nguyên nhân và biến đổi gây hư hỏng đậu hũ 13

1.2 Tổng quan về chitin - chitosan 15

1.2.1 Giới thiệu về chitin – chitosan 15

1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan 16

1.2.3 Tính chất của chitosan 18

1.2.4 Các phương pháp thu nhận chitosan 25

1.2.5 Chitosan tan trong nước (WSC) 28

1.2.6 Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm 30

CHƯƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Nguyên vật liệu 34

2.1.1 Nguyên liệu 34

2.1.2 Vật liệu 34

2.2 Bố trí thí nghiệm 34

2.2.1 Chuẩn bị cho nghiên cứu 34

2.2.3 Tiến hành thí nghiệm 37

2.2.4 Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Một số thông số cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu 39

3.2 Nghiên cứu quá trình biến đổi của đậu hũ trong thời gian bảo quản 39

3.2.1 Khảo sát biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 39

3.2.2 Khảo sát độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 42

3.2.3 Khảo sát chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 44

3.2.4 Khảo sát chỉ tiêu nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 46

3.2.5 Khảo sát chỉ tiêu E coli trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PCA: Plate Count Agar

PDA: Potato Dextrose Agar

SCA: Simmon Citrate Agar

TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam

TPC: tổng vi sinh vật hiếu khí

VP: Voges – Proskauer

WSC: chitosan hòa tan trong nước

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.3 Hàm lượng acid amin không thay thế trong protein đậu nành 4

Bảng 1.4 So sánh hai phương pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành 10

Bảng 1.5 Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997) 11

Bảng 1.6 Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011) 12

Bảng 1.7 Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78) 12

Bảng 1.8 Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phương pháp hóa học và sinh học 27

Bảng 1.9 Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosan tan trong nước 29

Bảng 2.1 Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của dung dịch ngâm đậu hũ 38

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu được xác định của đậu hũ dùng trong nghiên cứu 39

Bảng 3.2 Giá trị pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 39

Bảng 3.3 Giá trị độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 42

Bảng 3.4 Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 44

Bảng 3.5 Mật độ nấm men nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 46

Bảng 3.6 Số lượng E coli giả định trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất đậu hũ 7

Hình 1.2 Cấu tạo hóa học của chitin 16

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của chitosan 17

Hình 1.4 Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosan 27

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

Hình 3.1 Biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 40

Hình 3.2 Biến đổi độ đục của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 43

Hình 3.3 Biến đổi về tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 45

Hình 3.4 Biến đổi về nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 47

Hình 3.5 Biến đổi về E coli giả định của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 49

MỞ ĐẦU

Đậu hũ là một sản phẩm được ưa chuộng của người châu Á, thích hợp chonhiều đối tượng do dễ tiêu hóa, dễ sử dụng, ít cholesterol và chất béo bão hòa… rấttốt cho sức khỏe của con người

Tuy nhiên, đậu hũ khó bảo quản và dễ hư hỏng do thành phần giàu dinhdưỡng và chứa hàm lượng nước cao, thời hạn sử dụng cao nhất của đậu hũ là từ 1đến 2 ngày trong điều kiện bình thường (Dotson và cộng sự, 1977; Kovats và cộng

sự, 1984) Vì vậy, nhiều người sản xuất đã bổ sung thạch cao, chất phụ gia hoặcchất bảo quản trong quá trình sản xuất để kéo dài thời gian bảo quản, điều này gâyảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm ra các chất bảo quản có hoạttính sinh học để thay thế cho chất bảo quản hóa học, và một trong những chất đó làchitosan Chitosan là polysaccharide nhiều thứ hai sau cellulose được tìm thấy trong

tự nhiên, đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng chitosan trong thực tế nhưnông nghiệp, công nghiệp, y dược, bảo vệ môi trường, chất bảo vệ hoa quả,…

Một số nước như Nhật Bản, Hàn Quốc đã có nghiên cứu khoa học về ứngdụng chitosan vào bảo quản đậu hũ Ở Việt Nam chưa có báo cáo khoa học nào về

đề tài này, vì vậy, chúng tôi muốn thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất bằng phương pháp kết tủa nước chua” trong điều kiện khí hậu cũng như nguồn nguyên liệu của Việt Nam.

2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

Mục đích chung của đồ án là nghiên cứu khả năng sử dụng chitosan hòa tantrong nước để kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ sản xuất theo phương pháp kết tủabằng nước chua Để đạt được mục đích này, nghiên cứu tập trung vào một số nộidung sau:

- Phân tích một số chỉ tiêu cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu Trang 1

- Theo dõi biến đổi chất lượng của đậu hũ thông qua dung dịch ngâm đậu hũ trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về đậu hũ

1.1.1 Giới thiệu về đậu nành

1.1.1.1 Khái quát về đậu nành

Đậu nành là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại được trồng từ

hơn 5000 năm trước, có tên khoa học là Glycine Maxx Merril.

Bảng 1.1 Thành phần của hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2006)

Bảng 1.2 Thành phần protein đậu nành (Ngô Thế Dân và cộng sự, 1998)

Đậu nành cũng như tất cả các hạt khác đều chứa enzyme cần thiết cho quátrình nảy mầm Về mặt công nghệ thì enzyme quan trọng của đậu nành làlipoxygenase Enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa,gây mùi hôi cho đậu nành.

Bảng 1.3 Hàm lượng acid amin không thay thế trong protein đậu nành

là đặc tính kết tủa của protein đậu nành Protein đậu kết tủa ở pI = 4,5

Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hưởng bởi lực ion Ở pH=6,8 lựcion ít ảnh hưởng, ở pH = 2 lực ion làm giảm tính tan, ở pH = 4,7 lực ion làm tăngtính tan

Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hưởng bởi chế độ xử lý nhiệt Nhiệt

xử lý làm biến tính và giảm tính tan của protein đậu nành, sau đó một số protein cóthể phân cắt thành các thành phần nhỏ hơn và tan lại

1.1.1.2.2 Khả năng hấp thụ và giữ nước

Khả năng hấp thụ và giữ nước của protein dựa trên tương tác giữa protein –protein và protein – nước Khi nồng độ protein tăng, khả năng hấp thụ nước tăng

Khi pH thay đổi thì sự tích điện của protein cũng thay đổi Do đó, ở điểmđẳng điện, sự hút nước là thấp nhất vì tương tác giữa protein – protein rất chặt chẽ

Ở pH cao hơn và thấp hơn pI, sự hấp thụ và giữ nước của protein tăng

Khi nhiệt độ tăng, khả năng hấp thụ nước giảm vì giảm các liên kết hydronhưng làm tăng các liên kết khác như liên kết disunfide…

1.1.1.2.3 Khả năng tạo gel

Protein đậu nành có khả năng tạo gel Khi đó protein tạo mạng lưới giữ cácphân tử nước lại cho thực phẩm chứa nhiều nước và có sự liên kết chặt chẽ như cấutrúc của agar

Khi protein bị biến tính, các cấu trúc bậc cao bị phá hủy, các mạchpolypeptide duỗi ra, tiến lại gần nhau, tiếp xúc và tạo nên mạng lưới không giantương đối chặt chẽ

Các yếu tố gây tạo gel:

 Sử dụng nhiệt: khi dịch sữa protein đậu nành có nồng độ cao đượcđun nóng ở pH trung tính thì sẽ tạo gel

 Sử dụng pH đẳng điện: ở pH đẳng điện, protein có khả năng tạo gel

 Sử dụng các muối của ion kim loại hóa trị 2: nhờ liên kết giữa Ca2+,

Mg2+ và nhóm carboxyl

1.1.1.2.4 Khả năng tạo kết cấu

Protein đậu nành có khả năng tạo sợi tốt Khi protein bị phân ly, chuỗipolypeptide duỗi mạch và cho qua khuôn đúc sẽ định hướng được các phân tửprotein và các sợi hình thành

1.1.1.2.5 Khả năng tạo nhũ

Trong phân tử protein đậu nành có đầu ưa nước và ưa béo nên có khả năng làm bền hệ nhũ tương chất béo/nước

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ:

 pH: ở điểm đẳng điện, khả năng hòa tan là thấp nhất nên khả năng tạonhũ giảm

 Nhiệt độ: gia nhiệt và cô đặc làm đông tụ protein nên làm giảm độ bềncủa nhũ tương, nhưng do khả năng tạo gel đã tạo nên lớp màng protein và chất béo(tàu hũ ki)

1.1.2 Quy trình sản xuất đậu hũ

1.1.2.1 Quy trình sản xuất đậu hũ

Sữa đậu

Gia nhiệt

Nước chuaKết tủa

NướcÉp

Đậu hũ

1.1.2.2 Thuyết minh quy trình

Quá trình này xảy ra hai giai đoạn:

 Giai đoạn đầu xảy ra quá trình solvat hóa Ở giai đoạn này các liên kếttrong hạt đậu chưa bị phá vỡ

 Giai đoạn hai xảy ra khi các phân tử nước tiếp tục tác động và làmphá vỡ liên kết các phân tử trong hạt đậu, chuyển chúng sang trạng thái dịch thể keo linhđộng nằm trong các tế bào hạt đậu

Thời gian ngâm:

 Nhiệt độ ngoài trời từ 15oC – 25oC, ta ngâm 5 – 6 giờ

 Nhiệt độ ngoài trời từ 25oC – 30oC, ta ngâm 3 – 4 giờ

 Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đậu đạt 55% - 65% là tốtnhất

1.1.2.2.3 Đãi vỏ

Mục đích: Sau khi ngâm, vỏ tách khỏi hạt đậu nành, tránh một số thành phầnkhông mong muốn có trong vỏ hạt như sắc tố, chất chát,… đi vào sữa đậu khixay, làm giảm chất lượng của đậu hũ

1.1.2.2.4 Xay

Mục đích: Dùng lực cơ học để phá vỡ tế bào, nhằm giải phóng protein, lipid,glucid, Nhờ có nước hòa tan các chất này và sẽ chuyển chúng sang dạng huyềnphù

Các biến đổi:

 Kích thước hạt đậu nành giảm đáng kể thành các hạt mịn

 Nhiệt độ tăng do ma sát giữa các hạt rắn trong quá trình xay

 Hóa lý: đây là biến đổi quan trọng vì các chất dinh dưỡng trong đậunành được trích ly vào nước, đậu nành chuyển từ trạng thái hạt rời thành hỗn hợp huyền phù gọi là sữa đậu nành thô

 Hóa sinh: có thể xảy ra phản ứng oxy hóa do enzyme lipoxygenasexúc tác Enzyme này được giải phóng ra khi tế bào hạt đậu bị phá vỡ Tuy nhiên,phản ứng xảy ra không đáng kể vì quá trình xay được thực hiện trong nước

 Ức chế enzyme và tiêu diệt toàn bộ các hệ vi sinh vật có mặt trong sữa

 Loại bỏ những hợp chất gây mùi khó chịu trong dịch sữa

 Phá vỡ lớp solvat (lớp nước bao quanh) tạo điều kiện cho các phần tửsữa gần lại nhau hơn và dễ keo tụ hơn

Các biến đổi:

 Độ nhớt của dịch sữa giảm khi nhiệt độ tăng

 Một số phản ứng phân hủy xảy ra làm tổn thất các thành phần dinhdưỡng trong dịch sữa

 Các thành phần đường khử và acid amin tham gia phản ứng Maillard làm cho dịch sữa bị sậm màu

1.1.2.2.7 Kết tủa

Một số phương pháp kết tủa protein đậu nành:

- Kết tủa bằng ion kim loại kiềm thổ kết hợp với nhiệt độ.

 Các muối đông tụ protein đậu nành: CaSO4, MgSO4, CaCl2, MgCl2…

 Quá trình cho chất đông tụ vào đơn giản, dễ kiểm soát, có thể chỉ cho một lần vào dung dịch

 Cơ chế đông tụ: đông tụ bằng muối của ion kim loại kiềm thổ xảy ratheo hai bước:

+ Bước 1: protein bị biến tính bởi nhiệt, các mạch polypeptide duỗi ra làm lộ các gốc –COO-

+ Bước 2: cation hóa trị 2 (kim loại kiềm thổ) cho vào sẽ liên kết các mạch protein lại với nhau nhờ các gốc –COO-, làm cho khối protein bị đông tụ

- Kết tủa bằng acid thực phẩm kết hợp với nhiệt độ

 Các acid thực phẩm được dùng làm tác nhân gây đông tụ protein như:acid acetic, acid lactic, acid citric, glucono – delta – lactone (GDL)… Trong các acid nói trên, acid lactic được sử dụng nhiều nhất

 Acid lactic: có dạng lỏng, không thuận lợi cho việc vận chuyển, sửdụng Ở các cơ sở sản xuất đậu hũ quy mô gia đình, người ta dùng nước chua – làacid lactic được tạo ra bằng cách lên men phần nước trong của sữa đậu nành saukhi tách protein

Bảng 1.4 So sánh hai phương pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành

Thời gian bảo quản Sản phẩm có pH = 6 – 6,8 Sản phẩm có pH = 5 – 5,5, khả

nên thời gian bảo quản năng ức chế vi sinh vật cao nên

Mùi vị Không có mùi thơm đặc Có mùi thơm đặc trưng của đậu

trưng của đậu nành nành

Trạng thái bìa đậu Bìa đậu bị cứng, ngả màu Bìa đậu mềm, cầm dẻo tay, màu

Ảnh hưởng đến sức Để lại dư lượng kim loại An toàn cho sức khỏe người

khỏe người dùng nặng như Cu, Pb, Hg… dùng

gây nguy hiểm cho sứckhỏe con người

1.1.2.2.8 Ép và định hình thành khuôn bánh

Sau khi chắt gạn nước xong, cho ngay hoa đậu kết tủa vào khuôn ép để loạinước, tạo khối cho sản phẩm Thời gian ép định hình khoảng 10 phút, dùng vậtnặng với khối lượng cố định để ép

1.1.3 Các chỉ tiêu chất lượng của đậu hũ

Bảng 1.5 Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997)

Hình dạng Sản phẩm có dạng hình hộp đáy chữ nhật, không bị vỡ nát

Cho phép không quá 20% sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ.Khối lượng sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ không quá 5%

Màu sắc Bề mặt màu trắng ngà, mặt cắt màu trắng

Mùi vị Mùi thơm, vị ngon của đậu hũ không có mùi ôi, chua, khê và

các mùi vị lạ khác

Tạp chất Không có cát sạn, mảnh vụn của cháy đậu và các loại tạp chất

khác

Trạng thái Bề mặt đậu hũ mịn, sờ vào hơi ráp tay, không mủn bột Khi

sản xuất xong, để nguội ở nhiệt độ phòng, đậu hũ phải dẻo,khi cầm ở giữa miếng đậu không bị nứt Mặt cắt của đậu hũ

mịn, nhẵn trên mặt cắt ngang của đậu hũ có lỗ hổng khôngquá 3 Ăn sống có cảm giác béo ngậy, dai Miếng đậu khi rángphải nở đều.

Bảng 1.6 Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011)

Bảng 1.7 Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78)

1.1.4 Những nguyên nhân và biến đổi gây hư hỏng đậu hũ

1.1.4.1 Những nguyên nhân gây hư hỏng đậu hũ

Có 2 nguyên nhân cơ bản dẫn đến giảm chất lượng và hư hỏng thực phẩm:

do hoạt động của vi sinh vật và do hoạt động sinh lý, sinh hóa của nguyên liệu.Ngoài ra, các yếu tố khác như độ ẩm môi trường, ánh sáng, không khí cũng ảnhhưởng không nhỏ tới chất lượng của thực phẩm

Các vi sinh vật gây hư hỏng bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và một

số loại tảo, kí sinh trùng, virus Khi xâm nhập vào thực phẩm, đầu tiên vi sinh vật

sẽ phát triển về mặt số lượng, trong quá trình đó chúng tiết ra các sản phẩm thải,làm biến đổi màu sắc, trạng thái, mùi vị của thực phẩm dẫn đến hư hỏng hoặc giảmchất lượng thực phẩm

Vi khuẩn có khả năng tiết ra nhiều enzyme hỗn hợp có thể phân hủy được tất

cả các thành phần protein, glucid, lipid có trong thực phẩm Sự lên men glucid hìnhthành các acid hữu cơ làm cho môi trường trở nên acid Trong quá trình này, cácacid được tạo thành như acid acetic, acid lactic, … ức chế vi sinh vật gây thối Nấmmen, nấm mốc tiêu thụ các acid làm cho môi trường trở nên trung tính Vi sinh vậtgây thối bắt đầu phát triển chuyển hóa protid thành peptid, acid amin,… và cuốicùng là các chất đơn giản bay hơi có mùi khó chịu như NH3, H2S, indol, phenol,…

Quá trình hư hỏng đậu hũ luôn bắt đầu từ bề mặt sau đó mới đi dần vào bêntrong Thường trong giai đoạn đầu các vi khuẩn chứa enzyme hỗn hợp sẽ nhân lêntrước và hoạt động mạnh mẽ để khai phá nguyên liệu, sau đó đến lượt các vi khuẩnchứa enzyme đơn tiến hành phân hủy thực phẩm một cách mạnh mẽ và triệt để.Cùng với các enzyme do vi sinh vật tiết ra thì đồng thời những enzyme có sẵn trongbản thân khối thực phẩm cũng bị kích hoạt và tham gia vào các phản ứng phân hủylàm tăng tốc độ hư hỏng của thực phẩm

Đậu hũ là loại thực phẩm chứa nhiều protein, glucid và lipid Mặt khác, hàmlượng nước trong đậu hũ rất cao, đây là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật gây

hư hỏng phát triển

1.1.4.2 Những biến đổi của đậu hũ trong quá trình hư

hỏng - Biến đổi protein:

Từ các chất đạm tạo ra các chất như: amoniac, phenol, indol…và các aminnhư: putresin, tyramin, histamin,…

Yếu tố quyết định tốc độ quá trình hư hỏng là nhiệt độ, độ ẩm tương đốicủa không khí và mức độ nhiễm vi sinh vật ban đầu Quá trình biến đổi protein thểhiện qua các dạng thối rữa, lên mốc, đổi màu, hóa nhầy…

- Sự lên men thối: quá trình lên men thối được chia làm 3 giai đoạn:

 Quá trình thủy phân protein dưới tác dụng của enzyme protease do vi sinhvật tiết ra tạo thành nhiều sản phẩm trung gian và cuối cùng là acid amin

 Quá trình khử acid amin thành amoniac, acid (acetic, propyonic, butyric),rượu (propyolic, butylic, amylic), H2S, indol, skatol

 Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân hủy sơ bộ acid amin lại tiếptục chuyển hóa Tùy theo loại vi sinh vật và điều kiện môi trường mà các hợp chất

đó bị oxy hóa hoàn toàn cho ra các hợp chất vô cơ như CO2, H2O, NH3, H2S Trongđiều kiện kỵ khí sẽ cho ra các acid hữu cơ, rượu, amin, trong đó có nhiều chất độc

và mùi hôi thối

Các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh như Bacterium Vulgaris, Bacterium Paecalis, Pseudomonas Fiuoresen,… vi khuẩn yếm khí như Bacillus Spectogennes, Bacillus Putripicus, Bacillus Putripiciens, Bacillus Postamus, Clostridium Butulinum, Clostridium Sporogenes…

- Sự lên men chua:

Trong quá trình lên men chua xảy ra hàng loạt các quá trình: quá trình tăngsinh khối của vi sinh vật tạo ra acid lactic, quá trình ức chế sự phát triển của vikhuẩn gây thối bởi acid lactic và muối Quá trình này xảy ra 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: đường và các chất hòa tan có trong dịch bào của mô thực vậtđược thẩm thấu ra ngoài tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật khácphát triển

 Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này, sinh khối của vi khuẩn lactic đạt caonhất Đồng thời acid lactic tích tụ nhiều, pH của dịch giảm Do tác dụng của vi khuẩnlactic mà các vi khuẩn gây thối phát triển rất nhanh Cuối giai đoạn này

lượng acid lactic tích tụ cực đại nên quá trình chyển sang giai đoạn 3

 Giai đoạn 3: Vi khuẩn lactic chết dần trong khi nấm mốc và nấm men lạităng dần số lượng Acid lactic bắt đầu giảm nên sản phẩm hư hỏng nhanh

- Biến đổi lipid:

 Sự hóa chua lipid (sự thủy phân): sự tạo thành gốc tự do do hoạt động củaenzyme Dạng phân giải lipid này liên quan đến cả hai quá trình thủy phân lipid và sựoxy hóa acid béo do hoạt động của enzyme lipoxydase Quá trình thủy phân lipid gây ra

do vi sinh vật hoặc enzyme lipase nội tại Bước đầu tiên của phản ứng này là sự thủyphân triglyceride tạo thành glycerol và các acid béo tự do Glycerol làm

tăng độ nhớt, nhầy của chất béo Các acid béo tạo ra càng nhiều càng làm cho thực phẩm bị chua (chỉ số acid tăng cao, chất lượng chất béo giảm)

 Oxy hóa: dưới tác động của enzyme lipoxydase và oxy không khí Sau khithủy phân các sản phẩm glycerin và các chất béo tiếp tục bị oxy hóa tạo ra nhiều sảnphẩm khác nhau, trong đó nhiều sản phẩm độc hại như: peroxyde, hydroperoxyde,

ceton,… Các sản phẩm này làm cho thực phẩm có mùi khó chịu

1.2 Tổng quan về chitin - chitosan

1.2.1 Giới thiệu về chitin – chitosan

Chitin, chitosan là những polysaccharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượngrất lớn (đứng thứ 2 sau cellulose)

Chitin lần đầu tiên được tìm thấy trong nấm bởi nhà khoa học người PhápBraconnot vào năm 1811, nó cũng được tách ra từ biểu bì của sâu bọ và được đặttên là chitin, có nghĩa là bao bọc, tức là vỏ bọc của cuộc sống trong tiếng Hy Lạp,bởi nhà khoa học người Pháp Odier vào năm 1823

Và chất được khử acetyl từ chitin đã được khám phá bởi Roughet vào năm

1859, nó được đặt tên là chitosan bởi nhà khoa học người Ðức Hoppe Seyler vàonăm 1894 Chitosan (được chuyển hoá từ chitin) rất độc đáo, là polymer hữu cơ tự

nhiên duy nhất mang điện tích dương do có những nhóm amino tự do tích điệndương, điều này khiến cho chitosan có những thuộc tính đặc biệt hơn nhóm amidecủa chitin.

Cho đến hôm nay, việc sử dụng hợp chất thiên nhiên này vẫn còn rất ít, vìchitin/chitosan dù dồi dào nhưng lại ở các nguồn phân tán quá rộng, đặc biệt hàmlượng chứa trong các nguồn ấy thường nhỏ, không đạt hiệu quả kinh tế (giá thànhđiều chế chitosan còn rất đắt) Hơn nữa, cả chitin và chitosan đều rất khó tan trongcác dung môi thông thường và các phản ứng hoá học nhằm biến tính chúng đều tốnkém và có hiệu suất thấp

1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan

1.2.2.1 Cấu trúc hóa học của chitin

Chitin là polysaccharide mạch thẳng, có thể xem như là dẫn xuất củacellulose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm acetylamino (-NHCOCH3) (cấu trúc I) Như vậy chitin là poly-(N-acety-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-(C-1-4) glycoside.Trong đó các mắt xích của chitin cũng được đánh số như của glucose

Hình 1.2 Cấu tạo hóa học của chitinTên gọi: poly(1 – 4) – 2- acetamido – 2 – deoxy – β- D- Glucose

Công thức phân tử : [ C8H13O5N ]n

Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n

1.2.2.2 Cấu trúc hóa học của chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thếnhóm (-COCH3) ở vị trí C(2)

Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởicác liên kết β-(1-4)-glycozide, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose hoặc là poly β-(1,4)-D-glucosamine (cấu trúc III)

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của chitosanTên gọi: Poly(1,4) – 2- amino- 2- deoxy- β- D- glucose

Công thức phân tử: [ C6H11O4N ]n

Phân tử lượng: Mchitosan= (161,07)n

Qua cấu trúc hóa học của chitin và chitosan, ta thấy chitin chỉ có 1 nhómchức hoạt động là –OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hidoxylbậc 2 trong vòng 6 cạnh), còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH và –NH2,

do đó dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin

Chitin có cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ở dạng rắn Do

đó, các phương pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, phương pháp hoá học để

biến tính chitin cũng như việc sử dụng và lựa chọn các ứng dụng của chitin gặpnhiều khó khăn.

Mặt khác, khả năng ứng dụng của chitin thường thấp hơn so với các dẫn xuấtcủa nó như chitosan, glucosamine, vì vậy chitin thường được sử dụng để điều chếcác dẫn xuất của nó Chitosan là một chất có nhiều đặc tính hóa học thích hợp nênđược nghiên cứu sử dụng trong nhiều ngành lĩnh vực

1.2.3 Tính chất của chitosan

1.2.3.1 Mức độ deacetyl hóa

Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân

tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao.Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi

vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này.Mức độ deacetyl hóa của chitosan vào khoảng 56% - 99% (nhìn chung là 80%) phụthuộc vào loài giáp xác và phương pháp sử dụng Chitin có mức độ deacetyl hóakhoảng 75% trở lên thường được gọi là chitosan

Phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI…

1.2.3.2 Trọng lượng phân tử

Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân tử cao Giống như cấu tạo,khối lượng nguồn nguyên liệu và phương pháp chế biến Khối lượng chitin thườnglớn hơn 1 triệu Da trong khi các sản phẩm chitosan thương phẩm có khối lượngkhoảng 100,000 – 1,200,000 Da, phụ thuộc quá trình chế biến và loại sản phẩm.Thông thường, ở nhiệt độ cao, sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phânhủy chitosan Giới hạn nhiệt độ là 280°C, sự phân hủy do nhiệt xảy ra và mạchpolymer nhanh chóng bị phá vỡ, do đó khối lượng phân tử giảm

1.2.3.3 Độ nhớt

Độ nhớt là một nhân tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử củachitosan Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao,điều này có thể không mong muốn trong đóng gói công nghiệp

Một số nhân tố trong quá trình sản xuất như mức độ deacetyl hóa, khốilượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ ảnhhưởng đến sản xuất chitosan và tính chất của nó Quá trình loại protein trong dungdịch NaOH 3% và sự khử trong quá trình khử khoáng làm giảm độ nhớt của dungdịch chitosan thành phẩm Tương tự như vậy, độ nhớt của chitosan bị ảnh hưởngđáng kể bởi các biện pháp xử lý vật lý (nghiền, gia nhiệt, hấp khử trùng, siêu âm)

và hóa học (xử lý bằng ozone), trừ quá trình làm lạnh thì độ nhớt sẽ giảm khi thờigian và nhiệt độ xử lý tăng Dung dịch chitosan bảo quản ở 4°C được cho là ổnđịnh nhất

1.2.3.4 Tính tan

Chitin tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, trong khi đó chitosan tantrong các dung dịch acid có pH dưới 6,0 Các acid hữu cơ như acetic, formic vàlactic thường được sử dụng để hòa tan chitosan Thường sử dụng nhất là dungdịch chitosan 1% tại pH 4,0 Chitosan cũng tan trong dung dịch HCl 1% nhưngkhông tan trong H2SO4 và H3PO4 Dung dịch acid acetic nồng độ cao tại nhiệt độcao có thể dẫn đến depolymer hóa chitosan Ở pH cao, có thể xảy ra hiện tượng kếttủa hoặc đông tụ, nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp poly_ion với chất keoanion

Tỉ lệ nồng độ giữa chitosan và acid rất quan trọng Ở nồng độ dung môi hữu

cơ cao hơn 50%, chitosan vẫn hoạt động như là một chất gây nhớt giúp cho dungdịch mịn Một số nhân tố ảnh hưởng đến dung dịch chitosan bao gồm nhiệt độ vàthời gian quá trình deacetyl hóa, nồng độ các chất kiềm, việc xử lý sơ bộ, kíchthước của các phần tử

1.2.3.5 Khả năng kết hợp với nước (WBC) và khả năng kết hợp với chất béo

(FBC)

Sự hấp thụ nước của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin.Thông thường, khả năng hấp thụ của chitosan khoảng 581 - 1150% (trung bình là702%), và sự thay đổi trong thứ tự sản xuất như quá trình khử khoáng và khửprotein cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng giữ nước và giữ chất béo Sự khử

protein sau quá trình khử khoáng sẽ làm khả năng giữ nước tăng Bên cạnh đó quátrình khử màu cũng là nguyên nhân làm giảm khả năng này của chitosan.

Khả năng hấp thụ chất béo của chitin và chitosan trong khoảng 315 - 170%,chitosan có khả năng thấp hơn rất nhiều chitin Bước tẩy trắng trong quá trình sảnxuất làm giảm khả năng này cũng như ảng hưởng đến độ nhớt của chitosan Cácbước tiến hành theo thứ tự: khử khoáng, khử protein, deacetyl hóa sẽ làm tăng khảnăng này hơn là theo thứ tự khử protein, khử khoáng, deacetyl hóa

1.2.3.6 Khả năng tạo màng

Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm nhằmhạn chế các tác nhân gây bệnh trong các sản phẩm đóng gói thịt, cá tươi hay đã quachế biến

 Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng khôngkhí cho thực phẩm Nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ

bị ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển

 Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương vớimột số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói

 Màng chitosan làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả Rau quảsau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị Rau quả bịthâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polymer hóa của oquinon Nhờbao gói bằng màng chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol,làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ítbiến đổi, giữ cho rau quả tươi lâu hơn

 Chitosan được nghiền nhỏ bằng máy để gia tăng bề mặt tiếp xúc

 Pha dung dịch chitosan 3% trong dung dịch acid acetic 1,5%

 Sau đó bổ sung chất phụ gia PEG - EG 10% (tỷ lệ 1:1) vào và trộn đều, để yên một lúc để loại bọt khí

 Sau đó đem hỗn hợp thu được quét đều lên một ống inox đã đượcnung nóng ở nhiệt độ 64 - 65°C (ống inox được nâng nhiệt bằng hơi nước)

 Để khô màng trong vòng 35 phút rồi tách màng.

 Lúc này người ta thu được một vỏ bóng có màu vàng ngà, khôngmùi vị, đó là lớp màng chitosan có những tính năng mới ưu việt

1.2.3.7 Tính kháng khuẩn của chitosan

Cơ chế chính xác về hoạt động kháng khuẩn của chitosan, chitin và các dẫnxuất của chúng vẫn chưa được biết đến đầy đủ Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chếđược quan tâm:

- Cơ chế thứ nhất:

Chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa

số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị

hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiệnnhững lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạocủa tế bào bị thoát ra ngoài dẫn đến tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon,1999)

Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm

kháng lại E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm

tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn Nghiên cứu cũng chỉ ra cơ chế ức chế vikhuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kimloại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Khi bổ sungchitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điệndương Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp

hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện

dương ở màng của vi khuẩn Chitosan N – carboxybutyl – một polycation tự nhiên,

có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid có trên bề mặt vikhuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau

Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnhhưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+, Mg2+ và Ca2+ Nồng độlớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+ đối

với hoạt động kháng Staphylococcus aureus Người ta cũng thấy rằng chitosan

có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn Khi sử dụngchitosan thì một lượng lớn các ion K+ và ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm Candida albicans Cả chitosan phân tử lượng 50 kDa và 5 kDa đều

kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50 kDa làm mất nhiều gấp 2

-4 lần ion K+ và ATP so với chitosan 5 kDa Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩnkhác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp và cao Hoạt động kháng khuẩn củachitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn Cơ chế

kháng khuẩn này đã được chứng minh dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào

vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào Kết quả chỉ ra rằng khả năng nàygiảm khi khối lượng nguyên tử tăng và tăng cao ở nồng độ pH thấp, giảm rõ rệt khi

có mặt ion Ca2+, Mg2+ Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0,03 – 0,25%, thay đổitùy từng loài vi khuẩn và khối lượng phân tử của chitosan Đối với vi khuẩn gram

dương, chitosan 470 kDa có ảnh hưởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus spp.,

trong khi với vi khuẩn gram âm, chitosan có khối lượng 1106 kDa mới có ảnhhưởng Điều này là do vi khuẩn gram dương nhạy cảm hơn, vi khuẩn gram âm cólớp màng chắn bên ngoài (Zhong và cộng sự, 2008)

Theo Ming Kong và cộng sự (2008), tất cả các vi khuẩn gram âm có mộtmàng ngoài do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS) Sự ổn định của lớpLPS thông qua tương tác tĩnh điện với các cation hóa trị 2 Giống như EDTA,chitosan loại bỏ các cation, việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màngngoài

Cơ chế hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn gramdương và gram âm (Zheng & Zhu, 2003) Trong nghiên cứu này, họ phân biệt tác

động của chitosan trên Staphylococcus aureus (gram dương) và Escherichia coli (gram âm) Đối với Staphylococcus aureus, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lượng phân tử của chitosan Trong khi đó, với E.coli, hoạt động kháng khuẩn

tăng lên khi giảm trọng lượng phân tử Các tác giả gợi ý hai cơ chế khác nhau cho

hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trường hợp của Staphylococcus aureus, các

chitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một màng polymer, ức chế các

chất dinh dưỡng đi vào tế bào (2) Đối với E.coli, chitosan trọng lượng phân tử thấp

sẽ đi vào các tế bào thông qua sự lan tỏa

- Cơ chế thứ hai:

Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra cáctương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin vàtổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu cácthành phần dinh dưỡng của vi sinh vật…(Sudarshan và cộng sự, 1992)

Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan:

- Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt động ứcchế vi khuẩn và nấm Một trong các đồng phân của chitosan là N - carboxybutylchitosan có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh Khi cóchitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sựphát triển của những loài này Ở nồng độ 0,1% và pH 5,6, chitosan kháng các loại

nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những

vi sinh vật mà trên thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitin – ß – glucan

- Chitosan đã được cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật và HànQuốc lần lượt từ năm 1983 và 1995 Chính hoạt động ức chế vi khuẩn của

chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó

có chức năng tăng cường hoạt động kháng khuẩn như là một chất bảo quản tự

nhiên Ở pH 5,5, với nồng độ 0,5 - 1% chitosan có tác dụng ức chế đến các loài

Staphylococcus aureus, E.coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes Ở

pH 6,5 chỉ có Staphylococcus aureus bị ức chế ở nồng độ 0,5% trong khi các loài

khác vẫn phát triển ở nồng độ 2,5% (nồng độ cao nhất đã được nghiên cứu).Chitosan phân tử nhỏ có tính kháng các tác nhân gây bệnh trên thực vật mạnh hơnrất nhiều các chất phân tử lớn

- Các hợp chất chitosan lactate và chitosan hydroglutamate cũng được sử

dụng như là tác nhân ức chế E.coli, Staphylococcus aureus và Saccharomyces cerevisiae Nồng độ chitosan lactate trong nước cất có ảnh hưởng mạnh nhất đến

E.coli Chưa đến 1h, số lượng vi khuẩn này giảm khoảng 104, còn Staphylococcus aureus giảm đến 106 Đối với nấm men, chúng hoàn toàn ngừng hoạt động ở nồng

độ 1 mg/ml chitosan lactate sau 17 phút

Độc tính của chitosan:

- Nghiên cứu về độ an toàn, độ độc tích lũy:

Chitosan được thử độ an toàn (LD50) trên 123 chuột trắng (18 – 21 g) chia 5đợt, với liều lượng tăng dần 0,0025 - 0,020 g/ngày cho mỗi chuột Theo dõi liên tụctrong 72 giờ Kết quả chuột vẫn khỏe mạnh, không chuột nào chết

Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02 g một ngày cho mộtchuột, cho uống liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh bình thường

- Độc tính cấp:

Trên 5 lô chuột nhắt trắng (50 con) cho uống chitosan với liều lượng 9 g/kgcân nặng, theo dõi liên tục 72 giờ: không có chuột nào chết, suy ra chỉ số điều trị là250g theo đường uống, chứng tỏ chitosan dùng an toàn

- Độc tính tại chỗ

Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy chitosan không gây tổn thương các

cơquan, không gây phù nề tại chỗ, không gây phản ứng giãn mạch tại chỗ trên thỏ vàchuột cống thực nghiệm

- Kết quả

Chitosan được thử trên động vật thực nghiệm(chuột nhắc, chuột cống, thỏ),kết quả cho thấy: chitosan không gây độc tính tại chỗ, không ảnh hưởng đối vớitrọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu hóa sinh trongnước tiểu của động vật thực nghiệm.

1.2.4 Các phương pháp thu nhận chitosan

Chitosan được sản xuất theo quy trình như sau:

Chuyển chitin thành chitosan:

Ngâm trong NaOH 60%, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ 65oC, thời gian 20h

Rửa trung tính

Làm khô

Hình 1.4 Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosanTheo Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007), hiện nay có hai nhómphương pháp sản xuất chitin từ vỏ giáp xác là phương pháp hóa học và sinh học,trong đó phương pháp hóa học tách chiết chitin là phương pháp đã có từ rất lâu vàngày nay vẫn là phương pháp chính được áp dụng trong sản xuất polymer sinh họcnày, còn phương pháp sinh học mới được nghiên cứu áp dụng trong thời gian gầnđây với mục đích thay thế phương pháp hóa học truyền thống tiêu hao nhiều hóachất và gây ô nhiễm môi trường Hai nhóm phương pháp này giống nhau ở điểm làchúng đều được thực hiện theo 3 công đoạn chính đó là: loại khoáng, loại protein,loại các chất màu, tuy trình tự các công đoạn có thể phụ thuộc vào từng phươngpháp cụ thể Điểm khác nhau căn bản của hai nhóm phương pháp này là ở cách loạiprotein Trong các phương pháp sinh học, protein bị loại trong những điều kiện rất

“mềm” nhờ sử dụng hoạt tính proteolytic (phân hủy protein) của các enzyme thuộcnhóm proteinase, còn trong các phương pháp hóa học protein bị loại bằng acid vàkiềm

Bảng 1.8 Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phương pháp hóa học

và sinh học (Phạm Thị Đan Phượng và Trang Sĩ Trung, 2012)

chiết rút bằng phương rút bằng phương pháp

Độ đục (NTU) 26,3 2,8 42,2 6,4

Kết quả cho thấy chitosan sản xuất từ hai loại chitin với quá trình khử proteinkhác nhau thì tính chất khác nhau Sử dụng quy trình khử protein bằng phươngpháp sinh học có hàm lượng protein và khoáng còn lại cao hơn so với phương pháphóa học nên ảnh hưởng đến chất lượng chitosan thu được Bên cạnh đó, độ nhớt và

độ deacetyl của chitosan cũng bị ảnh hưởng rõ rệt bởi chất lượng chitin ban đầu

Độ nhớt của chitosan từ chitin khử protein bằng phương pháp sinh học thì cao hơnnhưng độ deacetyl thì thấp hơn so với mẫu chitosan từ chitin khử protein bằngphương pháp hóa học Độ nhớt cao của phương pháp xử lý sinh học có thể do khi

xử lý bằng Flavourzyme thì chitin ít bị cắt mạch so với phương pháp hóa học.Nhưng hàm lượng protein và khoáng còn lại trong chitin đã làm giảm hiệu quả củaquá trình deacetyl, dẫn đến chitosan từ chitin xử lý sinh học có độ deacetyl thấphơn

Chitosan từ chitin khử protein bằng phương pháp sinh học có thể ứng dụngvào các lĩnh vực như nông nghiệp và xử lý môi trường (chất kích thích sinh học,keo tụ trong xử lý môi trường…) với yêu cầu về độ tinh sạch không cao thì phươngpháp xử lý sinh học là một sự lựa chọn hợp lý vì đây là phương pháp sản xuất thânthiện với môi trường

1.2.5 Chitosan tan trong nước (WSC)

1.2.5.1 Điều chế chitosan tan trong nước

Chitosan tan trong nước (WSC) được điều chế theo phương pháp acetyl hóa.Hòa tan 25 g chitosan trong 500 ml dung dịch acid lactic 3% thu được dung dịch A.Sau đó cho 150 ml cồn 96o vào dung dịch A, khuấy đều được dung dịch B Cho 15

ml anhydride acetic vào 150 ml cồn 96o, khuấy đều ta được dung dịch C Cho từ từ

C vào B, khuấy đều để thực hiện phản ứng acetyl hóa trong 2 giờ Dung dịchchitosan đã acetyl hóa được điều chỉnh pH về 7 – 7,5 bằng NH4OH 5% và được kếttủa bằng cồn 96o Lọc kết tủa qua vải, rửa kết tủa bằng cồn 96o vài lần, sau đó sấyquạt cho bay hết dung môi cồn 96o, thu được chitosan tan trong nước

Chitosan tan trong nước được điều chế theo phương pháp trên có độdeacetyl hóa DDA = 60,1% và có khối lượng phân tử trung bình là 249790 Da(Nguyễn Thị Thanh Hải, 2012).

1.2.5.2 Tính chất của WSC

Theo Ying Chien Chung (2011), hoạt động kháng khuẩn của chitosan hòa tan

trong nước được đánh giá trên 6 loại vi sinh vật: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, B cereus, E.coli, Shigella dysenteriae và Salmonella typhimurium

ở các pH khác nhau của chitosan hòa tan trong nước và chitosan hòa tan trong acid.Kết quả của bài báo cáo này kết luận rằng, khả năng kháng khuẩn của chitosan tan

trong nước cao hơn chitosan tan trong acid

Bảng 1.9 Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosantan trong nước

pháp hóa học pháp sinh học

Hàm lượng tro (%) 0,98 ± 0,6 1,89 ± 0,03 0,05 ± 0,003Hàm lượng protein (%) 0,93 ± 0,1 1,95 ± 0,05 0,2 ± 0,01

Ngoài khả năng kháng khuẩn cao của chitosan tan trong nước thì theo bảng1.9 cho thấy hàm lượng protein và hàm lượng khoáng của chitosan tan trong nướcthấp hơn so với chitosan tan trong acid nên có độ tan tương đối cao (> 99%) Dohàm lượng protein và hàm lượng khoáng của chitosan tan trong acid cao hơnchitosan tan trong nước nên độ deacetyl hóa của chitosan tan trong acid thấp hơn sovới chitosan tan trong nước

Tóm lại, chitosan tan trong nước có độ tan tương đối cao, độ deacetyl caohơn và khả năng kháng khuẩn của chitosan tan trong nước tốt hơn chitosan tantrong acid.

1.2.6 Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm

1.2.6.1 Chất làm trong - Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả

Trong sản xuất nước quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc Thực tế hiệnnay đang sử dụng các chất làm trong như: genatin, bentonite, kali caseinate, tannin,polyvinyl pirovinyl Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ đi đục, giúp điều chỉnh acidtrong nước quả

Chitosan được sử dụng như tác nhân lọc các chất lơ lửng trong nước quả

Sử dụng dung dịch chitosan 2% trong acid acetic 7% giúp làm giảm độ đục hiệuquả hơn so với sử dụng bentonite và gelatin Đối với nước táo, khi sử dụng dungdịch chitosan hòa tan trong acid malic 2%, người ta nhận thấy rằng độ đục giảmđáng kể khi tăng lượng chitosan sử dụng từ 0,1 – 0,7 g/l nước quả Tuy nhiên, khităng lên đến 1 g/l thì độ đục tăng lên, điều đó được giải thích là do sự bão hòa vềtính chất hấp phụ của chitosan

Chitosan còn được dùng để điều chỉnh độ chua của nước quả Imeri vàKnorr (1998) đã nghiên cứu chitosan nồng độ 1,2% trong 2% acid ascorbic đối vớinước ép cà rốt và táo, kết quả cho thấy chitosan làm giảm đáng kể lượng acid củadịch ép

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có ái lực lớn đối với hợp chấtpholyphenol chẳng hạn: catechin, proanthocianydin, acid cinamic, những chất mà

có thể biến màu nước quả bằng phản ứng oxy hóa

1.2.6.2 Bảo quản trứng gà tươi

Ở nhiệt độ thường, trứng gà tươi bọc màng chitosan nồng độ 1,5% có bổsung 0,05% Sodium Benzoate hoặc 1% Sorbitol có khả năng duy trì hạng chất lượng ở mức A đến 15 - 20 ngày sau khi đẻ

Trong khi đó, trứng gà tươi không qua bọc màng chỉ duy trì hạng chất lượng

ở mức A không quá 5 ngày sau khi đẻ Đồng thời các chỉ tiêu chất lượng khác (hao

hụt khối lượng, chỉ số màu lòng đỏ trứng) đều có biến đổi lớn hơn so với trứng có

xử lý màng bọc chitosan Kết quả nghiên cứu của PGS.TS Trần Thị Luyến (Trường

ĐH Nha Trang) và Th.S Lê Thanh Long (Trường ĐH Nông Lâm Huế) đã cho thấymàng bọc không tạo cảm giác khác lạ cho người sử dụng so với trứng gà tươithương phẩm cùng loại về chất lượng cảm quan bề mặt

Phương pháp tạo màng trên vỏ được các nhà khoa học thực hiện như sau:trứng gà tươi sau khi gà đẻ không quá 24 giờ, không rạn nứt, không có khuyết tật vàđạt tiêu chuẩn TCVN 1858 : 1986 Sau đó tiến hành lau sạch và nhúng trong dungdịch bao màng chitosan được chuẩn bị gồm hỗn hợp dung dịch lọc bao gồmchitosan 1,5% pha trong dung dịch acetic acid 1% bổ sung thêm SB 0,05%, hoặcSOR 1% Tiếp theo để khô tự nhiên và bảo quản ở nhiệt độ thường nơi khô ráothoáng mát

1.2.6.3 Sử dụng trong thực phẩm chức năng

Chitosan có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu Nếu sửdụng thực phẩm chức năng có bổ sung 4% chitosan thì lượng cholesterol trong máugiảm đi đáng kể chỉ sau 2 tuần Ngoài ra chitosan còn được xem là chất chống đông

tụ máu Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong máu và chống đông tụ máu đượcbiết là do không cho tạo các mixen Điều chú ý là ở pH = 6 – 6,5 chitosan bắt đầu bịkết tủa, toàn bộ chuỗi polysaccharide bị kết lắng và giữ lại toàn bộ lượng mixentrong đó Chính nhờ đặc điểm quan trọng này chitosan được ứng dụng trong sảnphẩm thực phẩm chức năng

1.2.6.4 Thu hồi protein

Whey được coi là chất thải trong công nghiệp sản xuất phomat, nó có chứamột lượng lớn lactose và protein ở dạng hòa tan Nếu thải trực tiếp ra ngoài sẽ gây ônhiễm môi trường, còn nếu xử lý nước thải thì tốn kém do vận hành hệ thống dẫnđến hiệu quả kinh tế không cao Việc thu hồi protein trong whey được xem là biệnpháp làm tăng hiệu quả kinh tế của sản xuất phomat Whey protein khi thu hồi được

bổ sung vào đồ uống, thịt băm và các loại thực phẩm khác Nhiều phương phápkhác nhau đã được đưa ra nhằm thu hồi protein và chitosan được coi là

mang lại nhiều hiệu suất phân tách cao nhất Tỷ lệ chitosan để kết bông các hạt lơlửng là 2,15% (30 mg/l); độ đục thấp nhất ở pH 6,0 Nghiên cứu về protein thuđược bằng phương pháp này: không hề có sự khác biệt về giá trị giữa protein cóchứa chitosan và protein thu được bằng đông tụ casein hoặc whey protein.

Ngoài thu hồi protein từ whey, người ta sử dụng chitosan trong thu hồi cácacid amin trong nước của sản xuất đồ hộp , thịt, cá…

1.2.6.5 Phân tách rượu - nước

Chitosan được xử lý đặc biệt để tạo ra dạng màng rỗng Với việc điều chỉnhtốc độ thẩm thấu (lượng chất lỏng đi qua màng khoảng 1 m3/h) Màng này được sửdụng trong hệ thống phản ứng đòi hỏi không dùng nhiệt độ quá cao Việc phân táchnày chỉ loại đi nước, kết quả là hàm lượng ethanol có thể lên đến 80%

1.2.6.6 Ứng dụng làm màng bao (bảo quản hoa quả)

Lớp màng không độc bao quanh bên ngoài khối nguyên liệu nhằm hạn chế sựphát triển vi sinh vật bề mặt - một nguyên nhân chính gây thối hỏng thực phẩm

N-O carboxymethy (NOCC) được xử lý đặc biệt từ phản ứng của chitosan vàmonochloroacetic acid trong điều kiện kiềm, NOCC có thể hòa tan trong dung dịch

ở pH > 6 hoặc pH < 2 Màng NOCC dẻo có thể tạo thành ngay trong dung dịchnước đó Lớp màng này có tính thấm chọn lọc các khí như oxy, cacbon dioxide màcòn có khả năng phân tách hỗn hợp khí như: ethylene, ethane, acetylence

Quả táo được nhúng hoặc phun bởi màng NOCC có thể giữ độ tươi hơn 6tháng và độ acid trong khoảng 250 ngày nếu ở điều kiện bảo quản lạnh Màng nàymang lại cho quả độ bóng sáng nhưng trong và không nhớt khi cầm Chúng dễ dàngloại đi bằng rửa với nước, NOCC cũng có hiệu quả đối với bảo quản các loại tráicây khác như lê, đào, mận Lê được xử lý với NOCC tỷ lệ bị mắc hỏng thịt cùi vàthối ít hơn so với lê ở không khí có tỷ lệ oxygen là 1 - 2% Viện bảo vệ và chăm sócsức khỏe Canada đã chứng minh rằng việc sử dụng NOCC trên quả, khi sử dụngkhông cần phải rửa và lột vỏ trước khi ăn Bởi vì NOCC vẫn chứa lượng amin tự