Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú​

Xác định các thành phần trong quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic với chủng L..  Công nghiệp giấy Do có khả năng phân hủy sinh học nên chi

Ngành: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện MSSV: 0851110242

: TS Nguyễn Hoài Hương : Nguyễn Thị Ngọc Thu Lớp: 08DSH2

MỞ ĐẦU

Với hiện trạng các nhà máy sản xuất thuỷ sản, đặc biệt là tôm lột vỏ, đã thải ramôi trường hàng tấn vỏ tôm như là nguồn chất thải đã gây ô nhiễm môi trường trầmtrọng Hơn thế nữa, vỏ tôm là một nguồn tài nguyên quý nếu ta biết cách sử dụng.Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tái sủ dụng vỏ tôm như làm thức ăngia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp chất quý trong vỏ tôm như chitin,carotenoid Các hợp chất này có rất nhiều ứng dụng trong cuộc sống Vì vậy, emnhận thấy vấn đề thu nhận chitin từ vỏ tôm là việc vô cùng quan trọng hiện nay Nóvừa giúp cải thiện môi trường mà còn đem lại một nguồn lợi vô cùng lớn cho conngười

Tuy nhiên, các quy trình sản xuất chitin trước đây thường dùng công nghệ hoáhọc, vì vậy nó không những không góp phần bảo vệ môi trường mà còn gây hạithêm bởi một lượng lớn các chất hoá học với nồng độ cao thải ra ngoài môi trườngtrong quá trình chế biến

Trước thực tiễn trên, em nhận thấy cần phải nghiên cứu thêm về các quy trìnhthu nhận chitin bằng phương pháp sinh học để tránh các thiệt hại cho môi trường

đồng thời thu về nguồn lợi quý từ chitin Do đó, em đã thực hiện đề tài “Nghiên

cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú”.

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ởẤn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp… đều tìm được điểm chung là phương pháp lên menlactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn

Xác định các thành phần trong quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng

phương pháp lên men lactic với chủng L acidophilus Acid lactic sinh ra trong quá

trình lên men sẽ loại các ion khoáng trong nguyên liệu vỏ tôm như: Ca2+, Mg2+,đồng thời các vi khuẩn lactic sẽ phân huỷ một phần protein trong vỏ tôm

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Tìm ra tỉ lệ nước và đường D – glucose thích hợp cho quá trình lên men

So sánh phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và bằng sinh học

Lactobacillus acidophilus, một chủng vi khuẩn sản sinh nhiều vi khuẩn lactic vừa

thân thiện với con người để lên men vỏ tôm thu nhận chitin

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

Sử dụng phần mềm Statghraphics để xử lý số liệu

Xác định tỉ lệ nước:vỏ tôm và tỉ lệ đường:vỏ tôm thích hợp cho quy trình lênmen, từ đó hoàn thiện đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất

chitin với Lactobacillus acidophilus.

Đồ án gồm có 4 chương:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Lactobacillus

1.1.1 Giới thiệu về Lactobacillus acidophilus

Loài: Lactobacillus acidophilus.

Vi khuẩn này được mô tả lần đầu tiên do công của một bác sĩ là Bruno Oppler

và một nhà nghiên cứu dạ dày ruột là Ismar Isidor Boas Tên gọi Lactobacillus acidophilus bắt nguồn từ lacto có nghĩa là sữa, bacillus chỉ hình dáng giống cây gậy

và acidophilus nghĩa là một “acid đằm thắm” (acid loving)

L acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, không sinh bào tử Nó có khả

năng lên men cả hiếu khí lẫn kỵ khí Trong trường hợp lên men đồng hình, glucoseđược sử dụng để tạo acid lactic, hoặc tạo thành nhiều sản phẩm khác nhau như acidacetic, ethanol, CO2…trong trường hợp lên men dị hình

1.1.1.2 Hình thái

L acidophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6 - 0,9 µm, dài 1,5 – 6 µm,

lên men đồng hình, nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 - 42 oC Trong tự nhiên, chúngtồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn có khả năng chuyển động

Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose Không lên menđược mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xylose

c

Hình 1.1 Hình thái L acidophilus

a.Hình thái khuẩn lạc L acidophilus nằm nghiêng

b.Hình thái khuẩn lạc L acidophilus

c.Hình thái tế bào L acidophilus khi nhuộm Gram

1.1.1.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa

L acidophilus có thể phát triển ở nhiệt độ cao như 45 oC nhưng tối ưu là 35 –

40 oC Tính chịu acid của nó từ 0,3 - 1,9 % chuẩn độ acid, với pH tối ưu từ 5,5 - 6.Chúng có những yêu cầu phát triển phức tạp như: áp lực oxygen thấp, có thể lênmen carbohydrate, protein và các phần tử bị phá vỡ từ các chất này, một số vitamin

và khoáng như B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cần cho sự phát triển

L acidophilus phát triển ở pH thấp < 3,5 và lên men trong điều kiện yếm khí.

L acidophilus sử dụng đường như một cơ chất cho sự lên men và sống được ở môi trường phong phú đường Mỗi phân tử glucose trải qua sự lên men trong L acidophilus tạo ra năng lượng là 2 ATPs Ngoài glucose, L acidophilus còn sử

dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalosecho sự lên men

1.1.1.4 Đặc điểm sinh thái.

L acidophilus được biết như một loài có vai trò probiotic Sự bám dính và khả

năng liên kết với nhau tạo thành một tập đoàn của vi khuẩn lactic là cơ chế hữu hiệuđể hạn chế vi khuẩn có hại Khi vi khuẩn lactic vào trong cơ thể, định cư ở đườngruột, chúng cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với vi sinh vật có hại, làm hạn

chế số lượng tế bào vi sinh vật có hại trong đường ruột L acidophilus có khả năng

sinh tổng hợp một số chất có khả năng kháng khuẩn như acid lactic, hydrogenperoxide, diacetyl và bacteriocin làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại

Ngoài ra, L acidophilus còn có vai trò như một chất bổ trợ cho những người không

chịu được lactose Chúng tập hợp ở đường tiêu hóa, góp phần chuyển hóa và phângiải lactose trong quá trình tiêu hóa thức ăn ở dạ dày và ruột

1.1.1.5 Cơ chế kháng khuẩn của L acidophilus

Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức

chế sự phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm Chateau et al (1993) phân

lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella Khoảng 47 % 5

Lactobacillus của sản phẩm A và 70 % của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6

serotype E coli.

Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L acidophilus,

L casei vàL faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype

Salmonella Jin

et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E coli.

Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và

hydroperoxyd Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thànhphần protein sinh học chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976) Các chủng

Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm khác cũng

sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995).Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác

Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp, Salmonelle spp, E.coli và Staphylococcus spp vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất

rộng

Cơ chế hoạt động cơ bản của bacteriocin chủ yếu tạo nên những lỗ trên màngtế bào chất và enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đổi chất của vikhuẩn khác

Hoạt tính kháng vi sinh vật nhờ cơ chế biểu diễn trên hình 1.2 (Cotter et al.,

2005) Trong đó Bacteriocin class I (đại diện: Nisin của Lactococcus lactics) gắn

vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidglycan từ tế bào chất đếnvách tế bào, do đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám được vào lớp lipid II, cácphân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; Bacteriocin class II (đại

diện: Sakacin của Lactobacillus sakei) là các peptid lưỡng tính có khả năng xuyên

màng tế bào tạo kênh trên lỗ trên màng Lớp III (còn gọi là bacteriolysin nhưlysostaphin) – protein bền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích

Hình 1.2 Cơ chế kháng vi sinh vật nhờ khả năng sinh bacteriocin.

Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩmcuối của quá trình trao đổi chất Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi

do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm).

Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic,acid acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et al,1952; Dahiafa và Speck, 1968; Price và Lee, 1970) Các acid acetic, lactic ức chế sựphát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick,1972; Adams và Hall, 1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộcvào độ pH Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ acid ở dạng không hòa tan

Khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh ở chủng L acidophilus rất quan

trọng trong đề tài này Vì phải lên men trong môi trường vỏ tôm chứa nhiều dinh

dưỡng, nếu L acidophilus có khả năng đối kháng cao sẽ ức chế các VSV cây mùi

hôi thối trong quá trình lên men, đồng thời ngăn các VSV có thể gây hại cho sứckhoẻ con người

1.2.1 Vị trí phân loại

Tôm sú được định loại là:

Ngành: Arthropoda

Lớp: Crustacea

Bộ: Decapoda

Họ chung: Penaeidea

Họ: Penaeus Fabricius

Giống: Penaeus

Loài: monodon

Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

1.2.2 Vùng phân bố của tôm sú trên thế giới

Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Án Độ Dương qua hướng Nhật Bản,Đài Loan, phía đông Tahiti, phía nam châu Úc và phía tây châu Phi (Racek, 1955;Holthuis và Rosa, 1965; Motoh, 1981, 1985)

Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30

35 oN xung quanh các nước vùng xích đạo,

Philippines và Việt Nam

1.2.3 Các vùng nuôi tôm chủ yếu tại Việt Nam

Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn), năm 2011,

cả nước thả nuôi được 656.425 ha tôm nước lợ, với sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng2,71 % về diện tích và 5,48 % về sản lượng so với năm 2010 Trong đó, diện tíchnuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, bằng 95,81 % năm 2010.Riêng khu vực đồng bằng sông Cửu Long, tổng diện tích thả nuôi tôm là602.416 ha (bao gồm 588.419 ha nuôi tôm sú và 18.498 ha nuôi tôm thẻ chântrắng), chiếm 91,8 % diện tích nuôi tôm của cả nước

Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam cho biết, tổng giá trị xuấtkhẩu tôm của Việt Nam trong năm 2011 đạt 2.396 tỷ USD, tăng 13,7 % so với năm

8

2010 và đã vượt qua mốc 2 tỷ USD Trong đó, xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷUSD, chiếm gần 60 % tổng giá trị, xuất khẩu tôm chân trắng đạt 704 triệu USD,chiếm 29,3 % tỷ trọng, 12 % còn lại là tôm các loại khác.

Về thị trường xuất khẩu, tôm Việt Nam đã thâm nhập sâu hơn và các thịtrường khác ngoài 3 thị trường trọng điểm truyền thống là Mỹ, Nhật Bản và châu

Âu Năm 2010, giá trị xuất khẩu tôm sang 3 thị trường này chiếm hơn 71 % tổngsản lượng xuất khẩu tôm cả nước Sang năm 2011, tỷ trọng này còn 66 %

Trong khi đó, xuất khẩu sang một số thị trường khác như Hàn Quốc, các nướcĐông Nam Á… và đặc biệt là sang Nga tăng mạnh, xuất khẩu tôm sang Nga tăng

124 % so với năm 2010 Xuất khẩu tôm sang Hàn Quốc tăng 23 %, sang các nước

Đông Nam Á tăng 54,7 %

Năm 2011, tôm sú vẫn giữ vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm ViệtNam Tuy nhiên, tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm dần, đặc biệt là các mặthàng tôm sú sống, tươi hoặc đông lạnh

1.2.4 Các sản phẩm chủ yếu được sản xuất từ tôm sú

Tôm tươi được chế biến lạnh đông dưới nhiều dạng như sau:

 Tôm nguyên con còn đầu và còn vỏ

 Tôm bỏ đầu: tôm bỏ đầu và còn vỏ

 Tôm bỏ đuôi: tôm bỏ đầu, bỏ ruột và bóc một phần vỏ

 Tôm xẻ lưng, bóc vỏ đến đốt áp chót

 Tôm cánh bướm, bóc vỏ đến đốt áp chót, cắt dọc theo chiều dài sống

lưng, xẻ banh ra

 Tôm có 4 đốt đầu được bóc vỏ và cắt theo chiều dài

 Tôm bóc noãn: tôm bỏ đầu, bỏ vỏ và bỏ ruột

 Tôm bóc noãn

 Tôm bóc noãn, xẻ lưng

 Tôm bóc noãn không nguyên vẹn

 Tôm bóc noãn và cắt cánh bướm: tôm boc noãn được cắt dọc theo

 Tôm bóc noãn có 4 đốt đầu tiên được cắt theo chiều dài.

1.2.5 Các phương pháp xử lý vỏ tôm thải hiện nay

Trong các quy trình sản xuất tôm lột vỏ, một lượng lớn vỏ tôm bị thải ra ngoài,gây ô nhiễm môi trường, đồng thời trong vỏ tôm thải vẫn còn rất nhiều hợp chất cóthể thu nhận lại Các protein, khoáng chất, vi lượng… trong vỏ tôm thải có thể chếbiến thành thức ăn gia súc, gia cầm Ngoài ra, các hợp chất quý như carotenoid,chitin… thu nhận từ vỏ tôm có rất nhiều ứng dụng trong y học, công nghiệp và nôngnghiệp

Đầu vỏ tôm, phụ phẩm trong ngành chế biến thuỷ hải sản, đã được nhiều tácgiả nghiên cứu và sử dụng làm thức ăn gia súc, có nhiều công trình nghiên cứu vềthành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của đầu và vỏ tôm

Theo Vũ Duy Giảng (1995), bột đầu tôm được chế biến từ đầu, càng, vỏ tôm lànguồn protein động vật rất tốt cho gia súc, gia cầm Giá trị dinh dưỡng của bột đầutôm thấp hơn bột cá và bột máu Bột đầu tôm có 33 – 34 % protein, trong đó có 4 –

5 % lysin và 2,7 % methionin

Theo Dương Xuân Tuyển, đầu vỏ tôm tươi đem hấp cách thuỷ có chứa chấtkhô là 26,40 % và protein thô khoảng 11,38 %, trong khi protein thô trong vỏ đầutôm muối chua là 11,20 %

Chất xơ trong đầu vỏ tôm khá cao và biến động tuỳ theo thành phần đầu vỏtôm, hàm lượng thay đổi từ 3,3 – 6,0 % Canxi, phospho là thành phần khá quantrọng trong đầu vỏ tôm Đầu vỏ tôm tươi đem hấp chứa 3,68 % canxi và 0,22 %phospho, tro và đầu vỏ tôm ủ chua có hàm lượng canxi 2,15 % và phospho 0,44 %.Bột đầu vỏ tôm sấy khô chứa 5,2 % canxi và 0,9 % phospho (Dương Xuân Tuyển,1992)

Đầu vỏ tôm tươi ít được sử dụng nuôi heo nhưng được sử dụng khá phổ biếnnhư nguồn thức ăn bổ sung đạm trong chăn nuôi vịt đẻ Vỏ đầu tôm tươi đem hấpđược Dương Xuân Tuyển (1992) sử dụng đến 46 % và lúa là nguồn thức ăn nănglượng chính nuôi vịt đẻ CV super M tại trại Vigova, cho năng suất trứng 160

10

quả/năm so với tiêu chuẩn của Anh về năng suất trứng đối với giống vịt bố mẹ 170quả/năm.

Một vài tác giả cũng đã sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua nuôi heo thịt Lê Văn Liễn,Nguyễn Thiện (1995), dùng 5 % đầu vỏ tôm ủ chua thay thế bột cá trong khẩu phầnthức ăn nuôi heo thịt cho kết quả tăng trọng và tiêu tốn thức ăn tương đương khẩuphần có 10 % bột cá (Theo Nguyễn Thị Thu Vân – 1997)

Tuy nhiên, các phương pháp trên vẫn chưa tận dụng hết các hợp chất trong vỏtôm như chitin hay carotenoid Những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu trêntoàn thế giới về việc thu nhận chitin trong vỏ tôm nhằm tránh lãng phí nguồn tàinguyên này

1.3 Tổng quan về chitin – chitosan

1.3.1 Cấu trúc chitin - chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặndịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồngốc của nó Năm 1823, Odier phân lập một chất từ bọ cách cứng mà ông gọi làchitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra

sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luậnchitin có dạng công thức giống như cellulose

Chitin là polysaccharide phổ biến thứ 2 trên đất sau cellulose, được tìm thấytrong xương người cũng như trong các bộ phận của động vật không xương sống.Nó là sự kết hợp giữa liên kết β (1→4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D– glucose (N – acetylglucosamine)

Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9 % là N (Black vàSchwartz, 1950) Nó có cấu trúc giống hệt cellulose vì có gốc acetamide (-NH-CO-

CH3) ở vị trí C2 Một dẫn xuất khác của chitin, chitosan là 1 polymer tuyến tính

α (1 → 4) 2 – annino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose

Hình 1.3 Công thứ cấu tạo của chitin

1.3.2 Tính chất hoá học của chitin - chitosan

Chitin là 1 polysaccharide chứa nitơ, trắng, cứng, không đàn hồi, không tantrong nước và acid yếu, chỉ tan trong một số dung môi, bền trong môi trường kiềmnhưng kém bền trong môi trường acid

Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc –NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai,làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau

Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO4, H2O2, NaClO hayCa(ClO)2, có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin

Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử bởi gốc acetyl tạothành chitosan

Hình 1.3 Cấu tạo của chitin (a) và chitosan (b)

Phản ứng của chitosan linh hoạt hơn so với cellulose nhờ nhóm -NH2, có thểliên kết với chất béo.

Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng vớiiod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tínhchitosan

Tính chất chung của chitin và chitosan:

 chuỗi polymer bền,

 các nhóm amin phản ứng,

 có nhóm hydroxyl phản ứng tồn tại, và

 giữ nhiều ion thu kim loại chuyển đổi

Thuộc tính sinh học của chitosan:

a Thích ứng sinh học:

 chuỗi polymer tự nhiên,

 có thể phân hủy sinh học,

 an toàn và không độc

b Có phản ứng liên kết

c Tái tạo các phản ứng keo liên kết

d Tăng hệ hình thành chất osteoblast chịu trách nhiệm cho xương hình thành

e Cầm máu

f.Diệt nấm, vi khuẩn, virus

g Diệt tinh trùng

h Ngừa sưng tấy

i.Chống các tác nhân gây dị ứng

j.Ngừa chotesterol, ngừa tăng huyết áp

k Tăng khả năng tái tạo xương

l.Ức chế sự đau đến hệ thần kinh trương ương

m Bổ trợ miễn dịch

1.3.3 Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay

1.3.3.1 Các quy trình sản xuất cổ điển

Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về sản xuất chitin – chitosan bằng

phương pháp hoá học, nhưng nhìn chung phải thực hiện qua các bước sau:

Khử protein → Khử khoáng → Khử màu → Loại gốc acetyl

Ví dụ về một số quy trình sản xuất chitin – chitosan tiêu biểu:

 Quy trình sản xuất chitin từ tôm sông nước ngọt của Mayer và Lee, đại học Louisiana, Hoa Kỳ (1989)

 Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc Anh (1998)

 Quy trình sản xuất của PGS.TS Trần Thị Luyến, đại học Nha Trang

 Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước như Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp, Thái Lan…

Ví dụ: Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc

Rửa trung tínhNgâm trong HClRửa trung tính

Tẩy bằng NaOCl hoặc H2O2

Nấu trong NaOHRử a trung tính

Rửa trung tínhChitinSấy khôChitosan

NaOH 35 - 50 %

to = 80 – 140 oC

τ = 0,5 – 10h

Đây là quy trình tổng hợp từ cá quy trình sản xuất trước đó Sản phẩm chitosanđược sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, các chất màu được loại bỏ sạchtrong quá trình tẩy màu Hàm lượng protid và khoáng chất còn lại trong chitin thấp

15

Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là sử dụng quá nhiều hoá chất nồngđộ cao với số lượng lớn, dẫn đến tăng giá thành sản xuất, đồng thời nếu quá trình xửlý nước thải không tốt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến môi trường.

1.3.3.2 Quy trình sản xuất chitin hiện đại

Hiện nay, việc bảo vệ môi trường đang là vấn đề lớn và được nhiều ngườiquan tâm Vì vậy, việc tìm ra một quy trình sản xuất chitin ít gây ô nhiễm môitrường đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới Thay vì sử dụng các hoá chấtvới nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng dụng sinh học vào quy trình sản xuất

và đã đem lại nhiều thành công trong vấn đề này

Nguyên liệu

Làm sạchNghiền nhỏ < 5 mm

NaCl 2 %Trộn đều

Sucrose 15 %Lên men

Hình 1.4 Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar,viện nghiên

cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010

Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để ủtôm Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không chocác vi sinh vật gây hôi thối phát triển Đồng thời các vi sinh vật này sẽ phân huỷmột phần protein còn lại trong nguyên liệu Ngoài ra, có thể sử dụng các enzyme

thuỷ phân protein từ Aspergillus oryzea để thúc đẩy hiệu suất quá trình cao hơn.

1.3.4 Ứng dụng của chitin – chitosan

1.3.4.1 Ứng dụng trong công nghiệp

Do có tính chất vật lý và hóa học ưu việt, chitosan đang được sử dụng trongmột mảng lớn các sản phẩm và ứng dụng khác nhau, từ dược phẩm, mỹ phẩm vàbảo vệ thực vật

 Mỹ phẩmThông thường, các acid hữu cơ được sử dụng làm dung môi cho các ứng dụng

mỹ phẩm như là aminopolysaccharide, chitosan được bao phủ trong lớp keohydrocolloid, tuy nhiên không giống các loại keo hydrocolloid khác, chitosan tạotính nhớt khi được trung hòa acid Chúng tạo điều kiện tương tác với da và tóc tốthơn Ngoài ra chitin và chitosan diệt và kháng nấm rất tốt Chitosan cũng có thể hấpthụ các chất độc hại như tia UV hoặc các loại thuốc nhuộm khác do có thể dễ dàngliên kết chung với gốc amino của chitosan

Chitin và chitosan và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong ba lĩnh vực

 Xử lý nước

Do tích chất polycationic tự nhiên, chitosan được sử dụng như một tác nhânkết bong, hoặc kết tủa chất bẩn

Weltroswki et al, sử dụng chitosan N_benzyl dẫn xuất sulphonat như các chấthấp thụ để loại bỏ ion kim loại trong môi trường acid Năm 1999, Bhavani và duttasử dụng chúng như chất hấp phụ loại bổ màu từ nước thải xưởng nhuộm

Ngoài ra, chitosan còn dùng để loại khỏi chất thải các chất như: kim loại nặng,asen, plutoniun, methyl acetate – thủy ngân, acetaldehyd, kể cả dầu mỏ và dầu khí

 Công nghiệp giấy

Do có khả năng phân hủy sinh học nên chitin – chitosan được sử dụng trong ngành sản xuất giấy tái chế thân thiện với môi trường và bao bì thực phẩm

 Công nghiệp dệtDẫn xuất chitosan được sử dụng để chống tĩnh điện, chống bám bẩn Ngoài rachitin có thể sử dụng trong quá trình in ấn hoàn thiện sản phẩm Chitosan có khảnăng xử lý màu nhuộm trong nước thải

 Chế biến thực phẩmChitosan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì tính không độcđối động vật máu nóng của nó Các hạt tinh thể chitin siêu nhỏ (MLL) có tính chấtnhũ hóa, làm dày và tạo gell cho thực phẩm Nó còn được sử dụng như chất xơtrong thực phẩm nướng Việc sử dụng MLL giải quyết các vấn để như màu sắc, mùivị và hạn sử dụng dài hơn các loại chất xơ Ngoài ra chitin – chitosan còn kháng vikhuẩn, kháng nấm và cản trở sự hoạt động của enzyme

 Nhiếp ảnhTrong nhiếp ảnh màu, Chitosan đã được sử dụng như một tác nhân cố định màu thuốc nhuộm acid trong gelatin và hổ trợ khuyết tán

 Sắc ký phân cách

Chitosan và chitin là một chất hỗ trợ hữu ích cho sự phân ly trong sắc ký do có

sự hiện diện của các nhóm tự do – NH2, - OH chính và – OH thứ cấp

Rhee et al đã sử dụng chitin và chitosan làm vật liệu hấp thụ pha rắn trongkhai thác phenol và chloirophenol bằng sắc khí lỏng hiện năng cao HPLC Ngoài racó thể sử dụng chitosan trong sắc khí lỏng phân tích nucleic acid

 Pin dạng rắn

 Chitin cho các ứng dụng đèn LED và NLO.

1.3.4.2 Ứng dụng trong nông nghiệp

 Xử lý hạtHạt giống xử lý bằng chitin trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao độtăng trưởng Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vikhuẩn gây bệnh và nấm mốc

 Chất mang trong sản xuất phân bónTrong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất điềuhoà tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết Chitosan được sử dụng nhưchất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ từ các hợp chất mong muốn vàotrong đất Chitosan bị phân huỷ sinh học trong đất khoảng hai tháng, kèm theo là sựphogs thích các chất Do đó, người ta tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng vàthời gian bón lặp khi sử dụng chitosan làm chất mang

 Bảo quản nông sảnTrong bảo quản nông sản, chitosan không những phát huy khả năng khángkhuẩn và nấm, mà còn giúp điều chỉnh môi trường bên trong rau củ thông qua kiểmsoát quá trình trao đổi khí giữa rau quả và môi trường Ở Nhật, dung dịch chitosanđược phun lên táo và cam nhằm kháng nấm và vi khuẩn gây hư hỏng André Bégincũng đề xuất quy trình bảo quản dâu bằng chitosan Ngoài ra, chitosan còn được sửdụng để làm bao bảo vệ chống sương giá

1.3.4.3 Ứng dụng y sinh học

Màng chitosan đã được đề xuất làm màng thận trong sản xuất thận nhân tạo vì có độ thấm phù hợp và độ bền cao.

 Mô nhân tạoChitosan và một số dẫn xuất đã được nghiên cứu để sử dụng trong một số ứngdụng y sinh bao gồm băng bó vết thương và làm đầy không gian cấy ghép Chitosanđược ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật mô xương và hệ thần kinh trung ương,ngoài ra chúng còn được nghiên cứu để chữa sụn khớp

Chitosan đã được nghiên cứu để sản xuất chỉ may vết thương và cho thấy tốcđộ chữa lành vết thương nhanh hơn bình thường

 Điều trị bỏng

Do chitosan có thể hình thành màng thấm nước, có khả năng tương tác sinhhọc Màng phim có thể hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách sử dụng dịchnước của chitosan acetate Một lợi thế nữa của chitosan là khả năng thẩm thấu oxytốt đây là điều quan trọng để các mô bị thương không bị thiếu oxy Ngoài ra, lớpmàng phim chitosan có khả năng hấp thụ nước và bị phân hủy tự nhiên bởi cácenzyme trong cơ thể nên không cần phải phẫu thuật loại bỏ

 Da nhân tạo

Do nhiều tính chất như: tạo màng, có khả năng thẩm thấu oxy, thấm nước, diệtkhuẩn, làm mau lành vết thương… hiện nay chitosan đang được nghiên cứu để sảnxuất da nhân tạo phục vụ cho y học

 Nhãn khoaSử dụng làm kính áp tròng do có đặc tính quang học rõ rang, ổn định cơ học ,có độ thấm khí, có thể điều chỉnh quang, có thể thấm ướt, và có khả năng tươngthích với hệ miễm dịch, Ngoài ra khả năng kháng khuẫn và dễ chữa lành vết thươngcũng giúp ích rất nhiều trong trường hợp này

 Màng bao thuốcChitosan có đặc tính kháng khuẩn kháng nấm, không độc, chitosan là chất vô cùng thích hợp để sản xuất màng bao thuốc

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc trường Đại Học

Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM

2.1.2 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 1/05/2012 đến ngày 20/07/2012

2.1.3 Giống vi sinh vật

Giống L acidophilus được sử dụng trong các thí nghiệm được lấy từ dược

phẩm ANTIBIO Đây là một dạng chế phẩm sinh học dạng bột, chứa 109 CFU/g(theo như khuyến cáo của nhà sản xuất)

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

2.1.4.1 Nguyên liệu và hoá chất

Tiến hành thí nghiệm

Hình 2.1 Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm

Vỏ tôm sau khi thu nhận được bảo quản trong thùng lạnh từ chợ về đến phòngthí nghiệm, rửa sơ, loại bỏ các tạp chất như sỏi, đá nhỏ… sau đó được xay nhuyễn(≤2 mm) và bảo quản lạnh -4 oC Quá trình này cần làm nhanh để tránh vỏ tôm bị

hư hỏng Nếu vỏ tôm có hiện tượng hỏng như có mùi hôi thối hay tăng pH, cần

chỉnh pH về 6 – 6,5 trước khi thực hiện lên men với L acidophilus.

 Hoá chất

 Môi trường MRS

Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS

Thành phần môi trường MRS (1 l)Peptone:

Meat extract :Yeast extract:

K2HPO4 :Triammonium citrate:

Glucose :Tween 80:

Natri acetate :MgSO4.7H2O :MnSO2.4H2O:

H2SO4 đậm đặc.

NaOH 45 %

H2SO4 0,1 N chuẩn

NaOH 0,1 N chuẩn

Thuốc thử Tashiro

Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4:CuSO4 (3:1)

 Xác định protein hòa tan bằng phương pháp Bradford:

Dung dịch albumin 0,1 mg/ml: cân chính xác 10 mg albumin pha trong 100 mlnước cất, lắc đều cho tan, giữ ở 20 0C Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịchalbumin có nồng độ 0,01 mg/ml

Dung dịch thuốc thử Bradford:

- Coomassie Brilliant Blue: 0,001 g

- Ethanl tuyệt đối 4,7 g

- Acid phosphoric 85%: 8,5 g

Phẩm màu Coomassie Brilliant blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85 % và chỉnh tới 100ml bằng nước cất

 Xác định hàm lượng N amin theo phương pháp chuẩn độ formol:

Dung dịch NaOH 0,05 N

Dung dịch phenolphtalein 0,1% trong etanol 90%

Dung dịch formaldehyde trung hòa 30 %: Lấy 50 ml dung dịch formaldehyde

30 % cho thêm vài giọt phenolphtalein và chỉnh bằng dung dịch NaOH 0,1

N cho

đến khi xuất hiện màu phớt hồng

 Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men:

NaOH 0,1 N

Thuốc thử phenolphtalein

 Thí nghiệm xác định lượng đường khử có trong dịch lên men:

Thuốc thử DNS.

2.1.4.2 Thiết bị

Tủ cấy vi sinh (Brlad France)

Tủ ủ (Memmert Germany)

Máy chạy Kjeldahl

Tủ lạnh Toshiba

Kính hiển vi quang học (Olympus)

Autolave (Huxky Đài Loan)

Máy đo quang (Hach-Germany)

Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

Máy đo pH (Hach-Germany)

Cân phân tích (Orbital Germany)

Bếp từ (Billy – England)

Máy nước cất (Branstead USA)

Pipet thủy tinh 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml

Ống ly tâm eppendorf

Que cấy, que gắp, que trang

Đũa thủy tinh

Giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa

Bông thấm nước, bông không thấm nước.

Bao nilong hấp, bao nilon kích thước 5x7 cm, dây thun, giấy gói

2.2.1 Mục đích

Nghiên cứu quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin bằng

phương pháp lên men với L acidophilus.

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ

tôm Các yếu tố cần phân tích trong mục tiêu này:

1 Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm

2 Xác định hàm lượng N - tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp Kjeldahl

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn độ formol

4 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương pháp Bradford

Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ

tôm bằng L acidophilus Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1;

1,5:1; 2:1 và 2,5:1 (v:w) Các yếu tố cần phân tích:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở cáctỉ lệ nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N

2 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thờigian lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol đểđánh giá mức độ thuỷ phân protein

4 Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men

Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ

tôm bằng L acidophilus Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %,

30 % và 35 % Các yếu tố cần phân tích:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở cáctỉ lệ đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N

2 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp

Bradford

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thờigian lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol đểđánh giá mức độ thuỷ phân protein

4 Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men

5 Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp acid dinitro – salisylic (DNS)

Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp

lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương

Đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin

Nội dung 1: xác định các thông số về thành

phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm

N – tổngcó trongvỏ tôm

Xác địnhhàm lượng

N – amincó trongvỏ tôm

Xác địnhhàm lượng

N - proteinhoà tan có

trong vỏ

tôm

Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối

với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA

Xác địnhhàm lượng

N - amincó trongdịch lênmen

Xác địnhhàm lượng

N - tổngcó trongdịch saulên men

Tìm được tỉ lệ nước thíchhợp cho quá trình lên men

Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường

đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA

Xác địnhlượngđườngkhử cònlại sauquá trìnhlên men

Tìm được tỉ lệ đường thíchhợp cho quá trình lên men

Nội dung 4: So sánh hiệu quả

khử khoáng và khử proteinbằng phương pháp lên menlactic với các quá trình hóa học

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của toàn bộ đồ án.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm.

Tiến hành: vỏ tôm đã qua xử lý được thêm vào 20 ml nước cất, sau đó đem ly

tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, lặp lại 2 lần Phần dịch sau hai lần ly tâm đượctrộn lẫn và định mức tới 50 ml gọi là dịch D1, rắn sau ly tâm gọi là R1

Vỏ tôm đã xử lý (10g)

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt của nội dung 1.

Các yêu cầu của nội dung nghiên cứu 1 được thực hiện theo sơ đồ hình 2.2:

1 Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm

2 Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong vỏ tôm bằng phương phápKjeldahl

29

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn

độ formol

4 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương pháp Bradford

Các phương pháp thực hiện được trình bày ở phần phương pháp tiến hành

2.3.2 Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L acidophilus.

Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1; 1,5:1; 2:1 và 2,5:1 (v:w)

 Chuẩn bị:

Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 oC được đem rã đông

Giống L acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1 g vào 100

ml nước cất, khuất đều (10 8CFU/ml)

 Tiến hành:

Cho vào bao nilon các thành phần sau:

 Bột vỏ tôm: 10 g

 Giống L acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml.

Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí

và đem ủ ở nhiệt độ phòng

Sau các khoảng thời gian 24, 48, 60, 72 giờ, đem dịch lên men đi ly tâm 4000vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và lytâm thêm 4000 vòng trong 10 phút thu dịch Cả 2 phần dịch sau ly tâm được trộnđều và định mức đến 50 ml (dịch D2), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng

Lên men yếm khí (nhiệt độ

phòng, ở các thời gian 24, 48,

Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của nội dung nghiên cứu 2.

Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian =

120 nghiệm thức

Các yếu tố cần xác định trong phần thí nghiệm này:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở cáctỉ lệ nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N

2 Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford

31

3 Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thờigian lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol đểđánh giá mứ độ thuỷ phân protein.

4 Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men

Dựa vào kết quả của các thí nghiệm trên, ta tìm ra tỉ lệ nước thích hợp nhất cho quá trình lên men

2.3.3 Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L acidophilus.

Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %, 30 % và 35 %

 Chuẩn bị:

Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 oC được đem rã đông

Giống L acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1g vào

100ml nước cất, khuất đều (108CFU/ml)

 Tiến hành:

Thực hiện thí nghiệm như hình 2.4, nhưng khác phần nguyên liệu và thời gian lên men

Cho vào bao nilon các thành phần sau:

 Bột vỏ tôm: 10 g

 Đường D – glucose với các tỉ lệ thí nghiệm: 1,5 g; 2 g; 2,5 g; 3 g; 3,5

g

 NaCl: 0,2 g

 Nước:đầu tôm với tỉ lệ (v:w): 2,5:1

 Giống L acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml.

Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí

và đem ủ ở nhiệt độ phòng

Sau các khoảng thời gian 48, 60, 72, 96 giờ, lấy các bao nilon đi ly tâm 4000 vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và ly

đều và định mức đến 50 ml (dịch D3), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng nước (cặn R3).

Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian =

120 nghiệm thức

Các yếu tố thí nghiệm:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở cáctỉ lệ đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N

2 Xác định hàm lượng N protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp Bradford

3 Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thờigian lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol đểđánh giá mứ độ thuỷ phân protein

4 Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men

5 Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp acid dinitro – salisylic (DNS)

Từ các kết quả đạt được, ta tính toán được tỉ lệ đường nào thích hợp nhất cho quá trình lên men

2.3.4 Nội dung 4: so sánh phương pháp khử protein và khoáng bằng

phương pháp lên men lactic với phương pháp hoá học.

Khử khoáng và khử protein được thể hiện bằng tỉ lệ phần trăm như mô tả củaRao và cộng sự (2000):

% =[ × ]−[ × ]×100

[ × ]

% =[ × ]−[ × ]×100

[ × ]

Với: %DM: tỉ lệ phần trăm khử khoáng

%DP: tỉ lệ phần trăm khử protein

PO và PR: nồng độ protein trước và sau lên men

33

AO và AR: % tro trong mẫu trước và sau lên men.

O và R: khối lượng mẫu trước và sau lên men

Từ công thức trên ta tính được hiệu suất khử khoáng và khử protein của cả hai phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và sinh học

2.3.4.1 So sánh hiệu suất khử khoáng của quy trình thí nghiệm với quy trình phương pháp hoá học.

 Phương pháp lên men lactic

Từ các nội dung nghiên cứu 2 và 3, ta tìm ra được tỉ lệ nước : vỏ đầu tôm và tỉ

lệ đường thích hợp cho quá trình lên men, dùng nghiệm thức đã chọn để xác địnhkhoáng trong mẫu còn lại nhằm so sánh hiệu suất với quá trình khử khoáng củaphương pháp hoá học

Xác định hàm lượng khoáng

Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.1.

Cân 10 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm HCl 0,25 M vớitỉ lệ 1:40 w:v Lắc ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ, lọc chân không và thu cặn.Phần cặn sau đó được đem đi xác định hàm lượng khoáng (cách xác định được trìnhbày ở phần phương pháp tiến hành)

2.3.4.2 So sánh hiệu suất xử lý protein của quy trình thí nghiệm với quy trình từ phương pháp hoá học.

 Phương pháp lên men lactic

Tương tự như khi so sánh hiệu suất khử khoáng, dùng nghiệm thức này đểđịnh lượng N tổng số nhằm so sánh hiệu suất với quá trình xử lý protein củaphương pháp hoá học

 Phương pháp hoá học

Cân 20 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm NaOH 1 M vớitỉ lệ 15 mg/l Ủ ở 70 oC trong 24 giờ, lọc chân không và thu cặn Phần cặn sau đóđược đem đi xác định hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (cáchxác định được trình bày ở phần phương pháp tiến hành)

20 g Vỏ tôm đã được xử lý

NaOH 1 M với tỉ lệ 15mg/l

LọcThu cặn

Xác định hàm lượng N tổng số

Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.2.

2.4.1 Xác định độ ẩm của mẫu cần phân tích

Tiến hành

Cốc đã được sấy khô và cân đo trước (m0)

Cân mẫu Rx chính xác đến 0,001 g, cho vào cốc trên (m1)

Để cốc có chứa mẫu Rx vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 ºC ± 2 ºC thời gian 3 giờ.Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác đến0,001 g (m2) Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ để khoảng 30 phút trong tủ sấycho đến khi lượng mất đi của hai lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 2 mghoặc 4 mg tuỳ theo khối lượng của phần mẫu thử.

Tính toán

Độ ẩm tính bằng % khối lượng được tính theo công thức sau:

Độ ẩm (%)=([m1 – m2] * 100)/(m1 – mo)Trong đó:

mo : khối lượng cốc không (g)

m1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g)

m2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

2.4.2 Xác định hàm lượng khoáng trong mẫu phân tích

Tiến hành

Cho chén nung vào tủ sấy trong 2 giờ Sau đó lấy chén ra và làm nguội trongbình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0,001 g (mo) Cânkhoảng 2 g mẫu Rx ở trạng thái khô không khí và cho vào chén nung đã biết khốilượng với độ chính xác 0,001 g

Cho chén và mẫu vào tủ sấy, sấy ở 105 oC trong 2 – 3 giờ để cho nước cótrong mẫu bay đi hết, sau đó đặt chén mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 500 –

X : hàm lượng tro thô của mẫu (%).

m2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)

m0 : khối lượng chén (g)

m1 : khối lượng mẫu thử trước khi nung (g)

2.4.3 Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men

Độ acid được xác định bằng cách trung hòa với NaOH, sử dụng thuốc thử phenolphtalein

Tiến hành

Cho 30 ml dịch Dx vào bình tam giác, thêm 3 giọt phenolphtalein

Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi dịch chuyển sang màu hồng tím

Kết quả

%Khối lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức:

%g acid lactic = VNaOH/30*50/10*0.1/1000*90*100

Trong đó:

VNaOH: thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ được

30: số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ

50: tổng số ml dịch Dx

0,1: nồng độ NaOH dùng chuẩn độ

1000: hệ số chuyển đổi ra g

90: mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx

2.4.4 Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch sau lên

Tiến hành

Cho vào bình 10 ml dung dịch Dx, 15 giọt chit thị hỗn hợp, chỉnh độ pH bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi màu xanh xuất hiện