Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau​

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---***---HOÀNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁ

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE TỪ

CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH VẬT, TẠO LACCASE TỪ

CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU

Chuyên ngành: Vi Sinh Vật

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà

Hà Nội, 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Đặng ThịCẩm Hà đã kiên trì chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình họctập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệmquý báu trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các Thầy cô giáo đã tham gia giảngdạy trong suốt khóa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Đinh Thị Thu Hằng cùng tập thể cán bộ củaphòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và các nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡtôi lấy mẫu và trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin cảm ơn đến PGS TS Thành Thị Thu Thủy đã giúp đỡ tôi bổ trợthêm những kiến thức mới Cảm ơn GS Bram Brouwer và công ty BioDetectionSystems B.V- BDS, Hà Lan đã thực hiện các phân tích sử dụng công nghệ DR-CALUX

để có kết quả mới trong luận văn này

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới chồng và con trai - là chỗ dựa tinh thần vànhững người thân trong gia đình là chỗ dựa vững chắc, động viên, giúp đỡ trong suốtthời gian qua

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó !

Hà Nội, tháng 12 năm 2015Học viên cao học

Hoàng Thị Nhung

Trang i

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Nhung

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMS) 3

1.2 Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm 5

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7

1.3 Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên 8

1.4 Tách chiết và xác định các đặc tính của polysaccharide từ nấm 9

1.5 Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm 11

1.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide 12

1.7 Tính chất vật lý của polysaccharide 15

1.7.1 Khối lượng phân tử của polysaccharide 15

1.7.2 Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm 15

1.8 Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe 16

1.8.1 Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide 16

1.8.2 Hạ lipid máu và hạn chế đường huyết 20

1.8.3 Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm 21

1.8.4 Prebiotic từ nấm 22

1.8.5 Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm 23

1.8.6 Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm 24

1.9 Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người 26

Trang iii

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

1.9.1 Tổng quan về laccase 26

1.9.2 Ứng dụng của laccase trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe 27

1.10 Phương pháp phân tích sàng lọc DR-Calux 28

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Vật liệu 35

2.1.1 Vi sinh vật 35

2.1.2 Hóa chât và thiết bị 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng nấm 36

2.2.2 Phương pháp phân loại nấm dựa vào trình tự xác định trình tự ITS 36

2.2.3 Chuẩn bị giống 37

2.2.4 Phương pháp xác định sinh khối và hàm lượng exopolysaccharide 37

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase 37

2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase 38

2.2.6.1 Đánh giá anh hưởng của pH 38

2.2.6.2 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 38

2.2.6.3 Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ 39

2.2.6.4 Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon 39

2.2.7 Xác định hàm lượng protein, carbonhydrate tổng số của EPS thô 39

2.2.8 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định 40

2.2.9 Xác định thành phần của polysaccharide 41

2.2.10 Xác định hoạt tính của EPS và sinh khối nấm lên một số chức năng của tế bào 41

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu 44

3.2 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và hoạt tính laccase của các chủng nấm……… 48 3.3 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy một số chủng nấm .54

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo sinh khối, sinh tổng hợp EPS

và laccase của 2 chủng nấm Earliella sp FPT31 và Ganoderma sp FMD12 56

3.4.1 Ảnh hưởng của pH môi trường 56

3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 59

3.4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 61

3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon 63

3.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 65

3.4.6 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 khi kết hợp các yếu tố môi trường 67 3.5 Hàm lượng carbonhydrate và protein của EPS thô thu được từ FPT31 và FMD12 70

3.6 Thành phần và cấu trúc EPS của FMD12 và FPT31 72

3.7 Hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FMD12 và FPT31 75

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

4.1 Kết luận 77

4.2 Kiến nghị 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

Trang v

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

Chemical Activated Luciferase Gene ExpressionCorelated Spectrscopy

Cardiovascular DiseaseDeuterium oxide

Dried crude exopolysaccharideDulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12Dimethylsulfoxide

3,5-dinitrosalicylic acidĐồng tác giả

ExopolysaccharideEstrogen ReceptorFetal calf serumGas ChromatographyGlucocorticoid ReceptorHuman Immunodeficiency VirusHeteronuclear Multiple Bond CoherenceHeteronuclear Multiple Quantum CoherenceHigh- Performance Liquid ChromatographyConcentration Inhibiting 50% Of GrothInterferon

InterleukinIntracelular PolysaccharideInternal transcribed spacerInternal Zone Diameter

NEAA Non-Essential Amino Acid

MAE Microwave- Assisted Extraction

MIC Minimal Inhibitory Concentration

MMs Medicinal Mushrooms

MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

MRSE Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis

NK Natural killer

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Nrf2 Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2

PBS Phosphate Buffered Saline

PDA Potato Dextro Aga

PDB Potato Dextro Broth

PGM Potato Glucose Malt

PLE Pressurized Liquid Extraction

PR Progesterone Receptor

PSP Polysaccharopeptide

ROESY Rotating Frame Overhauser Enhancement Spectroscopy

SFE Supercritical Fluid Extraction

TNF Tumor Necrosis Factor

TSB Tryptone Soya Broth

UAE Ultrasonic- Assited Extraction

VREF Vancomycinresistant Enterococcus faecium

Trang vii

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 1.1 Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từnấm 10Bảng 1.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của 14

Bảng 2.2 Sơ đồ hút mẫu cho phân tích sàng lọc CALUX 38

Bảng 3.1 Độ tương đồng giữa các nấm thuộc Ganoderma từ các vùng 40Bảng 3.2 Hình thái các chủng nấm và khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp 44

polysaccharide và enzyme laccase của chúng

Bảng 3.3 Khả năng ức chế sự sinh trưởng 2 chủng vi khuẩn B cereus và M. 50

luteus của dịch nuôi cấy chủng FMD12

Bảng 3.4 Sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp EPS theo thời gian của FPT31 55

và FMD12

Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 62

trên môi trường chứa đường và cao nấm men ở nồng độ khác nhau

Bảng 3.6 Điều kiện nuôi cấy của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 với một số 64

nghiên cứu quốc tế

Bảng 3.7 Hàm lượng đường và protein trong EPS thô của FPT31 và FMD12 66Bảng 3.8 Kết quả sàng lọc hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FPT31 71

và FMD12 bằng Calux

DANH MỤC CÁC HÌNH

TrangHình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm 18

Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm thuộc chi Ganoderma 41

trong nghiên cứuHình 3.2 Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm trong nghiên cứu 42Hình 3.3 Khả năng kháng Bacillus cereus và Micrococus luteus của dịch 49

nuôi từ nấm FPT31 và FMD12Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp 53

enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12Hình 3.5 Hoạt tính enzyme laccase của chủng FPT31 theo thời gian nuôi 54

cấyHình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp 57

enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12Hình 3.7 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng 59

hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn nồng độ glucose đến khả năng sinh trưởng, 61

sinh tổng hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12

Trang ix

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

MỞ ĐẦU

Giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài tuy nhiên chỉ có 14.000 loài trong đó là nấm

đảm Basidomycetes Một vài trong số những chi này đã được trồng trên quy mô công nghiệp trên toàn thế giới bao gồm Pleurotus (nấm sò), Lentinula (nấm hương), Auricularia (mộc nhĩ), Agaricus (nấm Thiên Chúa), Flammulina (nấm kim châm), Hypsizygus (nấm ngọc châm), Ganoderma (nấm Linh Chi), Inonotus obliquus (nấm đen), Coprinus (nấm đùi gà), Agrocybe (nấm trân châu) và Volvariella (nấm rơm) Nấm được

sử dụng cho rất nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học đặc biệt là trong các ngành sảnxuất thực phẩm, enzyme, bổ sung cho chế độ ăn kiêng, các hợp chất có dược tính, thựcphẩm bổ sung [111] và nhiều ứng dụng khác

Một thành phần quan trọng của nấm chiếm được sự quan tâm lớn của khoa học là

polysaccharide Các polysaccharide từ nấm được thu nhận từ Ganoderma, Lentinus, Oyster, Flammulina, Cordyceps, Coriolus và Pleurotus đều đã được chứng minh là có

nhiều hoạt tính sinh học bao gồm miễn dịch, kháng u, chống ung thư, kháng khuẩn,kháng virus, chống oxy hóa, các đặc tính liên quan đến đường huyết và tim mạch Ngoài

ra các enzyme laccase cũng đang được chứng minh vai trò quan trọng của nó trong lĩnhvực bảo vệ sức khỏe con người

Nấm được sử dụng chủ yếu thông qua ăn trực tiếp (nấm ăn) và sắc lấy nước uốnghoặc dùng hàng ngày cũng ở dạng sản phẩm uống (thực phẩm chức năng và thuốc) đượctách chiết từ các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm Cho đến nay hầu hết các sảnphẩm từ nấm đều được thu nhận trực tiếp từ quả thể của nấm tự nhiên hay nấm trồng thôngqua quá trình tách chiết phức tạp và sử dụng nước nóng hay các dung môi hữu cơ khácnhau Lên men chìm là một giải pháp được đưa ra để khắc phục những nhược điểm của một

số phương pháp tách chiết truyền thống như thời gian thu nhận, hiệu suất tách chiết, khảnăng kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm trong suốt quá trình sản xuất và sự phức tạp củaquá trình thu nhận sản phẩm cuối cùng để tạo hàng hóa thương mại Vì vậy,

việc lựa chọn môi trường thích hợp cho nấm sinh tổng hợp một lượng lớn các hợp chất

có hoạt tính sinh học mà quan trọng là polysaccharide có ý nghĩa lớn

Các hoạt tính sinh học của polysaccharide bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm về cấutrúc của chúng như thành phần hóa học, khối lượng phân tử, các liên kết glycosidic vàdàng cấu hình Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm về cấu trúc của polysaccharide có ýnghĩa trong việc xác định các hoạt tính sinh học của chúng từ đó ứng dụng chúng vàocác mục đích thích hợp

Công nghệ phân tích sàng lọc bằng CALUX đã trở thành một công cụ sinh họcmới bắt đầu được sử dụng trong việc phát hiện các chất hay các cụm chất có tác dụng ởmức độ tế bào từ các mẫu sinh phẩm và môi trường dựa vào sự biểu hiện của gen đíchgắn với promoter chỉ thị là luciferase Hiện nay, CALUX là phương pháp hữu hiệu đểkhông chỉ xác định nồng độ dioxin hay các chất đích đang được mong muốn tìm màcông cụ này còn được ứng dụng trong các lĩnh vực như an toàn thực phẩm cho người.Các lĩnh vực như nước uống, chất lượng môi trường, dược phẩm/ hóa chất, thức ăn chănnuôi, sản phẩm tiêu dùng, các phép thử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, cácnguyên liệu đối chứng tham khảo và các sản phẩm khác v.v là đối tượng mà công nghệCALUX có thể phân tích Việc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từnấm lên các chức năng của tế bào giúp định hướng một cách rõ ràng hơn về khả năngứng dụng của chúng để tạo thuốc, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung cho người,vật nuôi và cây trồng

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau” đã được tiến hành Nội dung chính của đề tài bao gồm:

- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn nấm có khả năng sinh tổng hợp EPS vàenzyme laccase từ các mẫu nấm thu thập từ Vườn Quốc gia Xuân Sơn- tỉnh Phú Thọ; VườnQuốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội; rừng keo tỉnh Bình

Trang 2

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

Phước; rừng bị rải chất độc hóa học là A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế và Mã Đà- tỉnh Đồng Nai;

- Phân loại 2 chủng nấm bằng phương pháp xác định trình tự vùng ITS;

- Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và

laccase của 2 chủng nấm Ganoderma sp FMD12 và Earliella sp FPT31;

- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch nuôi cấy 2 chủng nấm

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Tổng quan về nấm ăn và nấm dược liệu (MMs- Medicinal Mushrooms)

Nấm sợi và nấm mũ được phân bố rộng rãi và phong phú trên toàn thế giới Cácước tính gần đây về nấm cho thấy số lượng nấm vào khoảng 500 000 đến hơn 5 tỉ loài,được công bố hơn 20 năm trước [46] Cho đến nay, có khoảng 3 tỉ loài nấm được chấpnhận sử dụng chung Trong khi đó, hiện nay có 110 000 loài nấm đã được mô tả Sốlượng các loài nấm trên trái đất hiện nay ước tính khoảng 150 00 – 160 000 Chưa hết,

có lẽ chỉ có 10% số loài có tên được khoa học biết đến [133] Một phân tích về nguồngốc của các loài nấm mới cho khoa học đã được mô tả và công bố trong cuốn Biên lục

về Nấm xuất bản 10 năm trước cho thấy khoảng 60% các loài nấm mới được mô tả là từcác vùng nhiệt đới

Nấm được tiêu thụ trên toàn thế giới không chỉ do đặc tính cảm quan mà còn thuhút được nhiều sự quan tâm do lợi ích của chúng đối với sức khỏe con người Hiện naynấm được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng cũng như dược lý của chúng Nấm có thểđược coi là một loại thực phẩm tốt cho sức khỏe vì chúng có hàm lượng protein và hàmlượng chất xơ cao, với một lượng vitamin và khoáng chất đáng kể và lượng chất béothấp Chúng là một nguồn dược phẩm lớn, mới nhưng chưa được khai thác Hơn nữa,nấm ngày càng thu hút sự quan tâm bởi chúng có thể được ứng dụng để tạo thực phẩmchức năng và là nguyên liệu cho sự phát triển của các loại thuốc và các sản phẩm dinhdưỡng do để bổ sung vào chứa một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học như β-glucans, polyphenol, phytosterol, tecpen Quan trọng nhất đối với y học hiện đại là nấmdược liệu (MMs) là nguồn polysaccharide vô hạn (đặc biệt là β- glucan) và các phức hợppolysaccharide- protein có khả năng chống ung thư và tăng khả năng miễn dịch Hầu hết

các Basidiomycetes bậc cao đều chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với phân tử

lượng thấp hoặc cao (triterpenes, lactones, alkaloids và các hợp chất khác) trong quả thểnấm, sợi nấm và dịch nuôi cấy [133], [128], [8], [27]

Trang 4

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

MMs được so sánh với thuốc thảo dược và được xác định có thể là các nấm lớn,hầu hết thuộc nấm đảm và một vài thuộc nhóm nấm sợi Chúng được sử dụng ở dạngchiết xuất hoặc dạng bột để ngăn ngừa, giảm thiểu hay chữa trị bệnh, và/ hoặc bổ sungcho người một chế độ ăn uống khỏe mạnh và cân bằng

Nấm dược liệu và nấm ăn có khoảng 130 chức năng để có thể sử dụng làmthuốc do có khả năng kháng ung thư, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa, kháng cácbệnh tim mạch, chống tăng cholesterol, kháng vi rút, kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng,kháng nấm, khử độc, bảo vệ gan, chống các ảnh hưởng của đái đường Nấm được sửdụng vào các liệu pháp tăng miễn dịch, và đã được chứng minh là có hiệu quả như chốngviêm, chống oxy hóa, kháng u, hoặc là kháng virus và là các nhân tố kháng khuẩn

Rất nhiều, nếu không nói là tất cả, các nấm mũ bậc cao chứa các hợp chất có hoạttính sinh học không chỉ có trong quả thể nấm, trong sợi nấm qua nuôi cấy mà còn cótrong môi trường nuôi cấy Các polysaccharide từ nấm đang được quan tâm đặc biệt bởicác đặc tính hữu ích của chúng Các dữ liệu khoa học về các polysaccharide từ nấm vàcác sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp lại khoảng 700 loài Số lượng cácpolysaccharide có hoạt tính sinh học hoặc các phức hợp polysaccharide- protein từ cácnấm thuốc có mặt để tăng cường các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và phản ứng miễndịch thu được và tạo ra hoạt tính kháng ung thư ở người và động vật Cho đến nay các cơchế về hoạt động kháng ung thư của chúng vẫn còn chưa được hiểu một cách rõ ràng.Polysaccharide và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có khối lượng phân tử thấp giữ vaitrò đặc biệt quan trọng do đặc tính kháng ung thư và tăng khả năng miễn dịch của chúng[134]

1.2 Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Việc sử dụng các loài nấm trong các liệu pháp điều trị đã xuất hiện ít nhất từ thời

kì đồ đá mới Trải qua hàng nghìn năm, các loài nấm được đánh giá là có giá trị cho conngười là nấm ăn và nấm dược liệu Các nghiên cứu hiện đại xác nhận và ghi nhận nhiều

kiến thức cổ xưa về nấm dược liệu Một lĩnh vực khoa học liên ngành tập trung vàonghiên cứu nấm dược liệu đã được phát triển và ngày càng chứng tỏ tính ưu việt và độcđáo của các hợp chất chiết xuất từ một loạt các loài nấm trong ba thập kỷ gần đây Cácthử nghiệm lâm sàng hiện đại được tiến hành ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga

và một số nước khác dựa trên các nấm đã biết nguồn gốc Đông y học cổ đại đã nhấn

mạnh tầm quan trọng của một số loài nấm như nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), nấm hương (Lentinus edode) Nấm cũng đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh ảnh

hưởng đến dân cư vùng nông thôn ở các nước châu Âu Các loài quan trọng nhất là

Inonotus obliquus, Fomitopsis officinalis, Piptoporus betulinus, Fomes fomentarius.

Những loài này được sử dụng trong điều trị rối loạn tiêu hóa, các dạng ung thư khácnhau, hen phế quản, đổ mồ hôi đêm …Từ lâu, nấm đã được sử dụng trong điều trị bệnh

ở Trung Mỹ (đặc biệt là chi Psilocybe), ở châu Phi, Algeria và Ai Cập Vai trò đặc biệt

của nấm hương bay được tìm thấy trong Shaman giáo ở Siberia và Tây Tạng, trong Phật giáo

và huyền thoại Celtic [107], [129], [133], [18]

Ngày nay, nấm dược liệu được sử dụng trong các lĩnh vực như làm thực phẩm

ăn kiêng (sản lượng nấm thế giờ là 30 tấn vào năm 2012); sản phẩm bổ sung vào chế độ

ăn uống (sản phẩm của lĩnh vực này phát triển mộtt cách nhanh chóng và có giá trị hơn

18 tỷ USD/ năm); một loại thuốc mới được gọi là “dược phẩm nấm”; nhân tố kiểm soátsinh học tự nhiên trong bảo vệ thực vật với các hoạt tính kháng côn trùng, diệt nấm, diệtkhuẩn, diệt cỏ, diệt tuyến trùng, kháng vi rút ở thực vật Trong mỹ phẩm, các hợp chấtkhác của MMs, bao gồm polysaccharide như β-glucans, glucuronoxylomannan (GXM ),sacchachitin, tyrosinase và các enzyme khác được các công ty mỹ phẩm sử dụng do khảnăng tạo màng của chúng, kích hoạt các yếu tố tăng trưởng biểu bì, chống oxy hóa,chống dị ứng, kháng khuẩn, va hoạt tính kháng viêm, kích thích hoạt động của collagen,

ức chế bạch biến tự miễn dịch và điều trị mụn trứng cá [133], [134], [54]

Trang 6

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Từ xưa, người Việt Nam đã sử dụng nấm Linh chi dùng làm dược liệu Từ thời LêQuý Đôn (1726-1784), nấm Linh chi được đánh giá rất cao Các chế phẩm từ Linh chi

(Ganoderma) được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như: gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư,

AIDS, suy nhược cơ thể, tiểu đường, giảm đau, giải độc trong cơ thể, đào thải chấtphóng xạ, giảm cholesterol trong máu, mất ngủ, loét dạ dày, làm tăng hệ thống miễnnhiễm của cơ thể, tê thấp v.v Tuy nhiên những nghiên cứu về nấm dược liệu và nấm ăncũng chủ yếu dừng lại ở thống kê, đánh giá và xác định sự đa dạng và giá trị tài nguyêncủa loại nấm này ở các khu vực khác nhau như Thừa Thiên Huế [1], Vườn Quôc gia BùGia Mập [6], vùng Thanh- Nghệ Tĩnh [5], tỉnh Tây Ninh [4]

Một nghiên cứu của Lê Xuân Thám và đtg (2011) đã xác định được thành phần

hóa học của mẫu nấm Linh Chi đen Amauroderma subresinosum Murr phân lập từ Vườn

Quốc Gia Cát Tiên bằng kỹ thuật sắc ký khí (GC) Nghiên cứu đã xác định được 14 axitbéo, trong đó axit béo chưa bão hòa 11-octadecaenomic có nồng độ cao nhất (khoảng51,01% tổng lượng axit béo đã được xác định) Ngoài ra, các axit béo là lignoceric, 14-methylpentadecaenoic, 8,11-octadecenoic cũng đã được xác định và làm sáng tỏ về cấutrúc [104]

Trần Thị Hồng Hà và đtg (2012) đã tách chiết và xác định hàm lượng các

polysaccharide từ quả thể nấm hầu thủ Hericium erinaceus Phân đoạn chiết bằng NaOH

4% cho tổng lượng polysaccharide chiếm 80% , bao gồm các dạng tan và không tantrong nước Một lượng ít polysaccharide được tổng hợp trong dịch nuôi cấy nấm.Polysaccharide tan trong phân đoạn chiết NaOH 2% có hoạt tính ức chế sự hình thànhkhối u tế bào ung thư gan (Hep-G2) thể hiện bằng việc giảm kích thước khối u xuống24,4% và mật độ hình thành khối u 61,5% so với đối chứng âm [2]

Tuy nhiên, những nghiên cứu được tổng hợp ở trên mới chỉ tập trung vào chi

Ganoderma và ứng dụng của chúng trong y học Trong khuôn khổ luận văn thạc sỹ này

học viên cao học không chỉ nghiên cứu, khảo sát về khả năng sinh tổng hợp

polysacchride của một số Ganoderma mà còn tập trung nghiên cứu khả năng sinh trưởng,

sinh tổng hợp expolysaccharide và enyme laccase của dịch lên men từ nấm phân lập mới

từ rừng ở các vùng khí hậu khác nhau Đồng thời đánh giá khả năng kháng một số visinh vật kiểm định; xác định thành phần và cấu trúc của polysaccharide trong dịch nuôi

cấy của 2 chủng nấm lựa chọn; đánh giá một số hoạt tính in vitro lên các chức năng của

tế bào Từ đó, có hướng ứng dụng thích hợp cho mỗi chủng nấm, đặc biệt trong lĩnh vựcthực phẩm bố sung cho người và gia súc, gia cầm

1.3 Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học tự nhiên

Trong số các hoạt chất sinh học có trong nấm, polysaccharides chiếm được sựquan tâm hơn cả chủ yếu là do đặc tính tuyệt vời của trong miễn dịch, các chất chốngoxy hóa, chống viêm, hoặc kháng u Polysaccharide là một polymer mà trong đómonomer là các phân tử đường đơn Một vài polysaccharide đã được phân lập từ cácnấm nguyên liệu Khi tất cả các monosaccharide tạo thành carbohydrate cùng loại thì cácpolymer này được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan Tuy nhiên, nếu cónhiều hơn một loại monosaccharide có mặt trong cấu trúc, chúng được gọi làheteropolysaccharide hoặc heteroglycan Như vậy, các heteropolysaccharide được hìnhthành bởi các loại đường khác nhau [22], [120] và phức hợp polysaccharide-protein [11]cũng có thể được tìm thấy trong một số nấm nhất định

Các đặc điểm về cấu trúc như tính chất của monomer, các loại hình liên kết và

vị trí liên kết, cũng như số lượng và vị trí của các nhánh có trong chuỗi polymer sẽ ảnhhưởng mạnh đến cấu trúc không gian 3 chiều cùng với kích thước phân tử từ đó sẽ xácđịnh các tính chất và hoạt tính của polysaccharide [16] Tương tự, các tính chất vật lýnhư khả năng hòa tan, độ nhớt, độ đông đặc, có thể ảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học

vì chúng có thể làm thay đổi tính sẵn sàng sinh học của polysaccharide [95] Do đó, việcxác định một cách rõ ràng các cấu trúc và tính chất vật lý phân tử của cácpolysaccharides có trong nấm là vô cùng quan trọng để dự đoán các hoạt tính sinh họccủa chúng

Trang 8

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

1.4 Tách chiết và xác định các đặc tính của polysacchride từ nấm

Việc tách chiết polysaccharide liên quan đến việc phân tách các carbohydrate từnấm nguyên liệu Các phương pháp tách chiết thông thường thường khuấy mẫu vào dungmôi [27] Các dung dịch thường được sử dụng là nước ở nhiệt độ phòng, nước sôi, thậmchí là dung dịch NaOH, KOH (2%) Phần còn lại được tách ra bằng cách ly tâm cònpolysaccharides được kết tủa với ethanol theo tỷ lệ 2: 1 ( v / v )

Trong một số trường hợp, nước hoặc dung môi cơ bản không đủ mạnh để táchcác polysaccharide không tan thì giải pháp có thể sử dụng các dung dịch có tính axitmang tính khả thi cao Một số axit, bao gồm acetic, formic, clohydric, axit phosphoric,

đã được thử nghiệm trong quá trình phân tách β- (1-3)-glucans không tan [94]

Các kỹ thuật tách chiết bằng dung môi thường sử dụng một lượng lớn các dungmôi hữu cơ độc hại, thường là mất nhiều thời gian, và có sản lượng thu nhận thấp và độchọn lọc cũng thấp Thêm vào đó, với các phương pháp tách chiết này, các chất cần táchchiết có thể tiếp xúc với nhiệt độ quá cao,cần ánh sáng và oxy, đòi hỏi phải có thời giantách chiết dài, dẫn đến sự hoạt động của các enzyme phân hủy glucan Trong thời giantách chiết, một số hợp chất có hoạt tính sinh học có thể dễ dàng bị mất do sự ion hóa,thủy phân và oxy hóa Do đó, các kỹ thuật phức tạp hơn như tách chiết bằng áp suất chấtlỏng (PLE), tách chiết có siêu âm hỗ trợ hoặc dùng vi sóng có thể là một giải pháp tốt đểphân tách các polysaccharides Bảng1.1 tổng hợp các kỹ thuật chính và các điều kiện cầnthiết cho việc chiết xuất các polysaccharide từ nấm

Bảng 1.1 Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm

chiết

Tách chiết bằng áp 10.1 MPa; 28°C; 70 phút - Thân thiện với môi trường; Lentinus [112]

suất chất lỏng - Lượng dung môi sử dụng ít, thường là edodes

- thời gian thực hiện ngắn;

- Là phương pháp tự động và sử dụngoxy, ánh sáng từ môi trường

Chiết xuất dòng 35 MPa; tốc độ dòng 10 - Sử dụng CO2 như các dung môi chiết; Ganoderma [37]

siêu tới hạn (SFE) kg/h CO2; 25°C ; 4 giờ - Thân thiện với môi trường; lucidum

- Nhiệt độ tương đối thấp và các dungmôi hữu cơ được loại bỏ trong quá trìnhchiết xuất sẽ tránh được sự phân hủy cácthành phần có hoạt tính sinh học;

- Hiệu suất tách chiết sẽ tốt

Tách chiết bằng Cường độ siêu âm 230 W; - Ưu điểm là nhanh, không tốn kém và Agaricus [126], [58]

siêu âm hỗ trợ 70°C; 62 phút; tỷ lệ nước: hiệu quả tương tự với các kỹ thuật tách bisporus

(UAE) vật liệu 30 mL/g chiết thông thường;

Chiết xuất bằng vi Cường độ vi sóng 400 W; - Lượng dung môi sử dụng ít; Agaricus [121], [109]

sóng hỗ trợ (MAE) 74,64°C; 29,37 phút; tỉ lệ - Quá trình chuẩn bị mẫu nhanh chóng blazei

nước: vật liệu 32,7:1Chiết xuất kết hợp Cường độ siêu âm 50 W; -Giảm thời gian chiết nhưng làm tăng Ganoderma [29], [21]

vi sóng và siêu âm Cường độ vi sóng 284 W; hiệu suất chiết và tiết kiệm năng lượng lucidum

(UMAE) 701 giây; tỷ lệ nước: vật

liệu 11,6:1

Trang 10

Theo Lindequist và đtg (2005) thì 80- 85% các sản phẩm từ nấm dược liệuđược thu nhận từ quả thể và chỉ 15- 20% được thu nhận từ sợi nấm và dịch nuôi cấythông qua lên men chìm [121] Tuy nhiên, lên men chìm đã được chứng minh là cóhiệu quả và khả năng kiểm soát tốt hơn cho quá trình sinh tổng tổng hợp các hợp chất

có dược tính từ Basidomysetes [33], [12], [8] Bước đầu tiên để thành công trong lên

men chìm là chọn lọc môi trường thích hợp cho mỗi chủng nấm để sinh tổng hợp mộtlượng lớn các chế phẩm sinh học Ngoài ra, quá trình thu nhận exopolysaccharide từlên men lỏng cũng có nhiều ưu điểm hơn so với thu nhận từ quả thể Thời gian lênmen chỉ khoảng 10-15 ngày so với nuôi cấy để thu quả thể có thể kéo dài đến 3 tháng[66] Dịch lên men chỉ qua bước kết tủa với ethanol ở 4oC trong khi một sốpolysaccharide được thu nhận từ quả thể nấm tốn nhiều thời gian, qua nhiều bướcphức tạp để tách chiết và tách phân đoạn như tủa đường trong ethanol, lặp lại cácbước tách chiết bằng nước nóng và dung dịch ammonium oxalate của NaOH, sau đócác polysaccharide đã được tách chiết lại trải qua nhiều bước làm sạch để sử dụngcho các nghiên cứu tiếp theo Hiệu suất tách chiết từ dịch lên men cũng cao hơn sovới các phương pháp tách chiết từ quả thể [56] Với những ưu điểm này, lên menchìm để thu một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học đang lựa chọn vànghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp khả thi nhất

1.5 Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm

Các phân tích về cấu trúc của các polysaccharide giúp xác định các đặc điểmphân tử như khối lượng phân tử, thành phần chuỗi, cấu hình và các dạng đồng phân,trình tự các monosaccharide, sự có mặt và vị trí các nhánh, sự có mặt của các liên kếtinterglycosidic Ngày nay, có một loạt các kỹ thuật đặc trưng để có được các thôngtin chi tiết về cấu trúc của các polysaccharide

Kích thước phân tử thường được xác định bằng phương pháp sắc ký loại trừkích thước (size-exclusion chromatography- SEC) bằng cách so sánh với các vật liệutiêu chuẩn

Thành phần monosaccharide có thể được nghiên cứu bằng cách thủy phâncác polysaccharide trong axit và sau đó phân tích các loại đường tạo thành bằng

Trang 11

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high- performance liquid HPLC ) bằng sắc ký khí ( gas- chromatography- GC ) [14]

chromatography-Sự có mặt và vị trí xuất hiện của các nhánh có thể được xác định thông qua

sự hình thành các dẫn xuất như methyl acetate alditol, trimetylsilyl, acetyl,trifluoroacetyl, methaneboronate, acetal hoặc sự kết hợp của chúng và các phân tíchtiếp theo có thể làm sáng tỏ bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS) [13] MS là một kỹthuật vô cùng hữu ích vì nó chỉ đòi hỏi một lượng mẫu tương đối thấp (picogramshoặc ít hơn) và không cần polysaccharide quá tinh khiết Mặc dù các phân tích về cấutrúc của polysaccharide bằng MS có thể được thực hiện đối với nhiềuolygosaccharides không dẫn xuất và các phức glyco nhưng các polysaccharides đượcO- methyl hóa vẫn được sử dụng để tăng tính ổn định của các ion và độ nhạy của MS.GC/MS cung cấp thông tin về vị trí của liên kết glycosid, sự có mặt của các nhánh vàthành phần monosaccharide trong các carbohydrate phức tạp

Polysaccharide có mặt trong tự nhiên ở cả 2 dạng cấu hình α và β; tuy nhiêncác tính chất vật lý về cơ bản khác nhau phụ thuộc vào loại liên kết Do đó, việc làmsáng rõ các cấu hình liên kết là một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc củapolysaccharide Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một công cụ ưu việt để có đượccác thông tin về thành phần các monosaccharide và cấu hình anomeric, các liên kếttrong chuỗi và xa hơn nữa là các kết quả phân tích sự methyl hóa [72]

1.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance- NMR) trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide

Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân đã được sử dụng rộng rãi trong phântích cấu trúc và cấu hình không gian của các polysaccharide trong dung dịch Giá trị

độ dịch chuyển hóa học và các hằng số tương tác thu được từ phổ NMR sẽ cung cấpcác thông tin về loại đường và cấu hình anomeric

Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu(không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) Phổ cũng cóthể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông quacác tín hiệu trong khoảng 4,3 đến 5,8 ppm Nếu các cấu hình là α thì sự thay đổi hóa

học là lớn hơn so với β Khi tín hiệu xuất hiện ở vùng 5,0- 5,8 ppm, cấu hình anomer

là α và nếu xuất hiện ở vùng 4,3- 5,0 ppm, thì đó là anomer β Như vậy dựa vào tỷ lệtích phân tương đối của các cộng hưởng anomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tửcủa các monosaccharide Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp vớikết quả phân tích 1H-NMR Nhìn chung, kết quả tính tích phân NMR là chính xáchơn so với kết quả phân tích hoá học Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự

có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ 1D 1H-NMR Tiếp theo, số lượng chínhxác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sátvùng anomer của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC

Độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (4,4 –5,8 ppm) được tách biệt mộtcách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2– 4,5 ppm)trong khi độ dịch chuyển 13C anomer (95 – 110 ppm) lại tách biệt rất rõ, không hềtrùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí còn lại (60 – 85 ppm)

Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình anomer được suy ra từ cácthông tin kết hợp có giá trị từ độ dịch chuyển hoá học 1H (H cộng hưởng giữa 5,0 và5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 5,2 ppm) với hằng số tươngtác vô hướng của C-1, H-1 (1JC-1, H-1 165-175 Hz đối với  trong khi 1JC-1, H-1 158-165

Hz đối với ) Tương tác dị hạt nhân liên kết 1JC-1,H-1 có thể thu được từ phổ 1H – 13CHSQC không khử tương tác

Ở phổ 13C-NMR, các carbon trong vòng được tìm thấy trong khoảng 50- 85ppm trong đó các carbon gắn với nitơ xuất hiện ở trong khoảng 65- 75 ppm Cáccarbon tham gia vào quá trình glycosyl hóa dịch chuyển xuống một khoảng 5-10 ppm.Các nguyên tử C6 không thế được tìm thấy quanh vùng 60- 63 ppm và các carbon C6liên kết với các đường dư khác xuất hiện quanh vùng 65- 70 ppm Các tín hiệu carboncủa các nhóm methyl hóa được tìm thấy trong khoảng 15-30 ppm và các carboncarbonyl hóa được tìm thấy ở 165- 185 ppm (Bảng 1.2) [72]

Trang 13

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

Bảng 1.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE củappm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của

tự các đơn phân trong mạch của polysaccaride được xác định chính là chuỗi các liênkết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổHMBC và NOESY

Kỹ thuật NMR hai chiều (2D) bao gồm phổ tương quan (COSY), phổ tăngcường định kỳ Overhauser (ROESY), hiệu ứng quang phổ hạt nhân Overhauser(NOESY) và sự kết hợp lượng tử đa dị nhân (HMQC) làm sáng tỏ cấu trúc củapolysaccharide gồm thành phần monosaccharide, liên kết glycosidic

1.7 Tính chất vật lý của polysaccharide

Các tính chất vật lý như độ tan trong nước, độ nhớt, độ đặc là các yếu tốquan trọng gần như quyết định khả năng sinh học và các hoạt động sinh lý khác Hầu

hết các nghiên cứu về tính chất vật lý của các polysaccharide đã được thực hiện đốivới các β - glucans từ ngũ cốc, tuy nhiên ngày nay các polysaccharide phân lập từnấm đang chiếm được tầm quan trọng ngày càng lớn với số lượng các nghiên cứutăng đáng kể

1.7.1 Khối lượng phân tử của polysaccharide

Khối lượng phân tử (MWS) của các polysaccharide khác nhau tùy thuộc vàophương pháp xác định Các β- glucan tan trong nước từ nấm có khối lượng phân tửtrong khoảng 105-106 Da Phương pháp sắc ký kích thước loại trừ kết hợp với tán xạánh sáng laser đa góc (SEC-LLS) thường được sử dụng để đo kích thước các phân tử

Theo đó, khối lượng phân tử của polysaccharides từ Auricularia auricula-judae là 2,15- 106 Dal [143], các carbohydrate từ Ganoderma lucidum là 1,24- 105 Dal [132]

và từ Pleurotus tuber-regium là 3.14- 105 Dal [124] Các kỹ thuật tương tự được kết

hợp với các kỹ thuật dò khác nhau, chẳng hạn như chỉ số khúc xạ (HPLC - RI , đã

chứng minh rằng các polysaccharides từ Calocybe indica có khối lượng phân tử là

2-105 Dal [80] , từ bào tử của Ganoderma lucidum là 1,26- 2-105 Dal [9], và một carbohydrate phân lập từ quả thể của Pleurotus Sajor - caju có khối lượng phân tử

9,75- 105 Dal [17]

1.7.2 Độ hòa tan của polysaccharide từ nấm

Độ tan trong nước của các polysaccharide phụ thuộc rất nhiều vào loại liên kếtxuất hiện trong chuỗi Thông thường, cụm các liên kết liền kề cùng loại như β- (1 →3) hoặc β- (1 → 4) có xu hướng tổng hợp các liên kết trong chuỗi thông qua các liên kếthydro mạnh mẽ do đó có thể góp phần làm tăng độ cứng của các phân tử trong dung dịch và

độ hòa tan thấp hơn Sự kết hợp của các liên kết tiếp giáp β- (1 → 4) hay β- (1 → 3) tạo nêncác liên kết dài giống như cellulose và kết quả là các

polysaccharide không tan Curdlan và các liên kết β- (1 → 3) glucan khác thườngkhông tan trong nước, rượu, và hầu hết các dung môi hữu cơ nhưng tan trong cácdung dịch có tính kiềm như 0,25 M NaOH, Dimethylsulfoxide (DMSO), acid formic,

và một số thuốc thử dung môi không proton [87] Các polysaccharide có cấu trúc lặpcủa các liên kết đơn vị (1 → 3), (1 → 6) glucose - thường rất cứng, hình que, có hình

Trang 15

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

xoắn ba trong dung dịch nước Ba sợi xoắn được giữ với nhau và ổn định bằng cácliên kết hydro mạnh Một số điều kiện có thể phá vỡ các chuỗi xoắn ba, chẳng hạnnhư nồng độ DMSO ≥ 87%, nhiệt độ ≥ 135°C, hoặc bổ sung natri hydroxide > 0,2mol /L để xoắn ba phân ly gần như hoàn toàn thành các chuỗi đơn và làm tăng khảnăng tăng khả năng hòa tan

Sự hiện diện của các mối liên kết khác nhau trong cấu trúc phá vỡ tính cân đốicủa các trình tự và làm cho các phân tử hòa tan và linh hoạt hơn Các khoảng cách bấtthường trong chuỗi β– glucan chịu trách nhiệm tạo nên hình dạng tổng thể chopolysaccharide và do đó các chuỗi không thể sắp xếp chặt chẽ trên các vùng mở rộng,tăng độ tan trong nước của các polysaccharide Tuy nhiên, sự hiện diện của một môhình lặp đi lặp lại xen kẽ các mối liên kết như ba phần cellotriosyl liên tiếp có thể tạothành hình dạng ổn đinh Phần đã được sắp này có thể áp đặt một số cấu hình khôngđều đặn lên chuỗi β – glucan và do đó hình thành mức độ tổ chức cao hơn của cácpolyme trong dung dịch dẫn đến khả năng hòa tan thấp [122]

Sự xuất hiện của các monosaccharide khác nhau trong chuỗi có thể điều chỉnh

độ hòa tan Sự hiện diện của monosaccharide khác nhau như nhóm thế arabinosyl,xuất hiện để ngăn chặn sự kết hợp này và làm cứng các phân tử lại bằng cách duy trìkhung xylan trong một cấu hình mở rộng hơn [95]

1.8 Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với sức khỏe

1.8.1 Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide

Polysaccharide từ nấm đã được sử dụng rộng rãi và có tác dụng trong điều trịkhối u bởi chúng làm tăng cường miễn dịch của cơ thể Các polysaccharide với hoạttính kháng u mạnh có cấu trúc hóa học khá đa dạng từ homoglycan cho tới cácheteroglycan với các loại monomer như glucose, galactose, mannose, xylose,arabinose, fucose, ribose, axit glucuronic Ngoài các β-glucan mạch thẳng, một số β-glucan mạch nhánh cũng có hoạt tính kháng u Nhóm các polysaccharide có hoạt tínhkháng u thường là heteroglycan gồm các galactan, fucan, xylan, và mannan tùy thuộcvào loại đường đơn trong chuỗi chính và các đường nhánh gồm arabinose, mannose,fucose, galactose, xylose, axit glucuronic [118], [119]

Nhiều polysaccharide có hoạt tính kháng u đã được tìm thấy trong quả thể,

trong khuẩn ty hoặc trong dịch lên men của một số nấm đảm Basidiomycetes Những

chất này tuy khác nhau về thành phần hóa học, cấu trúc không gian và hoạt tínhkháng u nhưng phần lớn thuộc nhóm b-1,3/1,6-glucan Hoạt tính kháng u ở nấm phầnlớn do các polysaccharide có đơn phân tử là glucose và được gọi chung là glucan.Trong các phân tử glucan có tương đối nhiều kiểu liên kết, và phần nhiều trong số đó

là heteroglycan Các phân tử glucan này tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm cùngvới một số polysaccharide khác như chitin, cellulose, galactomannan-protein,glucuromannan-protein v.v.Tuy nhiên, chitin, chitosan hay cellulose không có hoạttính kháng u

Các cơ chế hoạt động kháng u của các polysaccharide không hoàn toàn rõ ràng;người ta tin rằng hoạt động gây nguyên phân của các polysaccharide từ nấm gồmnhiều phản ứng miễn dịch thông qua việc kích hoạt các tế bào miễn dịch cụ thể đểtăng cường một loạt các chức năng của tế bào Chúng bao gồm việc kích hoạt các đạithực bào, tế bào lympho T và các tế bào diệt tự nhiên (NK)- là các tế bào có khả năngtiết chất trung gian gây kích thích và các cytokine như các yếu tố hoại tử khối u α(TNF - α), interferon γ (IFN - γ), hoặc 1β interleukin (IL - 1β) Các polysaccharidecũng có thể ức chế các protein E - selectin và sự biểu hiện gen, ức chế tế bào ung thưbám dính tế bào (tumoral cell-to-cell adhesion) [148] Các cơ chế khác bao gồm cáchiệu ứng chống tăng sinh (antiproliferative), sự cảm ứng cơ chế gây chết tế bào theochương trình (apoptosis), và sự khác biệt của các tế bào ung thư [130]

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các polysaccharide được phân lập từ cácchi nấm khác nhau đa số có khả năng cung cấp các hoạt tính kháng ung [51], [66],

[71] [130] [148] Một số nghiên cứu lâm sàng đã làm rõ được tác dụng ức chế ung thư

của Lentinus edodes [149] [48], Grifola frondosa [15], Schizophyllum commune

[15] [48], Ganoderma lucidum [69] [78], Trametes versicolor [48], Inonotus obliquus [91], Phellinus linteus [50], Flammulina velutipes [82], Hypsizygus marmoreus [83] Ophicordyceps (Cordyceps), [49] Agaricus brasiliensis [136] và Tremella mesenterica [71] [64] Bảng 1.3 trình bày một số polysaccharide có hoạt tính kháng

ung thư từ nấm điển hình

Trang 17

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

Hình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm

Các hợp chất miễn dịch được tách từ hơn 30 loài nấm thuốc đã chứng minhhoạt động kháng u trong điều trị ở động vật Tuy nhiên, chỉ một số ít đã được thửnghiệm tiềm năng chống ung thư ở người Một vài nghiên cứu trong số đó đã đượctiến hành mà đối tượng là β-d-glucans hoặc phức hợp β-d-glucans liên kết với protein.Hơn nữa, các thử nghiệm cũng cho thấy hoạt tính miễn dịch của phức hợp β-d-glucan-protein cao hơn so với glucan tự do Hình 1.1 minh họa cơ chế miễn dịch đơn giản củaβ- glucan [8]

Các hoạt chất miễn dịch hoạt động chủ yếu bằng cách cải thiện hệ thống miễndịch của vật chủ Như đã đề cập ở phần trên, quá trình này bao gồm kích hoạt các tếbào đuôi gai, tế bào tiêu diệt tự nhiên (NK), tế bào T, đại thực bào, và sinh ra cáccytokine Một số sản phẩm của nấm thuốc, chủ yếu là các polysaccharide (đặc biệt làβ-glucans), được phát triển cho mục đích lâm sàng và thương mại như Krestin (PSK)

và PSP (Polysaccharide peptide) từ T versicolor; Lentinan được phân lập từ L edodes; Schizopyllan (Sonifilan, Sizofiran, hoặc SPG) từ S commune; Befungin từ I.

obliquus; D-fraction, từ Gr frondosa; GLPS polysaccharide phần từ Ga lucidum;.

hexose hoạt động tương quan hợp chất (AHCC); và nhiều hoạt chất khác

Bảng 1.3 Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư từ

L edodes Ung thư dạ dày Quả thể β1,3/1,6-glucan Lentinan

S commune Ung thư cổ tử cung Dịch lên men β1,3/1,6-glucan Schizophyllan

Quả thể, β-glucan, Ganoderans

G lucidum Chữa ung thư heteropolysaccarit Protein LZ8

1.8.2 Hạ lipid máu và hạ đường huyết

Hầu hết các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm có thể ví như là chất

xơ, vì vậy chúng không được tiêu hóa trong hệ tiêu hóa ở người [40] Theo các

nghiên cứu trên một vài động vật và ở người, glucan từ các nấm L endodes, G lucidum, S commune, P ostreatus, G frondosa, A blazei, C sinensis và C miltaris

có khả năng làm giảm lượng đường trong máu và cholesterol trong huyết thanh [ 65],

[70] Tác dụng hạ đường huyết có được thông qua việc gắn các polysaccharide khó tiêuhóa vào biểu mô ruột làm giảm tốc độ hấp thu glucose trong khi hiệu ứng hypolipidemic là

do sự gián đoạn tuần hoàn ruột gan của các axit mật [40], [65]

Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease- CVD) là một trong những nguyênnhân chính gây tử vong ở các nước đang phát triển Bệnh tim mạch do nhiều nguyênnhân gây ra và bệnh sinh của các hình thức động mạch của bệnh tim mạch có liênquan đến xơ vữa động mạch Một số dấu hiệu sinh học có nguy cơ tiềm ẩn liên quan

Trang 19

đến bệnh tim mạch đã được xác định, như sự chuyển hóa lipid và lipoprotein (mật độ lipoprotein thấp [LDL] và mật độ lipoprotein cao [HDL], hàm lượng cholesterol và triacylglycerol), chức năng đông máu, tổn thương oxy hóa, chuyển hóa homocysteine, huyết áp [89] Polysaccharides từ nấm đã được chứng minh có khả năng bảo vệ và chống lại bệnh tim mạch và các biến chứng của chúng Ở đường ruột, β-glucans làm giảm sự hấp thu cholesterol và các chuỗi axit béo dài [30] Chuột đực được cho ăn 2%

cholesterol và 1% polysaccharide loại β-glucan ngoại bào tách chiết từ Volvariella volvacea (nấm rơm) cho thấy cholesterol tổng số trong huyết thanh giảm đáng kể,

LDL-cholesterol trong gan và cholesterol toàn phần cũng giảm ở các mức độ khác nhau Trong khi đó không có thay đổi nhiều triacylglycerol trong huyết thanh; HDL-cholesterol và lipid gan tổng số [23] Tương tự như vậy, các polysaccharide từ

Agaricus auricula có hiệu quả đáng kể làm giảm cholesterol và HDL cholesterol tăng

trong chuột được nuôi với chế độ ăn giàu cholesterol [19] Các phân đoạn

polysaccharide từ nấm Pleurotus nebrodensis đã được chứng minh có khả năng làm

giảm huyết áp tâm thu ở những chuột mắc chứng tăng huyết áp tự nhiên [90] Ảnh

hưởng của dịch chiết từ Cordyceps sinensis trong nước nóng được đánh giá ở chuột với

chế độ ăn uống không chứa cholesterol và chuột với chế độ ăn giàu cholesterol Lượng cholesterol huyết thanh tổng của tất cả các nhóm chuột giảm sau khi có sự tác động củapolysaccharide Trong số chuột được nuôi với chế độ ăn giàu cholesterol, mức HDL cholesterol tăng nhưng giảm mật độ lipoprotein xuống rất thấp (VLDL) và giảm mức cholesterol LDL [62]

Ngoài ra, các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm cũng có tác dụng hạđường huyết thông qua sự điều tiết quá trình chuyển hóa carbonhydrat và tổng hợpinsulin Các polysaccharide đường uống có vai trò rất quan trọng vì chúng có thểđược sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường

1.8.3 Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm

Các polysaccharide được chiết xuất từ các nấm G lucidum, T versicolor, L endodes, P linteus và Agaricus có khả năng khử và đặc tính tạo phức và có thể ức

chế sự oxy hóa lipid hoặc stress oxy hóa- khử Những tác dụng trên có liên quan đến

Trang 20

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

sự có mặt của β- glucan và một phenolic (chủ yếu là tyrosine và ferrulic acid) bán liênkết với chuỗi chính β- glucan bằng các liên kết cộng hóa trị [40], [63], [147] Mặc dù

các hợp chất phenolic có trong quả thể và sợ nấm của G lucidum là các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất nhưng polysaccharide của G lucidum cũng thể hiện

đặc tính khử các gốc tự do, thế khử và ức chế peroxy hóa lipid [47], [127] Saltarelli

và đtg (2009) đã nhận thấy trong số các polysaccharide khác nhau được chiết từ sợi

nấm của G lucidum thì các polysaccharide khối lượng phân tử thấp có hoạt tính

chống oxy hóa cao nhất, dựa vào hoạt tính tạo phức với Fe2+, xác định lipoxygenase

và gốc tự do1,1- diphenyl- dipicrylhydrazyl (DPPH) trong khi đó các polysaccharide

nội bào không có tác dụng chống oxy hóa [110] Tương tự, các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng peptidedoglucan từ G lucidum có tác dụng bảo vệ ty thể, lưới nội chất và

các tiên mao của các đại thực bào khỏi các tác dụng tie cực từ hóa chất và các biến cố

[146] Thêm nữa, dịch chiết trong methanol của các glucan và proteoglucan từ G lucidum và G tsugae cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa bằng cách thu các yếu tố

của phản ứng oxy hóa [65]

Một cơ chế chống oxy hóa khác là khả năng của các polysaccharide trong việchạn chế quá trình sản xuất các gốc oxy tự do từ nấm và hoạt động của các tế bào đơnnhân ngoại vi ở các đại thực bào có gai, điều này liên quan đến quá trình suy hô hấp

và lão hóa [142], [146], hoặc làm tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa trong

huyết thanh [141] Các dịch chiết trong methanol từ sợi nấm của các loài G frondosa,

M esculenta và Termitomyces albuminosus cũng thể hiện các hoạt tính chống oxy

hóa nhưng chủ yếu liên quan đến sự có mặt của các hợp chất phenolic trong dịchchiết [84] Các polysaccharide khác từ nấm bao gồm các polysaccharide được chiết

bằng nước từ quả thể của G lucidum, Auricularia auricula và Cordyceps militaris

cho thấy có các đặc tính thu dọn, tạo phức và tính khử do đó làm tăng hiệu quả chốngoxy hóa tổng số [22], [75], [140], [92] Không chỉ các dịch chiết từ quả thể, một sốnghiên cứu đã tìm thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch nuôi cấy và sinh khối nấm

thu được trong điều kiện lên men lỏng Trong môi trường nuôi cấy Hericium enrinaceum có bổ sung các nguồn selen (sodium selenite và selol), một

exopolysaccharide chứa selen được sinh tổng hợp Exopolysaccharide này bộc lộ khả

năng chống oxy hóa tuyệt vời, dựa trên sự khử và ức chế quá trình peroxy hóa lipid

và thu dọn các gốc tự do DPPH [79] Hai mươi lăm chủng nấm thuộc các chi

Agaricus, Lentinus, Schizophyllium, Pleurotus sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt

tính chống oxy hóa với hoạt tính thu được từ 753 đến 9.384 % quercetin/l/ngày theomột công bố của Umeo và đtg [202]

1.8.4 Prebiotic từ nấm

Prebiotic là các chất tiền trợ sinh học tạo ra thức ăn và môi trường thuận lợicho vi khuẩn có lợi (probiotic) phát triển trong đường ruột Các chất tiền trợ sinh họcnày góp phần duy trì sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột, kích thích miễn dịchđường tiêu hóa, giảm khả năng ung thư ruột kết, giảm cholesterol trong máu Các tácdụng prebiotic từ các polysaccharide từ nấm cũng đã được mô tả trong nhiều nghiêncứu Vì các enzyme tiêu hóa của người không thể thủy phân liên kết β-glucosid nênnhiều polysaccharide nấm có thể hoạt động như là các nguồn prebiotic [8] Synytsya

và đtg (2009) đã đánh giá hiệu quả prebiotic của các glucan được phân lập từ quả thể

của P ostreatus và P eryngii trên một vài chủng probiotic như Lactobaciluss, Bifidibacterium và Enterococusii [123] Cả 2 dạng glucan tan trong nước β-1,3/β-1,6-

glucan và gtan trong kiềm α-1,3-glucan của các loài nấm nói trên đều được đánh giá

là có khả năng kích thích sự tăng trưởng của các vi khuẩn probiotic, đặc biệt là các

glucan từ P eryngii Trong một nghiên cứu khác, các β- glucan từ màng cứng của P tuber-regium đã được đánh giá hiệu quả của chúng đối với Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, và Bifidobacterium adolescentis trong môi trường dịch thể,

sử dụng inulin như là chất kiểm soát prebiotic [150] Người ta nhận thấy rằng sau 24giờ lên men, quần xã vi khuẩn có ích có bổ sung glucan từ nấm có mức tăng trưởnggấp 3-4 lần tương tự như sự tăng trưởng khi bổ sung inulin [150] Gần đây, Chou vàđtg (2013) đã chỉ ra rằng các polysaccharide từ các phần bỏ đi của nấm như cuống

của L.endodes, gốc của P.eryngii, và gốc của F.velutipes có thể làm tăng tỷ lệ sống sót của Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei , và B longum trong sữa chua

[25] Các tác giả cũng quan sát thấy tác dụng hiệp đồng của các polysaccharide vớicác peptide và amino acid có trong môi trường sữa chua để duy trì số lượng vi khuẩn

có lợi trên 107 CFU/ml ở điều kiện lạnh Họ cũng phát hiện ra rằng các

Trang 22

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

polysaccharide từ nấm có tác dụng đáng kể trong bảo vệ (tăng tỷ lệ sống) cho các vikhuẩn có lợi probiotic trong dịch dạ dày và mật mô phỏng

1.8.5 Tính kháng virus của polysaccharide từ nấm

Một vài polysaccharide từ nấm dược liệu và nấm ăn đã được công bố có cácchất thể hiện hoạt tính kháng virus thông qua tăng sự giải phóng IFN- γ và tăngcường sự phát triển của các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC- peripheral blood

mononuclear cell) [70], [81] Các dịch chiết carbohydrate khác nhau từ nấm Lentinus edodes đã được thử nghiệm và kết quả chỉ ra rằng dịch chiết này có hoạt tính kháng

virus gây bệnh sốt bại liệt loại 1 (PV - 1) và virus đậu bò loại 1 (BoHV - 1) Các minhchứng thu được cho thấy các polysaccharide có tác dụng kháng virus và chúng hoạtđộng ở giai đoạn đầu của quá trình sao chép ở cả hai chuỗi virus [108] Đối với việcđiều trị vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV), chưa có một số lượng nghiêncứu thực nghiệm đủ lớn liên quan đến các polysaccharide từ nấm Đáng chú ý,

lentinan và một proteoglucan có tính acid từ G lucidum đã được áp dụng thành công

như một liệu pháp điều trị bổ sung đối với HIV trong việc kết hợp với các thuốckháng HIV thông thường vì chúng có khả năng tăng cường sức đề kháng đối vớivirus HIV và hạn chế độc tính của các thuốc chống HIV Một nghiên cứu đã đượctiến hành đối với 88 bệnh nhân HIV dương tính với CD4 ở mức 200-500 tế bào/mm

Các bệnh nhân được điều trị với sự kết hợp của lentinan polysaccharide từ L edodes

và didanosine (ddI) Sự kết hợp này đã tạo nên sự tăng đáng kể CD4 kéo dài đến 38tuần, trong khi nếu chỉ điều trị bằng ddI thì mức tăng CD4 là 5 % ở 14 tuần [42]

Hoạt tính kháng HIV tương tự cũng đã được phát hiện ở các glucan từ G frondosa và

T versicolor [70], [81].

1.8.6 Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide từ nấm

Sự phát triển của kháng sinh là một trong những thành tựu khoa học quantrọng nhất trong 70 năm qua Các hợp chất này hoạt động bằng nhiều cách như canthiệp vào quá trình chuyển hóa hoặc trong các cấu trúc sinh vật [38] Trong nhữngnăm gần đây, việc ứng dụng các thuốc kháng sinh thương mại được tổng hợp hóa học

đã thu hút sự quan tâm của lớn do các tác động nguy hại của chúng đến sức khỏe

Hiện tượng kháng các thuốc kháng sinh hiên nay đang là mối quan tâm lớn của cácbác sỹ, bệnh nhân, các nhà sản xuất dược và cộng đồng [86] Ngoài ra, việc điều trịcác bệnh truyền nhiễm phổ biến ngày càng trở nên phức tạp do sự gia tăng tính khángnhiều loại thuốc của các vi sinh vật gây bệnh ở con người Vì vậy, điều thiết yếu làphải phát triển các tác nhân điều trị mới và hiệu quả chống lại được các mầm bệnhkháng thuốc [10] Mặc dù số lượng các hợp chất kháng khuẩn rất nhiều và đa dạngnhưng thực tế sự kháng lại kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh đang có chiềuhướng gia tăng mạnh Năm 2010, tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã khuyến cáo tất cảcác nước tiến hành việc kiểm soát sự lây truyền của các vi khuẩn kháng đa thuốccũng như nêu bật lên những rủi ro gặp phải khi thiếu các trị liệu luân phiên để chốnglại các vi sinh vật trên [138] Hiện tượng kháng đa thuốc kháng sinh của các vi sinhvật gây bệnh ở người đang ngày càng gia tăng do việc sử dụng các kháng sinh thươngmại một cách bừa bãi, các kháng sinh này được sử dụng chung trong điều trị nhiềubệnh nhiễm trùng [113] Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng liều lượng kháng sinh thấpkhông có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn nhưng có tác dụng ức chế chúng.

Các bệnh viêm nhiễm trước đây có thể dễ dàng chữa bằng kháng sinh thì ngàynay lại trở nên nghiêm trọng do kháng lại kháng sinh [139], [101] Mối liên hệ giữacác vi sinh vật đa kháng khuẩn và các bệnh nhiễm trùng bệnh viện là vấn đề cấp báchcần được giải quyết đối phó [102] Vì vậy, việc nghiên cứu các chất kháng sinh mớihay các chất kháng khuẩn không phải là kháng sinh có hiệu quả kháng lại các vi sinhvật gây kháng thuốc hiện nay thực sự rất quan trọng Các nhóm các sinh vật mới,trong đó có nấm có thể là một nguồn thay thế có tính kháng vi sinh vật mới

Các phương pháp khác nhau đã được sử dụng để xác định hoạt tính khángkhuẩn của các hợp chất và dịch chiết từ nấm, bao gồm các phương pháp pha loãng,phương pháp khuếch tán đĩa, phương pháp vết pha loãng trên aga dựa trên cơ sởkhuếch tán xuyên tâm và hơn nữa là xác định số lượng khuẩn lạc Do đó, các kết quả

về hoạt tính kháng vi sinh vật được biểu diễn bằng các đơn vị khác nhau

Tác động kháng khuẩn của các nấm từ khắp nơi trên thế giới và các hợp chấttách chiết từ chúng đã được tổng hợp Kết quả này rất hữu ích cho các nghiên cứu

Trang 24

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

khoa học trong tương lai Cả các nấm ăn được và không ăn được đều thể hiện hoạttính kháng khuẩn kháng lại các vi sinh vật gây bệnh, trong đó có các vi khuẩn liên

quan đến nhiễm trùng bệnh viện như Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas

maltophila, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Serratia marcescens và các vi khuẩn đa

kháng như MRSA, MRSE, VREF, PRSP, ERSP

Các số liệu cho thấy các dịch chiết nấm và các hợp chất phân lập được thể hiệnhoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram dương cao hơn so với Gram âm Trong các nấm,

Lentinus edodes là loài đã được nghiên cứu là tốt nhất và gần như có hoạt động kháng

khuẩn kháng lại cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Các chủng nấm thuộc các chi

Boletus, Ganoderma và Lepista hứa hẹn nhiều tiềm năng cho các nghiên cứu trong

tương lai Xét về số lượng các nghiên cứu đối với các hợp chất riêng biệt thì Plectasin

peptide- phân lập từ Pseudoplectania nigreella biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn cao

nhất kháng lại các vi khuẩn Gram dương

Các nghiên cứu về nấm là rất rộng với hàng trăm loài đã được chứng minh là

có phổ ứng dụng trong công nghiệp y dược bao gồm cả các hoạt tính kháng khuẩn.Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đánh giá các đặc tính kháng khuẩn của dịchchiết từ quả thể nấm Thực tế chưa có nhiều các nghiên cứu về xác định các đặc tínhkháng khuẩn cho các hợp chất riêng biệt, mới chỉ một số hợp chất có phân tử lượngthấp và một vài peptide đã được mô tả Sau khi cơ chế hoạt động của chúng được làmsáng tỏ, các chất chuyển hóa từ nấm hoặc các hợp chất có liên quan khác có thể được

sử dụng để phát triển trong lĩnh vực dinh dưỡng hoặc như các loại thuốc có hiệu quảchống lại các vi sinh vật gây bệnh đã kháng lại các phương pháp điều trị thôngthường [145]

1.9 Laccase và ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người

1.9.1 Tổng quan về laccase

Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) là một

polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxydase Trong phân tử có chứa 4 nguyên tửđồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử

Laccase có phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuấtphenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin

và cả hợp chất vô cơ như iot Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thìkhác nhau về khối lượng phân tử, tính chất glycosyl hóa và các tính chất động học

[28] Laccse được phân bố rộng rãi ở cả thực vật, nấm đảm, nấm sợi, xạ khuẩn và vi

khuẩn Tuy nhiên cho đến nay, laccase chủ yếu được phát hiện ở nấm đảm (Basidomycetes với hoạt tính cao), đặc biệt là ở các loài nấm có khả năng phân hủy

lignocellulose như Agaricus basidomyces, Botrytis cinerea, Chaetomium thmophilum, Coprius, cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiatre, Pleurotus otreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor v.v.

Trong những năm gần đây, laccase được đặc biệt quan tâm bởi những ứng dụngrộng rãi của nó trong xử lý môi trường và nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhưdệt nhuộm, tổng hợp hữu cơ, thực phẩm và tiềm năng trong lĩnh vực mỹ phẩm, dượcphẩm và bảo vệ sức khỏe con người

1.9.2 Ứng dụng của lacacse trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe

Do tính đặc thù và bản chất sinh học của chúng nên laccase có tiềm năng ứngdụng trong lĩnh vực y dược và đang được quan tâm nghiên cứu

Chứng viêm da nhiễm độc do nhựa cây (kết quả của việc da tiếp xúc với cácchất độc từ cây thường xuân, cây yến mạch hay cây sơn mà chủ yếu là từ nhựa) chủyếu do urushiol- một chất độc là dẫn xuất của catechol gây nên Khi urushiol bị oxyhóa trở thành dẫn xuất ο- quinone thì lại trở thành một chất không độc Lacase thểhiện tính oxy hóa, polymer hóa và khử độc urushiol từ đó hạn chế được ảnh hưởngcủa chứng viêm da do nhiễm độc nhựa cây

Một ứng dụng tiềm năng khác của laccase trong lĩnh vực này là dựa vào sự

vận phát sinh iodine insitu Laccase có thể oxy hóa iodide để tạo thành iodine- một

loại thuốc thử được sử dụng một cách rộng rãi như một loại thuốc tẩy Việc ứng dụng

hệ thống sinh iodine bằng hệ thống laccase- muối iodide để khử trùng mang lại nhiềutiến bộ hơn so với sử dụng trực tiếp iodine Thứ nhất, muối iodide có tính ổn định và

an toàn hơn so với I2 trong việc bảo quản, vận chuyển và sử dụng Thứ hai là việc giảiphóng iodine từ hệ laccase- iodide dễ dàng điều khiển (có thể điều chỉnh bằng hoạt độ

Trang 26

Luận văn Thạc sĩ sinh học Hoàng Thị Nhung- CHK17

laccase) Hệ thống này có thể được sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp nhưdược phẩm, nội thất, chăm sóc sức khỏe, khử trùng nước uống hay nước bể bơi cũngnhư trong việc tẩy sạch các dây quấn vô cùng nhỏ

Ngoài ra laccase còn được ứng dụng trong công nghệ khử mùi vì laccase cókhả năng oxy hóa nhiều hợp chất thiol và các hợp chất chứa sulphur Thậm chí hệlaccase còn có khả năng khử những mùi hôi thối thành mùi thơm nhờ khả năng tấncông và biến đổi các phân tử hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây nên những mùi hôi thốinày Laccase còn được sử dụng như là chất xúc tác trong quá trình sản xuất các thuốcchống ung thư Thậm chí laccase còn là thành phần của nhiều mỹ phẩm Nhiều cảmbiến sinh học có chứa laccase đã được phát triển cho các xét nghiệm miễn dịch và xácđịnh glucose, các amin thơm và các hợp chất phenol (Kunamneu và đtg, 2008).Laccase tạo liên kết đồng hóa trị với các phân tử liên kết sinh học như kháng thể,kháng nguyên, DNA, RNA, biotin và streptavidin có thể được sử dụng như mộtenzyme đánh dấu cho các xét nghiệm phát hiện trong hóa học mô, hóa học miễn dịch,hóa học tế bào hay axit nucleic (Schmid và Urlacher, 2007)

Nấm dược liệu cũng chứa một số các enzyme như laccase, superoxidedismutase, glucose oxidase, và peroxidase Các enzyme này cũng đã được chứngminh là đóng vai trò quan trọng trong các liệu pháp điều trị ung thư bằng cách ngănchặn sự oxy hóa và ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư Nhiều sản phẩmđược tạo ra từ laccase như các nhân tố kháng khuẩn, giải độc hay chăm sóc sức khỏecon người Laccase có thể được sử dụng trong quá trình tổng hợp các hợp chất phứctạp có dược tính như thuốc mê, thuốc kháng viêm, thuốc kháng sinh, an thần v.v., baogồm triazolo(benzo)cycloalkyl thiadiazines, vinblastine, mitomycin, penicillin Xdimer, cephalosporins và dimerized vindoline [98] Ngoài ra, laccase đã được các nhànghiên cứu chứng minh về hoạt động ức chế một cách đáng kể quá trình phiên mãngược của HIV-1 [131] Một laccase khác cũng đã được khẳng định về khả năngchống lại aceruloplasminemia (một bệnh rối loạn di truyền do đột biến ở gen) Cáchđây vài năm, một phương pháp enzyme mới dựa trên laccase đã được phát triển đểphân biệt đồng thời morphine và codeine trong các mẫu thuốc được tiêm vào hệthống phát hiện