Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương việt nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng​

Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm tăng đáng kể khả năng thích ứng với khô

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN VÀ SINH VẬT

PHẠM THỊ HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN ZmBZIP72 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG NGÔ ĐỊA

PHƯƠNG VIỆT NAM VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN PHỤC VỤ

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS HUỲNH THỊ THU HUỆ

Hà Nội - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêutrong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Huỳnh Thị Thu Huệ - Phó trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu hệ gen đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.

Luận văn này được thực hiện tại phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiêncứu hệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài cấp nhà nước: “Phân lập thiết kế gen chịuhạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen” giai đoạn 2014-2018 do Bộ Nôngnghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc cơ sở đào tạo Viện Sinh thái vàTài nguyên sinh vật và ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giảng dạy và tạo điềukiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen,Viện Nghiên cứu hệ gen đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên cũng nhưnhững góp ý quý báu trong quá trình tôi thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, Ngày tháng năm

2017

Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng

2016/2017

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình

nhân tạo

vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu

ZmbZIP72 giống Tẻ

chiếu

và HindIII

HindIII

thế hệ T0

Hình 3.19 Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị

gen T0

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán , 1.1.1 Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật 1.1.3.1 Các gen mã hoá protein chức năng 1.1.3.2 Các gen mã hoá protein truyền tín hiện 1.1.3.3 Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã 1.2 Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực vật

1.3 Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72

1.4 Cây ngô và vấn đề chịu hạn

1.5 Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen .

1.6 Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .

2.1 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

2.1.2 Các vật liệu khác 2.1.3 Hoá chất

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu

ix

2.2.7 Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn

tumefaciens .

2.2.8 Tách chiết và tinh sạch plasmid

2.2.9 Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 2.2.10 Điện di trên gel agarose

2.2.11 Chuyển gen vào thực vật thông qua A tumefaciens CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .

3.1 PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ

3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô .

3.1.2 Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất

3.1.3 RT-PCR nhân gen ZmbZIP72

3.1.4 Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2 3.1.5 Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72 3.2 Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72

3.2.1 PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme 3.2.2 Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72 3.2.3 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen 3.3 Tạo chủng A tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72

3.4 Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô

3.5 Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72

3.5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen 3.5.2 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin 3.5.3 Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 Kết luận

2 Kiến nghị

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 65

x

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

Cây ngô là một trong các loại cây ngũ cốc quan trọng đối với con người Ở Việt Nam,ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và được trồng ở nhiều vùng khác nhau.Theo số liệu của Tổng cục thống kê, diện tích trồng ngô ở nước ta năm 2015 ước đạt 1164,8nghìn ha, sản lượng ước đạt 5287,2 nghìn tấn và năng suất bình quân đạt 4,54 tấn/ha(https://www.gso.gov.vn) Tuy nhiên, sản xuất ngô ở Việt Nam hiện vẫn chưa đáp ứng đượcnhu cầu tiêu dùng trong nước, năm 2015 nước ta vẫn phải nhập khẩu khoảng 7,55 triệu tấnngô (https://www.gso.gov.vn ) Một trong những nguyên nhân chính là do việc canh tác ngô

ở Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nước mưa tự nhiên Điều này ảnh hưởng rất lớn đến khảnăng tăng năng suất và sản lượng ngô hàng năm và đặc biệt là trong điều kiện nắng hạn kéodài Do đó, việc nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn đang là chủ đề nghiên cứu của nhiều tổchức và các nhà khoa học Trong nhiều năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặcbiệt là công nghệ gen để cải thiện khả năng chịu hạn của cây

trồng đang được quan tâm Tuy nhiên, ở nước ta, những thành tựu trong nghiên cứu tạogiống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn vẫn còn hạn chế Nguyên nhân gồm cảkhách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều,công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó

để chuyển gen vào hệ gen

Ở thực vật, trong quá trình thích nghi với điều kiện hạn, sự biểu hiện và các cơ chếđiều hòa mức độ biểu hiện của các gen có vai trò quan trọng Sự biểu hiện của gen liên quan

chặt chẽ với các yếu tố điều khiển phiên mã Gen ZmbZIP72 là một trong những gen mã hóa

cho yếu tố điều khiển phiên mã của cây ngô đã được phân lập và mô tả bởi Sheng và cộng sự

(2012) Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm tăng đáng kể khả năng thích ứng với khô hạn, cho thấy vai trò tiềm năng của gen ZmbZIP72

trong việc tăng cường khả năng chịu hạn đối với cây chuyển gen Trên cơ sở đó, chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống

ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển

gen vào cây trồng” mục tiêu là phân lập gen và chuyển gen ZmbZIP72 vào cây dòng ngô

K7 để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn Các nội dung nghiên

cứu cụ thể như sau:

- Phân lập, tách dòng gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) của

Việt Nam

- Xác định và phân tích trình tự của gen ZmbZIP72

- Thiết kế các vector mang gen ZmbZIP72

- Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô thông qua vi khuẩn A tumefaciens

- Kiểm tra sự có mặt của gen ZmbZIP72 trong cây chuyển gen T 0 bằng kỹ thuật PCR

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán

1.1.1 Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sảnphẩm của cây trồng Khi môi trường hạn hán, cây bị mất nước dẫn đến nhiều hậu quảnghiêm trọng: (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo Sự conguyên sinh chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào bị thất thoát

ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp Khicây sống trong môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nênmềm yếu và sự héo xảy ra Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu

sự thiếu nước xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài (ii) Môi trường sống bị khô hạncản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ Trong điều kiện thiếu nước, sự cung cấp nướccho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến cáclông hút bị tổn thương lớp ngoài, vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễnên ảnh hưởng đến đẩy cột nước lên cao trong mạch gỗ Đặc biệt khi thiếu nước sẽ hìnhthành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nước làm cho cộtnước trong mạch gỗ không được đẩy lên liên tục (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bềmặt lá làm giảm sự thoát hơi nước qua biểu bì (iv) Sự thiếu nước làm giảm cường độquang hợp Khi hàm lượng nước trong lá còn khoảng 40 -50%, quang hợp của lá bị đìnhtrệ (v) Đặc biệt, hạn hán cản trở sự sinh trưởng của cây trồng Thiếu nước ảnh hưởng đếncác hoạt động sinh lý, nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trưởng và năng suất cây trồng

nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013).

Việc giảm năng suất do hạn hán đã được báo cáo ở nhiều loại cây trồng, mức độ

nghiêm trọng phụ thuộc vào thời gian xảy ra hạn Ở lúa mạch (Hordeum vulgare), hạn hán

làm giảm năng suất do số lượng của chồi, cụm hoa, hạt trên mỗi cây và trọng lượng của mỗihạt bị giảm Ở ngô, stress hạn làm giảm năng suất do trì hoãn việc phun râu, do đó làm tăngthời gian chênh lệch trỗ cờ - phun râu Đặc tính này liên quan chặt chẽ với năng suất hạt, cụ

thể là số bắp và số hạt trên mỗi cây bị ảnh hưởng (Cattivelli et al., 2008) Thâm hụt

nước trong suốt quá trình thụ phấn làm tăng tần số hạt không phát triển ở ngô Ở cây đậu

triều (Cajanus cajan), hạn hán diễn ra trong giai đoạn nảy mầm làm sản lượng hạt bị giảm đi 40 – 55% (Nam et al., 2001) Trong giai đoạn sinh sản, thiếu hụt nước làm giảm sản lượng ở bông (Gossypium hirsutum) do việc giảm hình thành và sự phát triển không

đầy đủ của các quả nang Hạn hán ở đậu tương cũng làm giảm tổng sản lượng hạt

(Frederick et al., 2001) Hạn hán ít có ảnh hưởng đến tỷ lệ hạt mẩy trên lúa mỳ nhưng thời gian hình thành hạt ngắn hơn và trọng lượng khô bị giảm khi trưởng thành (Wardlaw

vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ (Steponkus P.L et al, 2003) Tự điều

chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào còn thông qua tích lũy các chất hòa tan, các protein, cácaxit amin ví dụ như: axit amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzyme phân hủy gốc

tự do… Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: Giữ và lấy nước vào trong tếbào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+; thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứngsinh hóa, tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và cácphức protein (Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, 1998)

1.1.3 Cơ chế phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật

Việc nắm được các cơ chế phân tử của phản ứng chịu hạn ở thực vật là vô cùngquan trọng đối với việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng Các nghiên cứu gầnđây đã phân lập được hàng trăm gen được cảm ứng hoặc ức chế khi cây gặp điều kiệnkhô hạn Tuy nhiên, chỉ một phần rất nhỏ các gen được kiểm chứng về vai trò của nótrong việc tăng tính chịu hạn của cây Những gen này có thể phân vào các nhóm dựa vàochức năng nội bào như: các gen mã hoá protein chức năng, các gen mã hoá yếu tố truyềntín hiệu và các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã…

1.1.3.1 Các gen mã hoá protein chức năng

Các gen liên quan đến chức năng bảo vệ trực tiếp lên màng tế bào và protein nhưLEA protein, heat shock protein (HSP), cold shock protein (CSP) LEA là một nhóm cácprotein tự nhiên tích tụ trong hạt phấn hoa, hạt và các mô thực vật trong quá trình đápứng lại các stress phi sinh học Việc tích luỹ các protein LEA liên quan trực tiếp với khả

năng chịu khô hạn ở thực vật (Amara et al 2012) Bên cạnh dữ liệu phong phú về cấu

trúc và sự biểu hiện của protein này, ngày càng có nhiều các công trình đề cập đến việc

sử dụng các gen LEA nhằm cải thiện tính chống chịu khô hạn ở thực vật (Grelet et al., 2005) Ví dụ, gen HVA1 mã hoá nhóm protein LEA3 của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.) Người ta đã chuyển nạp gen này thành công vào cây ngô để tăng cường khả năng chịu hạn và mặn trong điều kiện nhà lưới (Nguyen et al., 2013) Gen OsLEA3-1 nhạy

cảm với mặn đã thể hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều

khiển của promoter CaMV35S và promoter HVA1-like (Xiao et al 2007).

Các protein sốc nhiệt (HSP) và sốc lạnh (CSP) là các chaperone ngăn ngừa sự biến

đổi và gấp nếp của các thành phần tế bào trong điều kiện stress Các gen CspA và CspB từ

vi khuẩn đã được chuyển vào ngô để tăng cường khả năng chịu hạn, nóng, và lạnh bằngcách bảo vệ quá trình quang hợp, sinh dưỡng và các giai đoạn sinh trưởng, sinh sản.Năng

suất tăng lên khoảng 11 – 12% đối với cây ngô chuyển gen CspA và CspB thông qua việc đánh giá các thử nghiệm về năng suất trong nhiều năm, ở nhiều địa điểm (Yang et al.,

2010) sHSP17.2, sHSP17.4 và sHSP26 là 3 protein sốc nhiệt nhỏ đã được xác định bằng

cách sử dụng quang khối phổ MALDI-TOF ở lá ngô khi đáp ứng với stress hạn Các phântích hệ phiên mã cho thấy mức biểu hiện của các sHSP này được điều chỉnh tăng lên khiđáp ứng với stress nhiệt và hạn ở lá ngô ABA chịu trách nhiệm điều hoà biểu hiện sau

phiên mã các sHSP này (Hu et al 2010).

Protein Cyclophilin (CYP) liên quan đến nhiều chức năng như phân chia tế bào,truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển protein, điều hoà phiên mã, cắt nối tiền mRNA và khả

năng chịu stress (Trivedi et al 2012) Các phân tích silico cho thấy rằng việc đáp ứng

stress của thực vật có liên quan với các protein cyclophilin Các protein CYP ở lúa, ngô,

Arabidopsis, lúa mạch và brachypodium giống nhau đến trên 80% cho thấy tần số cao các trình tự bảo thủ CYP thường gặp ở lục lạp, cytosol, và ty thể (Trivedi et al 2013) Đánh

giá so sánh chỉ ra rằng mRNA chịu trách nhiệm tổng hợp CYP được phát hiện với tần sốcao ở ngô sau 6 – 7 giờ xử lý stress hạn, ở đậu mất khoảng 48 giờ

1.1.3.2 Các gen mã hoá protein truyền tín hiện

Nhiều hệ thống truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng với điều kiện bất lợiphi sinh học, bao gồm kinase, enzyme chuyển hoá phospholipid, calcium sensing… Mặc

dù các quá trình truyền tín hiệu này khá phức tạp và chưa được hiểu rõ, một vài gen mãhoá cho các yếu tố truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng chịu hạn đã được phân lập.Một vào yếu tố gần đây đã được sử dụng trong tạo tính chịu hạn ở cây chuyển gen như:

NPK (Kovtun et al, 2000), SnRK2 (Umezawa et al., 2004), CBL (Cheong et al., 2003).

Cũng giống như các yếu tố điều khiển phiên mã, việc biến đổi một yếu tố truyền tín hiệu

có thẻ làm thay đổi một loạt các sự kiện sau đó, kết quả là tạo khả năng chống chịu ở

nhiều mặt Ví dụ, NPK1 là một kinase của Nicotinana NPK1 nằm ở giai đoạn đầu của

con đường truyền tín hiệu oxi hoá và dẫn đến khả năng chịu hạn, lạnh, nóng và muối ở

cây ngô chuyển gen (Shou et al., 2014) PIS (Phosphatidylinositol synthase) là một

enzyme quan trọng trong con đường tổng hợp phosphatidylinositol không những là mộtthành phần cấu trúc màng tế bào mà còn là tiền chất của phần tử tín hiệu điều hoà đáp

ứng của cây trước điều kiện bất lợi Khi biểu hiện quá mức gen ZmPIS trong cây ngô, cây tăng cường khả năng chịu hạn đặc biệt là giai đoạn trước khi nở hoa (Liu et al., 2013).

1.1.3.3 Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã

Yếu tố điều kiển phiên mã (TF) là các protein có vai trò kiểm soát quá trình phiên mãbằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu trên promoter của gen Các yếu tố điều khiểnphiên mã hiện nay được các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu và khai thác do tiềm

năng sử dụng lớn trong công nghệ sinh học (Saibo et al., 2009; Century et al., 2008) Hiện

nay, những nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra rằng abscisic acid (ABA) đóng vai trò quantrọng trong việc đáp ứng và thích nghi với các stress phi sinh học Người ta nhận thấy rằng,bên cạnh phần lớn các gen đáp ứng với stress được điều hòa bằng ABA, vẫn còn một lượngcác gen không chịu ảnh hưởng bởi ABA Do đó, các yếu tố phiên mã cũng được chia thànhnhóm phụ thuộc hay độc lập với ABA Các TF của hơn 50 họ khác nhau mã hoá cho 1700

gen khác nhau đã được tìm thấy trong Arabidopsis (Yang et al., 2010) Các TF được trình

bày dưới đây đều là các TF đáp ứng với hạn và chịu hạn

TF bZIP là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã phụ thuộc ABA ABAresponsive element binding factors (AREB/ABF) là một thành viên của nhóm TF bZIPliên quan đến tín hiệu ABA trong điều kiện hạn hán và trưởng thành của hạt AREB/ABFnhận biết và bám vào ABA responsive element (ABRE) yếu tố hoạt động cis để điều

khiển sự hoạt động của các gen phía sau (Mundy et al., 1990) ABRE nằm trong vùng

promoter của các gen đáp ứng ABA (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006) Việcđóng khí khổng và giảm sự thoát hơi nước là kết quả của việc tăng hàm lượng ABA do sự

biểu hiện quá mức của AREB1/ABF2, ABF3 hoặc AREB2/ABF4 (Kang et al., 2002) Sự biểu hiện quá mức của gen ABF3 ở cây lúa chuyển gen cho thấy khả năng chịu hạn thông

qua việc tăng cường độ phát huỳnh quang của diệp lục (Fv/Fm) và giảm sự héo và cuộn

xoắn ở lá (Oh et al., 2005) Các cây chuyển gen AREB1 được điều khiển bởi 35S promoter cho thấy khả năng sống sót vượt trội (100%) so với cây đối chứng (40%) trong

điều kiện hạn, không những vậy cây chuyển gen còn có hiệu năng sử dụng nước cao hơn

và có nhiều lá hơn so với dòng đối chứng (Leite et al., 2014).

Một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn khác là WRKY, TF này đượctìm thấy ở nhiều loài, đặc biệt là ở các loài thực vật bậc cao (Ulker and Somssich, 2004)

Gần đây, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò của nhóm TF này trong đáp

ứng của cây với các điều kiện bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn hán ở Arabidopsis, lúa mạch (Luo et al., 2013; Xiong et al., 2010) Mới đây, các nhà khoa học đã phân lập được gen ZmWRKY58 từ ngô và sự biểu hiện của gen này ở các dòng lúa chuyển gen làm tăng khả năng chống chịu hạn và muối (Cai et al., 2014).

NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) là một họ TF đặc trưng cho thực vật, bao gồm các

vùng NAC bám DNA có tính bảo thủ cao (Guo et al., 2008) Có hơn 100 gen mã hóa cho các protein NAC đã được xác định trên đối tượng Arabidopsis Các protein NAC có nhiều chức

năng, không chỉ tham gia vào sự phát triển của cây mà còn tham gia vào phản ứng chống

chịu stress của thực vật (Nakashima et al., 2012) Có khoảng 40 TF NAC trong số

140được tìm thấy chịu trách nhiệm đối khả năng chịu hạn và mặn ở lúa NAC019,NAC055 và NAC072 là các thành viên của họ các yếu tố phiên mã NAC, chúng nhậnbiết và bám vào yếu tố NACRS (CATGTG) nằm trong vùng promoter của các genđáp ứng nhanh với mất nước (ERD1) và tăng cường khả năng chống mất nước (Tran

et al., 2004) Sự biểu hiện của gen SNAC1 trong cây lúa biến đổi gen làm tăng độ thụ

phấn của hoa lên 17 -22% và khả năng hình thành hạt lên 22 -34% so với các cây đối

chứng trong điều kiện hạn hán vừa và nặng (Hu et al., 2006) Các cây lúa chuyển gen OsNAC6 tăng cường tính chịu hạn và mặn, ngoài ra còn tăng cường tính kháng bệnh

bạc lá so với cây đối chứng (Nakashima

et al., 2007) Cũng nằm trong nhóm NAC, các cây lúa chuyển gen OsNAC9 có tính chịu

hạn rất cao đồng thời, năng suất tốt hơn 13 – 32% so với các cây đối chứng trong điều

kiện bình thường và khô hạn (Redillas et al., 2012).

Một số TF đáp ứng mất nước nhưng không liên quan đến ABA, chúng được gọi là các

TF đáp ứng mất nước không phụ thuộc ABA Phân tích vùng promoter của các gen biểu hiện

không phụ thuộc ABA trong phản ứng stress của thực vật cho thấy một yếu tố hoạt động cis

với trình tự A/GCCGAC là vị trí liên kết của các TF này, được biết đến như yếu tố đáp ứngmất nước (DRE- dehydration responsive element) Họ TF đáp ứng mất nước độc lập ABAđiển hình là họ DREB Các TF này đóng vai trò điều tiết trong điều kiện stress hạn, lạnh và

sự phát triển của lá, hoa, và hạt (Yang et al., 2010) Có 2 loại DREB

(DREB1 và DREB2) được tìm thấy đáp ứng cho những stress khác nhau DREB1 đápứng với stress lạnh trong khi DREB2 đáp ứng với stress hạn, nhiệt và mặn Sự biểu hiện

quá mức của ZmDREB1A (DREB1A của Zea mays L.) và OsDREB1A (DREB1A của Oryza sativa L.) ở Arabidopsis làm tăng cường sự hoạt động của các gen phía sau và tăng cường khả năng chống chịu stress hạn hán, nhiệt và mặn (Qin et al 2004; Yang et al., 2010) Promoter ZmUbi (Zea mays L Ubiquitin) có hiệu quả trong điều khiển các gen DREB1A, DREB1B và DREB1C ở Arabidopsis để cải thiện khả năng chống chịu hạn hán (Yang et al., 2010) Sự biểu hiện của DREB2A-CA đã cảm ứng biểu hiện một loạt các gen sốc nhiệt và tăng cường khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen (Sakamura et al.,

2006) Rất nhiều cây trồng đã được chuyển gen thử nghiệm nhằm biểu hiện yếu tố phiên

mã DREB/CBF như đậu phộng (Arachis hypogaea) (Bhatnagar-Mathur et al., 2014), khoai tây (Iwaki et al., 2013), đậu nành (de Paiva Rolla et al., 2014), lúa (Datta et al., 2012; Ito et al., 2006), lúa mỳ (Saint Piere et al., 2012) đều cho kết quả cải thiện khả năng chịu hạn một cách đáng kế ở các cây chuyển gen HARDY là một thành viên khác

của họ TF DREB được biểu hiện trong mô sẹo Sự biểu hiện quá mức của thành viên này

có ảnh hưởng đa tính trạng lên sự tăng trưởng của thực vật và hình thành rễ dày đặc và láxanh dày HARDY cải thiện hiệu quả sử dụng nước thông qua cải thiện quang hợp và

giảm sự thoát hơi nước (Karaba et al., 2007).

Protein zinc finger (ZFP) là protein phổ biến nhất ở tế bào nhân thực, chức năngcủa các protein này khá đa dạng, bao gồm bám DNA và RNA, hoạt hoá phiên mã, điềuhoà quá tình tự chết, điều hoà sự cuộn gấp và kết hợp protein Nhiều protein ZFP đượcchứng minh là có khả năng làm tăng khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi Các TFnày tham gia tự động vào phản ứng stress thông qua hoạt động như chất hoạt hoá hoặc ứcchế phiên mã (Sakamoto et al 2000, 2004) Các thành viên của họ ZFP như: OsZFP252

(Xu et al 2008) và ZAT10 (Xiao et al., 2009) tích cực tham gia vào việc điều hoà phản

ứng mất nước DST là một chất điều hoà âm tính, cải thiện khả năng chịu hạn và mặn

thông qua việc giảm biểu hiện của gen (Huang et al., 2009) C2H2 ZFP, EAR và ZAT10 là

thành viên của TF ZFP cải thiện khả năng chịu hạn ở lúa (Yang et al., 2010).

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu tập trung vào các yếu tồ điều khiển phiên mã liênquan đến tính chịu hạn của thực vật cũng đang được các nhóm nghiên cứu quan tâm.

Nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội đã phân lập một số gen TF (OsNAC1, OsNAC6, OsDREB1A, OsDREB2A, OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô Việt Nam và chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al., 2014; Nguyễn Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội, 2010; Cao Lệ Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội, 2012 ) Một nhóm tác giả khác cũng đã chuyển thành công các gen TF OsRAP2.4A, OsNLI-IF1 và cây lúa nhằm nghiên

cứu đặc tính của các yếu tố phiên mã này để tăng cường mức độ chịu hạn và mặn của cây

trồng (Nguyen Duy Phuong and Pham Xuan Hoi 2015, Nguyen Duy Phuong et al., 2014) Cao Lệ Quyên và đồng tác giả (2009) đã phân lập được gen MtOsDREB2A từ thư

viện cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền Đây là nguồn gen điều khiển chịu hạn từchính nguồn thực vật của Việt Nam, là cơ sở cho các nghiên cứu tính chịu hạn trên câylúa Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Đồng cũng đã áp dụng thành công các gen yếu tố

điều khiển phiên mã NF-YB2, MYB trong việc chọn tạo giống ngô và đậu tương có khả

năng chống chịu với điều kiện khô hạn (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013;

Nguyễn Văn Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015) Gen DREB1A cũng được

áp dụn g ở đậu tương (Trần Thị Cúc Hoà, 2009; Trần Thị Cúc Hoà et al., 2015) để chọn

tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn

1.2 Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực

vật

Basic leucine zipper (bZIP) là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớnnhất ở thực vật, chúng tham gia điều hòa nhiều chức năng tế bào, đặc biệt là quá trình điềuhòa trong đáp ứng stress và cảm ứng tín hiệu hormone (Kim, 2006) Tên của họ bZIP đượcbắt nguồn từ việc protein này chứa một vùng cơ sở (basic region) và một motif leucinezipper Vùng cơ sở chứa 16 chuỗi bên amino acid được nhận biết bởi sự có mặt của mộtmotif bất biến N-x7-R/K-x9, trong khi đó Leu zipper bao gồm sự lặp lại 7 lần của amino acidLeu hay các amino acid kị nước khác như Ile, Val, Phe, hay Met nằm chính xác ở vị

trí amino acid thứ 9 từ đầu C Vùng cơ sở và vùng Leu zipper có chức năng riêng biệt.Vùng cơ sở có nhiệm vụ là tín hiệu di chuyển vào nhân và bám đặc hiệu lên trình tựDNA, vùng này vô cùng bảo thủ Vùng Leu zipper là trình tự lưỡng cực ở dạng cuộnxoắn, đặc trưng cho chức năng dimer hóa và kém bảo thủ hơn Vùng trình tự Leu zippernày thực hiện quá trình dimer hóa tương đồng (homo-) hoặc không tương đồng (hetero-)của các protein bZIP Các đơn phân bZIP ở dạng một chuỗi xoắn alpha dài, và khi bámvới DNA chứa trình tự lõi ACGT, thường là G-box (CACGTG), C-box (GACGTC) và A-box (TACGTA), đầu N bám vào rãnh chính của sợi kép DNA, còn đầu C thì làm chứcnăng dimer hóa để hình thành nên cấu trúc cuộn xoắn chồng gọi là Leu zipper (Nijhawan

et al., 2008).

Họ gen bZIP đã được phân lập và mô tả ở Arabidopsis (có 75 gen), lúa (89), đậu tương (131), ngô (125) (Wei et al 2012) Ở Arabidopsis, 75 gen khác nhau đã được xác định và phân vào 10 nhóm dựa vào vùng bảo thủ của nó (Jakoby et al., 2002) Trong khi

ở lúa, 89 gen bZIP cũng được chia thành 11 nhóm (Nijhawa et al., 2008) Phần lớn các gen bZIP liên kết với ABRE thuộc nhóm A, các gen trong nhóm này được cảm ứng mạnh

mẽ bởi ABA và stress phi sinh học khác (Jakoby et al., 2002, Lu et al., 2009).

Ở Arabidopsis, 75 gen mã hóa cho yếu tố phiên mã bZIP đã được phân lập nhưng

còn khoảng 50 gen chưa được miêu tả trong các dữ liệu Trong số 7 gen thuộc nhóm A,nhóm tham gia quá trình chống chịu stress và đáp ứng ABA thì chỉ có 3 gen tham gia vào

sự chịu hạn của cây Đó là ABRE-binding protein 1 và 2 (AREB1 và AREB2) và ABRE

binding factor 3 (ABF3) (Jakoby et al., 2002) Một số nghiên cứu cho thấy ABA và stress phi sinh học cảm ứng sự biểu hiện của ABF/AREB và ABA gây sự phosphoryl hóa của

AREB1/2 Sự photphoryl hóa này là cần thiết cho AREB1/2 cảm ứng gen sau nó và cóthể xảy ra ở vị trí phosphoryl hóa bằng casein kinase II nằm ở các domain bảo thủ ABA

và stress hạn do đó có thể cảm ứng cả sự phiên mã và điều hòa sau dịch mã của nhiều genbZIP thuộc nhóm A

Ở lúa, có gần 100 gen thuộc họ bZIP, trong đó 33 gen tham gia phản ứng với hạn

(Nijihawan et al., 2008) Trong số đó, 5 gen ABF3, OsbZIP23, OsbZIP46, OsbZIP 52 và

OsbZIP72 được cho là tạo nên khả năng thích ứng với hạn khi biểu hiện quá mức ở lúa Gen OsbZIP23 biểu hiện mạnh bởi stress phi sinh học, bao gồm muối, hạn, xử lí với ABA

và PEG Gen OsbZIP23 khi biểu hiện quá mức ở thực vật cho thấy một sự điều hòa tăng

lên ở trên 800 gen tham gia trong các con đường chống chịu khác nhau OsbZIP46 có thể

là yếu tố điều hòa dương tính của con đường tín hiệu ABA và chịu hạn ở lúa (Tang et al.,

2012) Một protein bZIP khác OsbZIP52 gần đây được cho là có khả năng tăng tính nhạy

cảm với hạn và lạnh (Liu et al., 2012) OsbZIP72 được công bố là có chức năng như một

chất điều hòa dương tính trong con đường truyền tín hiệu của ABA và hạt nảy mầm biểu

hiện quá mức OsbZIP72 cho thấy tăng khả năng chịu hạn.

1.3 Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72

Gen mã hóa ZmbZIP72 dài 2164bp, gồm 3 intron, giống với sự phân bố introns ở hầu hết các gen bZIP nhóm A ở Arabidopsis và lúa Vùng promoter của gen ZmbZIP72 (1670bp upstream) có nhiều các yếu tố hoạt động cis đáp ứng với stress và một vài đáp

ứng với ánh sáng cũng được tìm thấy Điều đó gợi ý rằng ZmbZIP72 có thể tham gianhiều đáp ứng stress và điều khiển bởi một cơ chế điều hòa phức tạp Tuy nhiên chưa cóbằng chứng cho thấy ZmbZIP72 tham gia đáp ứng lạnh

Gen ZmbZIP72 chứa một khung đọc mở dài 894bp mã hóa cho một chuỗi

polypeptide dài 297 aa, 180bp ở vùng 5’ không dịch mã và 226bp ở vùng 3’ không dịch

mã Trình tự amino acid suy diễn của ZmbZIP72 được tính toán tương ứng với protein cókhối lượng 32,4 kDa và chỉ số pI là 9,39 Protein suy diễn có trình tự amino acid tương

đồng cao với protein của lúa là OsbZIP72 (Sheng et al., 2012).

Protein ZmbZIP72 chứa một domain bám DNA bZIP điển hình ở đầu C và 4 trình

tự bảo thủ phân bố ở đầu N hoặc C Một vài vị trí hoạt động đích của kinase, ví dụR/KXXS/T cho CDPK, S/TXK/R cho PKC, nằm trong các vùng bảo thủ Amino acid vị

trí từ 23 đến 63 là cần thiết cho hoạt động hoạt hóa phiên mã của gen ZmbZIP72.

Sản phẩm phiên mã của gen ZmbZIP72 được tìm thấy ở tất cả các cơ quan, nhưng

nồng độ cao nhất là ở rễ của cây mới nảy mầm và trưởng thành và thấp nhất ở thân Protein

ZmbZIP72 hoạt động ở nhân Tín hiệu chuyển vào nhân được tìm thấy ở domain bảo thủ

bZIP của ZmbZIP72 giống với các nghiên cứu trước (Fujita et al., 2005, Xiang et al.,

2008, Zou et al., 2008, Lu et al., 2009) Để hoạt động thì bZIP cần được phosphoryl hóa

phụ thuộc ABA nhờ protein kinase Một vài gốc serin ở vùng bảo thủ có thể là vị trí đượcphosphoryl hóa Đồng thời, chúng có thể cần được dimer hóa tương đồng (homo) hoặc

không tương đồng (hetero-) như ở Arabidopsis và lúa.

Khi chuyển cDNA ZmbZIP72 vào Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter

CaMV 35S, dòng chuyển gen thể hiện một số đặc điểm của sự thích ứng với hạn như: sựnảy mầm của hạt bị ức chế mạnh hơn so với hạt đối chứng trong điều kiện xử lí với ABA

và stress thẩm thấu Cây trồng trong đất không được tưới nước trong 2 tuần cho thấy látươi và xanh hơn so với cây đối chứng, đồng thời nhanh phục hồi khi được tưới lại với tỉ

lệ sống sót cao hơn đối chứng Những kết quả kiểu hình và thay đổi sinh lý này cho thấy

sự biểu hiện quá mức ZmbZIP72 ở Arabidopsis chuyển gen có thể làm tăng đáng kể khả

năng thích ứng với khô hạn Không những thế, ZmbZIP72 có thể hoạt hóa sự biểu hiệncủa một vài gen cảm ứng bởi ABA ZmbZIP72 làm tăng sự biểu hiện của các gen như

RD29B, RAB18, HIS1-3, các gen được cảm ứng bởi các stress khác nhau qua con đường phụ thuộc ABA, và các gen này biểu hiện càng cao thì tính chống chịu càng cao Điều

này chứng tỏ ZmbZIP72 hoạt động như là yếu tố hoạt hóa phiên mã dương tính trunggian ABA (ABA-mediating) Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức liêntục của gen mã hóa yếu tố phiên mã thường gây ra các kiểu hình không mong muốn, như

là sự sinh trưởng chậm của cây (Kasuga et al., 1999; Kim et al., 2004) Tuy nhiên, các dòng Arabidopsis chuyển gen biểu hiện quá mức ZmbZIP72 không gây ra hậu quả bất lợi

nào đến sự sinh trưởng và phát triển của cây như chiều cao hay kiểu hình so với kiểu dại

Do đó protein ZmbZIP72 có tiềm năng ứng dụng vào trồng trọt để tăng khả năng chống

chịu stress, đặc biệt là điều kiện khô hạn (Sheng et al., 2012).

1.4 Cây ngô và vấn đề chịu hạn

Ngô là cây lương thực quan trọng đối với nền kinh tế toàn cầu, có tiềm năng năngsuất cao và được trồng phổ biến ở nhiều nước Trên thế giới, ngô chỉ đứng thứ ba về diện tíchsau lúa mì và lúa nước nhưng ngô lại dẫn đầu về năng suất và sản lượng Bên cạnh đó, ngôcòn là cây điển hình được ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học,chọn giống, công nghệ sinh học,… vào công tác nghiên cứu và sản xuất (Ngô Hữu Tình,2009) Theo USDA dự đoán, sản lượng ngô ước tính sẽ đạt 1,011 tỷ tấn trong niên vụ2016/2017, tăng 9,58% so với niên vụ 2015/2016 (968,85 triệu tấn) (USDA-FAS, 2017)

Bảng 1.1: Sản lượng ngô trên toàn thế giới qua các niên vụ 2011/2012 – 2016/2017

(Nguồn: FAS/USDA, 2017)Quan sát sản lượng ngô trên thế giới qua các niên vụ (bảng 1.1), chúng ta có thểnhận thấy rằng sản lượng ngô trên thế giới tăng qua các niên vụ từ 2011/2012 đến2014/2015 và đến niên vụ 2014/2015 đã đạt hơn 1 tỷ tấn Có được kết quả trên, trước hết là nhờ ứng dụng rộng rãi giống ngô biến đổi gen và giống ngô lai, đồng thời không ngừng cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác Tuy nhiên, trong năm2015/2016, sản lượng ngô đã bị giảm đi 9.55% Nguyên nhân chính được cho là do tình trạnghạn hán diễn ra tại các nước sản xuất ngô

Ở ngô, hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống Tỷ lệ nảy mầm, tốc độnảy mầm, hình thành cây con và sức sống của cây con bị hạn chế do hạn hán ở giai đoạnphát triển sớm Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các đặc điểm như toàn bộthân và lá sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại, khíkhổng đóng, quang hợp giảm, giảm cố định carbon qua đó sinh trưởng bị chậm lại Giaiđoạn sinh sản của ngô cũng bị hạn chế do hạn hán Sự phát triển của cờ và bắp, quá trìnhthụ phấn, sự phát triển của phôi, sự phát triển của nội nhũ và hạt bị ảnh hưởng nặng nềbởi stress hạn Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7 – 10 ngày, sự phát triển của bắp sẽchậm hơn cờ, do đó quá trình phu râu sẽ chậm hơn sự tung phấn, điều này dẫn đến khảnăng thụ phấn thấp Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể dẫn đến việc mất hoàn toànbắp và làm mất năng suất (Chapman, Edmeades, 1999) Nếu hạn xảy ra trong thời gian

tạo hạt, bắp ngô sẽ ít hàng hạt, và các hàng không có nhiều hạt (Edmeades et al., 2000).

Như vậy, hạn hán dù ngắn hay dài, dù nặng hay nhẹ cũng đều ảnh hưởng không nhỏ đếnsản lượng và năng suất của ngô

Các cơ chế chống chịu khác nhau đã được phát triển ở ngô giống như các câytrồng khác, cho phép chúng tồn tại một cách hiệu quả trong điều kiện hạn hán Thoát hạn,tránh hạn và chịu hạn là các cơ chế khác nhau của thực vật làm việc trong điều kiện hạnhán Các giống ngô thoát hạn điều chỉnh đời sống của chúng hoàn thành trước khi bắt đầuhạn hán và các giống ngô tránh hạn tránh không bị hạn bằng cách giảm tổn thất nướchoặc tăng lượng nước hấp thụ Các giống ngô chịu hạn duy trì sự tăng trưởng và pháttriển của chúng cùng với năng suất hạt trong điều kiện hán hán

Do nhu cầu về ngô ngày càng tăng và tình trạng khan hiếm nước ngày càng trầmtrọng, cần phải nâng cao mức độ chịu hạn đối với cây ngô Các nhà khoa học và người nôngdân có thể sử dụng nhiều phương thức khác nhau để làm tăng khả năng sống sót của trồngtrong điều kiện hạn hán Các chiến lược khác nhau đã được sử dụng để cải thiện khả năngchống lại stress hạn hán của ngô như: chiến lược quản lý và chiến lược sinh học Các chiếnlược quản lý bao gồm việc sử dụng nguồn tài nguyên nước hợp lý và áp dụng các biện phápnông học tiết kiệm nước Các chiến lược sinh học được ưa thích hơn các chiến

lược quản lý do hiệu quả kinh tế lâu dài Cách tiếp cận sinh học được thực hiện dướinhiều hình thức khác nhau như phương pháp lai tạo giống truyền thống và phương pháp

sử dụng công nghệ gen Các giống ngô lai chịu hạn được trồng thực tế ở nhiều nước châuPhi Với nghiên cứu chuyển gen chịu hạn cho ngô thì năm 2013, Monsanto đã công bốgiống ngô chuyển gen chịu hạn đầu tiên DroughtGard MON 87460, chứa gen shock lạnh

(CspB) được phân lập từ Bacillus subtillis Ngoài ra, gen HVA1 và mtlD dưới sự điều

khiển của promoter Act1 ở cây ngô chuyển gen đã cho thấy sự cải thiện khả năng chịu

hạn và chịu mặn (Nguyen et al., 2013) Một số gen mã hóa cho các protein tham gia vào chuyển hóa đường và tổng hợp các hợp chất phản ứng cũng đã được phân lập từ vi khuẩn như glutamate dehydrogenase (gdhA); choline dehydrogenase (betA) từ E.coli, trehalose synthase (TPS) của vi sinh vật cũng đã được chuyển vào hệ gen ngô nhằm nâng cao tính chịu hạn của cây và đã thu được những kết quả khả quan (Chun-lin et al., 2011; Lightfoot

et al., 2007; Quan et al., 2004) Gần đây, nhóm nghiên cứu của Zou đã công bố một nghiên cứu chuyển gen AtCBF4 – một yếu tố phiên mã không phụ thuộc ABA- nhằm nâng cao tính chịu hạn của cây ngô và đã đạt được hiệu quả tích cực khi biểu hiện bằng promoter cảm ứng hạn RD29A (Zou et al., 2014) Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dòng

ngô chịu hạn đang được đầu tư và tập trung nghiên cứu Nhóm nghiên cứu của Bùi MạnhCường đã xác định được một số chỉ thị SSR liên kết với các gen chịu hạn và một số chỉthị liên quan đặc tính chịu hạn ở ngô (Bùi Mạnh Cường, 2007) Theo báo cáo của LươngVăn Vàng (2012), đã lựa chọn được một số dòng ngô chịu hạn tốt, thích ứng rộng, năngsuất khá và ổn định: VS36, H119, VS71 và CN11-2 Các giống ngô lai LVN61, LVN14

và VN8960 phát triển tốt trong điều kiện hạn và có năng suất cao (Nguyễn Đức Thuận et al., 2008) Dựa trên đánh giá kiểu hình và maker phân tử, nhóm nghiên cứu Phan Đức

Thịnh đã chọn ra được 5 dòng TP17, TP12, TP2, TP5 và TP4 ưu tú là những dòng pháttriển từ giống ngô địa phương Việt Nam có thể sử dụng để lai thử khả năng kết hợp chọn

tạo giống ngô lai chịu hạn (Phan Đức Thịnh et al., 2013).

1.5 Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen

Nhu cầu ngô nguyên liệu luôn gia tăng là động lực thúc đẩy các nhà khoa họcnghiên cứu lai tạo ra nhiều giống ngô đáp ứng với các điều kiện sống khác nhau Nhữngtiến bộ vượt bậc trong công nghệ gen đã cho ra đời nhiều giống ngô biến đổi gen có khảnăng chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng, chịu hạn, đạt năng suất cao hoặc có cáctính chất theo ý muốn

Diện tích trồng ngô biến đổi gen phát triển mạnh trên thế giới bắt đầu từ năm

1996, tính đến năm 2016 đã đạt 60,6 triệu hecta, tăng 13% so với năm 2015 Diện tíchtăng lên là do giá cả thị trường thuận lợi, nhu cầu về năng lượng sinh học và thức ăn giasúc cũng như sự gia tăng của sâu đục thân ngô ở châu Âu Bên cạnh đó, việc chấp nhậncác mặt tích cực của ngô chịu hạn ở Mỹ và Châu Phi năm 2017 sẽ khiến cho việc chấpnhận ngô chuyển gen tăng lên ở nhiều nước phải đối mặt với stress hạn hán do biến đổikhí hậu Đồng thời, ngô biến đổi gen cũng đã mang lại lợi ích về thu nhập cho nông dântrong suốt 20 năm từ 1996 đến 2015 là 57,1 tỷ đô la Mỹ (USD) và chỉ riêng trong năm

2015 là 6,25 tỷ USD (Brookes and Barfoot, 2017) Trong 60,6 triệu hecta cây chuyển genngô thì có 6 triệu hecta trồng cây chuyển gen kháng sâu, 7 triệu hecta trồng cây chuyểngen kháng thuốc diệt cỏ và 47.7% hecta trồng cây chuyển gen có cả hai đặc tính trên Câyngô chuyển gen được trồng ở 16 quốc gia, năm quốc gia đứng đầu bao gồm: Mỹ (30 triệuhecta), tiếp sau đó là Brazil (15.6 triệu hecta), Argentina (4.7 triệu hecta), Nam Phi (2.2triệu hecta), và Canada (1.5 triệu hecta) Các quốc gia trồng dưới 1 triệu hecta bao gồmPhillipines, Paraguay, Spain, Colombia, Uruguay, Việt Nam, Honduras, Bồ Đào Nha,Chile, Slovakia và Cộng hoà Séc Trong số 185 triệu hecta trồng ngô trên toàn cầu(FAOSTAT, 2016), thì diện tích trồng cây ngô chuyển gen chiếm 33%

Ở Việt Nam, ngô biến đổi gen là cây trồng chuyển gen đầu tiên được thương mạihoá với diện tích tối thiểu là 3500 heta vào năm 2015 Năm 2016, nông dân Việt Nam đãchấp nhận công nghệ này khá nhanh với ước tính diện tích trồng ngô biến đổi gen tăng lên

10 lần khoảng 35000 hecta với các giống mang đồng thời hai đặc tính kháng sâu bệnh vàkhác thuốc diệt cỏ Vào năm 2015, có 14 sự kiện ngô chuyển gen được phê duyệt, đếnnăm

2016, có 3 sự kiện được phê duyệt làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bao gồm sự kiện

5370 và MIR604 kháng côn trùng và TC1507 kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ Có 4 sựkiện được chấp nhận được trồng vào năm 2015 bao gồm: Bt11 x GA21, GA21,MON8904 và NK603 Các thử nghiệm trên đồng ruộng về các sự kiện ngô chuyển genđược tiến hành tại các địa điểm khác nhau trong nước như là một điều kiện tiên quyết đểcác sự kiện này được thương mại hoá Một thử nghiệm trên đồng ruộng cho MON810 bắtđầu vào 17/03/2017 do Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam và Pioneer Hi-bredVietnam thực hiện ở huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên Một thử nghiệm khác được thựchiện bởi Viện Bảo vệ thực vật kết hợp với Công ty TNHH Syngenta Việt Nam về ngôbiến đổi gen kháng côn trùng MIR162 cũng như đặc tính kháng côn trùng và thuốc diệt

cỏ Bt11 x IR162 x GA21 ở Sơn La bắt đầu từ ngày 2/6/2016 (CBU, 2016)

Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam có thểnói là đang khá mới mẻ và đang ở giai đoạn ban đầu nên các thành tựu đạt được chưanhiều Nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội và cộng sự đã phân lập một số gen TF

(OsNAC1, OsNAC5, OsNAC6, OsNAC10, OsDREB1A , OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô Việt Nam và chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al., 2014; Nguyễn Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội, 2010; Cao Lệ Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội,

2012 ) Các gen chịu hạn ZmNF-YB2 và IPT đã được chuyển thành công vào các giống

ngô chọn lọc cho kết quả chuyển nạp ổn định và đồng đều trên hai dòng ngô VH1 và

C8H9 (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015) Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự cũng đã chuyển thành công gen modiCspB vào ba dòng ngô Việt Nam V152N, C436 và C7N (Huỳnh Thị Thu Huệ et al., 2014).

1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hiện nay, có nhiều phương pháp được các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào

thực vật như: phương pháp gián tiếp sử dụng A tumefaciens, phương pháp trực tiếp sử dụng

xung điện, vi tiêm, xử lý polyethylene glycol (PEG) và dùng súng bắn gen Mỗi phươngpháp chuyển gen đều có những ưu, nhược điểm riêng tùy vào từng đối tượng nghiên cứu

khác nhau Trong đó, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất Ưu điểm lớn của phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A tumefaciens là một lượng nhỏ bản sao (thường là 1 hoặc 2) kích thước tương đối lớn (có thể

lớn hơn 10kb) của T-DNA với các đầu xác định được ghép vào hệ gen thực vật với sự tái sắp

xếp tối thiểu, tạo ra cây chuyển gen chất lượng cao (Ishida et al., 2007) Việc chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A tumefaciens đã được biết đến như là một cơ chế

đưa DNA mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao Tuy nhiên, trước đây, phương pháp

chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefacines không được xem là hiệu quả với cây một lá mầm (Raineri et al., 1990) Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chậm trễ trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây một lá mầm thông qua A tumefaciens là do thiếu phản ứng gây tổn thương hoặc phản ứng gây tổn thương kém ở mô tế bào của cây một lá mầm (Repellin et al., 2001) Phản ứng này là một trong các yếu tố quan trọng trong quá trình

chuyển gen Khi tế bào bị tổn thương, chúng tiết ra các hợp chất phenol: acetosyringone(AS),chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi khuẩn với tế bào thực vật Cơ

chế nhận biết này được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A tumefaciens với cây hai lá mầm,

ở cây một lá mầm chỉ có ở 1 ít loài Vì vậy, khi tiến hành chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua A tumefaciens, người ta thường bổ sung AS Năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên được thu nhận nhờ lây nhiễm phôi non với A tumefaciens (Chan

et al., 1993); tiếp đó là nhiều thành công chuyển gen vào các loại ngũ cốc quan trọng khác

như ngô, lúa mì, lúa mạch và cao lương Các yếu tố quan trọng cho những thành công này

gồm tối ưu hóa loại mô thực vật chuyển gen, lựa chọn vector, lựa chọn chủng A tumefaciens

và tối ưu kĩ thuật nuôi cấy mô Ngày nay,

chuyển gen thông qua A tumefacien khuyến khích được sử dụng trên các giống ngô do

đáp ứng nuôi cấy mô tốt

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) là giống ngô địa phương của Việt Nam cókhả năng chịu hạn tốt do Viện Nghiên cứu Ngô sàng lọc và cung cấp Hạt ngô được gieomầm và phát triển đến giai đoạn ba lá thì xử lý hạn nhân tạo theo phương pháp của Sheng

và cộng sự (2012) Mẫu tại các thời điểm: 3 giờ và 6 giờ được thu giữ trong Nitơ lỏng vàbảo quản ở -70oC

ZmbZIP72 SacI F 5’ ATGAGAGCTCATGGACGAGCTG 3’

ZmbZIP72 SacI R 5’ TAATGAGCTCTCACCAGGGGGC 3’

HptF

Ch3COOH); Ampicillin; các enzyme giới hạn: BamHI, BglII, HindIII, SacI.

- Các hóa chất chloroform, isoamyl alcohol, Tris, acetic acid, EDTA, cồn tuyệt đối

và các hóa chất chuyên dụng khác: Hãng Merck (CHLB Đức)

- Các hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Thành phần môi trường

sử dụng nuôi cấy mô thực vật được thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy

mô thực vật (Frame et al 2015)

Môi trường

Lây nhiễm

lỏng

Các thiết bị được sử dụng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam Bao gồm: Tủ lạnh −20°C (Sanyo, Nhật Bản), Cân phân tích(Mettler Toledo, Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt (Memmert, Đức), máy làm khô chân không(Concentrator Plus) (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh Eppendorf 5424R (Eppendorf,CHLB Đức), máy li tâm lạnh đa năng 5810R (Eppendorf, Đức), máy chạy điện diPowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy PCR Master Cycler Pro S (Eppendorf, Đức), máy soigel M-26 UVP (Mỹ), máy chụp ảnh gel (GelDoc) UVP (Mỹ), máy ủ nhiệt Thermomixer

C (Eppendorf, Đức), máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies,

Nhật), máy biến nạp xung điện Gene Pulser (Bio-Rad, Mỹ), box cấy vi sinh vật The Esco

Airstream® Class II Biological Safety Cabinet (Esco, Singapore) Phòng nuôi cấy mô vôtrùng, box cấy thực vật Esco laminar flow cabinets ( Esco, Singapore)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ thực vật

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Roger và đồng tác giả nhưng

có cải tiến cho phù hợp với mô lá ngô, bao gồm các bước sau:

1 Nghiền lá tươi thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng Chotoàn bộ bột lá vào ống eppendorf 1.5ml

2 Bổ sung đệm chiết (1ml cho 100g lá) vào ống Đảo ống vài lần hoặc vortex nhẹ

để đệm chiết và bột lá trộn đều với nhau Ủ hỗn hợp ở 65°C trong 60 phút

4 Để hỗn hợp 15 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm mẫu ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên chuyển sang ống mới

5 Loại protein và tạp chất bằng hỗn hợp phenol/choloroform/isoamyl alcohol (v:v:v = 25:24:1) Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên

6 Bổ sung RNase, ủ dịch thu được ở 4˚C, 1 giờ Dịch thu tiếp tục được tinh sạchbằng hỗn hợp choloroform/isoamyl alcohol (v:v =24:1) Ly tâm 12.000vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, thu dịch ở pha trên

7 Tủa DNA trong dịch thu được bằng 2 lần thể tích EtOH 100% , 0.3M

CH3COONa trong ít nhất 3 giờ ở -20˚C

8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, loại bỏ dịch, thu kết tủa

9 Rửa kết tủa bằng cồn 70% Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4˚C, thu kết tủa

10 Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút Hòa lại tủa trong nước khôngchứa DNase Bảo quản DNA ở -20⁰C

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số từ thực vật

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tách chiết RNA theo phương pháp sử dụng TRI Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu ngô Quy trình thực hiện như sau:

1 Nghiền 2- 3 g mẫu thành bột mịn bằng cối chày sứ đã khử trùng trong nitơ lỏng

2 Bổ sung ngay 700 µl Trizol, trộn đều, sau đó chuyển sang ống eppendorf 1.5ml, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

3 Ly tâm 12.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC, thu dịch ở pha trên và chuyển sang ống eppendorf mới

4 Bổ sung 300 µl Chloroform vào mỗi ống Lắc mạnh ống bằng tayhoặc vortex trong 15 – 20 giây sau đó chuyển sang máy ly tâm, lytâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC

5 Sau khi ly tâm xong, hút dịch ở pha trên một cách cẩn thận, chuyển sang ống eppendorf 1.5 ml mới

6 Bổ sung 300 µl 2-propanol lạnh vào mỗi ống Ủ mẫu ở -20oC trong 1giờ để tủa RNA tổng số

7 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC Loại bỏ dịch, thu tủa RNA

25

9 Làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút.

10 Hòa tan RNA tổng số trong 50µl nước đã được xử lý DEPC

11 Kiểm tra RNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang phổ ở bước sóng 260nm RNA tổng số được bảo quản ở -80oC

2.2.3 Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất

Trong di truyền học, cDNA (complementary DNA) là đoạn DNA sợi đôi đượctổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA xúc tác bởi enzyme phiên mã ngược (reversetranscriptase) Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất dựa trênkhuôn mẫu mRNA bằng kit tổng hợp cDNA của hãng Affymetrix: First-Strand cDNASynthesis Kit for Real – Time PCR Thành phần phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhấtbao gồm: 2 µl primer mix 10pM, 1 µg RNA tổng số, 2 µl 10X RT Buffer, 2 µl dNTPs10mM, 1 µl RNase Inhibitor, 1 µl M-MLV RT, và H2O Phản ứng được thực hiện trênmáy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau: 44oC - 60 phút,

92oC - 10 phút Các cDNA sau khi được tổng hợp được kiểm tra bằng phản ứng PCR

nhân gen Actin từ cặp mồi Plant Actin F/R và được lưu giữ ở tủ -20oC

2.2.4 Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR

PCR được tiến hành với thể tích là 25 µl Bao gồm các thành phần: 2,5 µl 10XDreamTaq Buffer, 1 µl dNTPs 10mM, 1 µl mồi xuôi 10pM, 1 µl mồi ngược 10pM, 1 µlDNA khuôn (20 ng – 100ng), 0.2 µl DreamTaq DNA polymerase (5U/µl) và nước Phảnứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệtnhư sau:

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen Actin: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ : 95oC

- 45 giây, 54oC - 45 giây, 72oC - 30 phút; 72oC - 10 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng RT-PCR phân lập gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30chu kỳ: 95oC - 45 giây, 60oC - 45 giây, 72oC - 1 phút; 72oC -10 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng CDS gen ZmbZIP72: 950C - 3 phút;

30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1 phút; 72oC - 10 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen hygromycin: 950C-3 phút; 30 chu kỳ:

95oC - 30 giây, 54oC- 30 giây, 72oC - 50 giây; 72oC - 8 phút; 4oC

- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng từ cuối promoter RD29A đến cuối gen

ZmbZIP72: 950C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 1phút

15 giây; 72oC - 8 phút; 4oC

2.2.5 Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose

Chúng tôi sử dụng GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific để tinh sạch sản phẩm PCR Quy trình thực hiện:

1. Điện di sản phẩm PCR cần tinh sạch trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế: 100V

2. Sau khi điện di, nhuộm bản gel trong EtBr trong 10 phút, sau đó cắt đoạn gel có chứa đoạn DNA cần tinh sạch chuyển sang ống eppendorf 1.5ml

3. Bổ sung Binding Buffer vào ống eppendorf chứa gel (V:W = 1:1)

4. Ủ hỗn hợp gel + Binding Buffer ở 55oC trong 10 phút, cho tới khi miếng gel tanhoàn toàn Trong lúc ủ, cách 2 – 3 phút dảo ống một lần để đảm bảo gel tan đều.Sau khi gel tan hoàn toàn, đem ống eppendorf đi vortex và spindown trước khi chuyển lên cột tinh sạch

5. Chuyển dung dịch gel đã tan ở bước 4 sang cột tinh sạch Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống

6. Bổ sung 100 µl Binđing Buffer vào cột tinh sạch Ly tâm 1 phút, 12000

vòng/phút ở 24oC Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống

7. Bổ sung 700 µl Wash Buffer vào cột tinh sạch Ly tâm 1 phút, 12000 vòng/phút ở

24oC Bỏ dịch, đặt cột tinh sạch lại vào ống

8. Ly tâm cột tinh sạch không chứa gì trong 1 phút, 12000 vòng/phút ở 24oC để loại

bỏ hoàn toàn Wash Buffer

9. Bỏ dịch, chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorf 1.5ml mới Bổ sung 30 µl H2O