Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái và mức độ phân tử tập đoàn các dòng lúa đột biến được tạo ra từ giống lúa ST19 và q2​

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMVIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THÁI DƯƠNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ HÌNH THÁI VÀ MỨC ĐỘ PHÂN TỬ TẬP ĐOÀN CÁC DÒNG LÚA Đ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THÁI DƯƠNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ HÌNH THÁI VÀ MỨC ĐỘ PHÂN TỬ TẬP ĐOÀN CÁC DÒNG LÚA ĐỘT BIẾN ĐƯỢC TẠO RA TỪ

GIỐNG LÚA ST19 VÀ Q2

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã ngành: 8420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Khuất Hữu Trung

Đơn vị công tác: Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt Nam

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này được thực hiện bởi bản thân tôi dưới

sự hướng dẫn của PGS.TS Khuất Hữu Trung Kết quả đề tài là một phần kết

quả của đề tài NCS Hoàng Thị Loan: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân

tử và đột biến thực nghiệm để nâng cao chất lượng lúa ST19 và Q2” Các

số liệu và tài liệu trích dẫn nêu trong luận văn là trung thực Kết quả nghiêncứu trong luận văn này không trùng với bất kì công trình nào đã được công bốtrước đó

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình

Tác giả luận văn

Nguyễn Thái Dương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Khuất Hữu Trung, người hướngdẫn đề tài, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ, cung cấp tàiliệu, kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái – Viện Hànlâm khoa học Việt Nam, Ban Lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp, các anhchị em bộ môn Kĩ Thuật Di Truyền – Viện Di Truyền Nông Nghiệp đã tạođiều kiện và hỗ trợ cho quá trình học tập, nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn đề tài độc lập cấp nhà nước, mã số G36.2012, cảm ơn NCS – Hoàng Thị Loan đã thiết kế, hướng dẫn và trực tiếp

ĐT.ĐL-bố trí các thí nghiệm cho tôi, động viên, giúp đỡ, cung cấp tài liệu, và tạo điềukiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đãyêu thương, thông cảm, chia sẽ, an ủi, khích lệ tôi trong những lúc khó khănkhi thực hiện luận văn, giúp tôi có thêm động lực để hoàn thành chương trìnhhọc và thực hiện nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Nguyễn Thái Dương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

PHẦN II NỘI DUNG 4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Tổng quan về cây lúa 4

1.1.1.Nguồn gốc và phân loại cây lúa 4

1.1.2.Đặc tính nông học của các giống lúa 5

1.2.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái về năng suất, chất lượng 7

1.2.1.Một số các chỉ tiêu đánh giá của đặc tính nông học ảnh hưởng đến năng suất cây lúa 7

1.2.2.Phương pháp đánh giá đặc tính nông học ở lúa 9

1.3.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử 10

1.3.1.Sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa 10

1.3.2.Nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa ở mức độ phân tử trên thế giới 14

1.3.3.Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa mức độ phân tử của Việt Nam 15

1.3.4.Một số thành tựu trong chọn tạo giống lúa chất lượng 16

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.Vật liệu nghiên cứu 20

2.2.Nội dung nghiên cứu 20

2.3.Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1.Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 21

2.3.1.1.Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử 30

2.3.2.phân tích số liệu 33

2.4.Địa điểm và thời gian thực hiện 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái 35

3.1.1.Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của các dòng lúa đột biến và đối

chứng 41

3.2.Đa dạng di truyền của các dòng nghiên cứu và giống gốc dựa vào các đặc điểm hình thái 47

3.3.Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử 52

3.3.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số 52

3.3.2.Kết quả phân tích đa hình DNA bằng các chỉ thị phân tử SSR 53

3.5.3.Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các dòng lúa nghiên cứu 60

3.5.3.1.Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 20 dòng lúa đột biến và giống gốc ST19 60

3.5.3.2 Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 4 dòng lúa đột biến và giống gốc Q2 64

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Kiến nghị 66

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

Tỷ lệ dị hợp tửInternal Fragrant Antisense PrimerInternal Non-fragrant Sense PrimerInternational Rice Research InstituteNational Center for Biotechnology Information

Tỷ lệ số liệu khuyết thiếuNhiễm Sắc Thể

Nghiên cứu sinhPolymerase Chain ReactionQuantitative Trait LociRandom Amplified Polymorphic DNAsRestriction Fragment Length PolymorphismsScent

Leaf Senescence

Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa

v

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1: Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa 5

Bảng 2.1 Tên và liều đột biến của các dòng đột biến và giống gốc được

nghiên cứu 20

Bảng 2.2: Tên và vị trí các mồi trên nhiễm sắc thể 26

Bảng 2.3 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng amylose cho lúa (IRRI, 1988)

……… 29

Bảng 2.4 Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979) 29

Bảng 2.5 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979) 30

Bảng 2.6 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR 32

Bảng 2.7 Chương trình chạy của phản ứng PCR 32

Bảng 2.8 Các tính trạng hình thái nông học và thang điểm 24

Bảng 3 1 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu đặc tính nông học của các dòng đột

biến và đối chứng được gieo trồng vào vụ mùa năm 2016 37

Bảng 3 2 Kết quả đánh giá mật độ chỉ tiêu đặc tính chất lượng của các dòng

đột biến và đối chứng được gieo trồng vào vụ mùa năm 2016 41

Bảng 3 3 Kết quả kiểm tra gen BAD2 của các dòng lúa nghiên cứu 44

Bảng 3 4 Số alen thể hiện và hệ số PIC của 20 cặp mồi SSR trên các dòng

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với mồiBADH2………43Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các dòng lúa nghiên cứu với mồiW-xy………… ……….….46Hình 3.3 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền dựa vào các đặc điểm hình

thái của 20 dòng đột biến và giống ST19 49

Hình 3.4 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền dựa vào các đặc điểm hình

thái của 4 dòng đột biến và giống Q2 51

Hình 3.6 ảnh điện di sản phẩm PCR các mồi SSR với các dòng đột biến và

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba trên

thế giới sau ngô và lúa mì Tuy nhiên, gạo lại là lương thực chính cho khoảng3,7 tỷ người trên hành tinh vào thời điểm hiện tại Do được con người thuầnhóa và phát triển từ hàng ngàn năm về trước nên lúa có sự phân bố rộng trêntrái đất Có đến 114 quốc gia coi lúa và cây trồng quan trọng, phân bố ở tất cảcác châu lục trên thế giới Việc sản xuất lúa gạo tập trung chủ yếu ở các nướcchâu Á, nơi chiếm hơn 91% về diện tích gieo trồng cũng như về sản lượng,khoảng 9% còn lại được phân bố ở Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Phi Do đó, cácchương trình chọn tạo giống lúa luôn được chú trọng và phát triển nhằm tăngnăng suất và chất lượng lúa, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ đang tăng trên toàn cầu

Từ buổi đầu của nền văn minh, cây lúa là cây trồng được gắn liền với quátrình phát triển của loài người và đã trở thành cây lương thực chính của Châu

Á nói chung, người Việt Nam ta nói riêng Diện tích trồng lúa trên thế giớikhông ngừng tăng, theo số liệu từ FAO đến năm 2016 diện tích trồng lúa khoảnggần 163,3 triệu ha Tại Việt Nam từ năm 1945 đến nay, theo tổng cục thống kêdiện tích trồng lúa gạo không ngừng được mở rộng, năng suất ngày một tăng đếnnăm 2016 đạt 7,79 triệu ha Từ những năm đầu thực hiện công cuộc đổi mới củađất nước (1986), chúng ta vẫn nằm trong danh sách các nước thiếu lương thựctrầm trọng, song với đường lối đổi mới của Đảng ngành nông nghiệp đã có bướckhởi sắc, chúng ta từ một nước nhập khẩu lương thực đã trở thành nước xuấtkhẩu gạo đứng thứ 2 thế giới (Nguyễn Thị Anh Hạnh, 2008) [7]

Hiện nay do tác động của biến đổi khí hậu, tình hình sản xuất gặp rất nhiều khó khăn như:

Mất diện tích đất nông nghiệp do mực nước biển dâng, xâm lấn những cánh đồng thấp trũng ven biển

- Mùa đông có những đợt rét kéo dài, mùa hè thì hạn hán, nắng nóng, thiếunước dẫn đến hoang mạc hóa, sa mạc hóa trên những vùng đất cát, đất trống,đồi trọc ảnh hưởng sự sinh trưởng phát triển của cây trồng dẫn đến giảm năngsuất sản lượng cây trồng, hiệu quả kinh tế và đe dọa đến an ninh lương thực.

- Biến đổi khí hậu làm thay đổi điều kiện sinh sống của các loài sinh vật, dẫnđến tình trạng biến mất của một số loài và ngược lại làm xuất hiện nguy cơgia tăng các loài “gây hại”

- Biến đổi khí hậu có thể tác động đến thời vụ, làm thay đổi cấu trúc mùa mang gây thất thu, mất mùa

Nhiệm vụ của công tác chọn tạo giống cây trồng là phải làm thế nàotrong thời gian ngắn nhất tạo ra được những giống cây trồng mới có năng suấtcao, phẩm chất tốt ổn định, khả năng chống chịu tốt với điều kiện bất thuận,đáp ứng được yêu cầu sản xuất nông nghiệp và của nền kinh tế quốc dân Tiếnhành thí nghiệm chọn, tạo ra các giống mới đưa ra sản xuất để bổ sung vào cơcấu giống là nhiệm vụ rất quan trọng Bên cạnh đó việc đánh giá về năng suất,chất lượng cũng như khả năng chống chịu sâu bệnh, đặc điểm hình thái, cácđặc tính nông học và phân tử của các dòng giống lúa đang được tạo ra là điềucần thiết để chọn lọc ra những giống lúa phù hợp với điều kiện về địa lý vàcho năng suất và chất lượng gạo cao nhất Vì vậy chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái và mức độ phân

tử tập đoàn các dòng lúa đột biến được tạo ra từ giống lúa ST19 và Q2.”

nhằm tìm ra những dòng lúa triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt khángsâu bệnh khá thích ứng được với các điều kiện môi trường biến đổi khí hậuphức tạp hiện nay và góp phần bảo đảm an ninh lượng thực trong nước vàtrên thế giới

2 Mục tiêu của nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái, các yếu tố cấu thànhnăng suất, chất lượng và đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định mối

quan hệ di truyền của tập đoàn các dòng lúa được tạo ra từ đột biến của giống ST19 và Q2.

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

-Đối tượng nghiên cứu: 20 dòng lúa được phát triển từ giống ST19 và 4

dòng lúa được phát triển từ giống Q2 qua xử lí đột biến phóng xạ và chọn lọc đến thế hệ M6 và đối chứng lần lượt là giống gốc ST19 và Q2

-Thời gian nghiên cứu: từ tháng 5/2016 đến tháng 8/2018

- Địa điểm nghiên cứu: Thực hiện các thí nghiệm phân tử tại Bộ môn Kỹthuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp

Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại: Khu nhà lưới Trường Đại học

sư phạm kỹ thuật Hưng Yên

Khu khảo nghiệm lúa Trường Cao đẳng nghề Kinh tế Kỹ thuật Tô Hiệu Hưng Yên

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây lúa

Lúa trồng (Oryza sativa L.) là cây trồng có từ lâu đời và gắn liền với

quá trình phát triển của xã hội loài người, nhất là vùng châu Á Theo Mai Thọ

Trung (1990) [15], lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa dại (Oryza fatua,

Oryza off Cinalis, Oryza minuta) do quá trình chọn lọc tự nhiên và chọn lọc

nhân tạo lâu dài tạo nên

Lúa trồng thuộc:

Giới : thực vật (Plantae),

Ngành : thực vật có hoa (Angios permes),

Lớp : một lá mầm (Mono Cotyledones),

Bộ : hoà thảo có hoa (Poales),

Họ : hoà thảo (Poaceae) trước đây gọi là họ Graminae,

Chi : Oryza,

Chi Oryza có 23 loài phân bố rộng khắp thế giới Loài Orazy sativa L.

được trồng phổ biến ở khắp các nước trên thế giới và phần lớn tập trung ở

châu Á Loài Oryza glaberrima S được trồng) Loài Oryza sativa L được

chia làm ba loài phụ:

- Loài phụ Japonica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung

Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), có những đặc điểm như chịu rét cao nhưng ítchịu sâu bệnh

- Loài phụ Indica được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Việt Nam, Ấn Độ, Mianma, Philippin) Loài phụ Indica có đặc điểm: hạt dài,

thân cao, mềm, dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ

ánh sáng.

- Loài phụ Javanica có hình thái trung gian giữa Indica và Japonica.

Hạt dài nhưng dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ được trồng ở một vài nơi

- Trấu ít lông vàlông ngắn

- Hạt dễ rụng

1.1.2 Đặc tính nông học của các giống lúa

Lúa là cây thân thảo sinh sống hàng năm Thời gian sinh trưởng của các

giống dài ngắn khác nhau và trong khoảng 60 - 250 ngày tuỳ theo giống, vụ

lúa chiêm hay mùa, cấy sớm hay muộn Chu kỳ sinh trưởng, phát triển của

cây lúa bắt đầu từ hạt và cây lúa cũng kết thúc một chu kỳ của nó khi tạo ra

hạt mới Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa có thể được chia làm

hai giai đoạn: Giai đoạn sinh trưởng được tính từ thời kì mạ đến đẻ nhánh;

Giai đoạn sinh thực tính từ thời kì làm đốt đến hạt chín

Các nhân tố sinh thái (nhiệt độ, ánh sáng, nước, đất…) thường xuyên ảnh

hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa, trong đó nhiệt độ có tác dụngquyết định Ở mỗi giai đoạn sinh trưởng, cây lúa yêu cầu nhiệt độ khác nhau,nhiệt độ thích hợp nhất là 280C - 320C, ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ dưới

130C Nhiệt độ tối thích cho nảy mầm là 200C - 350C, ra rễ là 250 C - 280 C,vươn lá là 310C (Lê Trần Bình và cộng sự, 1995) [1] Ánh sáng tác động tớicây lúa thông qua cường độ chiếu sáng và thời gian chiếu sáng Quang hợpcủa lúa nước tiến hành thuận lợi ở điều kiện chiếu sáng 250 - 400cal/cm2/ngày (Trần Kim Đồng và cộng sự, 1991) [5] Cường độ ánh sángtrong ngày ảnh hưởng đến quá trình ra hoa, kết quả ở lúa Dựa vào phản ứngquang chu kỳ người ta chia cây lúa làm 3 loại: loại phản ứng với ánh sángngày dài, yêu cầu thời gian chiếu sáng trên 13 giờ/ngày; loại phản ứng với ánhsáng ngày ngắn, yêu cầu thời gian chiếu sáng dưới 13 giờ/ngày; loại phản ứngtrung tính có thể ra hoa trong bất cứ điều kiện ngày ngắn hay ngày dài (LêTrần Bình và Lê Thị Muội, 1998) [2]

Lúa yêu cầu nhiều nước hơn các cây trồng khác, để tạo ra 1g chất khôcây lúa cần 628g nước Lượng nước cần thiết cho cây lúa trung bình 6 -7mm/ngày trong mùa mưa, 8 - 9mm/ngày trong mùa khô Đất trồng lúa tốtnhất là đất thịt, trung tính đến sét, có hàm lượng N, P, K tổng số cao; pH = 4,5

- 7,0, độ mặn nhỏ hơn 0,5% tổng số muối tan [5, 4]

Đặc điểm hình thái dòng lúa ST19

Giống lúa ST19 là giống lúa thuộc loài phụ Indica, có thời gian sinh

trưởng 115-120 ngày vụ xuân, vỏ trấu có màu nâu Hạt gạo trong, cơm mềm,dẻo, hàm lượng amylose 18%- 21% có mùi thơm Hạt gạo ST19 dài 7,5mm,đang được trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam, nhất là các tỉnh Sóc Trăng và

Cà Mau Giống có năng suất khá, đặc biệt là chất lượng cao, chịu phèn mặnkhá, có kiểu hình đẹp, lá hình lòng mo, chịu thâm canh, năng suất khá, chỉthích ứng ở phía Nam, khi giống mang ra trồng ở phía Bắc thì giống có 4nhược điểm lớn cần khắc phục: Dài ngày, năng suất thấp; Bông thưa, tỷ lệ lép

cao; Nhiễm sâu bệnh nặng, nhất là bạc lá và rầy nâu; Chịu rét kém vào vụđông xuân.

Đặc điểm hình thái dòng lúa Q2

Giống Q2 có thời gian sinh trưởng 130-140 ngày vụ xuân, hàm lượngamylose 25%, năng suất cao đạt 60-65 tạ/ha nhưng cơm cứng và dài ngày

1.2 Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái về năng suất, chất

lượng

1.2.1 Một số các chỉ tiêu đánh giá của đặc tính nông học ảnh hưởng đến

năng suất cây lúa

Trong sản xuất lúa, năng suất là mục tiêu cuối cùng và là một chỉ tiêukinh tế quan trọng, có ý nghĩa quyết định đến sự tồn tại hay không tồn tại củamột giống lúa Mặt khác năng suất là chỉ tiêu tổng hợp phản ánh kết quả củamột giống Khả năng cho năng suất của các giống lúa được thể hiện qua cácyếu tố cấu thành năng suất như: Số bông/m2, số hạt chắc/bông, khối lượng

1000 hạt, các yếu tố này liên quan chặt chẽ với nhau Số bông/m2 phụ thuộcvào quá trình đẻ nhánh hữu hiệu và số cây trên đơn vị diện tích Dựa vào điềukiện đất đai, dinh dưỡng, khí hậu của địa phương và đặc điểm của từng giống

để quyết định mật độ cấy, tỷ lệ đẻ nhánh từ đó sẽ quyết định số bông, số hạt,

tỷ lệ hạt chắc và năng suất cuối cùng

Khả năng đẻ nhánh: Đẻ nhánh là tập tính sinh học của cây lúa, nhanhđược hình thành từ các mắt trên thân Các mầm này có thể phát triển thànhnhánh khi gặp điều kiện thuận lợi Khả năng đẻ nhánh nhiều hay ít phụ thuộc

và đặc điểm của từng giống, tùy thuộc vào tuổi mạ, kỹ thuật cấy, điều kiệndinh dưỡng, nước, điều kiện ngoại cảnh Cây lúa càng nhiều nhánh, tỉ lệnhánh hữu hiệu cao thì cho năng suất càng cao

Độ cứng cây: Ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất của lúa Trong thời kìhạt bắt đầu chín, độ cứng cây cần đạt yêu cầu để giữ cho cây lúa không bị đổgục trước những đợt gió hoặc mưa to Các yếu tố ảnh hưởng đến độ cứng cây

như bón phân, ánh sáng và chất lượng giống Cây càng yếu thì khả năng nâng

đỡ bông lúa càng kém

Chiều cao cây: Chiều cao cây là một chỉ tiêu quan trọng, ảnh hưởng tớinăng suất, những giống có chiều cao cây thấp, thân rạ cứng thường là nhữnggiống chịu thâm canh cao, khả năng tích luỹ vật chất khô lớn, có tiềm năngcho năng suất cao Chiều cao cây là đặc trưng của từng giống Chiều cao câyphụ thuộc vào điều kiện canh tác, chăm sóc, thời vụ gieo trồng, khác nhauthì chiều cao cây cũng khác nhau, ngoài ra chiều cao cây còn phụ thuộc vàochiều dài lóng và số lóng trên thân Xu hướng chọn tạo hiện nay của Việt Namcũng như trên thế giới là chọn lọc ra nhiều giống lúa mới có năng suất cao,phẩm chất tốt, cây thấp chịu thâm canh, có khả năng chống chịu tốt với điềukiện ngoại cảnh và sâu bệnh hại

Độ thoát cổ bông: Khả năng không trỗ thoát cổ bông nhìn chung đượccoi là một nhược điểm di truyền, có ảnh hưởng đến năng suất lúa nếu giốnglúa có tỉ lệ thoát cổ bông thấp, nhiều hạt lúa không thoát ra khỏi bẹ lá đòngdẫn tới hình thành hạt lép

Thời gian sinh trưởng: Thời gian sinh trưởng của các giống lúa bắt đầu

từ khi gieo đến khi thu hoạch được chia làm nhiều giai đoạn khác nhau, cácgiai đoạn sinh trưởng luôn biến động theo giống, mùa vụ tác động của conngười thông qua các biện pháp kỹ thuật trong quá trình sản xuất Sinh trưởng,phát triển là một chỉ tiêu quan trọng liên quan chặt chẽ với năng suất lúa Quátrình sinh trưởng, phát triển của lúa thể hiện trên đồng ruộng là kết quả của sựphản ánh tính bền vững của giống về mặt di truyền, đồng thời cũng phản ánhđược khả năng phản ứng của giống với điều kiện ngoại cảnh Hay nói cáchkhác, các giống khác nhau thì đặc tính của từng giống là khác nhau

- Năng suất hạt: Trên ruộng lúa số bông/m2 phụ thuộc rất nhiều vào khảnăng đẻ nhánh và sức đẻ nhánh hữu hiệu Như vậy, muốn nâng cao số bôngtrên đơn vị diện tích nhất thiết phải tác động, thúc đẩy hai yếu tố trên một

cách hài hoà nhất Thực tế ta thấy rằng quần thể ruộng lúa có quy luật tự điềutiết, không cho phép cấy dày hay thưa quá vì không phù hợp với những lợi ích

về kinh tế và kỹ thuật Số hạt/bông nhiều hay ít tuỳ thuộc vào số gié, hoa phânhoá cũng như số gié, hoa thoái hoá, các quá trình này nằm trong thời kỳ câylúa sinh trưởng sinh thực (làm đòng) Hạt chắc/bông là yếu tố ảnh hưởng rấtlớn đến năng suất Thời kỳ quyết định hình thành số hạt chắc/bông bắt đầu từthời kỳ phân hoá đòng đến cuối thời kỳ vào chắc (từ trước trỗ 30 ngày đến sautrỗ 15 ngày)

1.2.2 Phương pháp đánh giá đặc tính nông học ở lúa

Để đánh giá các các yếu tố về đặc tính nông học ảnh hưởng đến năngsuất và chất lượng lúa trên thế giới thường sử dụng hệ thống tiêu chuẩn đánhgiá cây lúa (SES) theo tiêu chuẩn IRRI (1996) [21] Riêng tại Việt Nam còn

có thêm hệ thống đánh giá theo thang điểm của tiêu chuẩn ngành quy phạmkhảo nghiệm giống lúa 10 TCN 558 - 2002

Phương pháp đánh giá theo IRRI (1996) [21] giúp các nhà nghiên cứulúa trên thế giới có một tiếng nói chung trong công tác đánh giá đặc tính củacây lúa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu thập, xử lý và phân tích các sốliệu trong những thí nghiệm đa môi trường, tăng cường phương pháp tiếp cận

đa lĩnh vực trong công tác cải thiện giống lúa, thang điểm SES đánh giá hàngloạt các đặc tính di truyền nhằm phân nhóm xếp hạng các tập đoàn quỹ gencây lúa hoặc các dòng lai Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế trong cách đánhgiá này là phức tạp trong các phương pháp thang điểm và đánh giá sự giaođộng giữa các tính trạng

Với phương pháp khảo nghiệm DUS theo tiêu chuẩn ngành của Bộ nôngnghiệp và Phát triển nông thôn Quy phạm này quy định nguyên tắc, nội dung

và phương pháp khảo nghiệm tính khác biệt (Distinctness), tính đồng nhất

(Uniformity), tính ổn định (Stability) - gọi tắt là khảo nghiệm DUS - của các

giống lúa mới, bao gồm giống thuần (true line varieties), các dòng bố mẹ lúa

lai và giống lai F1 (hybrid varieties), thuộc loài Oryza sativa Linn.

Hiện nay có nhiều vùng, địa phương tiến hành đánh giá chất lượng giốnglúa dựa trên năng suất và phẩm chất của giống lúa, đánh giá các đặc tính nônghọc như chịu hạn, chịu mặn, thời gian sinh trưởng, khả năng chống chịu sâubệnh được cho là những ưu tiên khi đánh giá một giống lúa, xem nó có phùhợp với địa lý và điều kiện ở địa phương, khu vực gieo trồng hay không.Abifarin và cộng sự (1972) [16], nghiên cứu đặc điểm nông sinh học vànăng suất trong điều kiện nước trời và có tưới nước tiến hành theo dõi các đặcđiểm liên quan đến khả năng chịu hạn như độ cuốn lá, độ khô lá, độ tàn lá,khả năng trỗ thoát, khả năng chịu hạn, khả năng phục hồi sau 7 ngày khi kếtthúc đợt hạn tự nhiên (khi có mưa trở lại) theo thang điểm của IRRI TheoNguyễn Thanh Tuyền (2006) [14], kết quả nghiên cứu về một số đặc điểmnông sinh học và chỉ tiêu chất lượng của các dòng giống lúa tẻ thơm ngắnngày năng suất cao Thời gian sinh trưởng của các dòng giống lúa trong các

vụ xuân dao động từ 128 ngày (KD18) đến 142 ngày (D30, D23, DTT05) vụmùa từ 110 ngày (KD18) đến 119 ngày (D30, D23) Như vậy các dòng nàythuộc nhóm có thời gian sinh trưởng ngắn thích hợp với trà xuân muộn vàsớm Các dòng lai đều có TGST dài hơn cả 2 bố mẹ (LT2, KD18)

1.3 Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử

1.3.1 Sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa

Chỉ thị phân tử (CTPT) là các chỉ thị chọn lọc trực tiếp dựa trên cấu trúcphân tử DNA

Các chỉ thị di truyền được phát hiện thông qua phương pháp đánh dấucác đoạn oligonucleotit và đều có một số đặc điểm chung là không bị ảnhhưởng bởi các yếu tố môi trường, thường liên kết với các tính trạng trội hoặcsiêu trội, mang tính ổn định và di truyền qua các thế hệ Số lượng các chỉ thịDNA là rất lớn, cây trồng có khoảng 108 - 1010 Nucleotit trong DNA tổng số

và vì thế nếu giữa 2 cá thể chỉ cần có sự sai khác nhỏ thì giữa chúng sẽ có một

số lượng khổng lồ các chỉ thị DNA để phân biệt sự sai khác đó Theo lý

thuyết, một chỉ thị DNA lý tưởng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau:

- Cho đa hình cao

Chỉ thị RFLP

RFLP là một kỹ thuật áp dụng để phân biệt các sinh vật với nhau bằngcách phân tích các kiểu dẫn xuất hình thành từ việc cắt nhỏ DNA của chúng.Nếu hai sinh vật khác nhau về các khoảng cách giữa các vị trí phân cắt vốnthực hiện bởi các enzymes cắt giới hạn giữa chuỗi đặc hiệu (particularRestriction Endonucleases), chiều dài của các đoạn hình thành sẽ khác nhaukhi mà DNA bị phân giải bởi các enzyme cắt giới hạn đó Sự giống nhau haykhông giữa các mẫu khảo sát dựa trên RFLP có thể được sử dụng để phân biệt

ra các loài (và thậm chí các dòng) trong số các sinh vật được nghiên cứu.Bằng kỹ thuật RFLP thì sự khác nhau giữa các sinh vật có nguồn gốc từ sựsắp xếp lại DNA xảy ra trong quá trình tiến hóa hoặc đột biến điểm xảy ratrong trình tự DNA tại vị trí nhận dạng để hoạt động của RestrictionEndonuclease hoặc việc thêm, mất một hay nhiều nucleotides hay giao chéokhông cân bằng Như thế, một đa hình có thể sử dụng để phân biệt các loài

thực vật, các kiểu gene hay trong vài trường hợp là giữa các cá thể cùng loài.Trong phân tích RFLP, sản phẩm phân giải DNA bộ gene bằng enzyme cắt giớihạn có thể được phân tách nhau theo kích thước bằng điện di trên gel và sau đóđược thấm lại vào một màng nitrocellulose Các kiểu băng đặc trưng sẽ đượcnhìn thấy bằng cách lai với DNA thăm dò có đánh dấu Việc đánh dấu này có thểđược thực hiện với các đồng vị phóng xạ hay các chất nhuộm không phóng xạkhác như digoxigenin hay fluoresein Những DNA thăm dò này chủ yếu là cácDNA thăm dò đơn locus đặc trưng cho loài kích thước khoảng 0,5 – 3 kb nhậnđược từ thư viện cDNA hay một thư viện bộ gene nào đó.

RFLP có thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và phát sinh loài trêndải đối tượng từ các cá thể đến quần thể, từ trong loài đến các loài có quan hệ

họ hàng gần RFLP được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu lập bản đồgene bởi tính phong phú cao của chúng trên bộ gene, khả năng ứng dụng rộngcủa các enzyme cắt giới hạn khác nhau và sự phân bố ngẫu nhiên suốt bộ genecủa các RFLP (Neale và Williams, 1991) [26] RFLP cũng được sử dụng trongnghiên cứu khảo sát mối quan hệ giữa các bậc phân loại gần, hoặc sử dụngnhư một công cụ làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA (DNAfingerprinting), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền lai, chuyển gene quantâm vào sinh vật và bao gồm cả những nghiên cứu về dòng gene hay phân bốgene giữa các cây trồng Các marker RFLP cũng được sử dụng lần đầu trongviệc xây dựng bản đồ di truyền bởi Botstein và cộng sự năm 1980, từ đó một

bộ các marker RFLP phát hiện được đã tạo nhiều cơ hội cho việc phát triểnmột bản đồ chi tiết ở rau diếp (Landry và cộng sự, 1987) [24]

Chỉ thị RAPD

RAPD là một kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR Phương pháp được dựa trên

cơ sở sự khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu hay ngẫu nhiên dưới tác độngcủa enzyme với các mồi tùy chọn, kỹ thuật này được Welsh và McClellandphát triển năm 1991 Trong phản ứng RAPD, một chủng loại mồi đơn sẽ gắn

vào DNA bộ gene ở hai vị trí khác nhau trên hai mạch bổ sung của DNAkhuôn mẫu Trung bình, mỗi mồi sẽ dẫn đến việc khuếch đại một vài locusriêng rẽ trên bộ gene, đó là cơ sở cho sự hữu dụng của RAPD cho việc sànglọc một cách hiệu quả các đa hình trình tự nucleotide giữa các cá thể Tuynhiên, vì tính ngẫu nhiên một cách tự nhiên trong việc khuếch đại DNA vớicác mồi có trình tự ngẫu nhiên, điều quan trọng là phải tối ưu hóa và duy trìđiều kiện phản ứng cho việc nhân mạch đôi DNA Các oligonucleotide trungbình khoảng 10 nucleotide được sử dụng trong vai trò cả hai mồi xuôi vàngược và được sử dụng để khuếch đại đồng thời các đoạn DNA từ 1- 10 vị tríbắt mồi trên bộ gene Sản phẩm khuếch đại (thường trong dải kích thướckhoảng 0,5 – 5kb) được phân tách nhau trên gel agarose với sự có mặt củaethidium bromide hay các chất nhuộm khác để có thể được nhìn thấy dưới tiacực tím Qua đó, sự hiện diện hay thiếu vắng của các band sẽ được quan sát.Những đa hình này được xem như là căn bản bởi sự biến động về vị trí bắtmồi, nhưng chúng cũng có thể được hình thành bởi sự khác nhau về chiều dàitrình tự được khuếch đại nằm giữa các vị trí bắt mồi.

Việc ứng dụng các RAPD và các marker được cải biến liên quan trongphân tích sự biến động và kiểu gene đặc trưng cá thể đã được thực hiện mộtcách rộng rãi, nhưng kém thông dụng hóa bởi những vấn đề như khả năng táilặp kết quả thí nghiệm kém hoặc tạo các sản phẩm mơ hồ và khó để có đượccác band rõ ràng để có thể đưa đến những kết luận một cách phù hợp RAPD

đã được sử dụng với nhiều mục đích, từ nghiên cứu ở mức độ cá thể (như xácđịnh đa dạng di truyền) đến nghiên cứu liên quan đến những loài họ hàng gầnnhau RAPD cũng đã và đang được ứng dụng vào việc nghiên cứu lập bản đồgene để lấp đầy những lỗ hổng mà các marker khác chưa thực hiện được(Hadrys và cộng sự, 1992) [19]

Chỉ thị SSR

Khái niệm microsatellite được Litt và Lutty đặt ra năm 1988 và cũng

được biết đến như là SSR - các phân đoạn ngắn DNA, bao gồm các đơn vị lặpcủa nucleotide đơn, 2- , 3-, 4- hay 5- nucleotide lần lượt nối tiếp nhau xuấthiện khắp bộ gene của phần lớn các loài nhân thật Chỉ thị SSR, vốn đượcphát triển từ các thư viện gene, có thể thuộc về vùng phiên mã hay khôngphiên mã trên bộ gene và hiếm khi chúng mang thông tin có giá trị liên quanđến chức năng SSR đặc biệt thích hợp để phân biệt các kiểu gene có quan hệ

họ hàng gần, bởi mức độ biến động cao của chúng, vì thế chúng được ưa thíchkhi sử dụng trong các nghiên cứu về quần thể và cho việc nhận dạng cácchủng giống nông nghiệp có quan hệ gần SSR thể hiện một tính đa hình caonên chúng là những chỉ thị có thể được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về ditruyền quần thể cũng như các nghiên cứu quan hệ phát sinh từ mức độ cá thể(như nhân dòng vô tính và xác định các dòng) đến mức độ những loài có quan

hệ họ hàng gần Ngược lại, tỷ lệ đột biến cao của chúng làm cho chúng khôngthích hợp trong nghiên cứu phân biệt các taxon có quan hệ phát sinh xa nhau.SSR được xem là các mồi lý tưởng trong nghiên cứu lập bản đồ gene (Jarne

và Lagoda, 1996) [22]

Marker SSR đã được chứng minh tính hữu dụng cho việc đánh giá biếnđộng di truyền trong chọn lọc các sinh vật (Mohammadi và Prasanna, 2003) [27]

1.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa ở mức độ phân tử trên thế giới

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời củanhiều loại chỉ thị chỉ thị cũng như số lượng của mỗi loại chỉ thị đã làm tănghiệu quả trong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng trong vớimục đích khác nhau Chỉ thị DNA được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu

di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểmsoát các tính trạng, hay chọn giống phân tử là các lĩnh vực được triển khaihiệu quả

Tác giả Olufowote (1997) [28], nghiên cứu biến động di truyền tronggiống của 171 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP Kết quả cho

thấy, các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử caohơn các giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng cácalen ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến Chỉ thịSSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời

số lượng alen cao hơn chỉ thị RFLP

Tác giả Yu và cộng sự (2003) [34] đã sử dụng 101 chỉ thị SSR để đánhgiá đa dạng 193 giống lúa từ 26 nước trên thế giới Khoảng cách di truyền từ0,13 - 0,88, trung bình là 0,68 Số alen/locus từ 2 - 11, trung bình 6,3/locus.Kết quả phân tích nhóm đã phân tách 193 giống thành 3 nhóm chính và 9

phân nhóm Nhóm I là các giống lúa Indica, nhóm II và III thuộc loài phụ

Japonica Các locus thuộc nhiễm sắc thể 9, 12 phân biệt rõ nhất sự khác nhau

giữa Indica và Japonica

Tác giả Lu H và cộng sự (2005) [25] đã phân tích cấu trúc của quần thểlúa ở Mỹ với 115 giống lúa trồng ở Mỹ và 30 giống lúa châu Á bằng 169 chỉthị SSR Kết quả thu được 870 alen, trung bình 5,15 alen/locus Tần số alenhiếm rất cao, lên đến 50%, trong khi đó tần số alen phổ biến chỉ chiếm 24-26% trong số 870 alen Hệ số đa dạng PIC đạt khá cao: 0,80 Kết quả phânnhóm cho thấy, 115 giống lúa đã phân thành ba nhóm: Japonica ôn đới vớiđặc điểm hạt ngắn, Japonica nhiệt đới có đặc điểm hạt trung bình và Japonicanhiệt đới hạt dài Các giống lúa Indica đại diện cho các giống lúa truyền thốngthì phân chia thành các nhóm riêng

1.3.3 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa mức độ phân tử

của Việt Nam

Việt Nam được coi là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên ditruyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng Nghiên cứu

đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam cònhạn chế Tuy nhiên trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã quan tâmứng dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta

Tác giả Trần Danh Sửu và cộng sự (2001) [9] sử dụng kỹ thuật RAPD đểnghiên cứu các giống lúa ở vùng Tây Bắc và Tây Nam nước ta cho thấy hầu

hết các giống lúa ở vùng Tây Bắc thuộc loài phụ Japonica, các giống lúa nước

ở Tây Nam nước ta thuộc loài phụ Indica Bùi Chí Bửu đã sử dụng 20 mồi

RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 72 giống lúa địa phương Trong 20mồi thử nghiệm thuộc nhóm OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng.Kết quả có hai nhóm chính bao gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm ở đồngbằng sông Hồng, lúa nước sâu của đồng bằng sông Cửu Long, lúa nếp củaTây Nguyên và lúa nước trời của Duyên Hải Trung bộ

Trần Danh Sửu và cộng sự (2001) [9] sử dụng 48 chỉ thị SSR để đánh giá

đa dạng của 17 giống lúa Tám Hệ số đa dạng gen thu được là 0,35 Số alenthu được trung bình 3,37 alen/mồi 17 giống lúa này còn được phân loại

Indica và Japonica dựa trên sự khác biệt của DNA lục lạp Kết quả 17 giống

lúa Tám đều thuộc nhóm Japonica.

1.3.4 Một số thành tựu trong chọn tạo giống lúa chất lượng

Trong chọn giống lúa thơm

Tác giả Sujatha (2004) [32] nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các giốnglúa Basmati bằng chỉ thị SSR Nghiên cứu được tiến hành trên 30 giống lúa

thơm (bao gồm 22 giống lúa Basmati hạt ngắn và 8 giống Basmati hạt dài)

dựa trên 6 chỉ thị SSR Kết quả cho thấy 20 trong số 22 giống lúa thơm hạtngắn nằm cùng một nhóm lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn còn lại nằm cùng

nhau và tách riêng so với các nhóm khác, tám giống lúa Basmati hạt ngắn

nằm trong cùng một nhóm khác Tác giả đã khẳng định chỉ thị phân tử cungcấp ước lượng đa dạng di truyền chính xác so với các chỉ thị hình thái Kếtquả nghiên cứu này cũng giúp cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thíchhợp trong công tác lai tạo giống lúa chất lượng

Trong nghiên cứu của mình, Weiwei Shi và cộng sự (2008) [33] đã phát

hiện alen badh2 và sự phát triển của các chỉ thị chức năng của locus badh2.

Tổng số 24 giống lúa thơm và 10 giống lúa không thơm đã được nghiên cứu

và giải trình tự locus badh2/badh2 của chúng Nghiên cứu này đã phát hiện được trong 12 giống lúa thơm nghiên cứu, tại alen badh2 có thiếu 8bp và SNPs ở đoạn exon7, các giống khác có một alen mới không phải là badh2 (badh2- E2), alen này có trình tự giống hệt với alen badh2 ở đoạn exon7 nhưng thiếu 7bp ở đoạn exon2 Alen không thuộc badh2 này cũng quy định

tính trạng thơm của lúa Dựa trên sự khác biệt về trình tự giữa hai alen,Weiwei Shi & cs đã phát triển các chỉ thị phân tử này như một dạng marker để

có thể dễ dàng phân biệt các giống lúa thơm và các giống lúa không thơm,cũng như để phân biệt giữa hai nhóm lúa thơm Các chỉ thị chức năng này sẽmang lại hiệu quả cao trong chương trình chọn tạo các giống lúa thơm quaphương pháp chọn lọc liên kết phân tử (MAS)

Dương Xuân Tú và cộng sự (2008) [12] đã nghiên cứu và sử dụng chỉ thịphân tử DNA để xác định gen thơm điều khiển tính trạng mùi thơm trong lúagạo phục vụ công tác chọn tạo giống lúa thơm, công trình được tiến hành từnăm 2007 đến 2008 tại Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Kết quả đãlựa chọn được 2 chỉ thị là L05 và BADH2 gồm 4 mồi: EAP, ESP, IFAP, INSP

có thể sử dụng để phân biệt chính xác giữa các giống lúa có mùi thơm do gen

fgr điều khiển và giống lúa không thơm (không mang gen fgr) Sử dụng chỉ

thị BADH2 để phân biệt các dòng lúa thơm trong tổng số 420 dòng lúa từ cácthế hệ F4 đến F6 và các dòng đơn bội kép, kết quả đã chọn ra được 73 dòng

lúa mang gen thơm fgr đồng hợp tử và 91 dòng lúa mang gen thơm fgr dị hợp

tử

Trong chọn giống lúa dẻo

Theo Hirano và cộng sự (1998) [20] Tính trạng dẻo của gạo được quyếtđịnh bởi hàm lượng amylose có trong nội nhũ hạt, amylose chiếm khoảng 16-30% trong tinh bột gạo và nó là yếu tố quyết định của tính dẻo, dính và trắng

bóng của hạt gạo Gạo có hàm lượng amylose cao thường cứng và khô cơm,khi nấu hạt gạo rời nhau Gạo có hàm lượng amylose thấp thường dẻo, dính

và bóng cơm Sự tổng hợp của amylose là do sự thủy phân của enzym

granule-bound starch synthaza (GBSS), enzym này được mã hóa bởi gen Wx Các giống lúa phi sáp (không dẻo) có chứa 2 alen ở locus waxy được gọi là

Wx a và Wx b Alen Wx a chủ yếu có mặt trong các giống lúa Indica trong khi đó

alen Wx b là trội trong giống lúa Japonica Qua nghiên cứu của mình, Wang và

cộng sự đã chỉ ra rằng sự khác biệt về cơ sở phân tử của thành phần amylose

trong nội nhũ của hạt là do sự điều khiển sau phiên mã của alen Wx Ở những

giống lúa có trình tự AGGTATA ở đầu nối 5’ của đoạn intron đầu tiên thuộc

gen Wx cho thấy sự phiên mã ở mức cao, do đó dẫn đến hàm lượng cao của

amylose trong nội nhũ hạt Trong khi đó, các giống lúa có trình tự AGTTATA

ở đầu nối 5’ cho mức độ phiên mã của gen Wx thấp, dẫn đến hàm lượng

amylose trong nội nhũ thấp Ở một nghiên cứu khác, Hirano và cộng sự đã chỉ

ra rằng trình tự AGGTATA ở đầu nối 5’ trùng với sự có mặt của alen Wx a ,

trong khi đó trình tự AGTTATA trùng với sự có mặt của alen Wx b Tuy nhiên,chỉ với hai alen này không đủ để giải thích được sự khác nhau về hàm lượngamylose của tất cả các giống lúa

Hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn so với hàm lượngamylose thấp, do một gen điều khiển kèm theo một số modifiers (gen phụ cótính chất cải tiến) Gen điều khiển sự co dãn hàm lượng amylose (amyloseextender) được xác định trên nhiễm thể số 2 (Kaushik và Khush 1991) [23].Thành tựu có ý nghĩa trong nghiên cứu di truyền phân tử về chất lượng cơm

có thể được ghi nhận qua công trình bản đồ liên kết gen hệ enzyme III củatinh bột trong hạt gạo trên nhiễm thể số 2, với hai chỉ thị kế cận CDO 718 và

RG 157 Amylose được đo lường bằng phương pháp hấp thu phổ sóng

“amylose - iodine complex” Trên thế giới, mạng lưới chất lượng lúa gạo(INQR - International Network for Quality Rice) đã điều tra số liệu biến thiên

giữa các phòng thí nghiệm khi phân tích amylose và xác định tại sao có sự sailệch này Phương pháp phân tích amylose không hề đơn giản và đòi hỏi độchính xác với điều kiện chuẩn mực hơn Phân tích QTL (phân tích di truyềncác gen điều khiển tính trạng số lượng) kiểm soát hàm lượng amylose cho

thấy, vùng giả định nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 với gen Wx và các alen

khác, giải thích biến thiên kiểu hình 91,1% trong quãng giữa hai markerRG573-C624 Yanagisawa và các cộng sự đã dùng kỹ thuật SNP (singlenucleotide polymorphism) và dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic

sequence) để tìm kiếm gen Wx-D1 trong lúa và lúa mì mã hóa protein Wx-D1

thông qua phân tích immunoblot

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: 20 dòng lúa ở thế hệ M6được chọn lọc từ quần thể gây đột biến giống lúa thơm Sóc Trăng 19 (ST19)

và 4 dòng lúa thế hệ M6 được chọn lọc từ các dòng đột biến của giống Q2 kếthừa từ đề tài độc lập cấp nhà nước, mã số ĐT.ĐL-G36.2012 Do NCS –Hoàng Thị Loan cung cấp (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các dòng đột biến và giống gốc được nghiên cứu

TT

12345678910111213

2.2 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá một số đặc điểm hình thái nông học chính của 20 dòng lúađột biến được tạo ra từ giống ST19 và 4 dòng lúa đột biến từ giống Q2

So sánh với giống gốc

Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR Các dòng đột biến so với giống gốc.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng

Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp tuần tự không lặp lại mỗi ô thí nghiệm

- Bố trí thí nghiệm đánh giá tập đoàn theo phương pháp tuần tự không nhắc lại, diện tích ô 2,5m2 (1 x 2,5 m)

- Mật độ: 45 khóm/m2

- Các khâu kỹ thuật trồng và chăm sóc theo đại trà sản xuất

- Đánh giá và so sánh các dòng đột biến thu được ở M6 so với giốngđối chứng là ST19, các định dòng ưu việt theo mục tiêu nghiên cứu, các dòngcòn phân ly thì loại bỏ

Phương pháp đánh giá một số tính trạng nông Sinh học và yếu tố cấu thành năng suất, chất lượng.

Các tính trạng theo dõi và đánh giá được thực hiện theo Hệ thống đánhgiá tiêu chuẩn cây Lúa của IRRI (1996)

Các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa được chia thành 9 giai đoạn nhưsau:

Giai đoạn 1: Nảy mầm

Giai đoạn 4: Vươn lóng

Giai đoạn 7: Chín sữa

Các tính trạng theo dõi và đánh giá gồm:

Các cá thể trong toàn ô thí nghiệm được thực hiện qua quan sát bằngmắt, trên từng cây và bộ phận của cây và cho điểm Các chỉ tiêu được đo đếm,

so sánh với đối chứng để đánh giá

+ Đột biến về thời gian sinh trưởng:

Khóm chín sớm hoặc muộn hơn đối chứng từ 10 ngày trở lên là thể đột

biến chín cực ngắn ngày hoặc chín trung, dài ngày và khóm chín tương đươngvới đối chứng gọi là thể đột biến ngắn ngày sau đó tính tần số đột biến.

+ Đột biến về hình thái:

Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá bằng phương pháp quan sát trong quần thể phát hiện ra các cá thể có xuất hiện đột biến, thu lại và tiến hành đo đếm.+ Chiều cao cây: Cây cao hơn hay thấp hơn cây cao nhất hoặc thấp nhấtcủa lô đối chứng từ >20cm là đột biến cao cây hoặc đột biến thấp cây

+ Độ cứng cây: Được đánh giá lần đầu vào lúc trỗ xong bằng cách laynhẹ các dảnh, ngược xuôi trong vài lần Lần quan sát cuối cùng tiến hành vàolúc chín nhằm ghi lại thế đứng của cây

Giai đoạn sinh trưởng 8 - 9 Thang điểm (số cây đổ): 1 Cứng ;3 Cứng trung bình; 5 Trung bình ;7 Yếu; 9 Rất yếu

+ Số nhánh đẻ nhiều nhánh: Khóm có số nhánh nhiều hơn khóm có nhiều nhánh nhất của lô đối chứng từ >5 nhánh được coi là đột biến đẻ nhánh khỏe

+ Số bông/khóm: Khóm có số bông hữu hiệu nhiều hơn khóm có nhiềubông hữu hiệu nhất của lô đối chứng từ 3 bông trở lên gọi là thể đột biến tăng

số bông hữu hiệu nhiều còn số bông hữu hiệu dưới 3 bông gọi là thể đột biếntăng số bông hữu hiệu ít

+ Số hạt/bông: Bông chính có số hạt/bông nhiều hơn bông chính có sốhạt/bông nhiều nhất của lô đối chứng từ 30 hạt trở lên được coi là đột biếntăng số hạt/bông Bông chính có số hạt/bông ít hơn bông chính có số hạt/bông

ít nhất của lô đối chứng từ 30 hạt trở lên được coi là đột biến giảm số

hạt/bông

+ Trọng lượng 1000 hạt: Cây có trọng lượng 1000 hạt lớn hơn trọnglượng 1000 hạt của đối chứng từ 4gr trở lên được coi là đột biến tăng trọnglượng 1000 hạt, Cây có trọng lượng 1000 hạt ít hơn trọng lượng 1000 hạt của

lô đối chứng từ 4gr trở lên được coi là đột biến giảm trọng lượng 1000 hạt

+ Độ thoát cổ bông: Giai đoạn sinh trưởng 7-9

Thang điểm: 1 Thoát tốt; 3 Thoát trung bình; 5 Vừa đúng cổ bông; 7 Thoát một phần; 9 Không thoát được

+ Màu vỏ lúa: Giai đoạn sinh trưởng 9

Thang điểm: 1 Trắng; 2 Hơi nâu; 3 Ánh nâu; 4 Nâu; 5 Đỏ; 6 Tím thay đổi; 7 Tím

Hương thơm: Giai đoạn sinh trưởng 9

+ Thang điểm (Vào lúc trỗ hay kiểm tra khi nấu): 0 Không thơm; 1 Hơi thơm; 2 Thơm

+ Hàm lượng amylose: Sử dụng các phương pháp chuẩn trong phòng thí nghiệm để phân tích hàm lượng amylose, lấy % làm đơn vị tính

+ Độ phân hủy trong kiềm: Đặt hạt gạo xát vào 10 ml dung dịch 1,7%KOH trong một đĩa chứa nông và sắp xếp làm sao cho các hạt không chạmnhau

Giai đoạn sinh trưởng 9 (sau khi xay xát)

Thang điểm: 1 Không ảnh hưởng như trở mầu bạc; 2 Trương lên; 3.Trương lên nhưng cổ không hoàn toàn và hẹp; 4 Trương lên và cổ cũngtrương hoàn toàn và rộng; 5 Tỏa ra hoặc bị phân đoạn, cổ trương hết và rộng;

6 Tỏa lan và hòa đồng với cổ; 7 Tiêu tan hoàn toàn

Bảng 2.8 : Các tính trạng nông sinh học và thang điểm

3 Số bông/khóm: Đếm tất cả các bông trong 1 khóm Giai đoạn sinh trưởng 8.

4 Độ cứng cây (giai đoạn sinh trưởng 89): 1 Cứng, 3 Cứng trung bình, 5 Trung bình, 7 - Yếu, 9 - Rất yếu.

-5 Độ thoát cổ bông (giai đoạn sinh trưởng 7-9): 1 - Thoát tốt, 3 - Thoát trung bình,

5 - Vừa đúng cổ bông, 7 - Thoát một phần, 9 - Không thoát được.

6 Độ rụng hạt (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Khó rụng, 5 - Trung bình,

9 - Dễ rụng.

1 Số hạt/bông.

2 Số hạt chắc/bông.

3 Trọng lượng 1000 hạt: Cân 1000 hạt 13% độ ẩm.

4 Chiều dài hạt (mm): Đo từ gốc vỏ mày lên tới mỏ hạt.

5 Chiều rộng hạt (mm): Đo ngang chỗ rộng nhất giữa hai nửa

Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

- Dụng cụ, máy móc và thiết bị thí nghiệm:

Máy nghiền mẫu, Tủ ủ nhiệt, Tủ hút khí độc, Máy li tâm, Máy lắc vortex,

Cân phân tích, Máy cất nước, Máy khuấy từ, Máy luân nhiệt PCR của hãng, Máy điện di, Máy soi gel, Micropipette, Tủ lạnh.

- Hóa chất: Một số hóa chất thông dụng của các hãng

Sigma,

Merck, CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orangeloading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acidglacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, NaOH, HCL, KOH,…

- Các chỉ thị SSR trên nhiễm sắc thể của bộ gen lúa

Bảng 2.2: Tên và vị trí các mồi trên nhiễm sắc thể

Phương pháp phân tích thành phần sinh hóa trong gạo.

Xác định hàm lượng amylose

Tiến hành theo phương pháp Cagampang DNA Rodriguez (1980) [34]

- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch

+ Ethanol 95%

+ HCl 30%

+ Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI)

- Bước 2: Chuẩn bị mẫu

+ Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml

+ Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều

+ Thêm 9,5 ml NaOH 1N Đun sôi trong 10 phút và lắc đều

+ Để qua đêm ở nhiệt độ phòng

- Bước 3: Pha loãng và đo mẫu

+ Rút 100 μl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N)

+ Thêm nước cất khoảng ½ bình, lắc đều

X: Lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml)

+ Tính hàm lượng amylose theo công thức:

X

% Amylose =

Xác định độ phân hủy kiềm

Tiến hành theo phương pháp của IRRI (1979)

+ Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử Mỗi mẫu lấy sáu hạtgạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa petri

+ Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa

+ Đậy dĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng

+ Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1986) được trình bày ở Bảng 3.2

Bảng 2.4 Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979)

CẤP

1234567

Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức:

Σxi x nCấp trở hồ =

NTrong đó: xi : cấp độ trở hồ

n : số hạt có cấp độ trở hồ xi

N : số hạt thử nghiệm

Cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.5)

Bảng 2.5 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979)

2.3.1.1 Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử

Tách chiết DNA tổng số

Mẫu lá non được thu từ cây lúa sau 30 ngày kể từ ngày cấy

Các bước tiến hành tách chiết DNA

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Cheng và cộng sự (2003) [18] Quy trình tách chiết được tiến hành với các bước như sau:

Bước 1: Nghiền 1,5 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ

Bước 2: Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 65oC)

Bước 3: Ủ mẫu đảo đều và ủ mẫu ở 65oC trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần

Bước 4: Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Bổ sung 4 mlChloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 10 phút Ly tâm 13000vòng/phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 5: Chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới(4ml) Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ởnhiệt độ - 200C trong 30 phút

Bước 6: Tủa DNA bằng máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong

10 phút Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%

Bước 7: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng Thêm 2 ml đệm TE và 15 µlRNase A (10 mg/ml) Ủ ở 37oC trong 3h

Bước 8: Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới Thêm 2 ml phenol chloroform - isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm

-10 phút ở -10000 vòng/phút

Bước 9: Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới Thêm 750 µl NaCl5M và 3ml Ete bão hòa hơi nước Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000vòng/phút

Bước 10: Loại bỏ lớp Ete bên trên Chuyển phần bên dưới vào ống mớiThêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút LấyDNA ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh

Bước 11:Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%

Bước 12: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng Thêm 800 µl đệm TE để hòatan tủa Giữ dung dịch DNA ở - 20°C

Đo độ tinh sạch của DNA

Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của DNA được đánh giábằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X

và dùng DNA nồng độ (50 ng/µl) làm thang chuẩn, trong 30 phút, điện thế100V Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộmethidium bromide Việc chụp mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy