So sánh và chọn lọc các quy trình pcr phát hiện vi khuẩn corynebacterium diptheriae gây bệnh bạch hầu​

Ưu điểm của phương pháp PCR là có thể phát hiện chính xácchủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian ngắn, độ đặc hiệu cao.. Trên cơ sở đó, đề tài “ Sosánh và chọn lọc các quy trình P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03

TP Hồ Chí Minh, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03

TP Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Khóa luận tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của THS Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy (Chuyên viên nghiên cứu phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh)

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình.

TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Như

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 22 năm qua, cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng

và ủng hộ con đường học tập của em.

Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan đã tận tâm chỉ dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy người luôn nhiệt tình giúp

đỡ em, luôn định hướng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.

Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn Gia

Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trương Khánh Duy, Lê Thị Thùy Trang, Hồ Thị Thu Trang đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất

cả các bạn trên phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá trình làm thí nghiệm.

Em xin chân thành cảm ơn !

TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Như

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

Phần I: MỞ ĐẦU

Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu .

2.1.1 Tác nhân gây bệnh .

2.1.2 Cơ chế gây bệnh .

2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới .

2.1.5 Biện pháp phòng bệnh .

2.2 Corynebacterium Diphtheriae .

2.2.1Hình thái và cấu trúc .

2.2.2Tính chất nuôi cấy .

2.2.3Đặc điểm sinh hóa .

Phần III: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu .

3.1.1Dụng cụ cần thiết .

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu .

3.2 Phương pháp nghiên cứu .

3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR 3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR 3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR 3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR PHẦN IV: KẾT QUẢ

4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR: 4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: .

4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR .

4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR .

4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR .

4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR 28

PHẦN V: KẾT LUẬN 31

Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHẦN VII: PHỤ LỤC 34

Polymerase Chain Reaction Real Time - Polymerase Chain Reaction Tris-Borate EDTA

Microlitter Micromole

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884

(bên trái) 11

Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 14

Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 15

Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới 15

Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015 16

Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dươngC.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm Xanh methylene (Nguồn: public health image library-PHLI) 18

Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public health image library-PHLI) 18

Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trường HA (bên trái) (Nguồn: public health image library-PHLI) 19

Hình 2.8: Thử nghiệm Elek 21

Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi DT1, DT2 32

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ sung MgCl2 32

Hình 4.3: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 33

Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 33

Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong Realtime PCR 34

Hình 4.9: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò trong Realtime PCR 35

Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu trong Realtime PCR 35

Hình 4.11: Kết quả khảo sát độ nhạy trong Realtime PCR 36

Hình 4.12: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu trong Realtime PCR 36

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu 19

Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype 20

Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR 25

Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR 26 Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu 26

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 28

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 28

Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 29

Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 29

Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR 30

Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng của phản ứng Realtime PCR 30

Bảng 4.1: Kết quả chạy trên 39 mẫu 37

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Bệnh bạch hầu do khuẩn C Diphtheriae gây ra Biểu hiện lâm sàng thông

thường nhất là nhiễm trùng khu trú ở niêm mạc hô hấp, với đặc điểm là màng giảxuất hiện ở nơi nhiễm trùng Một số vi trùng có thể tạo ra độc tố, do đó nếu nhiễmđộc tố, bệnh có thể diễn tiến nặng với nhiều biến chứng như viêm cơ tim, viêm dâythần kinh, viêm thận trong đó biến chứng tim gây tử vong rất cao Trong thế chiếnthứ II ở Na Uy, chỉ trong vòng 2 năm sau khi Đức xâm lược số trường hợp nhiễmbệnh tăng lên đến 50000 ca [3] Ở Việt Nam, thời kỳ chưa thực hiện tiêm vắc xinbạch hầu trong Chương trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) thì bệnh bạch hầuthường xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độdân cư cao Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ởViệt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm

2000 Nhưng đến năm 2015 ở tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát hiện 2 ca

dương tính với vi khuẩn C.diphtheriae Năm 2016 trong vụ dịch Bình Phước phát

hiện 5 ca trong đó có 1 ca tiếp xúc dương tính với khuẩn [15]

Phương pháp nuôi cấy đang là “ Tiêu chuẩn vàng” trong phòng thí nghiệm tuynhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian do không phải lúc nào các sinh vật sốngcũng còn trong mẫu bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu Để phânbiệt các chủng bạch hầu sinh độc tố và không sinh độc tố bằng các phương pháp nuôi

cấy truyền thống là rất khó, vì C.diphtheriae và C.ulcerans giống nhau đến 95% axit

amin và nucleotic Thử nghiệm Elek cũng là một trong những phương pháp phát hiệnđược độc tố bạch hầu Nhưng vì tình hình bệnh ngày càng ít đi và các sinh hóa phẩmdùng cho thử nghiệm này chỉ sử dụng riêng biệt mà lại không tận dụng được nhiều nênthử nghiệm này hiện nay ít được dùng đến hơn [13] Sự phát triển của sinh học phân tử

- phương pháp PCR giúp ích rất nhiều trong việc nghiên cứu, chữa trị cũng như kiểmsoát bệnh bạch hầu Ưu điểm của phương pháp PCR là có thể phát hiện chính xácchủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian ngắn, độ đặc hiệu cao Để đáp ứngnhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán và chữa trị, Real time – PCR ra đời rút ngắn hơnnữa thời gian xét nghiệm bệnh do chỉ thực

hiện một phản ứng cho ra kết quả chính xác vi khuẩn gây bệnh và loại bỏ đượcbước điện di sản phẩm của PCR chuẩn Realtime-PCR sử dụng mẫu dò giúp đọcđược kết quả chính xác ngay sau khi phản ứng kết thúc Trên cơ sở đó, đề tài “ So

sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn C.diphtheriae gây bệnh bạch

hầu ” được thực hiện nhằm khảo sát chọn lọc ra phương pháp PCR phù hợp vớiđiều kiện nghiên cứu của phòng xét nghiệm Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễndịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu

Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái)

2.1.1 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh C diphtheriae, được Klebs tìm thấy và Loeffler phân lập

C diphtheriae là trực khuẩn bắt màu Gram dương, không có vỏ, không có lông và

không có nha bào, đường kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, có những hạt nhiễm sắc khi nhuộm bằng phương pháp đặt biệt như Albert hoặc Neisser.Vi khuẩn dễ dàng mọc trên huyết thanh đông, mọc thành những khuẩn lạc sau 12-

18giờ, vượt nhanh sự phát triển của các loại vi khuẩn kèm theo Dựa trên hìnhthái học của cụm vi trùng trên thạch tellurite, dựa vào phản ứng lên men và khảnăng tán huyết, vi khuẩn Bạch hầu được chia làm 4 biotype: mitis, intermedius, gravis và belfanti [1]

Sức đề kháng của vi khuẩn ở ngoài cơ thể rất lớn Trên các đồ vật, trực khuẩnbạch hầu sống vài ngày, trong những điều kiện thuận lợi (được chất nhày tronghọng bảo vệ) vi khuẩn sống được vài tuần Trên đồ vải vi khuẩn sống được 40-

50 ngày,trên cát sống được đến 100 ngày, trên các đồ chơi bằng gỗ chúng sốngđược 3 tháng, trên quản bút mà học sinh ngậm vào miệng đã phát hiện thấy trựckhuẩn bạch hầu sau 15 ngày [1]

Tác nhân gây bệnh bạch hầu rất nhạy cảm với bất kì yếu tố hóa lý nào, ánhsáng mặt trời giết chúng sau vài giờ, ánh sáng khuếch tán giết trong vài ngày Ởnhiệt độ 60oC chúng chết sau 10 phút, dưới tác dụng của dung dịch clorua thủyngân 1% hoặc phenol 5% chúng chết sau 1 phút [1]

2.1.2 Cơ chế gây bệnh

Người là nguồn bệnh duy nhất của vi khuẩn Bạch hầu Bệnh lây lan chủ yếuqua tiếp xúc thân mật giữa bệnh nhân hoặc người mang vi trùng qua các chấttiết đường hô hấp hoặc qua các chất dịch ở sang thương ngoài da có chứa vitrùng gây bệnh, và trong rất ít trường hợp bệnh có thể lây qua đồ chơi của trẻ

Độc tố ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, gây ảnh hưởng lêntất cả toàn tế bào cơ thể nhưng tác động chủ yếu trên cơ tim, trên thần kinh vàtrên thận Liều độc tố nhỏ hơn 0.1mg/kg có thể gây chết với các động vật nhạycảm [5].

2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới

Theo một số tác giả Mỹ (Youmans và cộng sự 1975) bệnh thường xảy ra ởphía nam Hoa Kỳ, tại đây số đông người dân sống trong điều kiện thiếu vệ sinh

và cơ sở vật chất Môi trường sống không đủ vệ sinh tạo điều kiện thuận lợi chocác bệnh về hô hấp phát triển, người dân đa phần không được dùng vắc xin.Bệnh cũng thường xảy ra ở nơi có khí hậu ẩm ướt dễ dàng cho sự phát triểnbạch hầu da [3]

Thời kỳ tiền vắc xin, bạch hầu là một căn bệnh giết người hàng đầu trênthế giới Trong những năm 1940-1950, việc áp dụng phổ cập tiêm chủng cho trẻ

em ở trẻ sơ sinh đã được loại bỏ hầu hết các bệnh bạch hầu ở đa số các nướccông nghiệp hóa Ở các nước đang phát triển, mức tiêm chủng cao của trẻ sơsinh với ba liều vắc xin bệnh đậu mùa - bạch hầu (DTP) đã đạt được sau khithực hiện Chương trình Mở rộng Chương trình Tiêm chủng Tổ chức Y tế Thếgiới (WHO) vào những năm 1970 [12]

Tại Belarus, Estonia, Latvia, Lithuania, Nga và Ukraine, tỷ lệ mắc bệnhbạch hầu ở người nhỏ hơn 15 tuổi dao động từ 64% đến 82% Người lớn 40-49tuổi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong rất cao, ở một số quốc gia, nhóm tuổi nàychiếm gần một nửa số người chết Trẻ em và thanh thiếu niên ở độ tuổi đi họccũng có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở Liên bang Nga Tuy nhiên, nhữngnhóm tuổi này có tỉ lệ tử vong thấp, số bệnh nhân tử vong xảy ra chủ yếu ở trẻ

em không được tiêm vắc xin đầy đủ Tại Moldova, các nước thuộc khu vựcCaucasus (Armenia, Azerbaijan và Georgia), Trung Á (Kyrgyzstan, Tajikistan,Turkmenistan và Uzbekistan) và Kazakhstan, tỷ lệ người lớn bị bệnh dao động

từ 38% đến 59% [12]

Năm 1990, dịch bệnh bạch hầu đã tái hiện ở Liên Bang Nga, phần lớn là ởngười lớn Trong giai đoạn 1991-1993, đại dịch lan rộng nhanh chóng, vào cuốinăm 1994, do sự bất cập trong các biện pháp y tế cộng đồng, tất cả các Quốc giaMới độc lập (NIS) và các quốc gia Baltic của Liên bang Cộng hòa Xã hội Chủnghĩa Liên Xô (Liên Xô cũ) đều xảy ra dịch Dịch bệnh đạt đỉnh điểm vào năm1994-1995, với tỷ lệ hàng năm là 17 ca / 100.000 dân và tỷ lệ mắc bệnh caonhất là 73 ca / 100.000 dân ở Tajikistan năm 1995 Từ năm 1990 đến năm 1998,1157.000 trường hợp và 5000 trường hợp tử vong được công bố ở các quốc giathuộc Liên Xô cũ, chiếm 180% số ca tử vong do bệnh bạch hầu ở người Baphần tư các trường hợp được công bố từ Liên bang Nga Đây là vụ dịch bệnhbạch hầu lớn nhất kể từ những năm 1950, bắt đầu thời kỳ tiêm chủng bạch hầu

mở rộng [12]

Từ năm 1980 đến năm 2011 ở Mỹ đã xảy ra 55 ca Năm 1990 dịch xảy ra ởLiên xô cũ gây tổn thất nghiêm trọng về người Năm 1994 bệnh xảy ra ở 15quốc gia độc lập từ Liên Xô có 157.000 ca mắc và hơn 5,000 ca tử vong,nguyên nhân dẫn đến hậu quả này là do điều kiện sống của người dân khôngđược bảo đảm, vắc xin chưa được phổ cập rộng rãi [12]

Diphtheria - United States 1940-1980

Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980

Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010

(http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/dip.html)

.

Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới

2.1.4 Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam

Trước khi có chương trình tiêm chủng, bệnh bạch hầu là bệnh của trẻ em,thỉnh thoảng gây dịch lẻ tẻ, do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệmắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống0,14/100.000 dân năm 2000 [15]

Đến năm 2015 bạch hầu lại xuất hiện ở Quảng Nam trong đó phát hiện hai

ca dương tính với khuẩn C.diphtheriae Năm 2016 dịch xảy ra ở Bình Phước 5

ca được xác định, 1 ca tiếp xúc dương tính với khuẩn C.diphtheriae.

Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015

2.1.5 Biện pháp phòng bệnh

Đối với người nhiễm bệnh:

Bệnh xảy ra chủ yếu của trẻ nhỏ Lứa tuổi càng tăng sự nhạy cảm vớibệnh càng giảm Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nếu thiếu miễn dịch bạchhầu [3] Nguy hiểm nhất là bệnh đe dọa các trẻ em nhỏ tuổi (từ 1 đến - 4tuổi) Nhất thiết phải cách ly ở bệnh viện, ở cách li riêng biệt, khi xác địnhchuẩn đoán bằng xét nghiệm, nhân viên phải đeo khẩu trang, trang bị bảo hộ

an toàn Nếu điều trị sớm và đúng cách thì tỉ lệ tử vong rất thấp Phải dùng

huyết thanh chống bạch hầu ngay từ ngày đầu tiên của bệnh (trước ngày thứ6).

Những người mang vi khuẩn không sinh độc tố có thể trở lại tập thể

và sinh hoạt như bình thường Bắt buộc phải khử trùng trong thời kì phátbệnh và thời kì khỏi bệnh, năng rửa cổ họng cho người bệnh Trước đây,người ta dùng nhiều loại thuốc (huyết thanh khô giải độc tố, trypallavis,sulfamide) nhưng không mang lại kết quả tốt, trẻ em vẫn mang vi khuẩnhàng tháng Hiện nay người ta dùng penicillin hoặc tyrotricin cho kết quả tốthơn Chất tyrotrixin không tan trong nước, cho nên thường dùng với nước,trong glycerine hoặc trộn tyrotrixin bột với natri bitmutbazic [6] Phải khửtrùng buồng và đồ vật bằng cloramin 0.5% trong 1 giờ, khử trùng bát đũabằng cloramin 1% và đồ vải bằng cloramin 5% trong một giờ rưỡi.( Ramon,1944)

Đối với người tiếp xúc với ca bị nhiễm bệnh:

Tất cả những người tiếp xúc với người bệnh đều phải xét nghiệm 2lần cách nhau 2 ngày, lấy bệnh phẩm trước khi dùng thuốc súc miệng Nếuxét nghiệm có kết quả dương tính (có trực khuẩn bạch hầu sinh độc tố) thìphải theo dõi ít nhất là 7 ngày kể từ khi đưa người vào bệnh viện [6]

Tiêm ngừa phòng bệnh

Phải tiêm chủng đúng độ tuổi quy định và tiêm mũi nhắc lại cho trẻ

em Ngày nay người ta tiêm giải độc tố bạch hầu hoặc vắc xin phối hợp bạchhầu – ho gà hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – thương hàn, hay làvắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – ho gà Trong chương trình tiêmchủng mở rộng, chúng ta sử dụng vắc xin tam liên DPT có kết quả rất tốt,đến năm 2000 tỷ lệ mắc chỉ còn 0.14/100000 dân

C.diphtheriae là trực khuẩn Gram dương, đường kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ

1-8µm, mảnh , cong hoặc hình chùy, không di động, không sinh bào tử, không

có vỏ, không có nha bào

Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dương C.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm

Xanh methylene (Nguồn: public health image library-PHLI)

Nhuộm Gram C.diphtheriae có hình trực khuẩn bắt màu Gram dương, hình

hơi cong, có một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay như hình hàng rào.Khi nhuộm Albert vi khuẩn có hình dài, thân bắt màu xanh nhạt, có 2-3 hạt màu

10

Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert

(Nguồn: public health image library-PHLI)

2.2.2Tính chất nuôi cấy

Trực khuẩn Bạch hầu ưa các môi trường có máu, huyết thanh đông vàpepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ môi trường là 370C vìvậy các môi trường nuôi cấy và phân lập phải có đủ các điều kiện trên Trên môitrường thạch máu thường, khuẩn lạc mọc sau sau 24h, nhỏ, màu trắng, có thể

quan sát được tan huyết Môi trường chọn lọc cho C.diphtheriae là môi trường

thạch máu có tellurite ở 35-370C/24-48 giờ Khuẩn lạc nhỏ li ti, bắt màu xám đen

C.diphtheriae mọc sau 12-18 giờ trên môi trường huyết thanh đông Loffle, ở điều

kiện 370C (một số vi khuẩn khác mọc chậm hơn) Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục,đường kính 1-2 mm, dễ tan trong nước muối đẳng trương

Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạctrên môi trường HA (bên trái) (Nguồn: public health image library-PHLI)

2.2.3Đặc điểm sinh hóa

Cần phân biệt bạch hầu với giả bạch hầu, dựa vào sự lên men hai loại đường glucose và sacarose, khả năng làm tan hồng cầu cừu [5]

Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu

Chủng vi khuẩn

C.diptheriae C.hoffmanni C.cutis

Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype

C.diphtheriae

GravisIntermediusMitis

2.2.4 Độc tố vi khuẩn

C.diphtheriae chủ yếu sinh ngoại độc tố, gồm có 2 phần: A là độc tố,

Blà phần gắn vào các thụ cảm trên tế bào Sau khi B bám vào tế bào, quá

trình phân giải protein xẩy ra giúp cho phần A xâm nhập vào tế bào, tại đó

ức chế quá trình tổng hợp chuỗi acid amin của protein

Độc tố bạch hầu ức chế sự tổng hợp protein ở tất cả các tế bào có nhânđiển hình bằng việc gắn ADP vào yếu tố kéo dài 2 (EF-2) làm cho các

ribosom sẽ dịch xuống bộ ba tiếp theo để đọc mã trên RNA thông tin

Độc tố này được mã hóa bởi phage ly giải, phage này tích hợp vàotrong DNA của vi khuẩn Độc tố là một protein [6]

Các chủng vi khuẩn đều sinh độc tố (ngoại độc tố), có trọng lượngphân tử 62kDa Việc sản sinh độc tố phụ thuộc vào sự có mặt của thực khuẩn

thể gây ly giải mang gen mã hóa độc tố (tox +) Nó tác động lên tế bào vật

chủ giải phóng gen độc tố và sản sinh độc tố Sự sản sinh độc tố tăng khi cơ

thể vật chủ thiếu yếu tố sắt

Chủng vi khuẩn không có thể thực khuẩn sẽ không sản sinh độc tố dovậy không có khả năng gây bệnh Chúng có thể trở thành chủng có độc tố khi

bị nhiễm trùng với thể thực khuẩn có độc tố ly giải

Xác định độc tố vi khuẩn bằng cách tiêm truyền chuột lang, làm phảnứng trung hòa hoặc làm phản ứng Elek [5] Thử nghiệm này dựa trên sựkhuếch tán kép của độc tố bạch hầu và kháng độc tố trong môi trường thạch.Giấy lọc vô trùng ngâm tẩm chất kháng độc tố bạch hầu được đặc trong môitrường nuôi cấy Cấy các chủng nghi bạch hầu theo đường thẳng vuông góc

90 ° với dải kháng độc Toxigenic C.diphtheriae được phát hiện bởi vì độc tố

tiết ra từ khu vực tăng trưởng, phản ứng với chất chống độc để tạo thành cácdòng precipitin

Hình 2.8: Thử nghiệm Elek

Vi khuẩn nhạy cảm với penicillin nhưng độc tố gây ra các triệu chứnglâm sàng không bị bất hoặt bởi kháng sinh Điều trị và phòng bệnh đều phụthuộc vào việc trung hòa độc tố Nếu trên lâm sàng có triệu chứng của bạchhầu, cần dùng kháng độc tố Bạch hầu là bệnh cấp tính, đòi hỏi xử lý sớm vànhanh kể trước khi có xét nghiệm [6]

2.3 Phương pháp PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu phát hiện bệnh bạch hầu

Phát hiện bệnh bạch hầu phụ thuộc vào việc nuôi cấy C.diphtheriae và

thực hiện thử nghiệm Elek để xác định độc tính là chủ yếu Tuy nhiên, do quátrình bảo quản và vận chuyển số lượng vi khuẩn còn sống không phải lúc nàocũng có trong mẫu bệnh phẩm hoặc thường nằm dưới mức giới hạn phát hiện

Do đó các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phát hiện ra gen độc tố bạch hầu đang làphương pháp phổ biến nhất trong việc chẩn đoán phân tử bệnh bạch hầu [8]

PCR chuẩn phát hiện được C.diphtheriae dù tỉ lệ còn sống của vi khuẩn trong

bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển là rất ít Các nghiên cứu trước đó khôngđánh giá độ nhạy của PCR, một thời gian sau đó họ mới bắt đầu đánh giá độnhạy của phương pháp này sau khi vận chuyển và lưu trữ các mẫu lâm sàngtrong silica gel một thời gian dài (7-14 tháng) Ở Indonesia một nghiên cứu chothấy rằng khi bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm trong túi silica gel, 11trong số 17 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng đã được chẩn đoán bằng bạch

hầu cổ họng dương tính với C.diphtheriae sau khi chúng được bảo quản ở nhiệt

độ phòng trong 2 tuần [10] Tỉ lệ tử vong do nhiễm trùng gây ra chủ yếu là dođộc tố bạch hầu, vì vậy người dùng cặp mồi

DT1 Fw CGGGGATGGTGCTTCGCG-3’, DT2 Rev CGCGATTGGAAGCGGGGT-3’ trong phản ứng PCR để phát hiện gen độc

5’-tố Nhưng độc tố bạch hầu ở C.ulcerans và C.diphtheriae giống nhau đến

95% ở nucleotide và acid amin nên PCR chuẩn phải lặp lại đến 2 lần để phânbiệt được 2 chủng vi khuẩn này [14]

So sánh giới hạn phát hiện giữa Realtime PCR và các xét nghiệm PCRthường, các thử nghiệm Realtime PCR phát hiện được các nồng độ DNA thấphơn so với các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn Với sự xuất hiện của công nghệkhuếch đại gen dò huỳnh quang mới, phương pháp này đã có thể cải thiện đáng

kể hơn phương pháp PCR chuẩn Mười lăm DNA chiết xuất từ các mẫu bệnhphẩm được thu thập từ năm 1997 đến năm 1998, được lưu trữ