đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha grushv )

Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS -sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng....

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

o0o NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

o0o NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Nguyễn Thị Phương Trang

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại phòng Hệ thống học phân tử và Di truyềnbảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tận tình của

TS Nguyễn Thị Phương Trang Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới sựhướng dẫn của cô

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tác giả

đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình về nhiều mặt của Ban lãnhđạo Viện ST & TNSV,cán bộ phụ trách đào tạo của Viện, của TS Đặng TấtThế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn

Chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS NguyễnGiang Sơn, TS Hồ Thị Loan, TS Phạm Thế Cường, ThS Lê Thị Mai Linh đãluôn nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo những bước đi ban đầu trong lĩnhvực nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tác giả cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới nhữngngười thân trong gia đình đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ trong suốtquá trình hoàn thành luận văn

Luận văn được hoàn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tác songphương của Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS Nguyễn ThịPhương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16

Tác giả xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu thuthập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất

kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào Những thông tin tham khảo trong khóaluận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng

Học viên thực hiện

( Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thị Hồng Mai

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) 3

1.2 Tổng quan về sâm ngọc linh 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái 3

1.2.2 Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh 5

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh 5

1.2.4 Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh 7

1.2.5 Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam 9

1.3 Phương pháp luận và cách tiếp cận 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 16

2.3.2 Lựa chọn mồi SSR 17

2.3.3 Phân tích số liệu SSR 18

2.3.4 Thiết kế mồi đọc trình tự 19

2.3.5 PCR khuếch đại gen 20

2.3.6 Điện di trên gel agarose 21

2.3.7 Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST 21

2.3.8 Đọc trình tự gen 21

2.3.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 23

3.2 Lựa chọn mồi SSR 23

3.3 Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh 25

3.4 Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu 30

3.5 Kết quả phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử của các vùng gen rbcL, rpoB, ITS và 18S của loài sâm ngọc linh 32

3.6 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS -sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng 47

3.7 Kết quả so sánh khả năng phân loại sâm ngọc linh đối với các loài chi Panax khác của ba vùng gen nghiên cứu 50

3.8 Kết quả đăng ký mã số các vùng gen nghiên cứu trên ngân hàng gen 55

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN CỦA TÁC GIẢ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

AFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified

Fragment Length Polymorphism)

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CBOL Consortium for the Barcode of Life

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

ME Phương pháp Minimum Evolution Method

MP Phương pháp Maximum Parasimony Method

NJ Phương pháp Neighbor Joining

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)RAPD Đa hình các đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên (Random

Amplified Polymorphic DNA)RFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment

Length Polymorphism)SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)

UPGMA Unweighted Pair Group Method Analysis

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền 17

Bảng 2.2 Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen 20

Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu 22Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phân

tích 4 chỉ thị SSR 26Bảng 3.2 Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa vàrbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax 37

Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía trên

bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 44

Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền gen rpoB giữa loài sâm ngọc linh ( phía trên

bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 44Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa loài sâm ngọc linh 45(phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh

với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 45Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền mồi 18S giữa loài sâm ngọc linh (phía trênbên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1% 22Hình 3.2 Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4 23mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481

Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di 30trên gel agarose 1%

Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di 30trên gel agarose 1%

Hình 3.5 Ví dụ về hình ảnh các peak trong giải trình tự 31

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các loài 35

Panax trên ngân hàng gen.

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các loài 36

Panax trên ngân hàng gen.

Hình 3.8 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các loài 39

Panax trên ngân hàng gen

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài 41

Panax trên ngân hàng gen

Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc 48

linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng

gen ITS và rbcL

Hình 3.12 Kết quả so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa trên so 53

sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng.

Hình 3.13 Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài thuộc chi 54

Panax phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS.

MỞ ĐẦU

Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được xác định

là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen, đượcxếp vào một trong bốn cây sâm quý nhất trên thế giới do có chứa nhiềuthành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khoáng vi lượng hơnhẳn những loài sâm khác Tuy nhiên, việc khai thác quá mức và phá hủyvùng phân bố tự nhiên đã dẫn đến sự tuyệt chủng ngoài tự nhiên của sâmngọc linh Hiện loài này chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảotồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum Sâm ngọc linh đã được đưa vào sách

đỏ Việt Nam, danh lục của IUCN và Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chínhphủ Ngành Y tế đã hướng chọn sâm ngọc linh làm cây thuốc xây dựng sảnphẩm quốc gia về dược liệu Ngày 18/7/2012, chính phủ đã có Quyết định

số 936/QĐ-TT phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển kinh tế - xã hộivùng Tây Nguyên đến năm 2020, trong đó phát triển cây sâm ngọc linh trởthành cây đặc sản quốc gia Những nghiên cứu về di truyền quần thể giúpcác nhà khoa học và các nhà chiến lược có cái nhìn tổng thể về thực trạng

di truyền của các quần thể sâm ngọc linh, từ đó có những chiến lược hợp lýtrong việc bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của ViệtNam Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử còn giúp xác định được những sai

khác về mặt di truyền của loài sâm ngọc linh so với các loài Panax khác,

làm cơ sở cho việc phân loại và giám định các mẫu sâm ngọc linh

Xuất phát từ tình hình thực tế này, luận văn tập trung nghiên cứu đặcđiểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và KonTum, đồng thời kiểm tra sự sai khác di truyền của bốn vùng gen gồm hai

vùng gen nhân: 18S, ITS và hai vùng gen lục lạp: rbcL và rpoB của mẫu sâm ngọc linh, so sánh với một số loài Panax khác.

khác trên cơ sở giải mã trình tự vùng gen rbcL, rpoB, 18S và ITS, đặc điểm

phân tử của các vùng gen này, đồng thời so sánh khả năng phân loại củabốn vùng gen nói trên trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh với một số

loài Panax khác.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhậtthông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam

và Kon Tum

Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn vàchọn giống có những chiến lược hợp lý trong công tác bảo tồn và phát triểnbền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam

Kết quả của luận văn góp phần chọn lọc được vùng gen hữu hiệu (chỉthị phân tử) cho công tác nghiên cứu khoa học và phân loại loài sâm ngọclinh của Việt Nam

Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn mồi SSR phù hợp với loài sâm ngọc linh của Việt Nam

- Đánh giá đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum bằng kỹ thuật SSR

- Kiểm tra đặc điểm phân tử của bốn vùng gen rpoB, ITS, rbcL và

18S, so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen này trong việc phân biệt loàisâm ngọc linh của Việt Nam; đăng ký số hiệu genbank

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.)

Chi sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn

bộ chi sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var.) [21] Sự phân bố của chi Panax L trên thế giới cho thấy chúng chỉ

xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của

Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài Panax quinquefolius và Panax trifoliatus) Vùng Đông Bắc Á có 2 loài Panax ginseng và Panax japonica Trung tâm phân bố của chi Panax L có thể từ

vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam Thựcchất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) vàLào Cai (Việt Nam) Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn

toàn tự nhiên Hai loài nhập trồng là Panax notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và Panax pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có

nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài

gần gũi nào đó) Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi sâm (Panax L.) của thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (Panax notoginseng; Panax quinquefolius và Panax trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) ở miền Trung của Việt

Nam, tại 14°15’ vĩ độ Bắc Chính vì vậy sâm ngọc linh được coi là loài đặchữu hẹp của miền Trung Việt Nam [12]

1.2 Tổng quan về sâm ngọc linh

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)[36] là cây thân thảo,

sống nhiều năm Thân rễ có đường kính 3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ,đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến5cm Thân cao từ 40 cm – 60 cm, rỗng, lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5,6) Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7 – 12 cm (ít khi 15 cm) Lá

chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 – 14 cm, rộng 3– 5 cm, đầu lá thường nhọn, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép

lá có răng cưa nhỏ đều [12], [14], [25] (Hình 1.1)

Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh

(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)

Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp vớinhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°C, ban đêm 15 - 18°C, sâm ngọc linh có thểsống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm [25]

Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài racũng có thể dùng lá và rễ con [25]

Sinh học: Vào đầu tháng giêng hàng năm, cây sâm xuất hiện chồi mới saumùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành, từ tháng

4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả, tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dàiđến tháng 9 Khi quả chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang vàng lục rồi đỏcam với chấm đen lớn chiếm 1/4 đến 1/5 xuất hiện ở đỉnh quả (Hình 1.2)

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín

(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac - ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)

Vào khoảng cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lạimột vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12 Ngaytrong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đất hìnhthành một chồi thân mới Các chồi này tồn tại dưới dạng chồi ngủ trong suốt3-4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa xuân năm sau để tiếp tục một chutrình sinh trưởng phát triển mới Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mà người ta

có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi Phải ít nhất từ 3 năm tuổi tức trên củ

có một sẹo mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi [2], [12] Mùađông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm

1.2.2 Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh

Cho đến nay, sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên trungphần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có và quan trọng nhất là núiNgọc Linh Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xãMường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã TràCang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam) [12] Câysâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm

1970 cũng là sâm ngọc linh Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của

nó thì sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằngthuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang) Cả 2 khối núi nàyđều có độ cao trên 1.500 m Điểm phát hiện có sâm ngọc linh mọc tự nhiênđều vào khoảng 1.800 - 2.200 m [5], [25], [21]

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh

1.2.3.1 Tầm quan trọng và giá trị của sâm ngọc linh

Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài

của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm

vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như nhân

sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất (Panax

notoginseng) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) [6], [3], [9],

[21] Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống

Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở QuảngNam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thầndược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốmnặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máuvết thương,… [2], [3], [6], [11], [21] Theo quan điểm hóa phân loại vàdược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế

giới đã chia các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính:

Nhóm 1: gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: nhân sâm

(Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax

notoginseng),… có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển

và chứa các Saponin có khung thuộc nhóm dammaran

Nhóm 2: gồm các loài mọc hoang như Panax japonicas, Panax zingiberensis, Panax stipuleanatus,… với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển

theo hướng nằm ngang, chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [3]

Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặcbiệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm ngọc linh có

52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấutrúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố Khi so sánh với nhóm sâm

trồng (nhóm 1) có giá trị trên thế giới như nhân sâm (Panax ginseng), sâm

mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… thì thành phần

saponin của sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượnglại cao hơn nhiều [3], [11]

1.2.3.2 Thành phần hóa học của sâm ngọc linh

Từ năm 1974 – 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu nhân

sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium) Kết quả là bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng [13] Chi tiết hơn nữa, trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane

(7.58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏsaponin của axit oleanolic[13] Điều này trái với quy luật chung là thôngthường các cây nhân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponincủa axit oleanolic và saponin nhóm damarane [8], [11] Cũng là lần đầu tiêntrên thế giới, người ta chiết được một lượng lớn majonozit R2 và ocotillol

saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4.34%)

gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao nhất có trong các

loài chi Panax [16] Ocotillol saponin đã trở thành một hợp chất cần chú ý có

thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học vì nó có thể ảnh hưởng đến một

số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis Sự có mặt của

damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho sâm ngọc linh khác vớinhân sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong nhânsâm Triều Tiên Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân sâm củaViệt Nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so với nhânsâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26%trong nhân sâm triều tiên [9] Ngoài những saponin nói trên, trong nhân sâmcủa Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu

1.2.4 Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh

Ở Việt Nam, cho đến nay, các công trình khoa học nghiên cứu về sâmngọc linh khá đa dạng, ngoài những nghiên cúu cơ bản tập trung vào điều tra,phân loại, xác định vùng phân bố thì cũng đã có nhiều nghiên cứu về

thành phần hoá học, thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan, giải mã hệ gen lục lạp…có thể liệt kê một số các công trình đáng chú ý như sau:

- Trần Lê Quân và cs (2002): tách chiết, majonoside R2, Triterpen

Saponin từ cây sâm việt nam (Panax vietnamensis) và thử nghiệm hoạt tính bảo

vệ gan Nghiên cứu cho thấy cao chiết MeOH của củ sâm việt nam có hoạt tínhbảo vệ gan in vitro trên mô hình gây độc cho tế bào gan bằng D-galactosamine(D-GaLN)/yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-anpha) Nguyễn Thị Thu Hương

và cs (1999): nghiên cứu về tác dụng dược lý của sâm việt nam, trong đó tậptrung vào tác dụng kích thích miễn dịch chống căng thẳng, trầm cảm [48], [5],[11], [18]

- Nguyễn Thới Nhâm và cs (1993) Nghiên cứu về dược liệu học và hoá học cây sâm Việt Nam [16]

- Loạt công trình của PGS.TS Dương Tấn Nhựt (2010, 2011, 2014,2015) về nhân giống vô tính Sâm ngọc linh [13], [14]

- Cụm công trình của Viện Dược Liệu trong khuôn khổ chương trìnhbảo tồn nguồn gen đã khoanh vùng được khu vực phân bố, đặc điểm sinh thái,hình thái, lập bản đồ quy hoạch vùng trồng sâm (các tác giả, Lê Minh Thảo [8],[18],…)

- Phan Kế Long và cs (2014) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh giá sựsai khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh và mẫu sâm thu được tại Phong ThổLai Châu, cũng dựa trên trình tự gen matK và ITS, mẫu sâm thu tại Lai Châu đã

được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis var fuscidiscus, là một thứ của loài Panax vietnamensis [9, 40].

- Nguyễn Thị Phương Trang và cs (2011) đã sử dụng vùng gen ITS đểđánh gía mối quan hệ di truyền của loài sâm việt nam, sâm lai châu với các

loài khác trong chi Panax [22] Hay nhóm nghiên cứu của Đặng Tất Thế,

Nguyễn Thị Phương Trang (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật) thực hiệnmột số hợp tác nghiên cứu với nhóm nghiên cứu của Viện sỹ Yuri Zhuralev và

TS Galina D Reunova (Viện Sinh học thỗ nhưỡng Viễn Đông,

Viện Hàn Lân khoa học Liên Bang Nga) về phân bố và di truyền của loài sâm việt nam và sâm nga bằng kỹ thuật AFLP và SSR [34, 35].

- Trong đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền chi sâm, nhóm nghiêncứu của Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu, và cs (2016) đã thực hiện “Đánh giá di

truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) bằng chỉ thị ISSR.

Nhóm nghiên cứu của GS Nông văn Hải (2017) (Viện nghiên cứu hệ gen-ViệnHàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu về giải mã hệ gen lục lạpsâm ngọc linh Nhóm nghiên cứu của TS Lê Hùng Lĩnh

(2017)-(Viện Di truyền Nông nghiệp) thực hiện nghiên cứu nuôi cấy mô và

xác định gen lục lạp đặc hiệu của một số loài trong chi Panax

1.2.5 Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam

Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là tam thất (Panax notogineng) và nhân sâm (Panax ginseng) [5] Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là sâm

vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc biệt sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) là

loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện

Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), huyện Nam Trà My, huyệnPhước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên 1500 m.Tuy nhiên, hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên do tình trạngkhai thác cạn kiệt trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diệntích rừng tự nhiên bị thu hẹp Hiện, sâm ngọc linh đã được đưa vào danh lục

đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vìmục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006 về quản lýthực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo Sách đỏ Việt Nam(2007), sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI + 2b, c, e [1] Sâmngọc linh chủ yếu tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri,huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã TràLinh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng

khoảng 10 hecta [6] Tuy nhiên, với quyết định số 936/QĐ-TT ngày18/7/2012 của thủ tướng chính phủ thì kế hoạch đến năm 2020, diện tíchtrồng sâm ngọc linh sẽ được tăng lên đến khoảng 200ha.

1.3 Phương pháp luận và cách tiếp cận

Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụngrộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyềnquần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA, đặcbiệt đối với lĩnh vực phân loại học và di truyền phân tử Việc sử dụng các chỉthị DNA để định danh loài đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tậptrung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp, phát hiện đáng kể [10], [17], [22],[24], [27], [30], [40], [41], [42], [53] Xác định loài bằng chỉ thị DNA có độchính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi mà những quan sáthình thái, sinh trưởng, phát triển chưa đủ cơ sở để phân biệt Vì thế chỉ trongvài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) của thế giới đã lưu giữ trên 70triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotide Đây là nguồn dữ liệu có giá trịtrong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là: (1) sốliệu về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảotồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) sốliệu trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốtnhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (populationgenetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể,giữa các cá thể, giữa các cha mẹ và con cái ; (3) kết quả phân tích DNA chophép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vậtkhông còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài,các quần thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởngvào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra [10]

Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực

vật và vi sinh vật [37] Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam Sâm ngọc linh là loài dược liệu quý có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch

và ngăn ngừa ung thư… Đến nay quần thể sâm ngọc linh tự nhiên bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới có nguy cơ cạn kiệt do nhu cầu sử dụng loại dược liệu này ngày càng cao Công tác bảo tồn và phát triển bền vững loại dược liệu này

ở Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách Vì vậy, nghiên cứu đánh giá tính

đa dạng di truyền, làm cơ sở cho công tác bảo tồn nguồn gen cho loài sâm ngọclinh cần được tập trung thực hiện Bên cạnh đó, việc phát triển bộ mã vạch phân

tử cũng cần được nghiên cứu để giúp góp phần phân loại/giám định chính xácsâm ngọc linh và các loài sâm khác thuộc chi nhân Sâm

1.3.1 Phương pháp phân loại học phân tử

1.3.1.1 Ưu điểm của việc ứng dụng nghiên cứu phân tử trong phân loại học

Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất hiện nay trong việc xácđịnh mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự DNA, bởi vật liệu ditruyền là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bịảnh hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản

và chế biến DNA chiết từ bất cứ bộ phận nào đều mang cùng thông tin ditruyền DNA chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20°C trong thời gian dài(khoảng 3-5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích, đặcbiệt chỉ cần sử dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả [8], [12], [26]

1.3.1.2 Sử dụng hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật

Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae),chúng có chứa DNA riêng DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi tếbào Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyl) và là nơi thực hiện quá trìnhquang hợp của cây Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thựcvật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế

hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại

học phân tử đánh giá chúng là sự tích lũy của các đột biến theo thời gian, dovậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hóa giữa các loài Hệ gen lục lạp (cpDNA)thực chất là một phân tử DNA dạng vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặplại Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hóa cho các proteincần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein này.Vùng DNA không mã hóa trên hệ gen lục lạp là rất ít.

Hệ gen lục lạp có kích thước từ 120 kb – 220kb, kích thước này thay đổi

do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau, tách hệ gen lục lạp thành

2 vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC) Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đềumang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNAnhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấphơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng 3 lần so vớiDNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phânloại [45] Các nghiên cứu cấu trúc phân tử hệ gen lục lạp ở hầu hết các loàithực vật bậc cao cho thấy tỷ lệ thay thế trong hệ gen lục lạp thấp hơn rất nhiều

so với hệ gen nhân và chúng cũng có mức tái tổ hợp rất thấp, di truyền theomột dòng [54] Một số vùng gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên

cứu hệ thống học phân tử thực vật hiện nay bao gồm: matK, rbcL, psbA – trnH, rpoB,… tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi

không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận [29]

1.3.1.3 DNA barcoding và ứng dụng của nó

DNA barcoding là đoạn DNA ngắn (thường từ 200-500 bp) đặc trưng choloài/nhóm loài, dễ khuếch đại và bền vững Hiện nay DNA barcoding đã được

sử dụng rất nhiều trong phân loại và giám định các loài động thực vật Phươngpháp này dựa trên nguyên tắc so sánh các vùng trình tự DNA ngắn có tốc độtiến hóa nhanh để định loại các loài Phương pháp này có thể áp dụng cho tất

cả các đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật…

Ở thực vật, các vùng DNA mã vạch được sử dụng để phân loại thường là

các trình tự thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen nhân…[39]; [55]; [10] Trên thếgiới việc sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân biệt các loài đã phổbiến và thông dụng từ những thập niên 90 của thế kỷ trước Một số vùnggen nhân và lục lạp thường dùng trong phân loại/giám định thực vật gồm

ITS, 18S, matK, rbcL, rpoB, psbA – trnH …[29]; [38], [40]; [42].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 vùng gen lục lạp gồm rbcL,

rpoB và 2 vùng gen nhân gồm 18S và ITS để đánh giá khả năng phân biệt

loài sâm ngọc linh với một số loài Panax khác.

- RbcL là vùng gen đệm trong lục lạp dài khoảng 1500 bp mã hoá cho

protein Rubico Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ

(12 kDa) giống nhau Các tiểu phần lớn được mã hóa bằng gen lục lạp

(rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hóa bằng gen nhân Riêng đối với tảo nâu

và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hóa cho tiểu phần nhỏ Các gen

rbcL ở thực vật bậc cao không có intron Các gen này được dùng nhiều

trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại [29]

- rpoB là một vùng gen nhỏ nằm trong lục lạp, đây được coi là vùng

gen mang nhiều vị trí Nu dễ biến đổi Nghiên cứu của nhóm CBOL gợi ý dùng

gen rpoB cho các phân biệt ở cấp độ loài và dưới loài [29].

- 18S-rDNA là vùng gen giải mã cho tiểu phần RNA ribosome, vùng gen nằm trong nhân tế bào, có kích thước khoảng 1900 Nu Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không

mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa

gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cáchphối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưngkhác biệt giữa các loài khác nhau [29].

1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể bằng kỹ thuật phân tử

Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đadạng di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài trong tự nhiên

có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồnloài một cách hữu hiệu Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảmtính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến quátrình phân cắt nơi sống [27]; [28]; [26]; [33]; [29] Các tác giả này đã chỉ rarằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng cá thểthấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt Hệ số thụ phấn caogiữa các cá thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính đadạng di truyền Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyềngiữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữachúng Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự pháttriển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống

ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng đượcứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vựckhoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn Để nghiên cứu đadạng di truyền quần thể và loài bằng kỹ thuật DNA có các phương phápchủ yếu như RAPD, AFLP, RFLP, ISSR,

Một trong những kỹ thuật mới nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền ởcấp độ loài và quần thể là kỹ thuật SSR vì các chỉ thị SSR có tính đa hìnhcao, đặc hiệu cho từng loài nghiên cứu Kỹ thuật này đã được áp dụngnhiều trong các nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền và mốiquan hệ sinh sản trong các quần thể [20], [26]

Kỹ thuật SSR

Kỹ thuật SSR hay còn gọi là kỹ thuật microsatellite là những trình tự

nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide ngắn,đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh Phương pháp truy tìm các phân đoạn DNAđơn giản lặp lại do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tửnăm 1989 [37] Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp lại, cácđoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài Các chuỗi lặp lại này thường từ1- 6 nucleotide Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh ra do sựnhân bội từ DNA tổng số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ với trình

tự gần kề hai đầu vùng lặp lại Giá trị của SSR là do nó sinh ra đa hình từrất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có bản chất đồng trội,

dễ dàng phát hiện bằng PCR Cho đến nay kỹ thuật này đang được ứngdụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật; thực vật [30]

Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện SSR làchỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao Đây là chỉ thị phân

tử giúp tránh được các nhầm lẫn trong phân tích genome và là một loại chỉthị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loạicác giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài

Nhược điểm của chỉ thị SSR là quá trình thiết kế mồi tốn kém và hầu như mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tổng số 60 mẫu lá sâm ngọc linh thu ngẫu nhiên từ 25 cây sâm tại vườnsâm Tăc-ngo, xã Trà Linh, tỉnh Quảng Nam và 35 mẫu sâm thu tại Măng ri,Kon Tum (Hình 2.1) Các mẫu thu được được giữ trong phòng bì giấy vàbảo quản trong silicagel cho đến khi sử dụng

Hình 2.1 Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Ditruyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam từ tháng 12/2016 - 07/2018

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Các mẫu lá sâm ngọc linh được thu tại Quảng Nam và Kon Tum đượcbảo quản trong silicagen cho đến khi thực hiện các nghiên cứu phân tử.Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle(1987) [32], có cải tiến thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và ditruyền bảo tồn gồm các bước sau:

Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá thu được Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng

cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, cho vào ống eppendorf 2ml

Bước 2: Bổ sung 800 l đệm rửa (Tris-HCl 100mM, EDTA 5mM, NaH2PO4

0,5 %) vào ống eppendorf chứa mẫu, vortex tạo thành dịch đồng nhất Ly tâm

12000 v/p trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần)

Bước 3: Bổ sung 800l đệm tách chiết (NaCl 1,5M, Tris-HCl 100mM, EDTA

20mM, CTAB 4 %) wotex tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ 30 phút ở

650C thỉnh thoảng trộn đều Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Bước 4: Bổ sung 800l chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều tạo

thành dịch đồng nhất Ly tâm 12000v/p trong 10 phút ở 40C, hút dịch nổisang ống eppendorf 1,5ml mới (lặp lại bước này 2 lần)

Bước 5: Bổ sung 1 lần thể tích isopropanol đảo đều để ở tủ -200C 1 giờ Lytâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa

Bước 6: Rửa tủa bằng ethanol 70 % Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C

Bước 7: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng Hoà tan DNA trong 50-100 l TE Bước 8: Bổ sung 3l RNase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 1 giờ

Bước 9: Bổ sung 2 lần thể tích ethanol 100% (lạnh), đảo nhẹ để trong tủ -200Ctrong 30 phút Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa

Bước 10: Rửa tủa bằng ethanol 70% Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C

Bước 11: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng Hoà tan DNA trong 50-100 l

TE DNA tổng số được kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA bằng điện ditrên gel agarose 1% Sau đó pha loãng về nồng độ 10ng/l để bảo quản vàthực hiện PCR

2.3.2 Lựa chọn mồi SSR

Nhóm nghiên cứu của GS Kim Joonki tại trường đại học Kongju, HànQuốc đã phát hiện được 642 vùng lặp microsatellite trên toàn bộ vùng gen loài

Nhân sâm hàn quốc (Panax ginseng), đã chọn được 251 vùng khác nhau và đã

thiết kế được 90 cặp mồi SSR để nhân những vùng microsatellite này Kết quảnghiên cứu đã chọn ra 11 cặp mồi SSR cho kết quả đa hình [42] (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền

300 bp được thực hiện với cặp mồi đánh dấu huỳnh quang một chiều xuôi.

2.3.3 Phân tích số liệu SSR

Dẫn liệu di truyền được ghi nhận trên cơ sở sự có mặt hoặc vắng mặtcủa các đỉnh (peak) DNA thu được hoặc băng vạch DNA trên bản điện di.Các thông số xác định đa dạng di truyền trong quần thể bao gồm tần sốallen cho một lô cút (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ số gen dịhợp tử mong đợi (He) và hệ số giao giao phấn cận noãn (Fis) được tínhtoán bằng phần mềm GenAlex Đặc điểm di truyền quần thể được phân tíchdựa trên các số liệu thu được

Các chỉ số thống kê F của Wright (1969) được dùng để đánh giá sựphân bố allen trong và giữa các quần thể, trong đó Fis là hệ số dư thừa genđồng hợp tử trong quần thể, Fit là hệ số sai khác trong quần thể và Fst là hệ

18

số sai khác giữa các quần thể trong loài Giá trị trao đổi di truyền giữa cácquần thể (Nm) được xác định theo công thức: Nm = (1 – Fst) / 4Fst.

Tham số thống kê của Nei’s (1972) [40] dùng để phân tích mức độ đadạng di truyền trong và giữa các quần thể đối với mỗi lô cút đa hình, trong

đó Ht là giá trị đa dạng di truyền tổng số, Hs là giá trị đa dạng di truyềntrong mỗi quần thể, Dst và Gst là giá trị khác nhau về di truyền giữa cácquần thể và hệ số đa dạng di truyền được xác định bởi công thức:

Sự sai khác di truyền giữa các quần thể được đánh giá theo tần số alen sử dụngchỉ số khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền của Nei’s (1972)Xác định cấu trúc di truyền ở cả hai mức độ quần thể và loài của hai quầnthể sâm ngọc linh thu tại hai điểm Quảng Nam và Kon Tum trên cơ sở phântích bốn lô cút gen bằng chỉ thị SSR Các thông số đa dạng di truyền sẽ đượcxác định bằng phần mềm GenAlex và FSTAT bao gồm số alen cho mỗi lô cút,

tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình, tần số gen dị hợp tử quan sát và lý thuyết dướiđiều kiện cân bằng Hardy-Weinberg Kiểm định giả thiết 2 được sử dụng đểđánh giá sự sai khác giữa tần số gen dị hợp tử quan sát và lý thuyết Các chỉ sốthống kê F của Wright (1969) cũng được sử dụng để đánh giá sự phân bố alentrong và giữa các quần thể Mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các quầnthể sử dụng các tham số thống kê của Nei (1987) để phân tích đối với mỗi lôcút đa hình Nghiên cứu mối quan hệ sinh sản giữa các cá thể trong quần thể

và giữa các quần thể của loài trên cơ sở xác định hệ số thụ phấn cận noãn Chỉ

số thụ phấn chéo trong mỗi quần thể cũng được xác định Nghiên cứu khônggian phân bố di truyền trong quần thể liên quan đến khoảng cách di truyền, hệ

số di truyền tương đồng và mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể Điện

di phân tách trên máy điện di mao quản ABI Prizm 3100 Các phân đoạn SSRsau đó được phân tích bằng phần mềm Genscan v 3.7 Tất cả các thông số trênđược tính toán và phân tích bằng phần mềm GenAlex và FSTAT Phân tíchmức độ tiến hoá và mối quan hệ giữa các loài bằng phần mềm MEGA 7,Clustal W và PAUP*

2.3.4 Thiết kế mồi đọc trình tự

Trình tự các cặp mồi sử dụng được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ nằm ở haiđầu của vùng gen nghiên cứu Các mồi được thiết kế sao cho đạt được tỷ lệ

phổ biến cho các loài thuộc chi Panax Gen rbcL dài khoảng 1500 bp được chia thành 2 đoạn gen gồm rbcLa và rbcLc, mỗi đoạn gen dài khoảng 600 bp Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trên cơ sở trình tự rbcLa; rbcLc; rpoB; 18S; ITS của các loài trong chi Panax trên Genbank [29] Trình tự 5 cặp mồi

đặc hiệu được dùng để khuếch đại gen được thể hiện bảng 2.2

Bảng 2.2 Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen

2 rbcLc

F: 5’-TGAAAACGTGAATTCCCAACCGTTTATGCG-3’

600R:5’- GCAGCAGCTAGTTCCGGGCTCCA - 3’

F: 5’- GCAATTCACACCAAGTATCGC- 3’

700R: 5’- GCGATACTTGGTGTGAATTGC -3’

F: 5’- TCAAAGATTAAGCCATGCATGTCT - 3’

600R: 5’ - TACGAGCTTTTTAACTGCAACAAC -3’

5 rpoB

F: 5’-GCC ACC ATC GAA TAT CTG GT- 3’

500R: 5’- ACA CGA TCT CGT CGC TAA CC -3’

2.3.4 PCR khuếch đại gen

Nhân bản vùng gen rbcLa; rbcLc; rpoB; 18S; ITS dài khoảng từ 500 bp

đến 700 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế trên cơ sở trình tự

rbcLa; rbcLc ; rpoB; 18S; ITS của các loài trong chi Panax trên Genbank

[29] Phản ứng nhân gen được thực hiện trong thể tích là 25µl với các thành phần

mồi xuôi hoặc ngược): 1,25l, H2O khử ion: 7µl Chu trình nhiệt của mỗiphản ứng PCR: (1) 950C 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 950C 30 giây;

540C 1phút; 720C 1phút Cuối cùng là 720C 10 phút để kết thúc phản ứng

và giữ mẫu ở 40C Phản ứng được thực hiện trên máy PCR system 9700

20

2.3.5 Điện di trên gel agarose

DNA tổng số sau khi được tách và các sản phẩm PCR thu được đượcđiện di kiểm tra trên gel agarose 1%

2.3.6 Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST

Trình tự DNA thu được sau khi được hiệu chỉnh ở định dạng file fastặfas) sẽ được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công

cụ BLAST [57] Công cụ này cho phép bước đầu định danh đến mức độ loàicủa các trình tự thu được bằng cách xác định các trình tự tương đồng với trình

tự này trong cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen Bằng cách tìm kiếm nhữngtrình tự có điểm số bắt cặp cao giữa chuỗi truy vấn và các chuỗi trong cơ sở

dữ liệu sử dụng phương pháp tìm kiếm đơn giản, trên cơ sở phương phápphỏng đoán, công cụ BLAST tìm những trình tự tương đồng thông qua pháthiện các đoạn bắt cặp ngắn theo từng bộ 3 nulceotide gối lên nhau giữa trình

tự cần truy vấn và trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệụ Tiếp đó, nếu mỗi bộ 3này đạt tới một ngưỡng T tối thiểu được tính toán bằng ma trận điểm (scoringmatrix), chúng sẽ được đưa vào sắp xếp thẳng hàng (alignment) bởi thuật toánđược sử dụng trong công cụ BLAST BLAST sẽ cho ra kết quả các trình tựtương đồng được thể hiện ở dạng bảng đi kèm với thông tin của trình tự trênngân hàng gen cùng với các chỉ số tương đồng (ident), độ dài của chuỗi trình

tự được bắt cặp ở dạng phần trăm (query cover), điểm số bắt cặp giữa 2 trình

tự Trình tự nào có điểm số tương đồng cao hơn sẽ có mức độ giống nhau caohơn Dựa vào chỉ số tương đồng của các trình tự, chúng tôi sẽ đưa ra kết quảgiám định loài cho các mẫu vật nghiên cứụ

2.3.7 Đọc trình tự gen

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản

ứng giải trình tự trực tiếp với các mồi rbcLa, rbcLc; rpoB; 18S, ITS, sử

dụng Bigdye terminator cycler và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100Avant Genetic Analyzer Hình ảnh các đỉnh (peak) của trình tự DNA cácmẫu nghiên cứu được phân tích và ghép nối bằng phần mềm chromasPro[58], so sánh bằng phần mềm MEGA7 [51]

2.3.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Mối quan hệ di truyền của các loài được thể hiện bằng cây phát sinh

chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, được xây

dựng dựa trên sự giống và khác nhau của các đặc điểm vật chất di truyền

hay cơ thể Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về cấu

trúc DNA giữa các loài Các taxon được nối với nhau trên cây thể hiện mối

quan hệ di truyền Phương pháp Neighbor – Joining (NJ) là phương pháp

tạo cây thường được sử dụng Phương pháp NJ do Naruya Saitou và

Masatoshi Nei đưa ra vào năm 1987 [54] Kiểm tra và ghép nối các đoạn

gen và so sánh sự khác nhau về vị trí các nucleotide giữa các loài/thứ thuộc

chi Panax và 01 loài ngoài nhóm (Bảng 2.3) trên cơ sở trình tự nucleotide

của gene rbcLa; rbLc;18S; rpoB; ITS được thực hiện bởi phần mềm

ChromasPro (Technelysium Pty Ltd) [58] Thành phần base (%) vùng gen

rbcLa;rbcLc;18S; rpoB; ITS của các loài nghiên cứu, sự khác nhau giữa

các cặp loài trên cơ sở phân tích theo mô hình Kimura 2 tham số và sơ đồ

hình cây mối quan hệ di truyền theo hai phương pháp: NJ và MP được tiến

hành trên phần mềm MEGA7 [51] và Paup [53]

Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu.

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

Lá của các mẫu sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kom Tum đượcnghiền trong nitơ lỏng (-196°C) thành dạng bột mịn Khoảng 100 mg bộtnghiền được dùng để tách DNA tổng số Kết quả sau đó được điện di kiểmtra trên gel agarose 1% (Hình 3.1)

Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1%

Kết quả điện di (hình 3.1) cho thấy vạch DNA thu được khá rõ, vạchDNA thể hiện trên bảng gel điện di sắc gọn, chứng tỏ chúng tôi đã thựchiện tách chiết DNA tổng số của sâm ngọc linh khá tốt, DNA tổng số thuđược ít bị đứt gãy

3.2 Lựa chọn mồi SSR

Mười mẫu sâm ngọc linh trong số 60 mẫu thu được được thử nghiệmtính đa hình đối với 11 cặp mồi SSR đặc hiệu thiết kế cho sâm hàn quốc

(Panax ginesng) (bảng 2.1) Phản ứng nhân dòng các đoạn microsatellite

được thực hiện với cặp mồi đánh dấu huỳnh quang một chiều xuôi Chutrình phản ứng được thực hiện ở 95oC trong 30’’, 54 - 59oC trong 30’’,

72oC trong 40’’; 72oC trong 10’ với tổng số 35 chu trình Kiểm tra kết quảbằng phần mềm Gene Marker

Kết quả thử nghiệm cho thấy trong số 11 mồi thử nghiệm, chỉ có 4 mồigồm PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG -1481 cho kết quả đa hình, cácmồi còn lại hoặc không xuất hiện băng vạch, hoặc xuất hiện băng nhiễu,không đặc hiệu Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn 4 cặp mồi PG - 29, PG

- 668, PG -1419 và PG - 1481 để phân tích tính đa hình di truyền cho 60mẫu sâm thu được từ 2 quần thể sâm ngọc linh của Việt Nam tại QuảngNam và Kon Tum

Một vài hình ảnh các peak thu được khi phân tích 4 cặp mồi SSR được trích dẫn ở hình 3.2

Hình 3.2 Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4 mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481

3.3 Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh

Các thông số xác định đa dạng di truyền trong quần thể bao gồm tần sốallen cho một lô cút (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ số gen dịhợp tử mong đợi (He) và hệ số giao giao phấn cận noãn (Fis) được tínhtoán bằng phần mềm GenAlex (Bảng 3.1)

Kết quả phân tích 60 mẫu sâm ngọc linh thu từ 2 quần thể sâm ngọclinh tại Quảng Nam và Kon Tum cho thấy 25 mẫu sâm ngọc linh từ quầnthể Quảng Nam phân tích trên 4 cặp mồi SSR đã thu được tổng số 525alen, trung bình mỗi mẫu cho 21 alen Mồi PG - 29 cho 8 alen với kíchthước lần lượt là 91, 97, 100, 103, 106, 112, 115 và 118 bp Mồi PG - 668cho tổng số 5 alen với kích thước các băng lần lượt là 89, 95, 104, 107 và

110 bp Mồi PG - 1419 cho tổng số 6 alen với các kích thước là 95, 97,

103, 105, 107 và 111 bp Mồi PG - 1481 cho

2 alen với kích thước là 101 bp và 105 bp, tuy nhiên alen 101 bp xuất hiệnvới tần suất áp đảo (85%), alen 105 bp chỉ xuất hiện ở 9 mẫu trên tổng số 25mẫu của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam

Như vậy, tần số phân bố của các allen thu được ở 4 locus (PG - 29; 688; PG - 1419; PG - 1481) là không đồng đều Trong đó locus PG - 29 cótính đa hình cao nhất và locus PG - 1481 có tính đa hình thấp nhất thể hiện

PG-ở 2 vạch (101 bp và 105 bp) (Bảng 3.1)

Tất cả 4 lô cút SSR đều là đa hình cho quần thể sâm ngọc linh ở tỉnhQuảng Nam Như vậy, quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam đang duy trìmức độ đa dạng di truyền khá tốt, có giá trị bảo tồn cao

Đối với quần thể sâm tại Kon Tum, 35 mẫu sâm ngọc linh thu được đãcho tổng số 665 alen Trong 4 mồi là PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG -

1481 số alen (A) nhận được lần lượt là 8 alen; 5 alen; 6 alen và 1 alen Mồi

PG - 29 cho nhiều alen nhất (8 alen), mồi PG - 1481 cho kết quả đơn hìnhvới một vạch duy nhất; trung bình mỗi

locus có 5 alen Tần số alen (Allele frequency) xuất hiện ở nhiều nhất là ởlocus PG - 29 là 0,0119; 0,0357; 0,6786; 0,0476; 0,0357; 0,1190; 0,0238;0,0476 và thấp nhất ở locus PG - 1481 là 1,000 Mồi PG - 668 và PG -

1419 có kích thước băng dao động trong khoảng 89 bp đến 110 bp, tần sốallen dao động từ 0,0114 tới 0,6705 Ở locus PG - 668 quan sát được mức

độ đồng hợp tử khá cao nhưng chưa hoàn toàn lấn át các tổ hợp gen dị hợp

tử Số lượng alen quan sát được ở locus PG - 668 cũng thấp hơn so với 3locus PG - 29; PG - 1419 và PG - 1481 Điều này có thể sự cách ly vàphiêu bạt di truyền phần nào đã làm giảm tỉ lệ các tổ hợp gen dị hợp Cácphân tích chỉ ra rằng ở bốn locus nghiên cứu có sự đa hình khá lớn, tuynhiên tần số phân bố của các allen không đồng đều, số lượng allen có tần

số xuất hiện có ý nghĩa chỉ ở mức trung bình thấp Đây có thể là kết quảcủa quá trình cách ly và chọn lọc không đều đã làm giảm tần số xuất hiệncủa một số allene hiếm hay không có ưu thể trong tiến hóa

Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phân tích 4 chỉ thị SSR

Ghi chú: A: Số alen; ne: Số allen hiệu quả; H o : hệ số dị hợp tử; H e : Hệ số dị hợp tử mong đợi; Fis là

giá trị giao phối cận huyết

Chỉ số số alen có ý nghĩa (Ne) của bốn locus PG 29; PG 688; PG 1419; PG - 1481 lần lượt là 2,073; 1,944; 2,821; 1.000, như vậy số alen có

-ý nghĩa (Ne) dao động từ 1,0 đến 2,821 (trung bình là 1,959), trong đó hơnmột nửa là các alen hiếm với tỷ lệ rất thấp (0,05) Tiếp theo là tần số di hợp

tử quan sát (Ho) trung bình mỗi locus là 0,466 (dao động từ 0 đến 0,884tuỳ theo từng locus) cao nhất là cao nhất ở locus PG - 1419 là 0,645 Ở 4locus PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG - 1481 tần số dị hợp tử quan sát(Ho) có trùng bình mỗi locus đa hình là 0,621 Tần số dị hợp tử mong đợi(He) của bốn locus PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG -

1481 cao nhất ở locus PG - 1419 là 0,645 và thấp nhất ở locus PG - 1481 là0,000, tần số dị hợp trung bình của mỗi locus là 0,412 Như vậy trung bìnhtần số dị hợp tử mong đợi (He) mỗi locus thấp hơn tần số dị hợp tử quansát (Ho) mỗi locus (He = 0,412 < Ho = 0,466) Điều đó chứng tỏ hai quầnthể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon Tum đều đang duy trì được tần số

dị hợp tử tương đối khả quan

Ở mức độ quần thể, quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam cho thấy tần

số alen cao hơn so với quần thể sâm ngọc linh ở Kom Tum (AR = 2,27 >

AR = 2,05) Tần số alen di hợp tử quan sát được (Ho) của quần thể sâm

ngọc linh ở Quảng Nam là 0,49 và ở Kon Tum là 0,43 Tần số dị hợp tửmong đợi (He) ở hai quần thể này lần lượt là 0,42 và 0,4 Như vậy quần thểsâm ngọc linh ở Quảng Nam có tần số dị hợp tử mong đợi (He) cao hơn tần

số dị hợp tử mong đợi của quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum (0,42 > 0,4).Tần số alen di hợp tử quan sát được (Ho) của quần thể sâm ngọc linh ởQuảng Nam cũng cao hơn tần số dị hợp tử mong đợi so với quần thể sâmngọc linh ở Kon Tum (0,49 > 0,43) Như vây, có thể kết luận cả hai quầnthể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum đều đang duy trì được tần số

dị hợp tử tương đối cao, hiện tượng tự thụ phấn chưa ảnh hưởng đến cấutrúc di truyền quần thể của cả hai quần thể này, tuy nhiên quần thể sâmngọc linh tại Quảng Nam thể hiện mức độ đa dạng và tần số dị hợp tử caohơn so với quần thể sâm ngọc linh tại Kon Tum

Tuy vậy, các kết quả phân tích thu được cũng cho thấy mặc dù có sự đahình khá lớn ở bốn locus nghiên cứu nhưng tần số phân bố của các alenkhông đồng đều, số lượng alen có tần số xuất hiện có ý nghĩa chỉ ở mứctrung bình thấp Đây có thể là kết quả của quá trình cách ly và chọn lọckhông đều đã làm giảm tần số xuất hiện của một số alen hiếm hay không có

ưu thể trong tiến hóa, điều này cho thấy rất có thể quần thể sâm ngọc linhtại Quảng Nam và Kon tum thực chất ban đầu

có nguồn gốc từ một quần thể chung, sau đó bị phân ly tạo thành hai quầnthể riêng biệt nên vẫn tồn tại một số alen hiếm nhưng với tần số rất nhỏ.

Về chỉ số tự thụ phấn Fis, khi giá trị Fis > 0.1 thì khả năng quần thể đã

có hiện tượng giao phấn cận noãn xảy ra, khi giá trị Fis < 0 thì khả năngquần thể chưa xảy ra hiện tượng giao phấn cận noãn; còn khi giá trị 0 < Fis

< 0,1 thì quần thể chưa xảy ra hiện tượng thoái hóa hay tỷ lệ tần số alen dihợp tử quan sát được là tương đối cân bằng Kết quả phân tích chỉ số Fiscủa hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon Tum ở nghiên cứunày đều cho giá trị hệ số cận noãn (Fis) nhỏ hơn 0 (cụ thể, giá trị Fis của 2quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum lần lượt là - 0,12 và –0,09) Kết quả này phản ánh hệ số gen đồng hợp tử ở các quần thể này đềuthấp hơn so với tỷ lệ alen dị hợp tử quan sát được, nghĩa là chưa xuất hiệnhiện tượng thoái hóa di truyền hay nói cách khác chưa xảy ra sự tự thụphấn trong quần thể hay việc tự thụ phấn giữa một số cá thể trong quần thểchưa làm ảnh hưởng đến tần số alen dị hợp tử tổng số của quần thể Quầnthể sâm ngọc linh ở Quảng Nam có hệ số cận noãn (Fis) nhỏ hơn hệ số cậnnoãn (Fis) ở quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum (- 0,12 < - 0,09), điều đócho thấy tỷ lệ tự thụ phấn ở các cá thể trong quần thể sâm ngọc linh

ở Quảng Nam thấp hơn so với Kon Tum, kết quả phân tích alen dị hợp vàtần số đa dạng alen ở quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam cũng cao hơn so vớiquần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum

Nhìn chung, các kết quả thu được trong nghiên cứu này đều cho thấycác giá trị Ho, He của hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và KonTum đều cao hơn so với các kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền quần

thể của loài sâm mỹ (Panax quinquefollius) và loài nhân sâm (Panax

ginseng) [48] Điều đó chứng tỏ loài sâm ngọc linh của Việt