Khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic từ một số sản phẩm lên men truyền thống việt nam​

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆPKHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ MỘT SỐ SẢN PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM Giảng viên hướng dẫn : Ths... Hệ vi sinh vật này là một t

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ MỘT SỐ SẢN PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM

Giảng viên hướng dẫn : Ths Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

MSSV: 1051110100

: Phan Thị Thùy Linh

Lớp: 10DSH02

TP Hồ Chí Minh, 2014

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu,hình ảnh, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trongbất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xinchịu hoàn toàn trách nhiệm.

Tp Hồ Chí Minh, ngày… tháng …năm 2014

Sinh viên

Phan Thị Thùy Linh

Trước tiên cho em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đến Ban GiámHiệu Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, Quý thầy côgiảng dạy tại khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học cùng với tất cả các thầy cô

đã truyền dạy kiến cho em trong những học kì vừa qua Những năm học vừa qua đãgiúp em tích lũy được những kiến thức vô cùng quan trọng và cần thiết cho em,những kiến thức này sẽ giúp em rất nhiều trong cuộc sống và áp dụng vào trongcông việc sau này giúp ích cho xã hội, cuộc sống

Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy Phạm Minh Nhựt,người đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài Bêncạnh đó em cũng xin cảm ơn các thầy trong phòng thí nghiệm đã tạo cơ hội cho em

có không gian thực hiện đồ án và cũng cảm ơn những người bạn đã quan tâm vàgúp đỡ em nhiệt tình trong thời gian vừa qua

Đồng thời em xin kính chúc Quý thầy cô trường Đại Học Kỹ Thuật Côngnghệ thành phố Hồ Chí Minh luôn mạnh khỏe để tiếp bước con đường sự nghiệp

“Trồng Người” của mình Chúc các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong sựnghiệp

Cuối cùng, con gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, cùng các anh chị em tronggia đình đã quan tâm và nâng đỡ con mỗi khi con khó khăn trong quá trình học tậpcũng như trong cuộc sống để con có được thành tựu như hôm này

Tp Hồ Chí Minh, ngày…tháng …năm 2014

Sinh viên

Phan Thị Thùy Linh

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮC viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Vi khuẩn lactic 4

1.2 Đặc điểm chung của khuẩn lactic 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái của khuẩn lactic 5

1.2.2 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa 7

1.2.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 7

1.2.2.2 Quá trình trao đổi chất 9

1.2.3 Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn 10

1.2.3.1 Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn lactic sản sinh 11

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 15

1.3.1 Môi trường nuôi cấy 15

1.3.2 Điều kiện nuôi cấy 16

1.3.3 Chất ức chế và chất làm bất hoạt bacteriocin 17

1.4 sự phân bố của vi khuẩn lactic 17

1.4.1 Sữa chua lên men 18

1.4.2 Rau cải muối chua 19

1.4.3 Các sản phẩm lên men từ thịt (nem chua)

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 22

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu 26

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 26

2.1.2 Thời gian thực hiện 26

2.2 vật liệu nguyên cứu 26

2.2.1 nguồn mẫu phân lập vi khuẩn lactic 26

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị 26

2.2.3 Hóa chất dụng cụ và thiết bị 27

2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy và phân lập 27

2.2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu 28

2.3.2 Phương pháp pha loãng mẫu 28

2.3.3 Phương pháp tăng sinh 29

2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 29

2.3.4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 29

2.3.4.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 30

2.3.5 Phương pháp định danh vi sinh vật 31

2.3.5.1 Phương pháp nhuộm Gram 32

2.3.5.2 Phương pháp nhuộm bào tử 32

2.3.5.3 Phương pháp thử nghiệm catalase 32

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 32

2.3.6.1 Phương pháp đo đường kính vòng tròn kháng khuẩn 32

2.3.6.2 Phương pháp đồng nuôi cấy 33

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 33

2.4 Bố trí thí nghiệm 34

2.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và đinh danh sơ bộ vi khuẩn lactic

35

hợp chất kháng khuẩn mạnh 36

2.4.2.1 Thí nghiệm 2.1: Sàng lọc các chủng LAB có khả năng đối kháng mạnh đối với vi khuẩn chỉ thị 36

2.4.2.2 Thí nghiệm 2.2: Sàng lọc các chủng LAB có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 38

3.1.1 Kết quả phân lâp khuẩn lactic 38

3.1.2 Kết quả định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 39

3.2 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic co khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn chỉ thị 41

3.2.1 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng cua sinh khối khuẩn lactic đối với vi khuẩn chỉ thị 41

3.2.2 Kết quả đánh giá khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 45

KẾT LUÂN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

1 Kết luận 49

2 Đề nghị 49

Tài liệu tham khảo 51 Phụ lục

EMP: Embden – Meyerhoff – Parnas

LAB: Lactic Acid Bacteria

WHO: World Health Organization

Bảng 2.1 Danh sách mẫu phân lập vi khuẩn lactic 26

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 37

Bảng 3.2 Kết quả định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 39

DANH MỤC CÁC ẢNH

Hình 1.2 Chủng vi khuẩn Lactobacteriumbungaricus 18

Hình 1.3 Chủng vi khuẩn L brevis và chủng Str Cremoris 19

Hình 2.1 Phương pháp pha loãng mẫu 28

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34

Hình 2.3 Quy trình phân lập vi khuẩn lactic 35

Hình 3.1 Hình dáng khuẩn lạc của chủng SCPR03 quan sát được dưới kính hiển vi

39 Hình 3.2 Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử của chủng SCYK 02 41

Hình 3.3 Mẫu thử catalase của 2 chủng NCTC02 và NCTC03 41

Hình 3.5 Đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn chỉ thị của các chủng SCPR01, SCPR02, SCPR03, SCYK01, SCYK02 VÀ SCYK03 (mm). 42

Hình 3.6 Đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn của các chủng CPMC, NCVS, MCTC, KCHQ, NCTC01, NCTC02 VÀ CCTC (mm) 43

Hình 3.4.Vòng kháng vi khuẩn chỉ thị của chủng vi khuẩn SCPR02 và chủng SCPR03. 44

Hình 3.4 Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic không trung hòa acid hữu cơ 46

Hình 3.6 Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch sau ly tâm vi khuẩn lactic trung hòa acid hữu cơ. 47

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Sản phẩm lên men được biết đến từ lâu nhờ việc bổ sung muối và đường vào

để thu được một loại sản phẩm ăn ngon và có giá trị dinh dưỡng cao Thực tế việc

bổ sung này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của một vài loài vi sinh vật cósẵn trong sản phẩm để sinh ra một số chất làm cho sản phẩm có hương vị đặc biệt

có tác dụng bảo quản sản phẩm lâu bị hỏng Ngày nay người ta đã biết rằng các đặctính quý báu đó của sản phẩm là kếtquả của quá trình lên men đường thành acidlactic, thực hiện bởi nhóm vi khuẩn lactic có trong hệ vi sinh vật tự nhiên của cácsản phẩm Các vi sinh vật này cũng có thể được thêm vào trong quá trình sản xuất(chủng khởi động – starter cultures) Như nem chua là sản phẩm thịt lên men lactic

cổ truyền của người Việt Nam được rất nhiều người ưa thích Nem chua chế biếntheo phương pháp truyền thống, cho chất lượng sản phẩm không ổn định do nhiềuyếu tố như: phụ thuộc vào hệ vi sinh vật tự nhiên và trong thịt, chất lượng nguyênliệu thịt, điều kiện và qui mô sản xuất Những yếu tố này rất khó kiểm soát trongđiều kiện sản xuất thủ công, gây ra sự mất ổn định cho chất lượng sản phẩm Đặcbiệt thịt nguyên liệu do quá trình giết mổ vận chuyển thủ công nên sự nhiễm tạp các

vi sinh vật không mong muốn là rất lớn vì vậy nguy cơ ô nhiễm các vi sinhvật gâybệnh là rất cao gây nguy hiểm cho sức khỏe con người Hay như xúc xích lên men

là một trong những sản phẩm thịt lên men khá phổ biến trên thế giới.Tùy từng vùng,địa phương mà mỗi nơi có những sản phẩm đặc trưng rất nổi tiếng như: Chorozi(Tây Ba Nha), Salami (Ý) hay Summer (Mỹ) Trong số đó xúc xích lên menSummer là sản phẩm thịt lên men ở nhiệt độ cao, thời gian lên men ngắn rất giốngvới sản phẩm nem chua Việt Nam

Tuy nhiên việc sử dụng các sản phẩm lên men trên cũng thường hay gặp cácvấn đề về ngộ độc thực phẩm, điều này đã và đang trở thành một trong những vấn

đề cấp thiết cần được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người Bên cạnh đó, việcdùng chất bảo quản thực phẩm hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng

phụ không có lợi của nó Vì vậy, việc tìm ra những chất bảo quản vừa an toàn, vừahiệu quả đang là vấn đề thách thức cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm.

Kết quả nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy vi khuẩn lactic khôngnhững có thể lên men lactic rau quả mà còn có những tác động hiệu quả trong việcbảo quản thực phẩm Đặc tính của vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, có thửnghiệm oxidase và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử (Abee

và ctv, 1999) Hệ vi sinh vật này là một trong những nguồn vi sinh vật sinh rabacteriocin, dạng chất kháng khuẩn có khả năng chống lại sự phát triển của cácmầm bệnh và được ứng dụng như chất bảo quản thực phẩm Hầu hết vi khuẩn lacticđều tổng hợp được bacteriocin nên thành phần kháng khuẩn này rất đa dạng nhưLactacin, Nisin, Acidolin, Từ rất lâu các bacteriocin này đã được ứng dụng rộngrãi trong bảo quản thực phẩm, điển hình là Nisin Năm 1953, thương phẩm Nisaplinxuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1969, tổ chứcWHO công nhận Nisin là chất bảo quản an toàn có nguồn gốc sinh học Ở ViệtNam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men truyền thống nhưdưa cải muối chua, sữa chua, nem chua Do đó, việc tuyển chọn các chủng vi khuẩnlactic có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn mạnh là một yếu tố hết sức quantrọng và cần thiết ứng dụng trong công nghệ sản xuất và bảo quản thực phẩm, thaythế cho các chất phụ gia hóa học, ngoài ra còn ứng dụng trong tạo chế phẩm sinhhọc nhằm nâng cao tỷ lệ sống của động vật đối với vi khuẩn gây bệnh và xa hơn nữa

là ứng dụng trong y học

Với ý nghĩa thực tiễn và khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “Khảo sát khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactic từ một số

sản phẩm lên men truyền thống Việt Nam” Nghiên cứu này được thực hiện với

mục tiêu bước đầu phân lập và tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinhchất kháng khuẩn từ một số nguồn sản phẩm lên men có sẵn trên thị trường Qua đó

có thể tiến hành định danh và tiếp tục nghiên cứu điều kiện sinh chất kháng khuẩncao để có thể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực phẩm tự nhiên

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh hợp chất khángkhuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị từ các sản phẩmlên men truyền thống

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tiến hành định danh sơ bộ vi khuẩn lactic

- Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh các hợp chất khángkhuẩn

4 Phạm vi nghiên cứu

- Chỉ tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam

- Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic đối với 5 chủng

vi khuẩn chỉ thị là Escheria coli, Salmonella, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis và

Listeria monocytogenes.

Vi khuẩn lactic (LAB) thuộc họ Lactobacillaceae Các chủng vi khuẩn thuộc

nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giốngnhau Tất cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử,không di động, hô hấp tùy nghi (kị khí và hiếu khí) và không chứa các men hô hấpnhư cytochrome và catalase Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giảicarbonhydrat và sinh ra acid lactic, sinh sản bằng hình thức phân đôi tế bào Việcphân loại vi khuẩn lactic thành các chi khác nhau chủ yếu dựa vào hình thái, conđường lên men glucose, sự tăng trưởng ở các nhiệt độ khác nhau, cấu hình của acidlactic được sản xuất, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao và khả năng chịu acidhoặc chịu kiềm (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010)

1.2 Đặc điểm chung của khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, thử nghiệmoxydase và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử, không diđộng, kỵ khí tùy nghi và lên men carbohydrate tạo sản phẩm chính cuối cùng là acidlactic (Abee và ctv, 1999) Ngoài ra, nó còn sản sinh ra acid acetic, ethanol, các hợpchất thơm, bacteriocin, exopolysaccharide và một số enzyme quan trọng khác(Vuyst và Leroy, 2007)

Vi khuẩn lactic thường được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, đặc biệt làcác thực phẩm lên men vì nó có thể sản xuất ra một vài hợp chất góp phần vào tăng

mùi, vị, màu sắc và kết cấu của thực phẩm Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấyrằng vi khuẩn lactic không những có thể lên men rau quả mà còn có thể ứng dụngtrong bảo quản thực phẩm do chúng có khả năng sinh ra các hợp chất kháng khuẩnnhư bacteriocin, là hợp chất kháng khuẩn có khả năng chống lại sự phát triển củacác vi khuẩn gây bệnh Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic hiện diện chủ yếu trong cácsản phẩm lên men truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, nem chua và một

số sản phẩm men tiêu hóa đông khô (Ngô Thị Phương Dung và ctv, 2011)

- Vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi

khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium.

Hình 1.1 Một số chủng lactic điển hình Pediococcus I (a), Streptococcus

(b), Lactobacillus (c), Leuconostoc (d)

1.2.1 Đặc điểm hình thái của khuẩn lactic

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài Nhóm vi khuẩn

này có rất nhiều hình dạng khác nhau: có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài ở dạng đơn,đôi hoạt xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặcxếp thành chuỗi Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có dạnh hình que.

Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màutrắng đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắngđục Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid

Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đườngdisaccharide, protein tan, peptone và acid Phần lớn chúng không thủy phân đượctinh bột và các polisaccharide khác

Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua Vi khuẩn lactic

thuộc họ Lactobacillaceae, thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que.

Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn

lactic, thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của

Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb bifidum mặc dù Bifidobacterium

không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều

hơn đến nhóm Actinomycetaceae một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường

lên men đường khác với vi khuẩn lactic

Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu

nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc Đây là

những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không tạo bào tử Tất cả vi khuẩn lactic đềukhông chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi

- Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào

0,5-1µm Sau khi phân chia theo một phương, chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặcchuỗi ngắn

- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5

– 0,8 µm và chiều dài khoảng 1,6 µm Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng

hơi tròn, chiều dài khoảng 1 – 3 µm Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung.

- Giống Lactobacillus có dạng hình que Tùy vào điều kiện của môi trường

sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắp xếp thành chuỗi hayđứng riêng lẽ

- Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn Có hoạt

tính thủy phân protein rất yếu

- Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân

nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy truyền chúng trởthành dạng trực khuẩn dạng thẳng hay uốn cong

Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm Các tế bào hìnhm Các tế bào hìnhcầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trựckhuẩn lactic từ 1 – 8 μm Các tế bào hìnhm Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi

Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactictrong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau Đa số cáctrực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 ÷ 3 %) liên cầukhuẩn (khoảng 1 %) Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 ÷ 4 (cầu khuẩnkhông thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trựckhuẩn ở vùng pH 5,5 ÷ 6

Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 ÷ 350C, ưanhiệt là 40 ÷ 450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C Khi gia nhiệt khoảng 60 ÷ 800C thìhầu hết chúng bị chết sau 10 ÷ 30 phút

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trongkhông khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loạirau, quả, sữa, thịt,…)

1.2.2 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa

1.2.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau.Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở

bản như carbon, nitơ, phosphate và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…

- Nguồn carbon tốt nhất là các loại đường như glucose, frutose, maltose,galactose, sarcharose, lactose cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin)

- Nguồn dinh dưỡng quan trọng cho vi khuẩn lactic là monosarcharid vàdisarcharide Các nguồn carbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấutrúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như acid malic, pyruvic, fumaric, aketic

Tuỳ từng loại vi khuẩn lên men lactic đồng hình hay dị hình mà có các sản phẩm tạo

ra trong quá trình lên men khác nhau khi chúng sử dụng các axid gluconic tạo thành

CO2, acid acetic, acid lactic Khi sử dụng acid amin như acid glutamic Arginin,tirozin thì xảy ra quá trình đề cacbonxyl và tạo ra CO2

- Các loại vi khuẩn khác nhau thì sử dụng các nguồn cacbon khác nhau,

chẳng hạn: Streptococcus lactic sử dụng tốt glucose, lactose, maltose Lactobacillus

bulgaricus, sử dụng glucose, maltose, galactose, sarcharose, dextrin nhưng không sử

dụng được lactose

* Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứanitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng cácnguồn nitơ có sẵn trong môi trường.Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụngnhư: cao thịt, cao nấm men, tryptone, dịch thủy phân casein từ sữa,

peptone,… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và cóhiệu quả nhất Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này

vì rất tốn kém

*Nhu cầu về Vitamin:

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tếbào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactickhông có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào

môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết

từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

* Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ

Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của

vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muốicitrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập

và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quantrọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dướidạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

*Nhu cầu các muối vô cơ khác:

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần cácmuối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali,phosphor, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quátrình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

1.2.2.2 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông quaviệc lên men lactic

Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm:

- Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: Thực hiện quá trình lên men tạo ra sảnphẩm chủ yếu là acid lactic Do trong hệ enzyme của chúng có chứa aldolaza vàtriozophotphatizomeraza nên quá trình lên men này xảy ra theo con đường EMP

- Vi khuẩn lên men lactic dị hình: Thực hiện quá trình lên men, ngoài

axid lactic chúng còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như acid acetic, rượu etylic,CO2, một số chất thơm… Đây là quá trình lên men rất phức tạp, không theo conđường EMP vì chúng không có hai enzyme cơ bản là aldolaza vàtriozophotphatizomeraza

1.2.3 Cơ sở sinh học của quá trình hình thành các hợp chất kháng khuẩn

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hóa tự dưỡng nên sự oxy hóa các chất trong quátrình trao đổi chất cung cấp nguồn năng lượng cho các hoạt động sống của vi khuẩn.Dựa vào sản phẩm cuối cùng được hình thành trong quá trình lên men glucose, quátrình lên men lactic được chia thành 2 quá trình lên men lactic đồng hình và lên menlactic dị hình (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010)

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, acid pyruvic được tạo thành quacon đường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP) Sau đó acid pyruvic sẽ tạo thànhacid lactic dưới tác dụng của enzyme lactate dehydrogenase Lượng acid lactic tạothành chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acidacetic, ethanol, CO2… Lượng sản phẩm phụ tạo thành phụ thuộc vào sự có mặt của

oxy (Khalid, 2011) Vi khuẩn lên men lactic đồng hình như Pediococcus,

Streptococcus, Lactococcus và một số Lactobacilli sản xuất acid lactic là sản phẩm

chính cuối cùng hoặc duy nhất của quá trình lên men glucose Các vi khuẩn lên menlactic đồng hình sử dụng con đường EMP để tạo ra 1 phân tử acid lactic từ mỗimole glucose và thu được nguồn năng lượng gấp hai lần so với quá trình lên menlactic dị hình với mỗi mole glucose

Vi khuẩn lên men lactic dị hình như Weisella, Leuconostoc và một số chủng

Lactobacilli khác cũng tạo ra số lượng acid lactic, CO2 và ethanol bằng nhau từ

glucose thông qua con đường hexose monophosphate hoặc pentose phosphate(Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010) Trong quá trình lên men lactic dịhình chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩmphụ khác như acid acetic, ethanol, CO2… Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạothành ester có mùi thơm Sản phẩm phụ tạo thành phụ thuộc vào giống vi sinh vật,môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh Acid lactic thường chiếm 40%,acid succinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10% và các loại khí khác gần 20%lượng sản phẩm tạo thành

Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men tạo ra môi trường acidkhông thuận lợi cho sự phát triển của nhiều vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng thực

phẩm như acid lactic, acid acetic và acid propionic Acid thường thể hiện tính khángkhuẩn thông qua việc can thiệp tính ổn định điện thế trên màng tế bào, ức chế hoạtđộng vận chuyển, làm giảm pH trong tế bào và ức chế chức năng chuyển hóa Nó cótính kháng khuẩn diện rộng ức chế cả vi khuẩn gram dương và gram âm cũng nhưnấm men và nấm mốc (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010).Một ví dụđiển hình là acid propionic được sản xuất bởi vi khuẩn sinh acid propionic, nhữngchủng này hình thành một số sản phẩm bảo quản sinh học cơ bản, có hoạt độngkháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh bao gồm nấm men và nấm mốc.

Ngoài các acid hữu cơ, các chủng khởi động quá trình lên men lactic cũng cóthể sản xuất một loạt các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con đường lênmen dị hình, H2O2 được sản xuất trong quá trình tăng trưởng hiếu khí và diacetylđược hình thành từ sự phân hủy pyruvate có nguồn gốc từ citrate Đặc biệt, H2O2 cótác dụng oxy hóa mạnh mẽ trên màng lipid, protein của tế bào và được sản xuấtbằng cách sử dụng các enzyme như protein flavo oxidoreductases peroxidaseNADH, NADH oxidase và oxidase α-glycerophosphate (Rattanachaikunsopon vàPhumkhachorn, 2010)

Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy rằng mỗi hợp chất kháng khuẩn đượcsản xuất trong quá trình lên men ngăn cản vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn gây hưhỏng thực phẩm trước khi nó có thể tồn tại hoặc phát triển trong thực phẩm hoặc đồuống, kể từ thời điểm sản xuất tới thời gian tiêu thụ Khả năng kháng khuẩn của vikhuẩn lactic đã được xác định bởi khả năng kháng lại các vi khuẩn không mongmuốn nhờ vào các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất ra trong quá trình lên men(Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010)

1.2.3.1 Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn lactic sản sinh

LAB biểu thị một loạt các hoạt động kháng khuẩn Trong số các hoạt động

đó, việc sản xuất acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất Ngoài ra, một sốchủng LAB được biết đến để sản xuất các hợp chất kháng khuẩn như ethanol, acidformic, acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin và bacteriocin.Bên cạnh việc sản xuất ra hợp chất như bacteriocin, một số LAB còn có thể tổng

hợp peptide kháng khuẩn khác góp phần vào việc bảo quản thực phẩm một cách antoàn Một trong những đặc điểm của các hợp chất kháng khuẩn là khả năng chống

lại các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Helicobacter pylori, Escherichia coli,

Salmonella (Vuyst và Leroy, 2007).

a Acid hữu cơ

Sản phẩm chính của quá trình lên men là các acid hữu cơ, tùy vào từng loại

vi sinh vật và điều kiện môi trường mà sản phẩm acid là khác nhau (Yang, 2000) Acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic Acid lactic làm

giảm pH môi trường dẫn đến ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh nên

có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Khi acid lactic đi qua màng

tế bào, nó sẽ giải phóng ra proton H+, làm acid hóa nội bào, phá hủy cơ chế vậnchuyển qua màng tế bào gây chết tế bào vi khuẩn (Đặng Phương Nga và ctv, 2007).Mặt khác, pH giảm cũng ức chế quá trình đường phân, tế bào vi khuẩn cạn kiệtnăng lượng dẫn đến chết tế bào

Quá trình lên men lactic dị hình cho sản phẩm acid acetic và acid, có thểtương tác với màng tế bào vi khuẩn gây acid hóa nội bào và làm biến tính protein.Acid acetic thể hiện tính kháng khuẩn hiệu quả hơn acid lactic điển hình là với

Listeria monocytogenes và Bacillus cereus Acid acetic cùng với acid acetic làm

giảm pH môi trường và do đó làm tăng khả năng kháng khuẩn của acid lactic(Yang, 2000)

b Hydrogen peroxide và carbon dioxide

Tính kháng khuẩn của hydrogen peroxide chủ yếu thông qua việc tạo ra cácchất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc superoxide và các gốc hydroxyl

tự do Các chủng Lactobacillus, Lactococcus sản xuất hydrogen peroxide có khả năng ức chế Staphylococcus aureus và Pseudomonas sp.

Carbon dioxide được sản xuất thông qua con đường lên men lactic dị hình cóthể ức chế enzyme decarboxylase và sự tích tụ của khí carbon dioxide trong lớp đôilipid kép có thể gây ra rối loạn chức năng trong thẩm thấu Carbon dioxide có khả

năng ức chế nhiều vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm đặc biệt là vi khuẩn gram âm,mức độ ức chế khác nhau đáng kể giữa các vi sinh vật (Yang, 2000).

khuẩn Listeria, Salmonella, Yersinia, Escherichia coli và Aeromonas.

Acetaldehyde 10 – 100 ppm ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus,

Salmonella typhimurium và E coli trong các sản phẩm sữa (Yang, 2000) d Acid

béo

Các acid béo không bão hòa có khả năng ức chế vi khuẩn gram dương, cáchoạt động kháng nấm của acid béo phụ thuộc vào chiều dài chuỗi và pH của môitrường (Yang, 2000)

e Reuterin

Reuterin có khả năng ức chế sự phát triển của hầu hết các vi sinh vật có hạinhư vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm men, nấm mốc, kí sinh trùng vàthậm chí cả virus Reuterin có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do nó cạnh tranh vớicác ribonucleotide trong việc gắn với vị trí nhận biết ribose của ribonucleotidereductase - enzyme đầu tiên khởi động quá trình tổng hợp DNA

f Bacteriocin

Hầu hết vi khuẩn lactic đều tổng hợp được bacteriocin hay những chất gầngiống bacteriocin nên chủng loại của các hợp chất kháng khuẩn này rất đa dạng nhưlactacin, nisin, acidolin,… Các chất này có bản chất là kháng sinh nên có thể ức chếcác tế bào trong cùng họ hay khác họ (Đặng Phương Nga và ctv, 2007) Từ rất lâucác bacteriocin này đã được ứng dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, điển hình

là nisin Năm 1953, dạng thương phẩm của nisin là Nisaplin xuất hiện trên thịtrường như chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận

Nisin là chất bảo quản an toàn có nguồn gốc sinh học (Ngô Thị Phương Dung vàctv, 2011).

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ởriboxom của cả vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương để ức chế các vi sinh vậtcạnh tranh khác Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tínhkháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm nhưng không trực tiếp làm chết

vi sinh vật Chính vì lý do này nên thời kỳ đầu người ta chỉ tập trung vào phát triểncác chất kháng sinh, còn các chế phẩm bacteriocin bị xem nhẹ và không được quan tâmđúng mức Theo thời gian sử dụng chất kháng sinh, hiện tượng kháng thuốc xuất hiện vàngày càng trở nên trầm trọng đã gián tiếp xác nhận đặc tính quý giá của các bacteriocin lànguy cơ gây ra hiệu ứng trên của chúng rất thấp Nhờ vậy mà việc nghiên cứu, sản xuất

và sử dụng các bacteriocin đã được phục hồi và phát triển Các chế phẩm bacteriocin điểnhình là nisin, diplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ

Lactococcus), pediocin A, pediocin PA–1, pediocin

AcH (từ Pediococcus), lactocidin, acidolin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin

F, lactocin 27, helveticin J (từ Lactobacillus), leuconocin S, carnocin UI49,

micrograd (từ Leuconostoc), propionicin PLG–1, jensenin G

(từPropionicbacterium) (Lê Thị Hồng Vân, 2008).

Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin Một vài bacteriocinđược sản xuất bởi vi khuẩn lactic như nisin không chỉ ức chế các loài liên quan chặtchẽ mà còn chống lại các tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm và vi khuẩngram dương, thêm vào đó bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn sovới các giống khác Vì vậy, trong những năm gần đây bacteriocin đã nhận được sựquan tâm đáng kể trong việc sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và ứngdụng trong dược phẩm vì tính an toàn của chúng

Những nghiên cứu đã được thực hiện để giải quyết mối quan hệ giữa cấutrúc và chức năng của bacteriocin lớp I và lớp II Phần lớn bacteriocin trong lớp I và

II hoạt động trong trong vùng các phân tử có kích thước nano, gây ra tính thấm củamàng dẫn đến sự hao hụt các thành phần của màng, hao tổn các ion, ATP và

các phân tử quan trọng khác từ vi khuẩn đích (Vuyst và Leroy, 2007).

Ngoài ra Klaenhammer (1999) đã đề nghị thêm nhóm 4, là nhóm chứa cácbacteriocin phức tạp, đòi hỏi carbohydrate hay lipid để có hoạt tính Tuy nhiênbacteriocin của nhóm này chưa được miêu tả nhiều ở mức độ sinh hóa để mở rộngđịnh nghĩa Nhóm này bao gồm cả glycoprotein như lactocin hoặc lipoprotein nhưlacstrepcin (J.Delves-broughton và ctv, 1996)

*Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Mặc dù bacteriocin có thể được tìm thấy trong nhiều vi khuẩn Gram dương

và Gram âm, nhưng những sản phẩm được sản xuất bởi LAB đã nhận được sự quantâm đặc biệt trong những năm gần đây do ứng dụng tiềm năng của nó trong ngànhcông nghiệp thực phẩm như chất bảo quản tự nhiên (Vuyst và Leroy, 2007)

Bacteriocin được sản xuất bởi LAB là các peptide hoặc protein nhỏ đượctổng hợp do ribosome có hoạt tính kháng lại các vi khuẩn gram dương, trong khi tếbào sản xuất miễn nhiễm với chính bacteriocin do chúng tạo ra Nó có khả năngkháng lại các vi sinh vật gây hư hỏng và các tác nhân gây bệnh truyền qua thực

phẩm như Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus Bên cạnh hoạt động

kháng khuẩn đối với các vi khuẩn không mong muốn, bacteriocin còn được chorằng góp phần vào tính cạnh trạnh giữa các tế bào sản xuất Người ta đã chứng

minh được hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Gram âm nhưE coli và Salmonella của

bacteriocin nhưng thường chỉ khi màng ngoài của chúng đã bị tổn thương, ví dụnhư sốc áp suất thẩm thấu, xử lý pH thấp, bị tác động bởi các chất hoạt động bề mặthoặc tác nhân chelate hoặc sau khi xử lý với dòng điện hoặc áp suất cao (Vuyst vàLeroy, 2007)

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất hợp chất kháng khuẩn của vi

khuẩn lactic

1.3.1 Môi trường nuôi cấy

Kelstrup và Gibbons (2002) đã thấy rằng sự gia tăng tính nhớt của dịch môitrường bằng cách thêm agar, dextran, glycerol hay tinh bột sẽ gia tăng năng suất sản

sinh bacteriocin của vi khuẩn Streptococcus cô lập từ khoang miệng của người và

động vật gặm nhắm Một nghiên cứu khác của Riley (2007) về staphylococcin 1580cho thấy nuôi trong môi trường bán rắn sẽ cho năng suất lớn hơn 20 lần so với môitrường lỏng.

Quá trình tổng hợp bacteriocin của Streptococcus mutans chỉ diễn ra trong

điều kiện môi trường nuôi cấy nhất định Sự sản xuất bacteriocin của các chủng

Streptococcus mutans có thể được gia tăng nếu bổ sung 4% cao nấm men vào môi

trường cơ bản Trypticase, còn các chủng Corynebacteria và Staphylococcus phụ

thuộc vào hàm lượng amino acid trong môi trường nuôi cấy Khả năng sản sinh

bacteriocin của Staphylococcin 426 tăng nếu thêm 0,5% mannitol vào môi trường

brain heart infusion nhưng ngược lại điều đó làm giảm khả năng sản sinh

bacteriocin của Staphylococcin 414 Glucose làm tăng khả năng sản sinh bacteriocin của Streptococcin A–FF22 nhưng lại làm giảm khả năng sản sinh bacteriocin của

Streptococcin B–74628 Những nghiên cứu khác cho thấy thành phần môi trường

nuôi cấy là rất quan trọng (Kelstrup và Funder-Nielsen, 1997)

1.3.2 Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau như nhiệt độ, thời gian, oxy và pHảnh hưởng đến khả năng sản sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn Bacteriocinđược sản xuất nhiều hơn ở điều kiện nhiệt độ tối ưu, nhiệt độ quá cao ngăn cản sựsản sinh bacteriocin (Lê Thị Hồng Vân, 2008)

Việc sản sinh bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương thường xảy ra trongkhoảng pha log đến pha ổn định, lượng bacteriocin ở các pha trong chu kỳ tăng

trưởng là khác nhau Bacteriocin được Streptocin STH1 sản xuất nhiều nhất trong suốt pha log và giảm dần khi bước vào pha ổn định ngược lại Streptococcin A –

FF22 bắt đầu sản sinh bacteriocin ở cuối pha log và hoạt tính giảm dần khi nuôi kéo

dài Staphylococcin C55 sản sinh bacteriocin bắt đầu ở pha log và đạt tối đa trong

khoảng 24 đến 48 giờ phát triển sau đó suy tàn dần (Lê Thị Hồng Vân, 2008)

Meitert (2005) cho thấy rằng một vài chủng C diphtheriae sản xuất

bacteriocin liên tục nhưng một vài chủng khác lại sản xuất gián đoạn Theo nghiên

cứu của Lachowicz (2002) về khả năng sản sinh bacteriocin của Staphylococcin A–

1262a trên môi trường rắn hoạt tính được nhận thấy đầu tiên sau 8 giờ, đạt đến tối

đa từ 18 đến 24 giờ và sau đó giảm dần về 0 Những nghiên cứu khác cũng cho kếtquả rằng hoạt tính bacteriocin bị mất đi khi nuôi kéo dài Sự ảnh hưởng này liênquan đến sự xuất hiện của chất làm bất hoạt bacteriocin hay enzyme phá hủy hoặcthay đổi chúng

Việc thay đổi pH môi trường cũng quyết định đến khả năng sản sinhbacteriocin của một số chủng vi khuẩn Một số nghiên cứu cho thấy rằng khả năng

sản sinh bacteriocin của Streptococcin A–FF22 trên agar Todd–Hewitt tăng khi điều

chỉnh pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến 6,5 (Lê Thị Hồng Vân, 2008)

1.3.3 Chất ức chế và chất làm bất hoạt bacteriocin

Davie và Brock (2003) cho thấy rằng acid teichoic có trong lớp vỏ tế bào S.

faecalis subsp zymogenes X14 làm tăng tính miễn dịch của vi khuẩn với bacteriocin

do chính nó sản xuất ra (hemolysin) Việc thải ra các sản phẩm ức chế trong quátrình phát triển đã làm mất bacteriocin trong môi trường nuôi cấy Hoạt tính của

bacteriocin trong dịch nổi môi trường nuôi cấy Staphylococcin 1580 được gia tăng

khi thẩm tách, điều đó cho thấy rằng các chế phẩm này có thể chứa chất ức chếbacteriocin

Một số bacteriocin được sản xuất bởi Bacteriocinogenic có thể bị phá hủy bởi protease Tác động này lần đầu tiên được chứng minh ở Serratia marcescens,

Clostridium botulinum và Streptococcus nhóm A Việc đun chế phẩm bacteriocin ổn

định nhiệt sẽ làm bất hoạt protease do đó bảo vệ được bacteriocin (Lê Thị HồngVân, 2008)

1.4 sự phân bố của vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên Thường gặp nhất và nhiềunhất là trong các loại thực phẩm lên men như : sữa và các sản phẩm từ sữa (sữachua, phomat, bơ chua ) trong thịt và các sản phẩm từ thịt (xúc xích, salami, nemchua ) trong các loại thủy sản, ngũ cốc ủ chua; trong bia, rượu vang và rau quảmuối chua Các môi trường này hoặc có sẵn, hoặc được bổ sung các nguồn cơ chấtcần thiết, đặc trưng cũng như đảm bảo các điều kiện thích hợp cho sự phát triển của

chúng Một số các đại diện thường xuất hiện ở nhóm sản phẩm này là: S lastic, S.

cremort's, L plantarum, L bulgaricus, L cesei, L brevis, L oenos, L cremort's.Vi

khuẩn lactic còn có ở trong đất, trên bề mặt thực vật (chủ yếu là rau quả và các loạihạt) Chúng sống nhờ các chất sinh trưởng tiết ra từ mô cây Người ta cũng tìm thấy

vi khuẩn lactic trên da, trong tuyến nước bọt, ở niêm mạc và hệ tiêu hóa (nhất là ởđoạn ruột cuối) của người và một số động vật Hầu hết các loài được phân lập từ đườngruột và các nguồn thịt, cá đều có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh

Đây 1à một đặc tính quý báu của vi khuẩn lactic hiện đang được đẩy mạnh khai thác

và đã ứng dụng có hiệu quả

1.4.1 Sữa chua lên men

Sữa chua hay yaourt thực chất là sữa bò tươi được cho lên men với các chủng

vi khuẩn có lợi cho đường ruột Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus

thermophillus Chúng chuyển hóa sữa thành lactic, tạo ra độ chua hấp dẫn Hầu như các

loại sữa chua đều được sản xuất từ sữa thanh trùng, do đó mỗi quá trình vi sinh vật xảy ratrong sữa chua là do hệ sinh vật từ giống chuẩn gây ra

Các chủng lên men lactic chủ yếu là giống:

-Lactobacterium bungaricus: là trực khuẩn dài, nhiệt độ phát triển tối ưu là

200C, có khả năng lên men glucose, lactose Có khả năng tạo acid cao (3,7 % acid

lactic)

- Lactobacterium casei: là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự nhiên.

Yếm khí tùy tiện, lên men tốt đường glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có acidlactic từ 0,8 – 1 % Ở điều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng từ 10 – 12 giờ.Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển 100C, tối

ưu là ở 360C và tối đa là 450C, chúng thủy phân casein và gelatin rất yếu

- Steptococus lactic : là cầu khuẩn, sinh trưởng và lên men mạnh khi nuôi

cấy 280C, phát triển khá ở 350C và thấp nhất ở 200C

Hình 1.2 Chủng vi khuẩn Lactobacteriumbungaricus

Sữa chua có giá trị dinh dưỡng cao, chứa đầy đủ các chất protein (với nhiềuacid amin cần thiết nhất là lysine), glucid, lipid, các loại muối khoáng (nhất làcanxi) và vitamin chủ yếu vitamin nhóm B và nhóm A

- Ngoài giá trị dinh dưỡng trên thì sữa chua còn cung cấp cho cơ thể 1 lượng

lớn các vi khuẩn có lợi (Lactobacillus acidophilus, Bifido bacterium…) hỗ trợ khả năng

tiêu hóa và giúp tăng cường chất đề kháng

1.4.2 Rau cải muối chua

Muối chua rau củ nhằm hai mục đích cơ bản: bảo quản nguyên liệu và làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan của rau củ

Nguyên tắc muối chua rau quả là tạo điều kiện thuận lợi để phát triển vi khuẩn lactic đồng thời hạn chế tác dụng của vi khuẩn gây thối rữa

Các vi khuẩn lactic có tham gia trong quá trình lên men như: L brevis, Str

Cremoris…

Hình 1.3 Chủng vi khuẩn L brevis (a) và chủng Str Cremoris (b)

1.4.3 Các sản phẩm lên men từ thịt (nem chua)

Sản phẩm lên men từ thịt là sản phẩm hình thành do lên men lactic từ thịt, được sản xuất khắp nơi trong và ngoài nước (xúc xích, salami, nem chua )

Các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men thuộc họ Latobaceriaceae là

các vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, không di động và hiếu khí tùy tiện

Vi khuẩn lactic đồng hình: L acitophilus, L bulgarius, L delbruckii, Str

Lactic, Str Cremoris…

Vi khuẩn lactic dị hình: Str Cumoris, Str Falecalis, L brevis, L lycopssici.

1.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh hợp chất kháng khuẩn trong và ngoài nước

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinhtổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên cácnghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin còn ít và chưa thu được những kết quảkhả quan

- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của loài Lactobacillus

plantarum L24 Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy Trung tâm

Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Một số đặc tính của Bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn lactobacill Lê Thị

Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh.Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam

- Năm 2004, các tác giả Tăng Thị Chính, Đặng Đình Kim thuộc Viện côngnghệ môi trường - Viện KH&CN Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm chếphẩm trong nuôi tôm cao sản Một trong những loại vi sinh vật được dùng

là Lactobacillus Chế phẩm có tác dụng làm tăng tính ngon miệng, giúp tiêu hoá

các chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đề kháng, phòng ngừa các

bệnh đường ruột như nhiễm E coli, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại.

Do đó nâng cao năng suất nuôi tôm

- Một số tính chất của bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phânlập từ sữa bò Các tác giả Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú và Lê Thanh Bình

thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện KHCN Việt Nam, năm 2008

- Năm 2011, các tác giả Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly vàHuỳnh Xuân Phong thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học, TrườngĐại Học Cần Thơ đã nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năngsinh chất kháng khuẩn Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn lactic và đươc kiểm tra

tính kháng khuẩn 23 dòng biểu hiện tính kháng khuẩn chỉ thị B subtilis, trong đó có 10

dòng có khả năng tổng hợp bacteriocin

Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào cácsản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan cónhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên Bên cạnh đó,nhiều nơi đã sử dụng Bacteriocin trong quá trình làm nem chua Kết quả đã kéodài thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp phần tạo hương vị chonem chua

Thêm vào đó là các nghiên cứu khác ứng dụng khả năng kháng khuẩn đểtạo nên probiotic như:

* Từ bã khoai mì mà ngay cả động vật cũng chê, các chuyên gia thuộc ViệnSinh Học Nhiệt Đới đã tạo ra thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi kể cảthủy sản ProBio-S lại là chế phẩm dạng lỏng, được sản xuất bằng cách cho bã tươi vàonhững bao tải lớn rồi cấy chế phẩm EM-S chứa nhiều chủng vi sinh vật hữu ích như

Bacillus spp., Lactobacillus spp., Saccharomyces spp với tỷ lệ 1lít

EM-S/25kg bã (1ml chứa 1010 tế bào vi sinh vật hữu ích) Ba ngày ủ làm cholượng vi sinh vật tăng mạnh Với những chủng vi sinh vật hữu dụng nói trên, chếphẩm ProBio-S giúp cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột của vật nuôicũng như giảm lượng vi sinh vật có hại Nhờ thế mà vật nuôi tiêu hoá tốt hơn,giảm tỷ lệ bệnh đường ruột, tăng trọng nhanh hơn Giá thành của ProBio-S là5.000-6.000 đồng/kg Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 con lợn 1 tháng tuổicho thấy sau ba tháng được ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1-

1,3kg so với những con đối chứng (chỉ ăn thức ăn bình thường).

* Võ Thị Hạnh với chế phẩm Probiotic Bio I và Bio II gồm hỗn hợp các visinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đã nhậnđược giải thưởng WIPO dành cho nhà khoa học nữ xuất sắc nhất

* Trong thủy sản, công ty công nghệ hóa sinh Việt Nam đã sản xuất những sản phẩm phục vụ công tác môi trường nuôi tôm, cá đạt hiệu quả:

- BIO - DW - làm sạch nước, nền đáy ao nuôi; ngăn chặn dịch bệnh; tăng sản lượng tôm, cá

- BIO - PROBIOTIC - Thức ăn bổ sung cho tôm, cá

- EMC - Phức hợp vi sinh vật có lợi, VITAMIN và các ENZYME hữu hiệudùng nuôi tôm

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Y học hiện phải đối mặt với thực tế nhiều loại thuốc đang mất dần hiệu quảtrong điều trị do bị sử dụng quá thường xuyên Thêm vào đó, các chất có tínhkháng khuẩn được đưa vào cả chất tẩy rửa đến xà phòng, mỹ phẩm, kích thích sựlờn thuốc ở các vi khuẩn cần tiêu diệt

Bởi vậy, phát hiện ra loại thuốc kháng sinh chống lại được sự lờn thuốcđược xem như một hy vọng của ngành dược phẩm tương lai Các nhà nghiên cứuchuẩn bị đưa ra thị trường một loại thuốc kháng vi khuẩn có chứa loại protein nàyvới tên gọi Jensenin P

Hiên nay việc nghiên cứu , ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinhtổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm

Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công , góp phầnvào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin là một chấtkháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này màviệc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn

Năm 1970, nhóm tác giả Kekessy và Piguet thuộc viện Vệ sinh và An toànthực phẩm - Thuỵ Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mới trong việc phát hiệnbacteriocin Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên đĩa môi trường thạch

dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0,5 mm bằng cách khoét bỏ agar trênđĩa Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin vào giếng, sauthời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõquanh giếng.

Năm 1976, nhóm tác giả John Tagg, Adnan Dajani và Wannamaker thuộckhoa vi sinh- Trường Đại Học Otago, New Zealand, Trường Đại Học DượcMinnesota, Minnesota đã nghiên cứu về những loại bacteriocin của vi khuẩn gramdương và cho ra nhiều kết quả có giá trị Nghiên cứu đã cho biết được tính đốikháng của bacteriocin, cách đặt tên và phân loại bacteriocin, chiết tách và tinhsạch bacteriocin, phân tích hoạt tính bacteriocin, các loại hoạt động củabacteriocin và ứng dụng của bacteriocin

Năm 1999, các tác giả Callewaert và Vuyst thuộc Khoa công nghệ sinh họcứng dụng -Đại học Brussel, Bỉ đã nghiên cứu việc sinh tổng hợp bacteriocin của

Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các

sản phẩm lên men Việc sinh tổng hợp thu nhận bacteriocin bị ức chế bởi nồng độcủa nguồn nitrogen

Cũng trong năm 1999, nhóm tác giả Farida Khalid, Roquya Siddiqi vàNaheed Mojgani thuộc khoa vi sinh -Trường đại học Karachi-Pakistan đã nghiêncứu tìm ra một loại bacteriocin mới có tên lactocin LC-09 Lactocin LC-09 được

phân lập từ chủng vi khuẩn Lactobacillus có trong một mẫu bệnh Loại này ức chế được một số loài thuộc giống Lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác như

Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và S peyogenes Đặc tính của Lactocin

LC-09 là chịu nhiệt (4 giờ ở 1000C) và thích hợp với môi trường có pH acid Loạibacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzim protease Có thể dùngacridine orange, ethidium bromide để gây đột biến trong việc sản sinh ra loạibacteriocin này

Năm 2002 Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất khángkhuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin Bacteriocin được sử dụngnhư một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất

bảo quản khác Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻcon người.

Năm 2004, nhóm tác giả Todorov SD, Van Reenen CA và Dicks KM thuộckhoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng

hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum ST13BR , một chủng được

phân lập từ bia đại mạch Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia đại mạch (kích thước phân tử

10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas

aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiellapneumoniae và Escherichia coli.

Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinhtổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợpbacteriocin là lớn nhất

Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên mentruyền thống suan - tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếp tụcnghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợpbacteriocin

Năm 2006, Stefan Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF

cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi Lactobacillus do công ty

hoá chất BASF của Đức phát triển Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các

bệnh về răng miệng Chủng Lactobacillus mới có tên là L anti-caries có khả năng

sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối không thẻ dính trên

bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng

Tháng 3/2007 nhóm tác giả Todorov và Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đạihọc Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của

chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14 kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E.

coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiellapneumoniae

vàLactobacillus curvatus Sự phát triển của chủng ST712BZ trên môi trường BHI,

M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc

sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800 AU/ml) được ghi nhận trên môi trườngMRS sau 24h Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH cóảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loạimôi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất.

Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng

để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn

Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gâybệnh hoặc virus mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin Lợi ích chính của việc sửdụng bacteriocin là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lạithuốc kháng sinh Bacteriocins còn bị phân hủy nhanh bởi những động vật để màkhông còn cặn bã trong thịt

Các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tổng hợp Klemson vừa phát hiện ra mộtloại thuốc chống vi khuẩn mới không gây tính lờn thuốc từ chính những vi khuẩntạo ra loại pho mát Thụy Sĩ

Những vi khuẩn này tiết ra một loại protein có tên bacteriocin, tạo nên tínhchất của pho mát Các thử nghiệm sơ bộ cho thấy chúng có tác dụng chống lại hơn

150 loại vi khuẩn thường gặp

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh

Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM

2.1.2 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 23/04/2014 đến ngày 30/06/2014

2.2 vật liệu nguyên cứu

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn lactic

Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn lactic là những sản phẩm thực phẩm lên men

truyền thống được phân lập từ các nguồn khác nhau được trình bày Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách mẫu phân lập vi khuẩn lactic

Kim chi Hàn Quốc 2 Siêu thị coopmart miền đông, Bình Thạnh

Sữa chua uống yakult 3 Siêu thị Big C, Gò Vấp

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng nghiên cứu là vi khuẩn Escheria coli,

Salmonella, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis và Listeria monocytogen

được cung cấp giống bởi Phòng Thí Nghiệm Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm – Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

2.2.3 Hóa chất dụng cụ và thiết bị

2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy và phân lập

Môi trường MRS broth và MRS agar

Môi trường TSB (HiMedia - Ấn Độ)

Môi trường TSA (HiMedia - Ấn Độ)

2.2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

a Dụng cụ

Erlen loại 100 ml, 250 ml Dây cấy ria, que cấy trang

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu

Sử dụng các dụng cụ như kẹp gắp hoặc kéo cắt mẫu tiến hành lấy mẫu đạidiện tại địa điểm thu mẫu cho vào túi nlong vô trùng ( khối lượng mẫu lấy tối thiểu

là 200 g) Bảo quảnmẫu cho vào hộp kín vận chuyển về phòng thí nghiệm Cân 10 gmẫu ( sai số ± 0,1) cho vào bao ny long vô trùng đồng nhất mẫu Trường hợp mẫukhông được phân tích ngay cần bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở nhiệt độ -40C cho đếnkhi phân tích Trước khi tiến hành phân tích các mẫu đã được bảo quản lạnh cầnđược rã đông mẫu trong điều kiện vô trùng bằng cách để mẫu ở nhiệt độ 2 – 50Ctrong 18 h hoặc nhiệt độ phòng trong 2 giờ (Trần Linh Thước, 2010)

2.3.2 Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những cơ bản nhưng rất quan trọngtrong quá trình phân tích vi sinh Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽgiúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích Phương pháp phaloãng mẫu (mẫu lõng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vậtphân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu

Đối với mẫu lỏng: dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa

9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng 10-1 Tiếp tục từ ốngnghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta

được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đến nồng độcần thiết.

Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10 g mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng

ta được nồng độ pha loãng 10-1 Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1 ml dịchpha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch phaloãng ta được độ pha loãng 10-2 Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng( Phạm Minh Nhựt, 2013)

Hình 2.1 phương pháp pha loãng mẫu

2.3.3 Phương pháp tăng sinh

Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp Môitrường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vilượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảmbảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật vàmôi trường

Đối với giống vi khuẩn lactic được giữ trên môi trường MRS agar hay trongglycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa10ml môi trường MRS broth Sau đó tiến hành nuôi cấy ở 370C trong 48 giờ

Đối với giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trongglycerol,tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa