Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng, nước dừa và than hoạt tính lên sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà á mentha arvensis l ​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNGNGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–TP–MT  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNGNGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–

TP–MT 

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu HươngSVTH: Nguyễn Chí Thanh

MSSV: 1515100010Lớp: 15HSH01

TP.HCM, tháng 8/ 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNGNGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–

TP–MT 

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu HươngHVTH: Nguyễn Chí Thanh

MSHV: 1515100010Lớp: 15HSH01

TP.HCM, tháng 8/ 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứuthực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS Nguyễn Thị Thu Hương – giảng viên TrườngĐại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiêncứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ SinhHọc Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc TrườngĐại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàntrung thực

Đồ án không sao chép dưới bất kì hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lậnnào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

TP.HCM, ngày 18 tháng 08 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Chí Thanh

LỜI CẢM ƠN

Trong cuộc sống không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗtrợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Trong suốt thờigian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sựquan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinhthần và đã ủng hộ em trong suốt thời gian qua

Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này ngoài sự nổ lực của bản thân, em còn được

sự hỗ trợ từ rất nhiều người, em xin chân thành gửi lời cảm ơn:

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công NghệSinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ ChíMinh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu chochúng em trong suốt thời gian học tập tại trường Với vốn kiến thức được tiếp thu trongquá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài mà còn là hành trangquí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Đặc biệt cho phép chúng em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị ThuHương – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấpnhững tư liệu quý giá cho chúng em thực hiện tốt bài đề tài tốt nghiệp này Cảm ơn cô đãtiếp thêm cho chúng em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai

Qua bài đề tài thực nghiệm này, chúng em cũng xin chân thành cảm ơn ban giámhiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho chúng em tiếpcận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đề tài thực nghiệm giúp chúng emnắm vững những kiến thức đã học Bên cạnh đó, chúng em cũng xin cảm ơn thầy HuỳnhVăn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ chúng em

trong suốt thời gian làm đề tài thực nghiệm Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy

mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đề tài thực nghiệm

Cuối cùng chúng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong

sự nghiệp trồng người

TP.Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện đề tài

Nguyễn Chí Thanh

MỤC LỤC Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Phương pháp nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

6 Kết quả đạt được của đề tài 4

7 Kết cấu đồ án 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 5

1.1.1 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro 5

1.1.2 Sơ lược một số phương pháp nuôi cấy in vitro 7

1.2 Sơ lược về nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 9

1.2.1 Môi trường khoáng cơ bản 9

1.2.1.1 Môi trường MS 11

1.2.1.2 Môi trường SH 15

1.2.1.3 Môi trường N6 15

1.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng và hợp chất hửu cơ 16

1.2.2.1 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 16

1.2.2.2 Sơ lược về than hoạt tính và nước dừa trong nhân giống in vitro 20

1.3 Giới thiệu sơ lược về cây Bạc hà 24

1.3.1 Phân loại 24

1.3.2 Nguồn gốc, phân bố, và đặc điểm hình thái sinh học 26

1.3.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố 26

1.3.2.2 Đặc điểm hình thái sinh học 27

1.3.2.3 Điều kiện sinh thái 30

1.3.3 Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và ở Việt Nam 31

1.3.3.2 Ngoài nước 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 34

2.2 Phương pháp thí nghiệm 34

2.2.1 Chọn mẫu thí nghiệm 34

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 34

2.2.3 Bố trí thí nghiệm 35

2.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L 35

2.2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường SH (Schenk và Heldebrandt) lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L 36

2.2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường N6 (Chu et al, 1975) cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L 37

2.2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nước dừa lên sự phát triển của Bạc hà Á Mentha Arvensis L 38

2.2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của than hoạt tính lên sự tăng

trưởng của Bạc hà Á Mentha Arvensis L 39

2.4 Chỉ tiêu theo dõi 40

2.5 Thống kê và xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiếnlên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 41

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường SH cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 48

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường N6 cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 55

3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà, tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần 62

3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của than hoạt tính lên sự tăng trưởng của Bạc hà, tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần 70

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

4.1 Kết luận 78

4.2 Kiến nghị 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số môi trường nuôi cây cơ bản được sử dụng phổ biến trong nuôi

cấy in vitro 10Bảng 2.1 Ảnh hưởng của MS cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự pháttriển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà 35Bảng 2.2 Ảnh hưởng của SH cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự pháttriển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà 36Bảng 2.3 Ảnh hưởng của N6 cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự pháttriển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà 37Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây conhoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà 38Bảng 2.5 Ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình tăng trưởng hình thành rễphát triển chồi ở cây từ đoạn cắt thân Bạc hà 39Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc

hà Á Mentha Arvensis L và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau

8 tuần nuôi cấy 42Bảng 3.2 Ảnh hưởng của môi trường SH cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc

hà Á Mentha Arvensis L. 49Bảng 3.3 Ảnh hưởng của môi trường n6 cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc

hà Á Mentha Arvensis L và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau

8 tuần nuôi cấy 56

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nước dừa lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 65

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á

Mentha Arvensis L từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 73

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của môi trường MS lên sự tăng trưởng của cây bạc hàsau 8 tuần nuôi cấy 43Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường MS lên sự tăng trưởng của cây bạc hàsau 8 tuần nuôi cấy 44Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của môi trường SH lên sự tăng trưởng của cây Bạc hàsau 8 tuần nuôi cấy 50Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của môi trường SH lên sự tăng trưởng của cây bạc hàsau 8 tuần nuôi cấy 51Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của môi trường N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hàsau 8 tuần nuôi cấy 57Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của môi trường N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hàsau 8 tuần nuôi cấy 58Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 66Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của nước dừa lên sư tăng trưởng của Bạc hà Á 67Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á

Mentha Arvensis L và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8

tuần nuôi cấy 74Biểu đồ 3.10 Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á

Mentha Arvensis L và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8

tuần nuôi cấy 75

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. 24Hình 3.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến MS lên sự tăng trưởngcủa cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 45Hình 3.2 Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiến lên khả năng tăng trưởng từ

đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L không qua gia đoạn cảm ứng

sau 8 tuần nuôi cấy 46Hình 3.3 Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến SH lên sự tăng trưởng củacây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 52Hình 3.4 Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến SH lên sự tăng trưởng củacây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 53Hình 3.5 Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến N6 lên sự tăng trưởng củacây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 59Hình 3.6 Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến N6 lên sự tăng trưởng củacây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 60Hình 3.7 Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 63Hình 3.8 Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 64Hình 3.9 Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á

Mentha Arvensis L………. 71Hình 3.10 Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á

Mentha Arvensis L………. 72

: Indol butyric acid: Indolebutyric acid: Kinetin

: Knudson C (1946): Murashige và Skoog (1962): Nitsch (1969)

: Naphthyl acetic acid: Ngày sau cấy

: Polyvinylpyrrolidone: Ammonium Sunfate: Trung bình

: Thidiazuron: Vacin và Went (1949): Lloyd và McCown (1980): Zeatin

: Acid 2,4-Diclorophenoxiacetic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNGNGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–

TP–MT 

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu HươngSVTH: Nguyễn Chí Thanh

MSSV: 1515100010Lớp: 15HSH01

TP.HCM, tháng 8/ 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNGNGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–

TP–MT 

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu HươngHVTH: Nguyễn Chí Thanh

MSHV: 1515100010Lớp: 15HSH01

TP.HCM, tháng 8/ 2016

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Từ xa xưa, cây Bạc hà đã được con người biết đến là một vị thuốc rất hữuhiệu, và tinh dầu Bạc hà còn được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau,…

Cây bạc hà Châu Á còn được gọi là Bạc hà Á Mentha Arvensis L cho hàm lượng

tinh dầu rất cao (80 90%) Nhiều năm qua, nhu cầu sử dụng những nguyên liệu

có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được ưu tiên sản xuất số lượng lớn Để đảm bảonguồn cung cấp cho nguyên liệu sản xuất các chế phẩm từ Bạc hà ngày một tăngcao thì việc tập trung vào nghiên cứu quy trình nuôi trồng nhân nhanh giống câyBạc hà Á là hết sức cần thiết

Hầu hết cây Bạc hà được nhân giống chủ yếu bằng các phương pháp truyềnthống như giâm cành, gieo hạt,… Trong những nơi khô hạn, việc nhân giống củaBạc hà gặp nhiều khó khăn Vì vậy, kỹ thuật invitro được coi là phương pháp hữuhiệu cho phép nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật, trong đó có loài dược thảo

quan trọng như Bạc hà Mentha Arvensis L Nhân giống invitro đã được chứng minh

là công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003; Azad, 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009).

Vài năm gần đây việc nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nhân giốngBạc hà Á bằng phương pháp nuôi cấy mô đã có nhiều tiến bộ Bằng phương phápnày cho phép từ một lượng nhỏ giống ban đầu nhân nhanh với tốc độ cao trongthời gian ngắn có thể cung cấp một lượng lớn giống đồng nhất, sạch bệnh.Tuynhiên, để đảm bảo được tỷ lệ sống sót và năng suất như mong muốn sau khi đưacây ra vườn ươm ta cần phải áp dụng các kỹ thuật chăm sóc đặc biệt

Mỗi loại cây có một nhu cầu dinh dưỡng riêng, nên cần có một môi trườngnuôi cấy đặc trưng riêng (Preece JE., 1995), hiện đã có hơn 685 loại môi trường nuôi

cấy mô thực vật đã được công bố (Georgen et al., 1987) Không những thế các

khoáng chất lại có ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành hình thái của các loại thực

vật (Ramage CM et al., 2002) Nên việc nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp và

an toàn không có dư lượng nitrate là công việc vô cùng cần thiết trong nhân giống in

vitro nhất là đối với các loại cây dược liệu Bên cạnh tìm kiếm môi trường

dinh dưỡng an toàn và thích hợp, trong nuôi cấy in vitro chất điều hòa sinh trưởng

thực vật an toàn cũng là điều đáng quan tâm trong nhân giống vô tính cây dược liệu.Nước dừa có chứa một số hợp chất hữu cơ và chất dinh dưỡng khoáng chất quantrọng trong sự phát triển của thực vật, đóng một vai trò quan trọng như bộ đệm sinh

lý chứa hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng cao, thích hợp cho sự sinh trưởng và

phát triển của thực vật (Krikorian, 1991), (Ge et al, 2005; Yong et al, 2009) Bổ sung

than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến sự ra rễ, kéo dài chồi

và phát sinh phôi (Webb., 1988) Ngoài ra, khi bổ sung than vào môi trường nuôi cấy

có thể thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng của thực vật in vitro; các tác động của than bao gồm: tạo điều kiện tối trong môi trường nuôi cấy, hấp thu các chất ức chế

trong môi trường nuôi cấy, hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các hợpchất hữu cơ khác đồng thời phóng thích các cơ chất có lợi cho sự sinh trưởng của

thực vật nuôi cấy in vitro (Pan M J et al., 1998).

Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nôngnghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, tạo nguồn lớn nguyên liệu dượcliệu sạch Chúng tôi đề suất nghiên cứu đề tài: “Khảo sát sự ảnh hưởng môi

trường nuôi cấy và các chất bổ sung lên cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.”

2. Mục đích nghiên cứu

Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy như MS, SH, N6 lên Bạc

hà, bên cạnh đó khảo sát ảnh hưởng của than và nước dừa đến sự phát triển của

cây Bạc hà nhằm góp phần xây dựng và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây dược liệu nói chung và cây Bạc hà Á Mentha arvensis L nói riêng.

Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng tới mẫu cấy in vitro Bạc hà Á Mentha arvensis

L. và hướng khắc phục để tăng cường sự phát triển của mẫu, đồng thời tạo nguồncây giống chất lượng phục vụ sản xuất

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) khithay đổi nồng độ môi trường lên khả năng tăng trưởng và phát triển Bạc hà Á

Khảo sát sự ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ không xác định như nước dừa

lên sự phát triển của Bạc hà Á Mentha Arvensis L.

Khảo sát sự ảnh hưởng chất làm thay đổi trạng thái của môi trường lên Bạc

hà Á Mentha Arvensis L.

4. Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiênn, đơnyếu tố Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi nghiệm thức cấy 1 chai Kết quảghi nhận số liệu là giá trị trung bình

Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phầnmềm SAS 9.1 và 9.4 Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêutheo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tựa,b,… thì không có sự khác biệt về mặt thống kê Các mẫu tự khác nhau (a,b,…)chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học:

Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra một số khảo sát về môi trường nuôi cấy thông

qua kỹ thuật nhân giống Bạc hà Á Mentha Arvensis L bằng phương pháp in vitro

để đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung hoặc thay thế các yếu tố

trong môi trường nuôi cấy Bạc hà Á Mentha Arvensis L.

Ý nghĩa thực tiễn:

Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân

nhanh giống Bạc hà Á Mentha Arvensis L ở quy mô lớn, cây sạch bệnh, an toàn

nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất cógiá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng

6. Kết quả đạt được của đề tài

Xác định được ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L.

Xác định được ảnh hưởng của môi trường SH (Schenk et Hildebrandt,

1972) lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L.

Xác định được ảnh hưởng của môi trường N6 (Chu et al, 1975) lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L.

Xác định sự ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ không xác định như nước dừa

lên sự phát triển của Bạc hà Á Mentha Arvensis L.

Xác định sự ảnh hưởng chất làm thay đổi trạng thái của môi trường than

hoạt tính lên Bạc hà Á Mentha Arvensis L.

7 Kết cấu của đồ án

Đồ án bao gồm các chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi câyin vitro

1.1.1 Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro

Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thực hiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

đầu tiên từ lá của một số cây một lá mầm như: Errythronium, Orrnithogalum,…

nhưng không thành công

Năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt nhưng trênđỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo, trên môi trường lỏng có muối khoáng

và glucose Tuy nhiên sự sinh trưởng này chỉ kéo dài trong thời gian ngắn

Năm1934, nhiều nghiên cứu về nuôi cấy mô thành công như: White vàGautheret đã nuôi cấy rễ cây cà chua trên môi trường muối khoáng và dịch chiếtnấm men, nhóm tác giả Nobecourt và Gautheret duy trì sự sinh trưởng của môsẹo cà rốt, đặc biệt, Kogl lần đầu tiên xác định vai trò của IAA, một hormonethực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng vàphân chia tế bào

Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt, White đã đồng thời nuôicấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt và thuốc lá

Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non

Năm 1955, các chất kích thích sự phân bào được Skoog đặt tên là kinetin

và gộp với các chất kích thích phân bào tự nhiên gọi là cytokinin

Năm 1956, Morel, học trò của Gautheret, áp dụng thành công nuôi cấy mô

vào cây lan (Cymbidium) tạo ra các protocorm.

Năm 1957, Skoog và Millert đã phát hiện vai trò tỉ lệ nồng độ của các chấtauxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy

Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm thử sinh khối mô thực vậtbằng nuôi cấy chìm.

Năm 1960 – 1964, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sửdụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh giống địa lan

Cymbidium mở đầu thành công trong sự nghiệp vi nhân giống thực vật Từ kết

quả đó, lan được xem là nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa Đến nay,hầu hết các giống lan đã được nhân giống nhanh bằng phương pháp nuôi cấy mô

như: Oncidium, Denrobium, Cattleya, Phalaenopsis, Ngọc điểm,… Và ngay cả lan Hài nổi tiếng của Việt Nam.

Năm 1964, Guha và Maheshwari tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy

bao phấn của cây cà chua Datura.

Năm 1971, Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá

ở cây thuốc lá

Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa

các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần từ hai loài thuốc lá Nicotiana glauca và Nicotiana langsdorfii.

Năm 1974, Zaenen và cộng sự đã phát hiện plasmid Ti đóng vai trò yếu tốgây khối u ở cây trồng

Năm 1977, Noguchi đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích20.000 l Chilt và cộng sự đã chuyển thành công T-DNA vào thực vật

Năm 1978, Melchers đã tạo được cây lai soma giữa cà chua và thuốc lábằng lai xa hai tế bào trần của hai cây

Năm 1979, Marton đã xây dựng quy trình chuyển gene vào tế bào trần

bằng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium.

Năm 1982, đã chuyển thành công DNA vào tế bào trần

Năm 1985, Fraley và cộng sự đã thiết kế vertor chuyển gene vào thực

Cùng năm ấy Horsch cũng đã chuyển gene vào mảng lá bằng Agribacterium tumefacienns và tái sinh cây chuyển gene.

Năm 1994, thương mại hóa cây cà chua chuyển gene “Flavr-savr” Tại ViệtNam, trước 1975, Nguyễn Văn Uyển cùng với Lê Thị Xuân, Lê Văn Cát, là nhữngnhà khoa học đầu tiên có ý tưởng xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào

thực vật như bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy mô sẹo, bao phấn lúa vàprotoplast thuốc lá.

Sau năm 1975, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đầu tiên tại Viện Sinh VậtHọc, Viện Khoa Học Việt Nam, do Tiến sĩ Lê Thị Muội khởi xướng đã đạt đượcthành tựu lớn khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (LêThị Muội và cộng sự, 1978) Cùng thời điểm trên, Phân Viện Khoa Học Việt Namđược thành lập tại thành phố Hồ chí Minh đã hình thành các phòng thí nghiệm vềnuôi cấy mô tế bào thực vật không những chỉ phát triển tại thành phố Hồ Chí Minh,

mà còn ở các địa phương khác, trong đó đáng kể nhất là tại Đà Lạt Phát huy lợinhuận về khí hậu của Đà Lạt, Nguyễn Văn Uyển đã thành công trong việc triển khai

nhân giống in vitro cây khoai tây bằng những phòng thí nghiệm gia đình và sản xuất

cây khoai tây giống trong bầu bằng kỹ thuật luống mạ khoai tây

Thành công lớn nhất của nghiên cứu này là áp dụng phương pháp nhân giốngmới vào sản xuất giống khoai tây tại Đà Lạt trên nhiều đối tượng cây trồng khácnhau trong cả nước Từ thành công này, International Foundation for Science đã tàitrợ cho PGS TS Nguyễn Văn Uyển tổ chức hội thảo quốc tế “PropagationTcechniques for Commercial Crops of the Tropics” cho các nhà nuôi cấy mô vùngĐông Nam Á Thái Bình Dương, tổ chức tại Tp Hồ Chí Minh (Tháng 2/1993)

1.1.2 Sơ lược một số phương pháp nuôi cấy in vitro

a. Nuôi cấy nốt đơn thân

Sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thânngắn Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi

và lá được được hình thành Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡngthích hợp đến khi đủ số lượng chồi cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ trởthành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất

b Nuôi cấy chồi bên

Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơnthân Nhưng khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dàichồi, thân thường không cần đến cytokinin để phát triển Phương pháp nhân chồibên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát

triển dưới tác dụng của cytokinin nồng độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để các chồi bên có thể phát triển.

c. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Chồi ngọn được rửa sạch và khử trùng bằng cồn, hypochlorite calcium.Sau đó dùng dao mổ tách đỉnh sinh trưởng (gồm vùng mô phân sinh và cả phầndưới ngọn) ra khỏi ngọn và cấy trên môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh Vớiphương pháp này, chúng ta tạo được cây sạch bệnh, sạch virus

d Nuôi cấy mô sẹo

Tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1920, mô sẹo là một khối tếbào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc các cơ quan đã phân hóa dưới cácđiều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý hóa chất, tia phóng xạ,…) Các tế bào của môsẹo phải chịu sự phản phân hóa trước lần chia đầu tiên (Halperin,1969)

Mô sẹo tăng trưởng nhanh trên môi trường có chất auxin và trong môitrường không có chất kích thích thì mô sẹo có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh.Cụm mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng, nhưng khả năng bị biến dị tế bào soma lại cao hơn

e Nuôi cấy huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào được tạo từ các mảnh mô sẹo nuôi cấy trong môi trườnglỏng lắc liên tục Trong môi trường lỏng, mô sẹo phóng thích ra những tế bàoriêng lẻ hay những cụm tế bào dính nhau để hấp thụ các chất dinh dưỡng Sau đó

tế bào được chuyển sang môi trường đặc để tái sinh thành cây

f Nuôi cấy thể đơn bội

Cây thể đơn bội mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa, sử dụng những

phần sau cho việc nuôi cấy in vitro:

- Túi phấn: thu túi phấn từ chồi hoa thì chỉ khử trùng chồi hoa Còn thu túi phấn của hoa đã nở thì phải khử trùng túi phấn

- Hạt phấn: được nuôi cấy trên môi trường để tạo mô sẹo

- Cụm hoa: thường nuôi cấy trong môi trường lỏng

g Nuôi cấy protoplast (tế bào trần)

Tế bào thực vật được xử lý bằng hóa lý để tách lớp vỏ cellulose, nhưngvẫn còn giữ chức năng của tế bào Trong môi trường thích hợp, protoplast có thểphân chia tế bào hay tái sinh thành cây (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Với cách nuôi cấy này, ta có thể áp dụng để chuyển gene vào tế bào trầnhay tạo cây đa bội bằng cách dung hợp hai tế bào trần với nhau

1.2 Sơ lược về môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 1.2.1 Môi trường khoáng cơ bản

Môi trường dinh dưỡng cơ bản là một trong những yếu tố quan trọng

nhất ảnh hưởng đến sự thành công của trong việc nuôi cấy in vitro thực vật (Gamborg et al., 1976).

Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môitrường Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer vàSkoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974),

Ngay từ những giai đoạn đầu của sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tếbào thưc vật, Gautheret (1939) và White (1943) đã đề xuất các môi trườngnuôi cấy mô sẹo, mô rễ Do đối tượng nghiên cứu, mục đích nghiên cứu rấtkhác biệt đòi hỏi phải có những môi trường dinh dưỡng thich hợp khác nhau,việc nghiên cứu đề xuất các môi trường nuôi cấy mới đã được liên tục pháttriển Theo tổng kết của Georgen và cộng sự (19/87) hiện đã có 685 loại môitrường nuôi cấy mô thực vật đã được công bố

Bảng 1.1 Một số môi trường nuôi cấy cơ bản được sử dụng

phổ biến trong nuôi cấy in vitro.

Thành phần môi trường trường nuôi dưỡng

NH4NO3KNO3CaCl2H2OMgSO4.7H2O

KH2PO4(NH4)2SO4

(NH4)H2PO4

NaH2PO4.H2O

K2SO4Ca(NO3)2.4H2O

Na2SO4KI

H3BO3MnSO4.4H2OMnSO4.H2OZnSO4.7H2O

Na2MoO4.2H2OMoO3CuSO4.5H20OCoCl2.6H2ONiSO4.6H2OZn(NO3)2.6H2O

Na2EDTAFeSO4.7H2O

Fe2(SO4)3Myo-insositolAcid nicotinicMS: Murashige và Skoog; B5: Gamborg và cộng sự, 1968; N6: Chu và cộng sự,1975; SH Schenk et Hildebrandt, 1972; NN: Nísch và Nisch 1969; DKW: Driver– Kuniyuki Walnut, 1984; WPM: Woody Plant Medium (Lloyd G, Mc Cown B.,

1980)

Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân cácmôi trường nuôi cấy thành bốn nhóm:

Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: đại diện là môi trường MS (1962), ER(Erksson 1965): nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất làcác muối nitrat, amon, kali, các nguyên tố vi lượng đầy đủ Môi trường thuộcnhóm này thích hợp với hầu hết các loại và đối tượng nuôi cấy

Nhóm môi trường đủ dinh dưỡng: đại diện là các môi trường N6, B5, SH.Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng đa lượng và vi lượng thấp hơn môi trường

MS, nhưng đặc biệt có hàm lượng muối nitrat kali cao Nhóm môi trường nàythích hợp cho các mục đích nuôi cấy tăng cường cảm ứng hình thành callus vàphân hóa chồi

Nhóm thứ 3 là môi trường nghèo dinh dưỡng: đại diện cho nhóm này là môitrường Nitsch và Nitsch Môi trường này có hàm lượng muối đa lượng chỉ bằng

½ môi trường MS, nhưng hàm lượng các muối vi lượng và hàm lượng vitamin thìphong phú hơn so với MS Môi trường này thích hợp cho nuôi cấy bao phấnnhiều loại cây nhất là cây họ Cà…

Nhóm thứ tư là nhóm môi trường thích hợp để nuôi cấy các cây nhân gỗ:môi trường WPM, DKW,…

Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy là dinh dưỡng vô cơ (Nguyên

tố đa lượng và nguyên tố vi lượng) dinh dưỡng hữu cơ nguồn cacbon, chất điềuhòa sinh trưởng thực vật và chất làm đông tạo giá thể Thông thường thành phầnmôi trường nuôi cấy biểu thị thành phần cơ bản của môi trường dinh dưỡng vô cơ

và dinh dưỡng hữu cơ cơ bản, nguồn cacbon và pH (bảng 1.1) Việc bổ sung chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật và các chất dinh dưỡng hữu cơ khác vào môitrường hoàn toàn phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu riêng

1.2.1.1 Môi trường MS

Lịch sử nuôi cấy

Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp vàchỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô Điều quan trọng

cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gene, cơ quan được chọnlọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu.Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trườngMurashige và Skoog (1962) viết tắc là MS

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đềugồm một số thành phần cơ bản sau:

Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Nguồn carbon

Các vitamin và amino acid

Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

Các chất điều hòa sinh trưởng

➢ Các khoáng vô cơ

Thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các cơ quan trong cơ thể thực vật (Anderson, 1980)

Khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồngtrong tự nhiên Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K

Đạm (N) giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân

lá rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh Thiếu đạm cây màu nhợt nhạt, ốm yếu,cây sinh trưởng kém, cằn cỗi, Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau:

:Potassium nitrate (14% N):Ammonium nitrate (34% N):Sodium nitrate (16,4% N):Calcium nitrate (15,5% N)

Lân (P): giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng.Lân giúp cây ra hoa, ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền ít rụng, Các chất cóthể cung cấp lân:

KC1 : Potassium chloride (60% K2O)

KH2PO4 : Monopotassium phosphate (40% K2O)

K2SO4 : Potassium sulfate (48% K2O)

KNO3 : Potassium nitrate (44% K2O)

Nhóm bán đa lượng

Gồm các nguyên tố: Ca, Mg, S

Calcium (Ca): tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc, Các chất cung cấp Canhư: CaCl2 (Calcium Chloride), Ca(NO3)2 (Calcium nitrate) Đối với các chấtchứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấpthu hiệu quả Cây thừa Ca sẽ hấp thu đạm nhiều trở nên quá mập, tán lá rợpxuống, dễ bị gãy Thiếu Ca cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lánhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được

Magnesium (Mg): thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây pháttriển, lá xanh Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây Nếu

dư Mg lá sẽ có màu xanh đậm nhưng đọt non lại bị khô héo Thiếu Mg bộ rễ sẽphát triển to, mập nhưng thân lá lại èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá.Sulfur (S): là thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng Thường (S)

có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4, Thiếu S cây sẽ cằncỗi, lá bị vàng như bị thiếu đạm, cây trở nên èo uột, ốm yếu

Nhóm vi lượng

Một số nguyên tố vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo, Mn, Fe, Các nguyên tố

này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sựphát triển của thực vật ở giai đoạn Xuân hóa (Lê Văn Chi, 1992), ngoài ra nó còn

là thành phần của enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh hoá trong cơ thể

Sắt (Fe): đóng vai trò tạo diệp lục tố, giúp cây quang tổng hợp tốt, làm cho

lá cây có màu xanh Thiếu sắt làm lá cây có màu xanh lợt, cây không quang hợptốt, cây ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp

Fe cho cây

Đồng (Cu): thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồinhiều ở dưới gốc Lá bạc tái mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi khô héo.Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây

Kẽm (Zn): Zn giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin Thiếu Zn làmthân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều

để kích thích ra hoa Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây, đồng thời giảmtưới lân

Mangan (Mn): thiếu mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng.

Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho cây

Molypden (Mo): điều hòa tăng trưởng của cây Có thể dùng Na2MoO4(sodium molybdate) để cung cấp Mo cho cây

Cobalt (Co): cobalt có mặt trong khoảng một nửa số lượng môi trường nuôicấy mô tế bào thực vật nồng độ sử dụng là 1 μM, đôi khi người ta có thể sử dụngnồng độ cobalt cao gấp 10 lần Cobalt là thành phần kim loại trong vitamin B12

có liên quan đến sự sinh tổng hợp nucleic acid nhưng chưa có bằng chứng nào vềtác động của nó lên sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô trên môi trườngnuôi cấy Một trong những mục đích của việc bổ sung cobalt vào môi trường nuôicấy có lẽ là chống lại sự gây độc của các chelate kim loại và có thể ngăn cản cácphản ứng oxy hóa gây ra bởi đồng và sắt Cobalt kết hợp với lưu huỳnh dướidạng CoSO4 và đạm nitrogen dưới dạng Co(NO3)2

Sodium thiosunfate (Na2S2O3): nuôi cấy mô thực vật sử dụng với các muốisulfate cung cấp nguồn thiosulfate đặc biệt khi và chỉ khi phức của bạc sulfate

được thêm vào môi trường Gần đây, Steinitz et al., (2010) nhận thấy rằng bổ

sung sodium thiosulfate (Na2S2O3) vào môi trường kích thích rõ rệt sự phát triển

ở loài thực vật họ Đào kim nương Corymbia maculata, nghiên cứu chỉ ra rằng

thiosulfate (S2O3)2- trong bạc thiosulfate góp phần vào sự phát triển của việc nuôi cấy

1.2.1.2 Môi trường SH

Năm 1983 ông David Stuart and Steven Strickland đã nuôi cấy thành công

phôi soma của cây Linh lăng (Medicago sativa L ) môi trường SH có bổ sung

proline trung bình với 50 – 300 mM L – proline

Năm 2014, Nguyễn Hữu Hồ và cộng sự đã nuôi nhân sinh khối mô sẹo sinhphôi đối tượng sâm ngọc linh không dùng chất điều hòa sinh trưởng thực vậttrong bình tam giác và bioreactor dùng môi trường ½ SH có và không có 10%nước dừa Nuôi nhân sinh khối cụm mô phôi có rễ bằng bioreactor cũng đượcthực hiện có kết quả dùng môi trường SH có bổ sung 1-2 mg/l IBA nuôi cấythành công các loại hệ thống mô tạo tiền đề cho việc nhân giống sâm thông quaphôi soma

Alma Neri-Soto (2015) cũng đã nhân giống in vitro thành công cây Chihuahuana Picea qua việc nuôi cấy hạt cây này trên môi trường SH.

là 7,0 mM(tương đương 3,5 mM (NH4) 2SO4) nồng độ cao hơn của amoni mạnh ức chế

sự phát triển và biệt hóa của các hạt phấn hoa gạo

Nồng độ của KNO3 và các thành phần khác vừa không ảnh hưởng đến sựphát triển của (N6) vừa callus Môi trường N6 (Chu 1978) được xác định để cảithiện sự hình thành, phát triển và biệt hóa của phấn hoa mô sẹo trong gạo Nồng độamoni được chứng minh là rất quan trọng cho sự phát triển của mô sẹo Nồng độtối ưu NH4 + là 7.0 mM (tương đương 3,5 mM (NH4)2SO4) Nồng độ cao hơn củaamoni mạnh ức chế sự phát triển và biệt hóa của các hạt phấn hoa gạo

Nồng độ của KNO3 và các thành phần khác vừa không ảnh hưởng đến sựphát triển của mô sẹo Chu (N6) vừa được xác định để cải thiện sự hình thành,phát triển và biệt hóa của phấn hoa mô sẹo trong gạo Nồng độ amoni đượcchứng minh là rất quan trọng cho sự phát triển của mô sẹo Nồng độ tối ưu NH4+ là 7.0 mM (tương đương 3,5 mM (NH4)2SO4 Nồng độ cao hơn của amonimạnh ức chế sự phát triển và biệt hóa của các hạt phấn hoa gạo.

Nồng độ của KNO3 và các thành phần khác vừa không ảnh hưởng đến sựphát triển của mô sẹo

Trần Đình Giỏi cùng cộng sự (2002) đã nuôi cây thành công mô sẹo cây lúacao sản trên môi trường N6 Cũng trên môi trường N6, theo Jaruwan Summart vàcộng sự (2008) để tăng tốc độ tăng trưởng trong nuôi cấy mô sẹo cây lúa thì bổsung thêm bổ sung thêm 4% sucrose trong môi trường nhân giống

1.2.2 Các chất điều hòa sinh trưởng và hợp chất hữu cơ

1.2.2.1 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thựcvật là các yếu tố hoá học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật.Khác với các chất cần thiết cấu tạo nên cơ thể thực vật như: protein,carbohydrate, acid nucleic,…

Chất điều tiết sinh trưởng với một lượng rất nhỏ nhưng nó có vai trò quantrọng Nó điều chỉnh tất cả các quá trình phát triển và hoạt động sinh lý của cây.Chất điều tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinhvới hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc lànhững chất được tổng hợp nhân tạo

Các chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ sinh lý có tác dụng kích thích cácquá trình sinh trưởng của cây gọi là các chất kích thích sinh trưởng Còn cácchất điều hoà sinh trưởng nhìn chung ảnh hưởng lên quá trình sinh trưởng gọi làchất ức chế sinh trưởng

Vai trò điều hoà của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là khởi độngcho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặctrì hoãn quá trình đó

Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin vàcytokinin, ngoài ra còn có gibberelin và ethylene cũng là những chất có vai tròquan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật.

Các dẫn suất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indoltryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol Auxin được tổnghợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở định chồingọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật: lá, rễ và các mô

dự trữ,…

Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D,…).Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàngloạt các quá trình sinh lý: tốc độ sinh trưởng, trạng thái ngủ, sự ra hoa, sự kếttrái, sinh trưởng quả, sự chín của quả, sự rụng quả và rụng lá, tạo củ, sự lão hóa,

… Các loại hormone thực vật tác động lên sinh trưởng thông qua mối tươngquan nồng độ giữa các loại hormone khác nhau, nên các quá trình trên đâykhông chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hormone khác

Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứngkhác nhau đối với auxin Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lýauxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn

nở của vách tế bào

Cytokinin

Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purine Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được

và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ hạt ngô Ngoài ra còn có hàng loạt

cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea,…trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà ngừơi ta thu nhận bằng cách

độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúngtương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phầncủa các glycoside Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứngtrong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi acid nucleic và protein

Gibberellin

Là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chấtkhác nhau Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườngibbane Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây Tuy nhiên

ởnhững chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệuhiệu quả nhất

Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển củathực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phânhóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa

Acid abscisic

Là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từacid mevalonic hoặc do sự phân giải caroteniod Acid abscisic được sinh tổnghợp trong các lạp thể (Neill và Horgan, 1984; Milborrow, 1974)

Vai trò quan trọng của ABA như là một chất cảm ứng với stress đã đượcbiết trong nhiều năm qua

Xử lý ABA ngoại sinh gây đóng khí khẩu trong điều kiện sáng và duy trìcho đến khi ABA bị chuyển hóa Trong điều kiện stress do thiếu nước ABA cóthể gia tăng lên 20 lần Hàm lượng ABA gia tăng khi cây bị stress do mặn, lạnh

và nóng Những sự biến đổi này là nguyên nhân của sự thiếu nước

Việc xử lý ABA ngoại sinh có thể làm cho một số loài cây chống lại điềukiện lạnh và mặn Trong điều kiện ngày ngắn, hàm lượng ABA gia tăng trong lá

và mầm chồi đã dẫn đến sự miên trạng Tuy nhiên cũng có trường hợp trongđiều kiện ngày ngắn gây ra sự miên trạng trong vài loài lại không có sự gia tăngABA nội sinh

Việc xử lý ABA ngoại sinh lên mầm chồi và lên hột đã kích thích miêntrạng của chúng Từ khi mới được phát hiện, ABA được xem là chất gây nên sựrụng lá, trái và hoa Thật ra điều đó không hoàn toàn đúng và ABA không trựctiếp ảnh hưởng lên sự rụng ABA có thể tác động gián tiếp lên quá trình lão hóatrước trưởng thành và làm gia tăng sự sản sinh ethylene và ethylene đánh thứcmột số gene liên quan đến sự rụng

Ngày nay người ta biết rằng ABA có nhiều ảnh hưởng về mặt sinh lý, sinhhóa và phân tử trong hột cũng như có mặt phổ biến trong lúc hột phát triển Tuynhiên vai trò trực tiếp của ABA đối với các quá trình này vẫn còn chưa rõ

Ethylene

Những người Ai Cập đã không biết rằng ethylene chính là tác nhân gâychín trái khi họ tạo vết thương trên trái Ngày nay, ethylene đã được biết làhormone điều hoà sự chín trái

Năm 1901, Neljubow chứng minh ethylene ức chế sự vươn dài, kích thích

sự phát triển theo chiều ngang Ngày nay, người ta biết được ethylene có khảnăng kích thích hoặc ức chế sự vươn dài của thân, rễ hoặc những cơ quan khác

1.2.2.2 Sơ lược về than hoạt tính và nước dừa trong nhân giống in vitro

Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dụng than hoạt tính

và nhiều dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác định như nước dừa,dịch chiết chuối xanh, khoai tây, cà chua và dịch chiết nấm men, casein thủy phân,

… để nhân giống nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy Hiệuquả thúc đẩy quá trình tăng trưởng này được giải thích bằng những vitamin, aminoacid và những chất điều hòa khác chứa trong chúng (Perik, 1987)

Theo Tuleke, amino acid ở nước dừa xanh chiếm hơn 40% amino acidtổng số là glutamine, ở nước dừa già cũng có một số lượng lớn acid glutamic,glutamine, serin, leucin, acid amino butyric Ngoài ra trong nước dừa còn có cácacid hữu cơ có chứa acid hữu cơ có chứa acid malic, sikimic, quinic và cácnguồn hydrate carbon khác như saccharose, glucose, fructose

Theo Vandebelt (1954), trong nước dừa có nhiều vitamin như acidnicotinic, acid pantotenic, biotin, riboflavin, acid folic, thiamin và pyridoxine.Theo Paris, Duhamat (1953) trong nước dừa có chứa IAA Còn Radiey (1958)phát hiện cả gibberellin trong dịch thực vật này

Nước dừa có chứa một số hợp chất hữu cơ và chất dinh dưỡng khoáng chấtquan trọng trong sự phát triển của thực vật, đóng một vai trò quan trọng như bộ

đệm sinh lý Nước dừa giàu Magnesium, Phosphate và chứa lượng đường caokhoảng 2,5% (w / v) Bên cạnh đó, nước dừa còn chứa nhiều acid amin, vitamin,khoáng và hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng cao, thích hợp cho sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật (Krikorian, 1991), (Ge et al, 2005;… Yong et al, 2009).

Trong những năm qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng nướcdừa bổ sung vào môi trường vi nhân giống của các loài thực vật có giá trị kinh

tế cao như chanh dây (Hall et al., 2000), cà phê (Ismail et al., 2003) và hoa lan (Santos -Hernandez et al., 2005)

Trevisan et al 2005 cũng đã chứng minh những ưu điểm của nước dừa cho sự phát triển chiều cao của chanh dây Villa et al (2010) làm việc với các

giống cây ô liu 'Ascolano 315' báo cáo rằng bổ sung 25ml/ L nước dừa kết hợpvới 500 μg/L BAP tạo ra cây con có chiều dài thân và sinh khối tươi nặng hơn

so với cây con trồng theo phương pháp truyền thống

Peixe và cộng sự., 2007 báo cáo rằng việc sử dụng nước dừa như mộtthành phần của môi trường nuôi cấy có thể cải thiện sự tăng trưởng của phôi cây

ô liu Các tác giả quan sát thấy rằng nước dừa kết hợp với BAP thay thế thànhcông zeatin trong nuôi cấy in vitro của cây trồng ô liu Galega vulgar

Nasib và cộng sự., 2008 cũng đã chứng minh việc sử dụng 20% (v / v)nước dừa kết hợp với BAP trong nhân giống in vitro cây Kiwi giúp tăng trưởngchiều cao và số lượng lá

Theo báo cáo trong Grigoriadou et al (2002), sự kết hợp của nước dừa với

cytokinin là cách hiệu quả nhất để có thể cải thiện đáng kể số lượng chồi trong

nhân giống cây phỉ Corylus avellana L.

Sandoval Prando, 2014 cho biết, bổ sung 20% nước dừa kết hợp với 2

mg / L BAP, 0,01 mg / L IAA và 0,5 mg / L GA3 là hiệu quả nhất trong nhân

nhanh số lượng chồi cây phỉ Corylus avellana L.

Từ các công trình trên nó có thể được quan sát thấy vai trò của nước dừa

trong nuôi cấy in vitro Vì vậy, mục đích của thí nghiệm này là để xác định liều