Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn bacillus spp và lactobacillus spp đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin​

Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường...31 ix... Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG

MSSV: 1515100007 Lớp: 15HSH01

TP Hồ Chí Minh, 2016.

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướngdẫn của TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm-MôiTrường của trường Đại Học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệpcủa người khác với bất kì hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệphoàn toàn trung thực Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình

TP.HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Lê Ngô Vũ Phượng

i

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyếnkhích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hômnay

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em

đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hếtlòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quátrình thực hiện đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ

có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời.Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương, đã tận tìnhhướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực hiện,hoàn thành đồ án này

Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quantâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dànhthời gian đọc và nhận xét đồ án này Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sứckhỏe

TP HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Lê Ngô Vũ Phượng

ii

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

TRANG

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 2

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nấm: 4

1.1.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 4

1.1.3 Tác hại của nấm 5

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây cho người và động vật 5

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây cho thực vật 6

1.1.4 Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm 6

1.2 Tổng quan về hợp chất kháng nấm: 7

1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học 10

1.2.2 Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học 10

1.2.3 Hợp chất kháng nấm trong sinh học 13

1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13

1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17

a Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp. 17

b Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp 19

1.3 Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc: 21

1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn) 21

1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) 23

1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp): 25

iii

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Địa điểm nghiên cứu: 26

2.2 Thời gian nghiên cứu: 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu: 26

2.3.1 Giống vi sinh vật: 26

2.3.1 Hóa chất và môi trường sử dụng 26

2.3.1.1 Hóa chất: 26

2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy: 26

2.4 Thiết bị và dụng cụ: 27

2.4.1 Thiết bị: 27

2.4.2 Dụng cụ: 28

2.5 Phương pháp luận: 28

2.6 Phương pháp nghiên cứu: 29

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.6.2 Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: 30

2.6.3 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với nấm mốc: 30 2.6.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: 35 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp với nấm mốc: 39 2.6.6 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 43

2.6.6.1 Nhuộm gram 43

2.6.6.2 Nhuộm bào tử 44

2.6.6.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 44

iv

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45

3.1 Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 45 3.1.1 Nhuộm Gram: 45

3.1.2 Nhuộm bào tử: 46

3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47

3.2 Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: 48

3.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc: 50 3.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc: 66

3.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc 81 3.6 So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC

v

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp. 45

Bảng 3.2 Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp. 47Bảng 3.3 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn

Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

53

Bảng 3.4 So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus

spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 54

Bảng 3.5 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

62

Bảng 3.6 So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi

khuẩn 63Bảng 3.7 Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn

Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán

68

Bảng 3.8 So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán

69

Bảng 3.9 Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 76

vii

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch

tán 77Bảng 3.11 Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi

khuẩn Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp

84

Bảng 3.12 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp 85Bảng 3.13 Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi

khuẩn Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 89

Bảng 3.14 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 90

Bảng 3.15 Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp theo từng phương pháp

dựa theo xếp hạng LSD 91

Bảng 3.16 Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp theo từng

phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92

viii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Metalaxyl 10

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Manocozeb 11

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole 11

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của Pyrones 14

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Viridines 15

Hình 1.6 Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) 20

Hình 1.7 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn 21

Hình 1.8 Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015)

22 Hình 1.9 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 23

Hình 1.10 Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp với các loại nấm (trích từ Kumar và các cộng sự,2009). 24

Hình 1.11 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đỗ dĩa 25

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn có lợi đối với nấm mốc 29

Hình 2.2 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường 31

ix

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3 Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi

khuẩn 35

Hình 2.4 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 36

HÌnh 2.5 Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán 37 Hình 2.6 Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 38

Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch 40

Hình 3.1 HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 45

HÌnh 3.2 Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 46

Hình 3.3 Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn 47

Hình 3.4 Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA 48

Hình 3.5 Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến 49

Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ phế phẩm 55

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ đất 56

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử nước thải 57

Hình 3.13 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân lập tử nem 63

x

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề:

Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đốikháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấmmốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc

Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin,tricothecenes, zearalenone… Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gâynhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thươnggan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượngcao sẽ gây chết người Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tácdụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật

Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối khánglại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác

như Trichoderma spp…và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học Nhưng

việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn cònkhá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm

Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng

nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc

khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau Từ đó,

em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng

và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm

của trường Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phương pháp

đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp và

Lactobacillus spp đối với một số nấm mốc Aspergillus spp sinh aflatoxin”.

1

lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng trong bảo quản nông sản”

(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm

thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp Của vi khuẩn Lactobacillus

L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)….

 Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn

lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus

Jeong-75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson vàSchnurer,2001)

3 Mục đích nghiên cứu:

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả

nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp của

phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường

4. Mục tiêu nghiên cứu:

Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ

thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực

Phẩm- Môi Trường

5 Nhiệm vụ nghiên cứu:

Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp và 10 chủng Lactobacillus spp đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp tiềm năng sinh

aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phươngpháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method)

Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.(AgarPlug Diffusion Method)

2

Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che phủ.(Overlay Method).

Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương pháp thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm

6 Phương pháp nghiên cứu:

a Phương pháp luận:

Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp đã được phân

lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đãđược mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòngthí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạtgiống cây trồng

b Phương pháp xử lí số liệu:

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số liệu

7 Kết quả đạt được từ đề tài:

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus

spp có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm

Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông quaphương pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.(Dual Culture Two Line Culture Method)

Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn quaphương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar PlugDiffusion Method)

Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method)

Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí nghiệm

3

Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thuđược

Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài

4

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm:

1.1.1 Giới thiệu chung về nấm:

 Nấm học (Mycology) được nhà khoa học người Ý là Pier AntonioMicheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova

Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thìngười có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794-1874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấmlớn (nấm quả thể) Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằngmắt thường Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinhvật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấmkhác Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủycác chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và traođổi chất

 Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản,

là tế bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặcsống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là

vô tính nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không cócenllulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp Nấm mốcthường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae)tạo hệ sợi (mycelium) Có 2 loại sợi:

 Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm

vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm

 Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử)

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra:

 Theo Nguyễn Duy Tường (2009), độc tố của nấm mốc (mycotoxin)

là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, đượctạo

5

ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có

vú, gia cầm và con người

 Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu.Tuy nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độnghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm Được tạo ra từ 5 chi

nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng

bao gồm:

 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và

G1, G2), Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin,

Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin…

 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon,

Zearalenon, T-2 toxin

 Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion,

Methyl Ether Alternarion

 Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà.

 Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin

Chúng là

độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra,

thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng) Phản ứnggây độc chủ yếu của chúng là trong gan Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽtích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâudài sẽ gây ra bệnh ung thư

 Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như

Ochratoxin Penicillium và Aspergillus tiết ra Độc tố Zearalenon và Tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết ra.

6

1.1.3 Tác hại của nấm mốc:

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật:

 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loàinấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng Chúng có thể là nấm mốc

trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ có vài loài nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomer, Ganoderma

Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng,các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn Ngộ độc do

ăn phải nấm độc, có thể làm rối loạn tiêu hóa, ảo giác, bào mòn ống tiêuhóa, làm giảm khả năng đề kháng tiêu hóa các chât dinh dưỡng trongthức ăn, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tử vong

 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể

Cryptococcus), hay Viêm phổi do nấm Pneumocystic carinii.

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây ra cho thực vật:

 Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho

ngành nông nghiệp và lâm nghiệp Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây bệnh cho lúa Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus Chúng làm thối rễ, tổn

thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chấtlượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,

1.1.4 Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm:

 Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủnggiống nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là

Aspergillus,

7

Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào

thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ,…

 Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính,

gây

đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rốiloạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợpnặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây têliệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết Nhiềucông trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặcbiệt là ở gan Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định

có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậuquả là đột biến hoặc quái thai

1.2 Tổng quan về các hợp chất kháng nấm:

Hợp chất kháng nấm là các chất

quan trọng trong việc kiểm soát

con người và động vật và trong

phẩm và các vật liệu khác

ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầmcác tác nhân gây bệnh của nấm đối vớiviệc phòng chống nấm mốc trong thực

1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học:

 Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loạithuốc trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl,Anvil, …

8

Bảng 1.1: Một số hợp chất kháng nấm hóa học thường gặp trong

thuốc bảo quản hạt giống (Mathre và các cộng sự,2011).

 Các hoạt chất kháng nấm hóa học phổ biến như metalaxyl,mancozeb và hexaconazole… chúng đều thông qua tế bào mô thực vậttiêu diệt các nấm gây bệnh phát triển trong đó

 Metalaxyl có tên hóa học là methyl

N-(methoxyacetyl)-N-(2,6-xylyl)-DL-alaninate là hoạt chất trừ nấm thuộc nhóm Alanine, đặc biệt

hiêu quả với nhóm nấm Oomycetes mà hai đại diện điển hình là Phytophthora và Pythium gây nên các bệnh nghiêm trọng cho cây trồng Hoạt chất Metalaxyl có tác dụng nội hấp và lưu dẫn mạnh, thuốc được hấp thụ qua lá, thân, rễ của cây trồng sau đó vẫn chuyển, lưu dẫn trong cây, ức

chế sự tổng hợp protein, can thiệp vào quá trình tổng hợp ARN ribosomecủa tế bào nấm Phòng trừ hiệu quả các loại nấm phát sinh từ đất và cácloại nấm phát tán bào tử trong không khí (trích Chi cục trồng trọt và bảo

vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng,2015)

9

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Metalaxyl

 Manocozeb có tên hóa học là Manganese Ethylene bisdithiocarbamate phức hợp với kẽm, là hoạt chất thuộc nhóm thuốc diệt

nấm Dithiocarbamate Manocozeb là phức hợp của kẽm và muối mangan,dạng bột màu vàng hung, không tan trong nước và các dung môi hữu cơkhác, bền trong môi trường khô nhưng thủy phân trong môi trường nóng,

ẩm và acid Hoạt chất này không diệt nấm trực tiếp chỉ khi tiếp xúc vớinước, manocozeb mới bị hoạt hóa, giải phóng ethylene bisthiocyanatesunfua (EBIS) Dưới tác động của tia cực tím, EBIS chuyển hóa thànhethylene bisthiocyanate (EBI) EBIS và EBI tác động tới các enzyme cóchứa nhóm sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóakhác nhau trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấmmốc.( trích dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng,2014)

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Manocozeb

10

 Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất

có chứa trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC Là hoạt chất trừ nấm

phổ rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợpErgosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừngphát triển do chúng không hình thành được tế bào mới Chất này được môcây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốcnhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole.

1.2.2 Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học:

 Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây

ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật.Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm

có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tạibệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vìlượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm Nếu liềulượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài

từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư…)

 Đối với con người: cơ thể con người nhiễm độc các hợp chất hóahọc biểu hiện ở nhiều mức độ như là giảm sức khỏe, gây rối loạn hoạtđộng ở hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa hô hấp, bài tiết, gây các tổnthương bệnh lý ở các cơ quan từ mức độ nhẹ đến nặng thậm chí tàn phế

và tử vong Ví

11

dụ: hoạt chất Mancozeb gây bệnh da đối với người tiếp xúc, hoạt chất Metalaxyl gây độc cấp tính thấp nhưng gây kích ứng ở mắt ở mức trung

bình và nhóm độc II về tác động kích thích mắt

 Đối với môi trường xung quanh: các hợp chất hóa học sẽ diệt hết tất

cả các loài côn trùng, sâu bệnh và nấm gây bệnh có thể làm mất đi sự cânbằng tự nhiên trong của hệ sinh thái gây ô nhiễm môi trường, đất, nước

và không khí Các chất tồn dư, không phân hủy ở trong đất và nước cóthể làm cho động vật, cây trồng sống ở đó bị nhiễm các chất đó lâu dài,con người khi ăn các sản phẩm trồng trọt và chăn nuôi bị nhiễm chất hóahọc hằng ngày một cách gián tiếp, lâu ngày sẽ rất có hại đến sức khỏe

 Đối với các loại thực vật, chúng sẽ hình thành sự kháng thuốc và cókhả năng sẽ tạo ra các loại vi sinh vật hay nấm gây bệnh mới, mạnh hơncác loài vi sinh vật và nấm gây bệnh cũ Chẳng hạn như: hoạt chất

Metalaxyl khi sử dụng liên tục dễ hình thành tính kháng thuốc của vi sinh vật gây hại; còn hoạt chất Manocozeb chỉ có tác dụng phong bệnh tiếp

xúc, sau khi phun thuốc lên thực vật thi chỉ ngăn ngừa sự hình thànhmầm bệnh, không xâm nhập được vào bên trong mô thực vật, do đóchúng không có tác dụng khi nấm mốc hình thành và xâm nhiễm bêntrong cây trồng

1.2.3 Hợp chất kháng nấm sinh học:

1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật:

 Các vi khuẩn có lợi thường tạo ra các chất có hoạt tính sinh họcnhằmức chế được các tác nhân gây bệnh, trong đó có 1 số chất như làchất có thể chuyển hóa thành hợp chất thứ cấp hoặc chất có tính khángsinh Các chất đó giúp cho vi khuẩn có thể ức chế hay tiêu diệt các loại visinh vật cạnh tranh với chúng trong cùng điều kiện sống thích hợp Thậtvậy, ta có thể tìm thấy một số hợp chất thứ cấp từ các vi khuẩn có lợikhác nhau đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học trongquá trình phát hiện bệnh trong cây trồng, chúng đã và đang được mọingười trên toàn thế giới sử dụng để làm thuốc bảo vệ cây trồng hay phânbón sinh

12

học Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp khôn những giúp cho thực vật chốnglại các tác nhân gây bệnh từ nấm mốc mà còn giúp chúng tăng trưởng vàphát triển tốt hơn Điển hình là hợp chất thứ cấp được tiết ra từ nấm

Trichoderma, chúng chống lại được phytopathogens và một số chất khác

ảnh hương đến sự trao đổi chất của thực vật

 Chất gây hại chủ yếu trong các bệnh của cây trồng chủ yếu làphytopathogenic, các hợp chất thứ cấp trong sinh học có thể kháng lạichúng mà không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến con người

và động vật, ít tốn kém, quan trọng hơn hết là không làm cho các chấthây hại có khả năng kháng thuốc nhanh như các chất hóa học

 Các hợp chất thứ cấp (SM) là sự chuyển hóa hóa học các hợp chấtkhác nhau có trọng lượng phân tử tương đối thấp (<3kDa) và được sảnxuất dựa bởi các vi sinh vật và thực vật có liên quan đến các chi, loài haychủng Các hợp chất thứ cấp này được chuyển hóa bằng con đường sinhtổng hợp từ các chất chuyên biệt (như polypeptide hhay con đường bắtnguồn từ Acetyl Co-enzyme A hoặc các amino aicd) Các hợp chất nàycòn có một số tác nhân sinh học ảnh hưởng đến sự sống, các chức năngcủa cơ thể hay cạnh tranh với các vi sinh vật khác

 Đối với nấm, việc sản xuất các hợp chất thứ cấp thường tương quanđến các giai đoạn như sự khác biệt về cấu trúc, hình thái và giai đoạntăng trường

 SM còn biểu hiện một số chức năng sinh học và đóng vai trò quantrọng trong việc điều chỉnh sự tương tác giữa các vi sinh vật Ví dụ:phytotoxins là hợp chất thứ cấp của nấm mốc tiết ra để gây hại cho câytrồng, độc tố nấm là hợp chât thứ cấp được sản xuất ra để gây hại cho câytrồng và có khả năng gây hại cho con người và động vật, kháng sinh làcác chất trong tự nhiên có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt đối thủ cạnhtranh của vi sinh vật Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp từ nấm có thể thayđổi sự tăng trưởng và trao đổi chất cho cây nhằm mục đích kéo dài sự

13

hình thành bào tử và sơi nấm Chính vì vậy, người ta tập trung nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nấm có lợi và vai trò của nó để chống lại cácvisinh vật và nấm gây bệnh khác.

 Trong các nghiên cứu cho thấy,sự phân lập nấm Trichoderma tiết ra

hợp chất thứ cấp quan trọng có hoạt tính kháng nấm và gây độc chống lại

phytopathogenic Trong nấm Trichoderma có chứa các chất kháng nấm

như là pyrones, viridins, butenolides và Hydroxy-lacton…

 Pyrones hay còn có tên gọi là 6-pentyl-2H-pyran-2-one (6PP): là chất được chuyển hóa từ các loại nấm Trichoderma spp khác nhau( T.viride, T.atroviride, T.harzianum, T.koningii) Hợp chất này đã thể hiện được khả năng kháng lại một số nấm gây bệnh trong

cả in vitro và in vivo Ngoài ra, còn có cytosporone S thuộc nhóm hợp chất pyrones được phân lập từ Trichoderma có hoạt tính kháng

sinh đối với 1 số loài vi sinh vật và nấm gây bệnh

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Pyrones.

14

 Viridins là hợp chất steroid được chuyển hóa từ sự phân lập các loài nấm Trichoderma spp, hợp chất này ngăn chặn sự tăng trưởng từ các loài nấm gây bệnh như: Aspergillus Niger, Fusarium caeruleum, Penicillium expansum….

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Viridins.

 Butenolides và Hydroxy-Lactones cũng là các hợp chât thứ cấp được phân lập từ các chủng Trichoderma spp khác nhau và thông qua các nghiên cứu trong in vitro thấy được khả năng kháng nấm gây

bệnh của chúng, đặc biệt là chống lại được phytopathogenic

1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn:

Một số loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện và môi trườngkhác nhau, sinh ra các khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặc cácyếu tố môi trường bất lợi là thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế

sự phát triển của vi sinh vật Trong thực tế, trong môi trường nuôi cấy nấmgây bệnh sẽ có sự hiện diện của rất nhiều loài vi sinh vật khác tranh dànhchất dinh dưỡng, không gian sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn pháttriển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡngtrong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinhtrưởng của nấm bị ức chế (Theo Nguyễn Lân Dũng và Hoàng ĐứcNhuận,1976, trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005)

15

a.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Bacillus spp.:

 Trước tiên, vi khuẩn Bacillus spp tạo thành khối xung quanh các

nấm gây bệnh ngăn chặn và không cho chúng bám lên vật chủ để gây bệnh

 Sau đó, Bacillus spp sẽ tiết ra hỗn hợp gồm nhiều chất lipopeptid

(hay còn gọi là serenade) làm thủng vách tế bào và màng tế bào của cácloại nấm gây bệnh đó, vì vậy ngăn chặn sự phát triển của chúng Serenda

có thể được bảo quản và được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu hóa họctổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm khônggây ngộ độc tới các loài động vật như cá hồi, ong mật, chim cút sâu đất…

 Serenda gồm có 3 nhóm lipopetid có tên là surfactin, agrastatin và iturin Ba nhóm chất này kết hợp lại với nhau sẽ làm tăng hoạt tính diệt

các mầm bệnh gây hại như nấm mốc và các bào tử gây bệnh của chúng

 Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid Bản thân của chất này không gây độc cho nấm nhưng khi

kết hợp với inturin thì sẽ trở thành hợp chất diệt nấm Sufactin cókhả năng làm thủng vách tế bào của nấm gây bệnh và bảo tử củachúng hỗ trợ cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng

 Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống như sufactin và iturin.

 Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt nấm mốc, bản chất của chúng là lipopeptide được chiết từ môi trường nuôi cấy Bacillus spp Iturin diệt nấm bằng cách tác dụng

lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành nhiều lỗ thủng làmmất đi tính thẩm thấu và chọn lọc của màng

 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng của

Aspergillus spp và Bacillus spp.:

 Trong nước:

Nguyễn Đình Đào (1993) đã kiểm tra đối kháng của Bacillus subtilis

AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết quả là

16

ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân,

1995)

Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã tiến hành sử dụng

Bacillus subtilis để ức chế sự sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavusvà Aspergillus parasiticus trên đậu phộng (trích

Lâm Thanh Thúy, 1995)

 Ngoài nước:

Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của

một số chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.

Norio Kimura (1990) đã sử dụng Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên đậu phộng và bắp Các chủng Bacillus subtilis

NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm mốc vàtổng hợp aflatoxin (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995).b.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic:

 Khả năng ức chế của các vi khuẩn Lactic liên quan đến sự ức chếcác vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và

sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Khả năng khángnấm và các thành phần ức chế đã tìm thấy và được công nhận qua cácnghiên cứu

 Các vi khuẩn Lactic có thể sản xuất ra các chất kháng sinh như acidlactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro,bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm Các vi khuẩnLactic đã được biết đến trong nhiều năm và có vai trò quan trọng trongviệc sản xuất các sản phẩm lên men phục vụ vho đời sống con người Lợiích của chúng mang lại là ảnh hưởng quan trọng đến đường tiêu hóa củacon người (Cogan và cộng sự,1995; Hafidh và cộng sự, 2010) Giống

Lactobacillus đã được báo cáo có hoạt tính kháng nấm đánh giá bằng thử

nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng Hoạt chất khángnấm của

17

L.coryniformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH

3-4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001)

 Hầu hết các nghiên cứu kháng nấm của vi khuẩn Lactic là do việcsản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hoạt chất proteinaceous và một

số các vi khuẩn Lactic L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất

acid hữu cơ và đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998;Lavermicocca và cộng sự, 2003) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh họcduy nhất là Nisin có thể thêm được vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩnLactic (Gardiner và cộng sự,2003; Corcoran và cộng sự,2004)

 Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic đã xác định

được một số hợp chất có tác dụng ức chế lại nấm mốc và các loại nấmmen khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.1).; Lavermicocca vàcộng sự, 2000;.Niku-Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren

và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005)

Bảng 1.2:Một số hợp chất đƣợc xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và

nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất đƣợc xác định

Caproic-, propionic-, buturic-,

acetic-, formic- and n-valeric acid

18

 Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từphô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại

Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và

cộng sự, 1996)

 Vi khuẩn Lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm

có tính acid và các tổ hợp khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số cácchất

kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acidhữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl… Ngoài sự ứcchế tăng trưởng thực tế của nấm, các vi khuẩn Lactic cũng có thể ức chếsản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997)hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El-Nezami và cộng sự, 2004)

1.3 Các phương pháp sàng lọc các chủng VSV kháng nấm mốc:

 Từ cuối những năm 50 và đầu các thập niên 60, các nhà khoa học đãnghiên cứu hoạt tính kháng nấm mốc của các vi khuẩn có lợi thông quanhiều phương pháp khác nhau để từ đó, các nhà khoa học có thể khẳngđịnh được sự kháng nấm của các vi khuẩn có lợi sẽ ức chế được sự tăngtrưởng và phát triển của các bào tử và sợi nấm của các chủng nấm gây hại,

đặc biệt là chủng nấm Aspergillus spp.

 Dựa trên tiêu chí đó, để lựa chọn ra được chủng vi khuẩn có lợi từ

bộ sưu tập của phòng thí nghiệm có khả năng kháng nấm mốc hiệu quảthích hợp nhất, em đã thực hiện theo 3 phương pháp khác nhau: phươngpháp đối kháng trực tiếp, phương pháp đặt thạch khuếch tán và phươngpháp đối kháng che phủ Từ đó, dựa trên sự đường kính của sợi nấm đánhgiá được mức độ đối kháng của vi khuẩn có lợi nào mạnh nhất và cũngnhư phương pháp nào tối ưu nhất

19

1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (phương pháp ria 2 đường vi

khuẩn):

Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sửdụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line CultureMethod) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005):Đầu tiên, ta cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đường kính 7mm) và đặtvào tâm dĩa petri có môi trường thạch đã chuẩn bị, sau đó ủ 24h cho nấmphát triển Tiếp theo, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn chỉ thị vào dĩa vàđặt cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diệnnhau qua tâm dĩa trên cùng một đường kính) Cuối cùng, ủ các dĩa thạchtrong 72h, nhiệt độ phòng Hoạt động ức chế sẽ dựa trên đường kính củasợi nấm

Hình 1.6: Phương pháp cấy ria 2 đường vi khuẩn thể hiện sự đối kháng của

vi khuẩn LAB với nấm mốc (trích từ Brunner và cộng sự (2005).

20

Hình 1.7: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của các vi khuẩn có

lợi theo phương pháp ria 2 đường vi khuân.

21

1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đảt thạch khuếch tán):

Phương pháp khuếch tán(Agar Plug Diffusion Method) này được phát triểnvào năm 1940, là phương pháp thông dụng được sử dụng nhiều trong cácphòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng để thử nghiệm nhạy cảm kháng sinhthông thường Hiện nay, nhiều tiêu chuẩn đã chấp nhận và phê duyệt đượccông bố bởi CLSI cho vi khuẩn và nấm mốc thử nghiệm, mặc dù không phảihầu hết các vi khuẩn đều thể hiện khả năng đối kháng trên phương pháp nàynhưng cũng đã thành công trên một số vi khuẩn và thể hiện rõ sự ức chế củachống đối với nấm mốc

Phương pháp này được mô tả như sau: Đầu tiên, ta trang huyền phù củanấm với mật độ 105/ml nấm trên dĩa thạch PDA cho khô Tiếp theo, sử dụngcây khoanh thạch đục lỗ vi khuẩn chỉ thị đặt vào 3 điểm đã xác định trên dĩapetri có chứa nấm Cuối cùng, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.Hoạt động ứcchế sẽ dựa trên sụ phát triển của đường kính nấm

Hình 1.8: Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện

sự đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus spp với C.albicans

(trích dẫn Mounyr Balouiri, 2011).

22

Hình 1.9: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn

có lợi theo phương pháp khuếch tán.

23

1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ: (phương pháp đỗ dĩa)

Phương pháp che phủ (Overlay Method) này như mô tả của Kumar và cáccộng sự, 2009 Sử dụng dịch tăng sinh của vi khuẩn chỉ thị được cấy tranglên môi trường đặc thù của chúng, sau đó ủ 24h trong nhiệt độ phòng Tiếptheo, chúng được phủ lên bằng 10ml chiết xuất malt thạch mềm có chứa

105/ml nấm ủ hiếu khí trong vòng 72h Sau 72h nuôi cấy, vùng ức chế sẽhiện ra.Hoạt động ức chế dựa trên độ bao phủ của nấm thể hiện trên dĩa

Hình 1.10: Phương pháp đối kháng che phủ của vi

khuẩn Bacillus spp với nấm mốc - Nấm Trichorphyton

sp (a) - Nấm Microsporum fulvum (b) (trích dẫn

Kumar và các cộng sự, 2009).

24

Hình 1.11: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm với các vi khuẩn có lợi

theo phương pháp đõ dĩa.

25