Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân giống cây hoa african violet (saintpaulia ionantha h wendl )​

Thứ ba: So sánh sự sinh trưởng và phát triển của cây african violet in vitro từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc so với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2,CaClO2, AgNO3] ở gi i đoạn vư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

-DƯƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA

AFRICAN VIOLET (SAINTPAULIA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

-DƯƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA

AFRICAN VIOLET (SAINTPAULIA

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG QLKH – ĐTSĐH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP.HCM, ngày … tháng… năm 2017

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: DƯƠNG BẢO TRINH

Ngày, tháng, năm sinh: 07/03/1993

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

I- TÊN ĐỀ TÀI:

Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân

giống cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H WendL.)

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Thứ nhất: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy

Thứ hai: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro.

Thứ ba: So sánh sự sinh trưởng và phát triển của cây african violet in vitro từ

mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc so với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2,Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vườn ươm

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

i

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Dương Tấn Nhựt

CBHDI

PGS.TS Dương Tấn Nhựt NCS Nguyễn Phúc Huy

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN

PGS.TS Dương Tấn Nhựt NCS Nguyễn Phúc Huy

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP HCM ngày

… tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

12345

Xác nhận củ Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận s u khi Luận văn đã được sử chữ (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin c m đo n nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng củ n no bạc lên quá trình

khử trùng trong vi nhân giống cây ho african violet (Saintpaulia ionantha H.

WendL.)” là công trình nghiên cứu củ tôi dưới sự hướng dẫn củ PGS.TS DươngTấn Nhựt và NCS Nguyễn Phúc Huy Nghiên cứu này c ng là một phần trongnhánh số 3 củ Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Kho học và Công nghệ Việt Nam

“Nghiên cứu tác động củ hạt n no kim loại lên khả năng tái sinh, sinh trưởng pháttriển và tích l y hoạt chất trong quá trình nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh

tế c o ở Việt N m” thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu cơ chế tác động và đánh giá ntoàn sinh học củ các chế phẩm n no”, mã số: VAST.TĐ.NANO.04/15-

18. Những kết quả nghiên cứu củ người khác và các số liệu được trích dẫn trongluận văn có chú thích đầy đủ Đề tài được tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử vàChọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên Các số liệu, kếtquả, đánh giá đư r trong luận văn chư được i công bố trong bất kỳ luận văn nàotrước đây Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trường về c m đo n này

Tác giả luận văn

Ký tên

Dương Bảo Trinh

LỜI CẢM ƠN

Chắc hẳn trong mỗi con người i c ng có những khoảnh khắc khó quên của cảcuộc đời, có thể là vui hay buồn, Nhưng với tôi có hai dấu ấn mà tôi mãi khắc ghiđến suốt cả cuộc đời Đó là lúc tôi chập chững với những bước đi cùng mẹ trongnhững ngày đầu tiên đi học, khi còn thơ bé Và giờ đây, cái cảm giác ấy một lần nữalại ùa về khi tôi bước chân vào phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống câytrồng Chính các thầy cô, anh chị, các bạn ở đây đã tạo cho tôi có một sự tự tin, nỗlực hơn trong cuộc sống c ng như trong học tập Để hoàn thành luận văn này, tôibiết bản thân đã nhận rất nhiều sự giúp đỡ của mọi người

Đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được bày tỏ lờicảm ơn chân thành tới Thầy, PGS TS Dương Tấn Nhựt Thầy đã tận tình chỉ bảocho tôi biết thế nào là nghiên cứu kho học, qu sự giảng dạy củ Thầy, cả chân trời trithức như rực sáng trước mắt tôi Có lẽ, tôi sẽ không b o giờ biết được những điều

kỳ diệu ấy nếu như không có sự tâm huyết, nhiệt tình, tận tụy củ Thầy Làm sao tôiquên được từng lời răng dạy nghiêm khắc trong những buổi họp, h y những câuchuyện hóm hỉnh trong bàn ăn, đặc biệt là hình ảnh đôi t y khẳng khiu, run run củThầy trong những ngày bệnh nhưng vẫn cố gắng gượng, đích thân chụp hình kếtquả thí nghiệm cho chúng tôi cốt là để số liệu, hình ảnh thu được chính xác và sắcnét nhất Chính giây phút ấy, tôi biết bản thân thật m y mắn khi được trở thành họctrò củ Thầy – “Người Thầy Toàn Tâm”

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến NCS Nguyễn Phúc Huy đã chi sẻ nhiều kinhnghiệm, những kiến thức thực tế, những lời động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốtluận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn B n lãnh đạo Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên;Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo s u Đại học, các giảng viên củ Trường Đại họcCông nghệ TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quátrình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi xin cảm ơn tới các cán bộ phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống câytrồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên: TS V Quốc Luận, NCS V Thị Hiền, TS Nguyễn Bá N m, NCS Hoàng Th nh Tùng, cô Phi Phượng Cảm ơn mọi người đã nhiệt tình, dành nhiều thời gi n để chỉ bảo, giúp đỡ tôi

v

Tôi c ng xin được gửi lời cảm ơn đến tập thể các nh chị cán bộ, nhân viên tạicông ty CP Công nghệ Sinh học Thái Dương đã giúp tôi có những buổi kiến tậpthực tế bổ ích.

Xin cảm ơn tập thể lớp 15SSH21 trường Đại học Công nghệ Thành phố HồChí Minh, cùng tất cả các nh chị, các bạn học sinh, sinh viên, học viên củ cáctrường Đại học Kho học Tự nhiên, Đại học Đà Lạt, Đại học Yersin Đà Lạt, Đại họcHuế, Đại học Tôn Đức Thắng,… đã và đ ng thực tập tại phòng Sinh học Phân tử vàChọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên

Bằng sự tin yêu và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS BS.CKII Trần Trọng Nhật Huy, kho Nội, Trung tâm Y tế Vietsovpetro – bác sĩ điều trị,người đã cứu sống tôi không chỉ một mà rất nhiều lần, cảm ơn nh vì đã luôn tận tìnhcứu chữ , qu n tâm, đồng hành cùng tôi trong cuộc sống Tôi sẽ không thể có đủ sứckhỏe để hoàn thành luận văn này nếu không có anh

Trên hết, con xin gửi lời cảm ơn đến b mẹ, chị h i và út Dù có đi đâu, làm gì,con (em, chị) vẫn mãi là người con, người em, người chị trong gi đình; vẫn luôncần một điểm tự , để được dỗ dành những phút con mít ướt, yếu lòng nhất Con biếtmọi người thương con, lo cho sức khỏe củ con nên đã từng rất giận khi con quyếtđịnh rời x gi đình mình Ông bà t thường nói “Đi một ngày đàng, học một sàngkhôn”, quả đúng là như thế, bởi con cảm thấy bản thân đã chín chắn hơn rất nhiều

s u khoảng thời gi n rèn luyện Và đặc biệt, khi càng x mọi người, con mới càngnhận r không đâu bằng gi đình Con xin lỗi và cảm ơn mọi người vì đã luôn tintưởng con, ủng hộ cho lý tưởng sống củ con, dẫu rằng con vẫn chư thành công nhưmọi người kỳ vọng Nhà là nơi để về, là nơi để yêu thương đong đầy, con mãi yêumọi người

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Đà Lạt – Mảnh đất thân thương gắn với những câu chuyện về “Lòng người và những Bài học trong Cuộc sống” Trân trọng cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2017

Người thực hiện luận văn

Dương Bảo Trinh

TÓM TẮT

Khử trùng mẫu cấy là gi i đoạn vô cùng quan trọng của quá trình tạo nguồn

mẫu b n đầu trong nuôi cấy in vitro Các chất khử trùng hiện n y thường có tính độc

cao gây ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp cho sức khỏe con người và môi trường

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nano bạc không chỉ kháng khuẩn hiệu quả

mà còn n toàn cho con người Do đó, n no bạc đ ng được sử dụng rộng rãi trongnhiều lĩnh vực khác nh u như: y học, dược phẩm, mỹ phẩm, sinh học, nông nghiệp,

… Tuy nhiên, các báo cáo về ảnh hưởng của nano bạc trong gi i đoạn khử trùngmẫu cấy thực vật vẫn còn hạn chế

Trong nghiên cứu này, các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2,AgNO3] và nano bạc đã được sử dụng để khử trùng mẫu cấy african violet

(Saintpaulia ionantha H Wendl.) với dãy nồng độ, thời gian khử trùng khác nhau

nhằm khảo sát khả năng khử trùng và cảm ứng mẫu cấy của nano bạc trong giaiđoạn khử trùng mẫu Sau khi khử trùng, chúng tôi tiến hành theo dõi và đánh giá sựsinh trưởng, phát triển của mẫu cấy qu các gi i đoạn khác nhau

Kết quả cho thấy, mẫu cấy được khử trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,05%trong 15 phút cho hiệu quả tốt nhất mà không có tác động xấu đến sự sinh trưởng

và phát triển của mẫu cấy Nano bạc kích thích sự cảm ứng của mẫu cấy Đây lànghiên cứu đầu tiên về khả năng khử trùng c ng như v i trò của nano bạc lên sự sinh

trưởng và phát triển của cây african violet (Saintpaulia ionantha H Wendl.).

vii

Surface sterilization is the most important step in preparation of explants formicropropagation, because controlling fungal and bacterial contamination of plantfrom field sources is very difficult Most of surface disinfectants are now highlytoxic influence either directly or indirectly to human health and the environment.Many studies have demonstrated not only nano silver antibacterial effectefficient but also extremely safe for humans So, the silver nanoparticles have beenwidely used in many different fields of life, such as medicine, pharmaceuticals,cosmetics, biological, agricultural, However, reports on the effect of silvernanoparticles for surface sterilization of plant explants are still limited

Nano silver and typical disinfectants [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] were tested

for sterilization of african violet (Saintpaulia ionantha H WendL.), by varying their

concentration and time of exposure The target of this study was to examineevaluated the possibility of sterilization and stimulate explants of nano silver formicropropagation After performing the decontamination step, we observed toevaluate the growth and development of explants through subsequent stages of themicropropagation process of african violet

The results indicated that among these sterilizing agents nano silver atconcentration of 0.05% for 15 minutes was the best for controlling the infection.Nano silver could be applied without adverse effects on the plant growth anddevelopment The induction of the explants in culture was also stimulated by silvernanoparticles This is the first report on in vitro establishment using nano silver toreduce bacterial infections, as well as the role of silver nanoparticles on the growth

and development of african violet (Saintpaulia ionantha H WendL.).

MỤC LỤC

Trang

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ i

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN v

TÓM TẮT vii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩ đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩ kho học 2

1.4.2 Ý nghĩ thực tiễn 3

1.5 Kết cấu luận văn 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

2.1 Tổng quan về cây african violet 4

2.1.1 Phân loại và đặc điểm 4

2.1.2 Tình hình nghiên cứu african violet 5

2.2 Sơ lược về gi i đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật 6

2.3 Sơ lược về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 8

2.3.1 Calcium hypochlorite [Ca(ClO)2] 8

2.3.1.1 Giới thiệu 8

2.3.1.2 Nhược điểm 9

2.3.2 Mercury chloride (HgCl2) 9

2.3.2.1 Giới thiệu 9

2.3.2.2 Nhược điểm 10

2.3.3 Một số chất khử trùng khác 10

2.3.3.1 Hydro peroxide (H2O2) 10

2.3.3.2 Nước brom 11

ix

2.3.3.3 Các chất kháng sinh 11

2.3 Sơ lược về nano bạc 11

2.3.1 Nano bạc 11

2.3.1.1 Giới thiệu về bạc kim loại và cơ chế kháng khuẩn của bạc 11

2.3.1.2 Ưu điểm của nano bạc 12

2.3.2 Nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

2.3.2.1 Các nghiên cứu sinh trưởng và phát triển của nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 2.3.2.2 Các nghiên cứu về khả năng khử trùng của nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

3.1 Đị điểm và thời gian tiến hành đề tài 17

3.2 Phương pháp thí nghiệm 17

3.2.1 Nguồn mẫu và nguyên liệu 17

3.2.2 Môi trường nuôi cấy 17

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy 17

3.2.4 Bố trí thí nghiệm 18

3.2.4.1 Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy 18 3.2.4.2 Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro 20 3.2.4.3 Nội dung 3: So sánh sự sinh trưởng và phát triển của cây african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vườn ươm21 3.2 Giải phẫu hình thái và quan sát mô học 22

3.3 Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy 24

4.2 Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro 46

4.3 Nội dung 3: So sánh sự sinh trưởng và phát triển của cây african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vườn ươm 55

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.1.1 Kết quả đạt được 59

5.1.2 Quy trình khử trùng mẫu cấy african violet bằng nano bạc 59

5.2 Kiến nghị 61

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

1 Tài liệu tiếng Việt 63

2 Tài liệu tiếng Anh 64

PHỤ LỤC 71

xi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

B5 : Gamborg và đồng tác giả (1968)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác

nhân vô trùng 8Bảng 3.1 So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy 19Bảng 3.2 So sánh sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy african violet in

vitro từ nguồn mẫu khử trùng bằng nano bạc với các chất khử

trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] 20Bảng 3.3 So sánh sự sinh trưởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi

african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng

nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2,

Bảng 3.4 So sánh sự sinh trưởng, phát triển của cây african violet in vitro

có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất

khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn

vườn ươm 22Bảng 4.1a So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc

và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ

lệ mẫu nhiễm25

Bảng 4.1b So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của

nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

thông qua tỷ lệ mẫu nhiễm 26Bảng 4.2a So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc

và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ

lệ mẫu cấy chết 27

Bảng 4.2b So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của

nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

thông qua tỷ lệ mẫu cấy chết 28

xiii

Bảng 4.3a So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc

và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ

lệ mẫu cấy thành công 30

Bảng 4.3b So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của

nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

thông qua tỷ lệ mẫu cấy thành công 31Bảng 4.4 Sự phát sinh hình thái khác nhau giữa nano bạc và chất khử

trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy 41Bảng 4.5 So sánh sự sinh trưởng, phát triển của cụm chồi tái sinh từ mẫu

cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy 47Bảng 4.6 So sánh sự sinh trưởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi

tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc

với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 52Bảng 4.7 So sánh sự thích nghi, sinh trưởng của cây african violet in vitro

có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3 sau 4 tuần ở điều kiện ex vitro 55

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cây hoa african violet 4Hình 2.2 Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy 7Bảng 2.1 Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác

nhân vô trùng 8Hình 4.1 Sự cảm ứng giữa các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc và

HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy 42Hình 4.2 Giải phẫu hình thái và quan sát mô học của các mẫu cấy khử

trùng bằng nano bạc và các chất khử trùng thông dụng sau 30

ngày nuôi cấy 43Hình 4.3 Mẫu lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2,

Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tái sinh chồi sau 30 ngày

nuôi cấy 48Hình 4.4 Mẫu cấy african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2,

Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 30

ngày nuôi cấy 53Hình 4.5 Cây con tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng

nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 56Hình 4.6 African violet ra hoa sau 4 tháng trồng ngoài vườn ươm 57Hình 5.1 Sơ đồ khử trùng mẫu cấy bằng nano bạc trong quy trình nhân

giống cây african violet 60

xv

Biểu đồ 4.2b Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african

violet của Ca(ClO)2 35

Biểu đồ 4.3a Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet

của AgNO3 36

Biểu đồ 4.3b Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african

violet của AgNO3 36

Biểu đồ 4.4a Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu lá african violet thành công khi khử

trùng bằng nano bạc37

Biểu đồ 4.4b Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu cuống lá african violet thành công

khi khử trùng bằng nano bạc 38

Biểu đồ 4.5 Biểu đồ thể hiện số chồi tái sinh từ mẫu cấy lá cây african

violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3

sau 30 ngày nuôi cấy 49

Chương 1

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Đư mẫu từ môi trường ex vitro vào in vitro là gi i đoạn vô cùng khó khăn bởi

vì ở gi i đoạn này mẫu cấy thông thường dễ bị nhiễm nấm, khuẩn, bị chết hoặcmẫu cấy phát triển chậm, gây tốn kém và mất thời gi n cho người thực hiện Có rấtnhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên: chất khử trùng, nồng độ và thời giankhử trùng mẫu cấy chư phù hợp là những nguyên nhân chính dẫn đến sự thất bại

trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu (Abdi et al., 2012) Phần lớn các chất khử trùng

mẫu đ ng được sử dụng hiện nay [HgCl2, Ca(ClO)2,…] là các chất mang tính tẩyrửa cao, kháng vi sinh vật theo cơ chế ăn mòn vách, thành tế bào vi khuẩn và nấmnên thường gây ảnh hưởng đến mẫu cấy nhưng vẫn không hiệu quả trong khử

trùng mẫu (Ines et al., 2013) Ngoài ra, hầu hết các chất được sử dụng trong khử

trùng mẫu cấy hiện nay đều có tác động xấu tới sức khỏe con người (WHO, 2000).Việc tìm ra một loại chất khử trùng mới an toàn cho sức khỏe, hiệu quả trong khửtrùng mẫu và có tác dụng kích thích mẫu cấy là việc vô cùng cần thiết

Bạc và các muối bạc đã được sử dụng phổ biến trong khử trùng y khoa nhờđặc tính kháng nấm, kháng khuẩn mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe và sự

tăng sinh của các mô biểu bì (Abdi et al., 2012) Mặt khác, ion bạc còn đóng v i trò quan trọng trong việc tác động phát sinh phôi soma, tạo chồi và tạo rễ (Bais et al., 2000), ảnh hưởng tích cực trong điều chỉnh quá trình sinh lý bao gồm cả hình thái của mẫu cấy (Halevy et al., 1981); do đó, ion bạc đã được sử dụng trong nuôi cấy

mô thực vật nhằm kích thích mẫu cấy c ng như hạn chế số lượng mẫu nhiễm

(Russell et al., 1994; Abdi et al., 2012) Thông thường các ion bạc luôn đi kèm với

các cation tồn tại ở dạng muối như: bạc nitrate, bạc thiosulph te,… điều này ảnhhưởng đến hiệu quả hấp thu và khử trùng của ion bạc

Công nghệ n no r đời để khắc phục tình trạng trên, với các đặc tính ưu việtnhư: tăng hiệu quả tiếp xúc bề mặt nên ion dễ dàng bám dính xâm nhập vào tế bào

vi sinh vật hay thực vật hơn, dễ dàng di chuyển bên trong thực vật giúp tăng hiệuquả hấp thu và khử trùng, hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thành công vượt trội tronglĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật (Husen, Siddiqi, 2014) Nhiều nghiên cứuchứng minh nano bạc có khả năng khử trùng đã được thực hiện, tuy nhiên chư cónghiên cứu nào mang tính hệ thống và đầy đủ về ảnh hưởng của nano bạc trong gi

i đoạn khử trùng mẫu c ng như phát sinh hình thái của mẫu cấy từ gi i đoạn in

vitro đến gi i đoạn ex vitro.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

So sánh khả năng khử trùng mẫu của nano bạc với các chất khử trùng thôngdụng thông qua sự cảm ứng và phát sinh hình thái của các loại mẫu cấy cây

african violet ex vitro khi vào mẫu in vitro bao gồm: Mẫu cấy lá chứa gân chính,

mẫu cấy phiến lá, mẫu cấy cuống lá cắt ngang, mẫu cấy cuống lá cắt dọc

Đánh giá ảnh hưởng của nano bạc thông qua quá trình theo dõi sự sinh trưởng,

phát triển của chồi và cây con african violet in vitro; sự sinh trưởng, phát triển

củ cây con khi đư r trồng ở điều kiện vườn ươm

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy

Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro.

Nội dung 3: So sánh sự sinh trưởng và phát triển của cây african violet in vitro

từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2,Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vườn ươm

1.4 Ý nghĩa đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Những tiến bộ về khoa học vật liệu trong những thập niên đầu thế kỷ XXI

đã tạo tiền đề để công nghệ nano có những bước phát triển mạnh mẽ và từng

2

bước có mặt trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ như kho học vật liệu,vật lý, hóa học, sinh học,… và công nghệ sinh học thực vật Trong đó, n no bạcđược nhìn nhận như một nhân tố mới có hiệu quả trong nuôi cấy mô tế bào thựcvật Các nghiên cứu về nano bạc hiện chủ yếu đánh giá tác động ngăn sinh tổnghợp ethylene, từ đó gián tiếp tác động lên sinh trưởng và phát triển của thực vật.Ngoài ra, nano bạc còn được quan tâm vì khả năng kháng khuẩn, nấm cao Hiệnnay, nano bạc chỉ được sử dụng như một tác nhân hỗ trợ khử trùng trong giaiđoạn khử trùng mẫu Nghiên cứu này mang tính hệ thống đầy đủ về ảnh hưởng

của nano bạc trong việc khử trùng, phát sinh hình thái của mẫu cấy ex vitro cây

african violet nói riêng và là bước đầu nghiên cứu khả năng sử dụng nano bạckhử trùng mẫu cấy thực vật nói chung

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Việc khử trùng mẫu cấy ex vitro hiện nay ở các phòng thí nghiệm chủ yếu

sử dụng chất khử trùng mẫu cấy có tính tẩy rử và ăn mòn c o nên có khả nănggây độc và ức chế mẫu cấy Ngoài r , đ phần các chất khử trùng hiện nay có ảnhhưởng tiêu cực đến sức khỏe con người; do đó, việc khảo sát và đánh giá khảnăng khử trùng, kháng khuẩn, nấm của nano bạc thay thế cho kháng sinh hay cácchất khử trùng này mang lại lợi ích vô cùng lớn, và là một bước ngoặc mới trongcông nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.5 Kết cấu luận văn

Ngoài phần danh mục tài liệu tham khảo, nội dung chính của luận văn gồm

có 5 chương:

Chương 1 Mở đầu

Chương 2 Tổng quan tài liệu

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 4 Kết quả và thảo luận

Chương 5 Kết luận và kiến nghị

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây african violet

2.1.1 Phân loại và đặc điểm

Saintpaulia spp thuộc họ Gesneriaceae, giống Saintpaulia H WendL được

phân loại vào nhóm cây cỏ lưu niên Thân cây gồm các lá ngắn, dày và kéo dài

chậm chạp, hoặc có thân bò ngang Rễ mọc ra từ các đốt thân (Jungnickel, Zaid,

1992)

Lá có cuống dày, phiến lá từ dạng hình tim hơi tròn đến hình elip Các lá mọc

đối, khít với nhau và xếp lại giống như hình vương miện Lớp lông c ng góp phần

vào sự phân biệt giữa các loài Các lông tuyến có cuống ngắn hoặc không có cuống

thì không có giá trị phân loại trong giống này Các lông che chở trên lá có thể dài

hoặc ngắn, dựng đứng hoặc nằm ngang, sự phân bố các lông trên lá chỉ có ở dạng

thẳng đứng, có lá các lông chỉ ở dạng nằm ngang hoặc có cả hai dạng phân bố trên

cùng một lá (Jungnickel, Zaid, 1992)

Cây african violet phát triển cao khoảng 30 cm Các lá thuôn tròn thành hình

bầu dục, dài 2,5 – 8,5 cm với một cuống 2 – 10 cm, lông mịn, kết cấu nhiều thịt

Các ho có đường kính 2 – 3 cm, với một thùy tràng hoa có 3 – 10 bông hoặc nhiều

hơn trên một cành hoa mảnh mai Các loài hoang dã có màu tím, xanh nhạt, hoặc

trắng African violet là loài hoa với đ dạng màu sắc, có cánh đơn cánh kép rất đẹp

mắt, có thể nở và sống dưới ánh sáng trắng, ánh sáng nhân tạo, không gian kín như

các văn phòng làm việc mà không phải chăm sóc nhiều

2.1.2 Tình hình nghiên cứu african violet

Nhiều giống Saintpaulia đã được nhân giống thương mại và sự phát triển của

các cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh được thu nhận nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.Các cây con khỏe mạnh, sạch bệnh và giống nhau về mặt di truyền đã được lưu trữ

trong in vitro trong một thời gian dài (Jungnickel, Zaid, 1992).

Theo Bilkey và Cocking (1982), khả năng tái tạo khác nh u củ mô biểu bì và

hạ bì ở Saintpaulia ionantha H WendL tùy thuộc vào môi trường muối khoáng cơ

bản được sử dụng trong nuôi cấy Môi trường chứa 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BAcho sự tạo thành mô sẹo trên cuống lá cắt ngang còn nguyên lớp tế bào biểu bì vàtrên cuống lá bị tách bỏ lớp biểu bì (chỉ còn lớp các tế bào hạ bì) Sự tạo cây chỉ xảy

ra trên cuống lá có chứa các lớp tế bào biểu bì Trên môi trường B5 với cùng nồng

độ các chất điều hò sinh trưởng đã diễn ra sự tạo chồi trên cả hai loại mẫu cấy Khitrồng các cây thu được trên cả hai loại mô biểu bì và hạ bì đến khi ra hoa,các tác giảnhận thấy rằng, các cây thu được từ mô hạ bì khỏe mạnh hơn, lớn hơn về khốilượng tươi 25%, đường kính lá lớn hơn 11%, nhiều lá hơn 28%, cuống lá mập hơn14% và dài hơn 18% so với các cây thu từ các lớp tế bào biểu bì

Theo Dallon (1987), từ lá, cuống lá và phần phát hoa của african violet có thểphát sinh tạo cơ qu n bình thường và hoàn chỉnh trên môi trường có 0,5 mg/l BA kết

hợp với 0,5 mg/l NAA Theo George (1993), việc nuôi cấy phát hoa in vitro của các cây

african violet thể khảm đã tạo ra các cây con đồng kiểu gene với cây mẹ Điều này cóthể là do các chồi con được tạo ra từ đỉnh sinh trưởng bên hoặc đỉnh sinh trường củphát ho đã biệt hóa thành chồi sinh dưỡng Chồi con african violet có thể nuôi cấyđược trong môi trường đơn giản gồm 23 g đường, 240 ml nước cất, 1 viên inositol

125 mg, 1 viên vitamin có chứa B1 và các khoáng tố, 4 muỗng nước dừa và 1 viên vôinhỏ để điều chỉnh pH H koz ki (1993) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường

và pH môi trường lên sự tạo mô sẹo, tái sinh và tăng trưởng chồi từ lá african violet.Thời gian hình thành mô sẹo và chồi ngắn nhất trên môi trường MS có chứ 30 g/lđường, pH 5,8 và đây c ng là môi trường cho chỉ số tái sinh chồi cao nhất ShizukOhki (1993) đã qu n sát các th y đổi bề mặt mô học của

5

quá trình biệt hóa chồi từ lá cây african violet bằng kính hiển vi điện tử SEM(scanning electron microscopy) Trong nghiên cứu này, Ohki qu n sát động thái củacác sự th y đổi ở các tế bào biểu bì của lá trong suốt quá trình nuôi cấy và xác định

sự tồn tại của các loại tế bào đặc biệt mà chúng sẽ tạo ra chồi Đồng thời c ng xácđịnh nồng độ chất điều hò sinh trưởng ảnh hưởng đến sự tạo chồi trực tiếp khôngqua sự hình thành mô sẹo trên các giống được thử nghiệm

Phạm Tấn Trường và Võ Thị Bạch M i (2008) đã vào mẫu thành công cây

Saintpaulia spp khi sử dụng Ca(ClO)2 10% trong 10 phút và c ng đạt kết quả tương

tự khi dùng HgCl2 0,1% trong 5 phút; theo các tác giả, môi trường 0,5 mg/l IBA và2,5 mg/l BA cho khả năng tái sinh chồi cao nhất và môi trường chứa 0,5 mg/l IBAcho khả năng tạo rễ cao nhất

Nguyễn Thị Kim Luyến và đồng tác giả (2008) cho rằng trong sự ra hoa củaafrican violet, mô phân sinh ngọn ở nách lá hoạt động trở thành mô phân sinh hoa

và cuối cùng thành nụ ho đầu tiên Các nụ ho s u đó xuất hiện ở bên dưới nụ hoađầu tiên C ng trong nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận acid salicylic có khảnăng cảm ứng sự chuyển mô phân sinh dinh dưỡng thành mô phân sinh hoa Bêncạnh đó, nồng độ AgNO3 2,5x10-4 g/l giúp cho sự nở và ngăn cản sự héo sớm của

hoa african violet in vitro.

2.2 Sơ lược về giai đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật

Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro luôn luôn được tiến hành trong điều kiện

vô trùng Vì vậy, điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất,

quyết định sự thành bại của nuôi cấy in vitro Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ

biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệu lực diệtnấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năngxâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy

Sơ đồ xử lý mẫu cấy ex vitro:

Mẫu cấy ex vitro

Rửa kỹ bằng xà phòng và nước máy

Cho vào bình tam giác ngâm trong cồn 70oC

khoảng 20 – 60 giây

Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần

Tiếp tục lắc mẫu trong dung dịch diệt khuẩn 1 – 25%

trong 5 – 15 phút với vài giọt Tween 80

Rửa bằng nước cất vô trùng 5 – 6 lần

Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử

Mẫu cấy

Cấy lên môi trường nuôi cấy

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy

(Minh, 2004)

7

Trong quá trình xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm,khuẩn; các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch bằng xàphòng và nước máy Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiều lần bằngnước cất vô trùng, loại bỏ những phần bị dập trước khi đặt mô cấy lên môi trườngnuôi cấy (Minh, 2004) Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt

để và ảnh hưởng xấu lên sự sinh trưởng của mô cấy Ngoài r , người ta còn sử dụngcác chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịchdiệt nấm khuẩn Street (1975) đã đư r khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụngcác chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như s u:

Bảng 2.1 Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác nhân vô trùng

Tác nhân vô trùng

Hypochlorite calcium [Ca(ClO)2]

Hypochlorite sodium (NaClO)

Hydroperoxid (H2O2)

Nước brom

Mecury chloride (HgCl2)

Chất kháng sinh

2.3 Sơ lược về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

2.3.1 Calcium hypochlorite [Ca(ClO) 2 ]

2.3.1.1 Giới thiệu

Ca(ClO)2 là một hợp chất thuộc nhóm chlorine, có màu trắng, dễ t n trong nước, giải phóng khí Cl2 làm cho nước có mùi hắc đặc trưng Trong công nghệ hó học: dùng trong nước sơn, chất hò t n, chất tạo bọt, thuốc trừ sâu, hó chất chống đông,… Xử lý nước sinh hoạt, nước thải công nghiệp và khu đô thị Trong thủy sản: tẩy trùng o, hồ, tr

ng thiết bị, dụng cụ,… Diệt vi khuẩn, virus, tảo, vi sinh vật trong môi trường nước Oxi hó các vật chất hữu cơ và mầm bệnh ngoại l i trong sản xuất

giống Trong nuôi cấy mô thực vật: sử dụng như một chất để khử trùng khi đư các

nguồn mẫu b n đầu từ môi trường ex vitro chuyển s ng in vitro, nồng độ từ 5 – 10%

trong khoảng từ 5 – 30 phút

Ca(ClO)2 là chất oxi hó mạnh có tác dụng oxi hó vật chất hữu cơ sống trên cơthể sinh vật Chúng tác động lên thành tế bào, hệ enzyme củ vi sinh vật tiếp xúc vớiCa(ClO)2 thì nguyên tử hydro trong cấu trúc phân tử được th y thế bởi Cl2, phá hủy

hệ enzyme củ vi khuẩn, gây chết vi sinh vật

2.3.1.2 Nhược điểm

Ca(ClO)2 có tính ăn mòn c o và đây c ng chính là cơ chế diệt khuẩn của chúng– ăn mòn màng tế bào; vì thế, chúng t không khó để gặp phải tình trạng mẫu cấysống nhưng bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm hay mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, khôngnhiễm nấm nhưng lại chết hoặc không thể tái sinh; bởi vì các mô tế bào thực vật rất

dễ bị tổn thương khi tiếp xúc với Ca(ClO)2 dẫn đến mẫu cấy sẽ khó tái sinh, thờigian tái sinh kéo dài Ngoài ra, ngộ độc có thể xảy r khi con người nuốt hay hít phải

Cl2 từ Ca(ClO)2 Cl2 sẽ phản ứng tạo ra HCl và HOCl gây độc đối với con người(bỏng rát trong miệng, sưng họng, đau họng, đau dạ dày, nôn mửa, tổn thương hệ

tuần hoàn,…) (WHO, 2000; Ines et al., 2013).

2.3.2 Mercury chloride (HgCl 2 )

2.3.2.1 Giới thiệu

Thủy ngân là một nguyên tố hó học trong bảng tuần hoàn có ký hiệu Hg (tiếng

Hy Lạp hydr rgyrum, tức là thủy ngân) và số nguyên tử 80 Thủy ngân là mộtnguyên tố kim loại nặng tồn tại ở dạng lỏng, có ánh bạc trong nhiệt độ thường.Thủy ngân được sử dụng trong các nhiệt kế, áp kế và các thiết bị kho học khác.Thủy ngân thu được chủ yếu bằng phương pháp khử khoáng chất chu s (HgS).Mercury chloride (HgCl2) là một dạng củ thủy ngân, hiện được sử dụng phổbiến trong nhiều lĩnh vực nhưng chủ yếu ở quy mô phòng thí nghiệm Trong đầuthế kỷ 20, thủy ngân được cấp phát cho trẻ em hàng năm như là thuốc nhuận tràng

và tẩy giun Bột ngậm cho trẻ em và một số v cxin có chứ chất bảo quản thimerosal(một phần là etyl thủy ngân) kể từ những năm 1930 Mercury chloride còn là chất

9

tẩy trùng đối với các bác sĩ, bệnh nhân và thiết bị Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, từnăm 1994, Hussain và đồng tác giả đã thành công khi sử dụng HgCl2 như là mộtchất giúp chống lại các vi khuẩn và nấm trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu Hiện nay,HgCl2 thường được sử dụng ở nồng độ 0,1 – 1% trong khoảng 2 – 10 phút chobước khử trùng mẫu cấy (WHO, 2000).

Chứng bệnh min m t là một dạng ngộ độc thủy ngân Thủy ngân tấn công hệthần kinh trung ương và hệ nội tiết, đồng thời ảnh hưởng tới miệng, các cơ hàmmặt và răng Sự phơi nhiễm kéo dài gây ra các tổn thương não, gây tử vong, hoặc

có thể gây ra các dị tật bẩm sinh ở thai nhi, mất khả năng điều hòa vận động, th yđổi tính cách, mất trí nhớ, mất ngủ, mệt mỏi, đ u đầu, giảm cân, căng thẳng tâm lý

và viêm lợi (WHO, 2000)

2.3.3 Một số chất khử trùng khác

2.3.3.1 Hydro peroxide (H 2 O 2 )

Hydro peroxide (h y còn gọi là nước oxi già) có công thức hó học H2O2.Hydrogen peroxide là một chất oxi hó mạnh mẽ và được sử dụng như một chất tẩytrắng và khử trùng Tuy nhiên, H2O2 là chất oxi hóa mạnh có khả năng ăn mòn c o,ảnh hưởng đến mô biểu bì của thực vật trong quá trình khử trùng, do đó, áp suấtthẩm thấu của mẫu cấy giảm nên mẫu khó mà hấp thu các chất dinh dưỡng từ môitrường nuôi cấy dẫn đến thời gian vào mẫu bị kéo dài Mặc khác, hiện nay có khánhiều vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme catalase, enzyme này có khả năng trung

hòa tác dụng diệt khuẩn của H2O2 nên khi sử dụng H2O2 để khử khuẩn thì tác dụngkhông cao.H2O2 là chất oxi hóa mạnh có thể gây nổ và ảnh hưởng đến sức khỏecon người (WHO, 2000).

2.3.3.2 Nước brom

Brom là nguyên tố hó học thuộc nhóm h logen, có ký hiệu Br và số nguyên tử

35 Cả nhóm halogen thuộc nhóm VIIA trong bảng hệ thống tuần hoàn Br cónguyên tử khối bằng 80 Brom c ng là một chất hóa học dùng để khử trùng, khibrom được thêm vào nước nó tạo thành chất khử trùng và phản ứng với chất ônhiễm trong nước Brom là một là một chất có khả năng b y hơi c o, mùi hắc khóchịu và được đánh giá là khá độc Hơi brom gây kích ứng niêm mạc, chảy nướcmắt, ho, suyễn, chóng mặt, đ u đầu, đ u bụng, chảy máu m i, gây mất trí nhớ, rốiloạn tâm thần,… (WHO, 2000)

2.3.3.3 Các chất kháng sinh

Kháng sinh h y còn gọi là trụ sinh, kháng khuẩn được sử dụng phổ biến(Ampicillin, Penicillin, Amoxillin, Streptomycin, P romycin,…) trong nuôi cấy mô thựcvật nhằm ngăn chặn sự phát sinh hoặc tiêu diệt sự phát triển củ khuẩn, nấm mốc Tuynhiên, kháng sinh lại gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người là: gây khó khăncho chẩn đoán; tiêu diệt các vi khuẩn có lợi; gây kháng thuốc; một số loại kháng sinhgây dị ứng, suy tủy và các bệnh khác như điếc, suy gan hay suy thận,… Trong nuôi cấy

mô thực vật thì kháng sinh được dùng để diệt hoặc ức chế các nguồn nhiễm từ môi

trường ex vitro, tuy nhiên kháng sinh có khả năng hấp thụ qua da, niêm mạc và có khả năng khuếch tán trong không khí (Ines et al., 2013), nên việc sử dụng kháng sinh trong

khử trùng mẫu là điều không được khuyến khích

2.3 Sơ lược về nano bạc

2.3.1 Nano bạc

2.3.1.1 Giới thiệu về bạc kim loại và cơ chế kháng khuẩn của bạc

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo vànấm; tuy nhiên, bạc khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân,…), vì bạckhông thể hiện tính độc với con người Từ x xư , người t đã sử dụng đặc tính này

11

của bạc để phòng bệnh Người cổ đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước,rượu dấm Trong thế kỷ 20, người t thường đặt một đồng bạc trong chai sữ để kéodài độ tươi của sữa Bạc và các hợp chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế

kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng (Siddhartha et al.,

2007)

Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion

Ag+ Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglycan, thành phần cấu tạo nênthành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxi vào bên trong tế bàodẫn đến làm tê liệt vi khuẩn Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ng y s u đó,khả năng hoạt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi Cấu trúc tế bào củ độngvật không có thành tế bào, nên ion bạc không thể gây tổn thương cho con người

hay động vật (Siddhartha et al., 2007).

Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tảnhư s u: sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó

sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sulfhydryl – SH của phân tửenzyme chuyển hóa oxi và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấpcủa tế bào vi khuẩn Ngoài ra, các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base củaDNA và trung hò điện tích của gốc phosph te do đó ngăn chặn quá trình sao chépDNA Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đư vào ứng dụng với hiệu quả

c o người t không còn qu n tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa Tuy nhiên,

từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên khángthuốc, sự quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn hay các

ứng dụng khác của bạc đã qu y trở lại, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano

(Siddhartha et al., 2007).

2.3.1.2 Ưu điểm của nano bạc

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Các hạt nanonhỏ, có diện tích tiếp xúc bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốthơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn, tạo ra hiệntượng cộng hưởng plasmon bề mặt; hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt

đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vàonồng độ và kích thước hạt nano Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rấtlớn, có những đặc tính độc đáo như: tính khử khuẩn, chống nấm, có khả năng phát

xạ tia hồng ngoại đi x ; không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tươngđối cao, không có phụ gia hóa chất Ngoài ra, nano bạc còn có khả năng phân tán ổnđịnh trong các loại dung môi khác nhau, độ bền hóa học cao, không bị biến đổidưới tác dụng của ánh sáng hay các tác nhân oxi hóa khử thông thường, và ổn định

ở nhiệt độ cao và chi phí cho quá trình sản xuất thấp (Kargov et al., 1986).

2.3.2 Nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.2.1 Các nghiên cứu sinh trưởng và phát triển của nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nano bạc và ion bạc được nhìn nhận như một tác nhân mới trong nuôi cấy môthực vật vì nó không được bổ sung trực tiếp trong môi trường nuôi cấy thường quyvới vai trò là chất dinh dưỡng Trong khoa học thực vật, các công trình nghiên cứukhông những tập trung vào hiệu quả kháng vi sinh vật của nano bạc, một số nhàkhoa học đã khám phá thêm được hiệu quả thú vị của nó trên thực vật trong nuôicấy mô đó là ức chế sinh tổng hợp ethylene, từ đó gián tiếp giúp cho sinh trưởngcủa thực vật được tăng cường

S rm st và đồng tác giả (2011) đã ghi nhận hiệu quả tích cực trong vi nhân

giống cây Araucaria excelsa Kết quả cho thấy, cây sinh trưởng, phát triển mạnh

trên môi trường MS có bổ sung nano bạc, cây tươi, tăng trưởng tốt, sắc tố ổn định

hơn so với đối chứng Tương tự như trong vi nhân giống Tecomella undulata

(Roxb.), khi bổ sung nano bạc sẽ tăng tỷ lệ sống sót, giảm hiện tượng rụng lá gây ra

bởi ethylene, tăng hệ số nhân chồi và chiều cao của thực vật (Aghdaei et al., 2012).

Nhiều nhà khoa học đã chứng minh được tác dụng của bạc là chất ức chế tổng hợpethylene trong nuôi cấy mô bằng cách ức chế hoạt động S-adenosyl-L-methionine(SAM) – là một tiền chất để tạo thành ethylene, hoặc làm mất liên kết ethylene vàngăn ngừa các tín hiệu ức chế của ethylene lên thực vật bao gồm các tác động tiêucực như rụng lá, giảm hàm lượng chlorophyll dẫn đến chết cây khi chuyển r điều

13

kiện tự nhiên (Zhao et al., 2002, Miyazaki et al., 1987) Dương Tấn Nhựt và đồng

tác giả (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc (kích thước ≤ 20 nm) trongkhoảng nồng độ 0 – 20 mg/l lên sự tăng trưởng của một số loại cây trồng nuôi cấy

in vitro có giá trị kinh tế cao của Việt Nam Kết quả cho thấy, nano bạc ở nồng độ

10 mg/l bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho sự sinh trưởng tốt nhất với đối tượngcúc và dâu tây, trong khi đó đối với đồng tiền là 5 mg/l; tuy nhiên, cần tiến hànhnghiên cứu chuyên sâu và quy mô rộng hơn để đánh giá tất cả các khía cạnh ảnhhưởng của nano bạc lên sinh lý mô và tế bào thực vật

Nano bạc ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng bằng cáchgây ra những biến đổi đáng kể ở mức độ sinh lý và phân tử theo hướng tích cựchoặc tiêu cực tùy theo loài thực vật, kích thước, cấu trúc và nồng độ nano bạc sửdụng Khi nghiên cứu trên sự sinh trưởng, phát triển cây con, một số nhà khoa học

đã cho thấy, nano bạc không chỉ làm tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển

mà còn có v i trò tăng cường các quá trình biến dưỡng trong cây như sinh tổng hợpchlorophyll, tổng hợp carbohydrate, protein và các enzyme chống oxi hóa của nhiềuloài thực vật Khi hấp thu hạt nano bạc, ngoài tác dụng kháng vi sinh vật rất mạnh,dựa vào tính chất vật lý của hạt nano bạc hấp thu ánh sáng trong dải sóng 390 – 420

nm nên khi đó tại bước sóng này cường độ ánh sáng được thực vật hấp thu mạnh.Cây phát triển trên môi trường có bổ sung nano bạc sinh trưởng tốt hơn, giảm hiệntượng rụng lá gây ra bởi ethylene, lá cây xanh đậm hơn do tích l y chlorophyll

mạnh hơn so với cây trên môi trường đối chứng (Sarmast et al., 2011; Aghdaei et

al., 2012; Salama et al., 2012).

2.3.2.2 Các nghiên cứu về khả năng khử trùng của nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nhân giống hiện n y giàu năng lượng khiến cho vi sinh vật dễdàng tăng trưởng, chiếm ưu thế và cạnh tr nh dinh dưỡng với thực vật Vì vậy, tácnhân vi sinh vật là một trong những vấn đề được quan tâm đầu tiên và xuyên suốttrong nuôi cấy mô thực vật

Ion Ag+ trước n y được biết đến như một loại ion khoáng có khả năng kháng

khuẩn cao (Ines et al., 2013) Với kích thước nhỏ, các hạt n no giúp tăng diện tích

tiếp xúc bề mặt, vì vậy khả năng các hạt nano bạc diệt khuẩn tốt hơn các muối chứaion bạc là hoàn toàn c o, đã có báo cáo ghi nhận sự khử trùng của nano bạc trong

nuôi cấy mô thực vật (Abdi et al., 2008) Việc áp dụng các hạt nano bạc trong kỹ

thuật nuôi cấy mô thực vật để ngăn chặn sự nhiễm các vi sinh vật b n đầu được báocáo bởi Abdi và đồng tác giả (2008) Nghiên cứu này đã được tiến hành trong giai

đoạn khử trùng của quá trình nhân giống cây Nữ lang (Valeriana officinalis L.), nguyên nhân gây nhiễm chủ yếu là vi khuẩn Xanthomonas sp nội sinh gây bạc lá.

Các đốt thân củ cây được ngâm trong dung dịch nano bạc (35 nm) ở h i gi i đoạn;trước và sau khi khử trùng bề mặt ở nồng độ 25, 50 và 100 µg/ml và thời gian xử lý

là 30, 60, 180, 300, 600 và 1200 phút Kết quả thu nhận được cho thấy sử dụngdung dịch nano bạc 100 µg/ml trong 180 phút sau khi khử trùng bề mặt có khả năngkiểm soát nhiễm khuẩn đến 89% mà không có bất kỳ tác động bất lợi nào lên đặctính sinh trưởng của cây con

Ngoài ra, hiệu quả kháng vi sinh vật gây nhiễm trong khử trùng c ng đã được

chứng minh trên cây Araucaria excelsa R Br (Sarmast et al., 2011) Ở đối tượng này, nano bạc được bổ sung trực tiếp vào môi trường nuôi cấy in vitro và làm trì

hoãn sự xuất hiện các vi sinh vật gây nhiễm c ng như giảm tỷ lệ nhiễm trong nuôicấy mô Bên cạnh đó, khả năng kháng nấm c ng đã được nghiên cứu và cho thấyhoạt động kháng nấm của nano bạc phụ thuộc vào kích cỡ, hạt nano càng nhỏ thìhiệu quả càng c o Cơ chế chủ yếu cho hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc là khảnăng bám dính và khả năng xâm nhập vào bên trong màng tế bào vi khuẩn, bẻ gãyhoặc tương tác các liên kết nội phân tử DNA, protein của vi khuẩn Tuy nhiên,những tác động tiêu cực của chúng với thành tế bào thực vật là không thể tránh khỏikhi xử lý ở nồng độ cao hoặc trong thời gian dài và những tác động tiêu cực đó vẫnchư được làm rõ

Rostami và Shahsavar (2009) đã thành công trong việc kiểm soát và hạn chếnhiễm khuẩn trong nuôi cấy ô liu khi bổ sung 40 mg/l nano bạc vào

15

môi trường MS Gh r ti và đồng tác giả (2010) c ng đã nghiên cứu và kết luận rằngkhi bổ sung 75 ppm nano bạc vào môi trường nuôi cấy óc chó B Tư sẽ giúp kiểmsoát hiện tượng nhiễm khuẩn khi nuôi cấy Trong một thí nghiệm khác, F khrfesh ni

và đồng tác giả (2012) đã nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn của các nồng độ nanobạc khác nhau trong nuôi cấy mô ho đồng tiền Kết quả cho thấy, khi bổ sung nanobạc vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ 100 mg/l thì an toàn cho mẫu cấy và giúpkiểm soát được vấn đề nhiễm khuẩn trong nuôi cấy

Abdi (2012) đã thành công khi sử dụng nano bạc nồng độ 120 mg/l, kích

thước 35 nm để khử trùng bề mặt mẫu Valeriana officinali L trong nhân giống in

vitro Gần đây nhất, Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả (2017) đã bổ sung nano bạc

vào môi trường nuôi cấy ho cúc để thay thế gi i đoạn hấp khử trùng mà không gâyảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây; vì thế, nano bạc được đánh giá

là một chất khử trùng mới, hiệu quả và an toàn với thực vật Tuy nhiên, chư cónghiên cứu nào so sánh đầy đủ và hệ thống về khả năng khử trùng của nano bạc

Chương 3

VẬT LIỆU

VÀ

PHƯƠNG PHÁP

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

 Đị điểm: Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và chọntạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên)

 Đề tài được tiến hành từ tháng 8 năm 2016 đến tháng 8 năm 2017

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Nguồn mẫu và nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu là cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H.

WendL.) trồng tại vườn ươm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên

Mẫu lá và cuống lá của những cây hoa african violet 6 tháng tuổi (10 cm)sinh trưởng và phát triển tốt, không bị sâu bệnh, được chọn làm nguồn mẫu b

n đầu

Dung dịch nano bạc do Viện Công nghệ môi trường cung cấp Các hạtnano bạc (nAg) kích thước ≤ 20 nm tạo bằng phương pháp khử dung dịchnước sử dụng tiền chất là AgNO3, tác nhân khử là NaBH4 và chất ổn định

được sử dụng là chitosan (Chau et al., 2008).

3.2.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS(Murashige, Skoog, 1962) có bổ sung 30 g/l sucrose và 9 g/l agar; pH môitrường được điều chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở121°C, 1 atm trong thời gian 30 phút và bổ sung các chất điều hò sinh trưởng

ở tỷ lệ khác nhau theo từng gi i đoạn của thí nghiệm (Nhựt et al., 2005; Hiếu

et al., 2006).

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Thí nghiệm in vitro được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2°C, thời gian

chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 45 µmol.m-2.s-1 dưới ánh

sáng huỳnh qu ng và độ ẩm trung bình 55 – 60% Thí nghiệm ex vitro được

tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 17 – 25°C, độ ẩm trung bình 70 – 80% và sửdụng ánh sáng tự nhiên có che sáng 50%

3.2.4 Bố trí thí nghiệm

3.2.4.1 Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl 2 , Ca(ClO) 2 , AgNO 3 ] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy

3 phút, 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút và 30 phút

Mẫu cấy sau khi khử trùng được chia thành 4 loại mẫu cấy gồm: mẫucuống lá cắt ngang (dày 1 mm), mẫu cuống lá cắt dọc (dài 1 cm), mẫu lá chứagân chính giữa (0,5 x 0,5 cm), mẫu phiến lá (0,5 x 0,5 cm); và cấy lên môi

trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA (Nhựt et al., 2005; Hiếu et

al., 2006) Riêng mẫu lá, đặt mặt dưới tiếp xúc với môi trường Nồng độ các

chất sử dụng trong khử trùng và thời gian khử trùng th y đổi theo nghiệm thứcthể hiện cụ thể ở bảng 3.1

18

Bảng 3.1 So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy