Xác định gen kháng thuốc của các chủng salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở hà nội​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌCNGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC

CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC

THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI

TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC

CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC

THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI

TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thựchiện với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Việnnghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sựhướng dẫn khoa học của PGS TS Nghiêm Ngọc Minh Các số liệu, kết quảtrình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳcông trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nhã Quyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chânthành và sâu sắc nhất của mình tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh - Trưởngphòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong quátrình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu; phòng Đào tạo; khoa Côngnghệ sinh học Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, các quýthầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiêncứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Võ Thị Bích Thủy, ThS Nguyễn Hoài Thu

và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng dẫn,giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luônluôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập vàlàm luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mongnhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể cóđược kết quả tốt hơn

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nhã Quyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella 3

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 5

1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella 7

1.2.1 Đặc điểm hình thái 8

1.2.2 Đặc tính nuôi cấy 8

1.2.3 Đặc tính hóa sinh 10

1.2.4 Cấu trúc của Salmonella 10

1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella 12

1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella 13

1.3.1 Ngộ độc thực phẩm 13

1.3.2 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella 14

1.4 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella 15

1.4.1 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn 15

1.4.2 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella 15

1.5 Gen kháng kháng sinh 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Thu thập và phương pháp lấy mẫu 19

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.1.1 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella 20

2.2.2 Định type vi khuẩn Salmonella 21

2.2.3 Thử khả năng kháng kháng sinh 21

2.2.4 Phương pháp xác định một số gen kháng kháng sinh của chủng Salmonella Typhimurium bằng phương pháp RT-PCR 22

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Thu thập mẫu ở một số loại thịt tươi 26

3.2 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp trên các môi trường cơ bản 27

3.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp trong mẫu thịt lợn, gà, bò 27

3.1.2 Kết quả giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập được 29

3.2 Kết quả định type vi khuẩn Salmonella phân lập được 30

3.3 Kết quả xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được 32

3.4 Kết quả phát hiện và đánh giá gen kháng thuốc của các chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được 35

3.4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số: Lựa chọn 3 chủng Salmonella Typhimurrium S181, S360, S384 để tiến hành tách chiết RNA 35

3.4.2 Kết quả RT-PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của chủng

Salmonella Typhimurium 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

: Kilobase: Optical density: Polymerase Chain Reaction: Ribonucleic acid

: Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction

: Tris-acetate-EDTA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi và nhiệt độ gắn mồi của các gen sử dụng trong

nghiên cứu 24Bảng 3.1 Danh sách thu thập mẫu thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội 26Bảng 3.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ các mẫu thịt 27Bảng 3.3 Kết quả giám định đặc tính nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của

các chủng Salmonella spp trong quá trình phân lập29Bảng 3.4 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi

khuẩn Salmonella spp phân lập được 30Bảng 3.5 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn

Salmonella spp 31

Bảng 3.6 Tổng hợp kết quả kháng các nhóm kháng sinh của 3 type

Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được 33

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá gen kháng kháng sinh của các chủng

Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella 8Hình 2.1 Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella theo tiêu

chuẩn ISO 6579 - 2005 20Hình 3.3 Kết quả mức độ kháng các nhóm kháng sinh của 3 type

Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được 33

Hình 3.4 Kết quả điện di đồ sản phẩm RNA tổng số của 3 chủng

Salmonella 1,2,3: S181, S360, S384 35

Hình 3.5 Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen 16S (550 bp) của

chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 36Hình 3.6 Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen tetA (494bp), sull II

(434bp, avrA (192bp), aadA (228bp), blaTEM (310bp), gyrB

(219bp), prmA (187bp) của chủng Salmonella Typhimurium S181,

S360, S384 M: thang chuẩn (DNA 1Kb) 37Hình 3.7 Tỷ lệ biểu hiện gen tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB,

prmA/16S rRNA của chủng Salmonella Typhimurium được

phân tích bằng phương pháp RT-PCR Gen 16S rRNA được

dùng để so sánh 39

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trởnên cấp thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do

vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo nhưng ngộ độc thực phẩm vẫn đang gia tăng

và ngày càng nghiêm trọng Theo số liệu thống kê của Cục vệ sinh An toànthực phẩm, Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ độc thựcphẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Tính riêng năm

2008, có 205 vụ ngộ độc thực phẩm, với 7828 người mắc, 161 người chết,trong đó 7,8% số vụ do nguyên nhân vi sinh vật gây ra Sáu tháng đầu năm

2014, có 67 vụ ngộ độc thực phẩm với 2048 người mắc, 24 trường hợp tửvong

Có rất nhiều loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như Clostridium butolinum, Escherichia coli, Listeria monocytogenes Trong đó, Salmonella

được biết đến là vi khuẩn hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm trên thế giới vớicác triệu chứng như buồn nôn, nhức đầu, sốt nhẹ, sau đó xuất hiện nôn mửa

và tiêu chảy nhiều lần, có thể lẫn máu Thường thì bệnh nhân có thể tự khỏi,nhưng đối với trẻ em, người già hoặc người bị suy giảm miễn dịch bệnh cóthể gây nguy hiểm đến tính mạng Mặc dù nhiễm trùng đường ruột do các

chủng Salmonella thường tự khỏi, nhưng việc điều trị kháng sinh để ngăn

chặn quá trình lây lan nhiễm trùng vẫn là điều cần thiết

Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị cả người và động vật có thể

ảnh hưởng đến khả năng kháng thuốc của Salmonella Các chủng Salmonella

gây ngộ độc thực phẩm kháng thuốc phân lập được là mối đe dọa trực tiếp đếnsức khỏe của con người do các chủng kháng thuốc này sẽ cản trở việc điều trị

và là mối đe dọa gián tiếp khi sự kháng có thể được chuyển giao cho các mầmbệnh khác ở người Do vậy việc giám sát tính mẫn cảm kháng sinh là quantrọng và cần thiết

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tầm quan trọng của việc bảo vệ sức

khỏe con người chúng tôi đã tiến hành đề tài "Xác định gen kháng thuốc của

các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được gen kháng thuốc của chủng Salmonella gây ngộ độc

thực phẩm phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội

3. Nội dung nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong các mẫu thịt tươi (gồm:

thịt lợn, thịt gà, thịt bò) thu thập tại các địa điểm khác nhau trên địa bàn Hà Nội

- Nuôi cấy, phân lập và định type các chủng Salmonella từ các mẫu thịt, xác định các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm.

- Kiểm tra sự biểu hiện của gen kháng thuốc từ chủng Salmonella

Typhymurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Xác định được các gen kháng thuốc của chủng vi khuẩn Salmonella gây

ngộ độc thực phẩm giúp cho việc nghiên cứu các bộ kit chẩn đoán nhanh vi

khuẩn Salmonella trong thực phẩm.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1891, Jensen đã phân lập được Salmonella Dublin từ bệnh phẩm của

bê bị tiêu chảy Cũng vào năm đó Salmonella typhimurium được phát hiện ở

vùng Greiswald và Breslau (Đức) Vào năm 1983, tại Breslau đã xảy ra một vụngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả ngộ độc đã xảy ra ở người [61]

Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S choleraesuis var kunzendorf, S typhimurium và S typhisuis [28] Trong một vài trường hợp, ở

lợn còn tìm thấy S dublin và S enteritidis Hai serotype S dublin và S.

enteritidis cũng gặp ở lợn con đang theo mẹ

Từ những năm 1990 trở lại đây tỷ lệ nhiễm Salmonella ở Châu Âu đều không giảm, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người

được phát hiện tuy nhiên con số thực tế có thể cao gấp 10 lần Salmonellosis làbệnh nhiễm trùng đường ruột phổ biến thứ hai tại Hoa Kỳ Trung tâm kiểm soát

và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) ước tính có hơn 1 triệu người nhiễm

Salmonella, ơ Mỹ mỗi năm và trung bình có khoảng 20.000 ca nhập viện và gần

400 trường hợp tử vong do nhiễm Salmonella, theo một báo cáo năm 2011 [60].

Tháng 11/2013, tại thành phố Brisbane của Queensland (Australia) cũng xảy ra

vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng do vi khuẩn Salmonella khiến 1 phụ nữ 77

tuổi thiệt mạng và hơn 220 người nhiễm bệnh Nguyên nhân gây ra vụ việc do vi

khuẩn Salmonella có trong trứng, thịt gia cầm và các loại thịt chưa được nấu chín

[40] Theo thông tin mới nhất được công bố vào 2/4/2015 bởi tổ chức Y tế thếgiới (WHO), cho thấy mối đe dọa từ các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm do vikhuẩn gây lên Những con số được

công bố khiến người tiêu dùng trên toàn thế giới không khỏi hoang mang Baogồm 582 triệu các ca mắc phải một trong 22 căn bệnh truyền qua thực phẩm;351.000 số ca tử vong liên quan đến an toàn thực phẩm trong đó có 52.000 ca

tử vong do vi khuẩn Salmonella gây nên, 37.000 số ca tử vong do vi khuẩn E.coli, 35.000 người chết do norovirus (loại virus là nguyên nhân hàng đầu gây nên dịch bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm tại Hoa Kỳ), và 40% là tỷ lệ

người ở độ tuổi dưới 5 mắc các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm

Điều đáng chú ý nhất ở vi khuẩn Salmonella là sự gia tăng khả năng

kháng thuốc của vi khuẩn này Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính

kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella đã được báo cáo nhiều ở các nước

phát triển và cả những nước đang phát triển (Báo cáo của Bộ Y tế, 2008) Cácnhà nghiên cứu của Wellcome Trust đã lập bản đồ mã gen trên 1.832 đối

tượng nhiễm khuẩn Salmonella typhimurium thu thập từ 63 quốc gia trong

khoảng thời gian từ năm 1992 đến 2013 cho thấy gần một nửa số vi khuẩnkhông hề bị tiêu diệt bởi những loại kháng sinh theo quy chuẩn Trong nghiêncứu mô tả các dữ liệu từ các chương trình giám sát tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốctrong thịt gà của Brazil (PREBAF) từ thời gian tháng 9/2004 đến tháng7/2006 cho thấy trong 2.679 mẫu thịt gà thu thập được tại 15 bang thuộc 5khu vực địa lý của đất nước có tới 8,9% (trung bình 2,7%) mẫu nhiễm

Salmonella spp Trong đó chủ yếu nhiễm 4 loài Enteritidis (48,8%), Infantis

(7,6%), Typhimurium (7,2%) và Heidelberg (6,4%), nhưng nguy hiểm là cácchủng đa kháng thuốc xuất hiện với tỷ lệ cao 53,2% (133 chủng/250 chủngthử nghiệm kháng thuốc) [43] Trong nghiên cứu 236 mẫu nước sông ở Đài

Loan, có 54 mẫu (chiếm 22,9%) nhiễm Salmonella ssp, 15 chủng Salmonella

được phân lập xuất hiện cả một số typ thường gây nhiễm trùng cho người vàgia súc, bao gồm Albany (27,8%), Newport (14,8%), Bareilly (13,0%), Derby(11,1%) và Typhimurium (7,4%) Đặc biệt 51,9% các mẫu kháng với ít nhất 1

trong 8 loại kháng sinh được thử nghiệm do trong các chủng vi khuẩn này tồntại các gen kháng thuốc [43].

Các nhà khoa học cũng đã chứng minh rằng trong bộ gen của các loài

vi khuẩn Salmonella gây bệnh có một loạt các gen liên quan đến việc ứng phó

với điều kiện thiếu dưỡng chất, sức đề kháng kháng sinh, sự trao đổi chất sắt

và các phản ứng sốc nhiệt [58] Một số gen hilA, prgH, invF được phát hiện

có mối quan hệ rất lớn đến khả năng kháng tetracycline của 2 chủng vi khuẩn

Salmonella Typhimurium DT 104 và DT 193 [32] Ngoài ra, amR là một yếu

tố phiên mã của protein Rama, một yếu tố đa kháng quan trọng cũng được tìmthấy trong vi khuẩn [72] hoặc các gen kháng thuốc của Salmonella Typhimurium và Salmonella Newport thường được đặt trên plasmid CMY-2

[39]. Sahu (2013) cũng đã phát hiện ra 1 vùng đột biến tại locus 1 có khả năng

đa kháng thuốc ở vi khuẩn S typhimurium [59]

Hiện nay, trên thế giới vẫn tiếp tục có các nghiên cứu về các gen kháng

thuốc của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là vi khuẩn Salmonella nhằm xác định chính xác cơ chế đa kháng thuốc của các vi khuẩn Salmonella

gây ngộ độc thực phẩm

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về sự ô nhiễm Salmonella đã được thực hiện và công bố Salmonella thường được tìm thấy trên thịt gà, thịt lợn,

đồ nguội, trứng sống, nghêu sò là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc Trongtổng số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt qua kiểm tra đã phát hiện tới 40,9%

số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây các bệnh về đường tiêu hóa Vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc cũng đã được bắt

đầu từ những năm 50 Viện Parteur Sài gòn trong những năm 1951-1953 đã

phân lập được 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước

tiểu) Cũng ở Sài gòn, trong thời gian này cũng đã phân lập được 35 chủng từ

360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S choleraesuis [1]

Lê Văn Tạo và Nguyễn Thị Vui (1994) đã phân lập và xác định

serotype của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các chủng được phân lập thuộc S Choleraesuis; 12,5% S Enteritidis; 6,25% S.

Typhimurium và một số loại còn lại thuộc các serotype khác [18]

Trần Xuân Hạnh (1995) đã phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella

ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S Typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S Paratyphi ở lợn 6-16 tuần

tuổi là 2,8% [6]

Năm 2003, Võ Thị Bích Thủy nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella

trên thực phẩm tại Hà Nội thấy tỷ lệ nhiễm cao nhất ở giò sống là 46,67%,tiếp theo là thịt bò 40%, thịt gà 39,29%, thấp nhất là thịt lợn 33,33% [25]

Cũng trong năm này, Lê Minh Sơn đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trong

thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa từ 10,91-16,67% và thịt lợn xuất khẩu trungbình 1,42% [15] Tô Liên Thu (2005) đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella của

các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao 33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫulấy tại chợ [22]

Tại các lò mổ là một trong những địa điểm rất quan trọng có nguy cơ

cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau khi giết mổ Trần Thị Hạnh và cs (2009) đã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn công

nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫu lauthân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn là 66%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờgiết mổ là 40%, mẫu lau sàn nhà giết mổ là 28%, còn các mẫu nước kiểm tra

không phát hiện Salmonella Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ giết

mổ là 87,5%, ở các mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫulau nền chuống nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%,mẫu nước là 50% [7]

Ở nước ta, chăn nuôi lợn, gia cầm và thủy sản thường được bổ sungnhiều loại kháng sinh với mục đích kích thích tăng trưởng, phòng bệnh vàđiều trị, do vậy nồng độ kháng sinh tồn dư trong thịt thường cao gấp vài lần

so với các quốc gia khác Các nhà nghiên cứu Nhật Bản và Việt Nam đã thực

hiện nghiên cứu về sự lan tràn của các chủng Salmonella kháng kháng sinh

trong thịt lợn và thịt gia cầm bán lẻ ở miền Bắc Việt Nam Kết quả phát hiện

được 118 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella phân lập từ 283 mẫu thịt

bán lẻ (135 mẫu thịt lợn, 148 mẫu thịt gà) [65]

Cùng với các quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện phápphòng bệnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, trong đó cóvacxin phòng bệnh Nguyễn Văn Lãm (1968) đã tiến hành nghiên cứu chế

vacxin phó thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn của Trung Quốc.

Hiện nay, các loại vacxin phòng bệnh phó thương hàn đã được một số công ty,

xí nghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược độc chủng TS-177, vacxin

có bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hóa có bổ trợ dầu [8]

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh và các gen kháng kháng sinh

ở các vi sinh vật gây bệnh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm hoặc động vật Cácnghiên cứu về gen cũng như cơ chế kháng kháng sinh của các vi si nh

vật gây bệnh phân lập từ thực phẩm chưa được đề cập nhiều, đặc biệt là nhóm

vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm một

cách toàn diện để từ đó đề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn

vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu cầu cầnthiết

1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột do Salmon và Smith phát hiện vào năm 1886 khi xác định Salmonella Choleraesuis là

nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn (Hog Cholera) [17] Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae Giống Salmonella gồm hai loài: S Enterica và S Bongori đã được phân chia thành trên 3000 serotype

theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyênthân O, kháng nguyên lông H và đôi khi có cả kháng nguyên vỏ (khángnguyên K)

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có kích

thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1 - 3 m, không hình thành giáp mô và nha bào, có

lông và di động được (trừ Salmonella Pullorum-gallinarum).

Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn bắt màu gram âm Vi khuẩn có cả kháng nguyên thân O(Ohne Hauch) và kháng nguyên lông H (Hauch), chỉ có một số loài như

Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Dublin có thể chứa

kháng nguyên Vi (là loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể Okhi nó phát triển nhiều)

1.2.2 Đặc tính nuôi cấy

Salmonella là trực khuẩn vừa hiếu khí vừa yếm khí, nhiệt độ thích hợp

cho sự phát triển là 37oC, độ pH 7,2 - 7,6 Vi khuẩn có sức chịu đựng tốt

trong các điều kiện nuôi cấy Chúng có thế sống sót trong môi trường thạch ởnhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4-8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ29% ở nhiệt độ 6-12oC Có rất nhiều môi trường dinh dưỡng chọn lọc được

dùng trong phân lập Salmonella, hiện nay thường dùng như Brilliant Green

Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI), XyloseLysine Deroxycholate (XLD), Mueller Kauffmann, Xylose LysineTetrathionate 4 (XLT4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV),Rambach, Kligler [58]

Khi nuôi cấy vi khuẩn Salmonella trong môi trường nước thịt: Sau vài

giờ đã vẩn đục, sau 18 giờ canh trùng đục đều Nếu nuôi lâu trong ốngnghiệm thì đáy có cặn, trên bề mặt môi trường có màng mỏng

Trên môi trường BSA: Sau 18 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn

Salmonella mọc lên những khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc màu

nâu thẫm, càng vào giữa khuẩn lạc càng đậm chuyển gần sang màu đen,khuẩn lạc có màu ánh kim

Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc dạng S (smooth) tròn, trongsáng hoặc xám, nhẵn bóng, rìa gọn và hơi lồi ở giữa, đường kính từ 1 -1,5mm, thi thoảng thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt trong mờ

Trên môi trường BGA: Vi khuẩn Salmonella thể hiện tính kiềm, hình

thành khuẩn lạc màu đỏ

Trên môi trường XLD: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đen do H2S

được tạo ra từ phản ứng điển hình của vi khuẩn Salmonella.

Trên môi trường TSI: Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc nhạt màu,mặt nghiêng trên môi trường có màu đỏ, màu hồng ở đáy cùng với sản sinh ra

H2S làm cho môi trường có màu đen

Trên môi trường MSRV: Là môi trường chọn lọc những Salmonella có

khả năng di động, vi khuẩn di động ra xung quanh môi trường tạo thành vòngmàu trắng có thể quan sát được

Trên môi trường XLT4: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màuđen, bóng, hơi lồi.

Trên môi trường Rambach: Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc trung bình, màu đỏ tím, bóng

Trên môi trường Kligler: Mặt nghiêng môi trường không đổi màu do vikhuẩn không lên men đường lactose, phần thạch đứng môi trường đổi màu do

vi khuẩn lên men đường glucose làm thay đổi pH của môi trường và sinh H2S

có màu đen

1.2.3 Đặc tính hóa sinh

Không len men đường : lactose, sucrose, andonitol,

Lên men sinh hơi các loại đường: glucose, mannitol, sorbitol,

Phản ứng indol âm tính (-), urease âm tính (-), Voges - Proskauer (VP)

âm tính (-), H 2 S dương tính (+), Metyl - Red (MR) dương tính (+)

Khả năng trao đổi chất đặc trưng của Salmonella là phân hủy nitrat

thành nitrit, phân hủy đường glucose sinh hơi, phân hủy H 2 S và sử dụng citratlàm nguồn cung cấp cacbon duy nhất

Đặc tính sinh hóa có ý nghĩa lớn trong quá trình phân lập và giám định

vi khuẩn, chính vì vậy khi xét nghiệm mẫu vật xác định sự có mặt của

Salmonella cần thiết phải tiến hành các phản ứng sinh hóa.

1.2.4 Cấu trúc của Salmonella

Vi khuẩn Salmonella có 3 loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất

hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệuvới những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng

nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S Typhi) có

kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩnthương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu

* Kháng nguyên thân O (O - Antigen)

Kháng nguyên thân O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúclipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của

thành tế bào vi khuẩn gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt và kháng cồn, bị biến tính khi xử lý bằng formaldehyde Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính:

- Polysaccharid không có nhóm hydro, không mang tính đặc trưng củakháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S sang dạng R và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn [61]

- Polysaccharid nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định tính kháng nguyên và đặc trưng cho từng serotype

Kháng nguyên O được xem như một nội độc tố mà nó được cấu tạo bởinhóm hỗn hợp glyco - polypeptip có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vikhuẩn

* Kháng nguyên lông H (H - Antigen)

Kháng nguyên lông H là protein nằm trong thành phần lông của vikhuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt, rất kém bền vững so với khángnguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 600C sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axityếu [19] Kháng nguyên H gồm 2 pha:

- Pha 1: có tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên được biểu thị bằngchữ mẫu Latint thường: a,b,c, ,z

- Pha 2: Không có tính đặc hiệu, gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số

Ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay Latinh thường: e,n,x,

* Kháng nguyên vỏ K (K - Antigen)

Theo Quinn và cs (2004), kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S Typhi, S Paratyphi, S Dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ Kháng

nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo tác giả, nếu

đun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 - 12 phút sẽ phá hủy

được kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kếtkháng thể O khi phát triển nhiều Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotype là:

S Typhi và S Paratyphi C.

1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella

* Các yếu tố không phải là độc tố

Các yếu tố không phải là độc tố bao gồm: kháng nguyên O, khángnguyên H và kháng nguyên K, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập vào tếbào, khả năng tổng hợp sắt, khả năng kháng kháng sinh Các yếu tố này với

cơ chế, phương thức tác động khác nhau tạo điều kiện bất lợi cho cơ thể vậtchủ và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tác động gây bệnh Chính vì thếcác yếu tố không phải là độc tố đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình

sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella.

Khả năng kháng kháng sinh: Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc khángsinh để phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc, gia cầm đã tạo ranhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid kháng khángsinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường Khi vi khuẩn

có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tínhgây bệnh của vi khuẩn lên nhiều lần Khả năng kháng kháng sinh có thể thayđổi, phụ thuộc vào địa phương, thời điểm làm kháng sinh đồ và loại vật nuôi

* Các yếu tố độc tố

Vi khuẩn Salmonella sản sinh ra các độc tố chính là độc tố đường ruột

(enterotoxin), nội độc tố (endotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin) [35]

Quá trình gây bệnh trong đường tiêu hóa của Salmonella lần đầu tiên

được mô tả bởi một thí nghiệm trên chuột lang vào năm 1967 [71] Thínghiệm cho thấy qua một quá trình sinh sản trên bề mặt thành ruột,

Salmonella sẽ xuyên qua lớp màng và xâm nhập vào bên trong tế bào biểu

mô, đặc biệt ở đoạn hồi tràng Tại đây nó gây tổn thương cho các tế bào biểu

mô ruột Trong giai đoạn này, vi khuẩn bị thực bào, song các đại thực bàokhông phá hủy được vi khuẩn hoàn toàn Kết quả là sau 24 giờ xâm nhập, vikhuẩn đã phát triển trong đại thực bào và mô lympho ruột Đồng thời với sự

phát triển nhanh về số lượng vi khuẩn là việc xuất hiện thể bệnh cấp tính, sựtập trung các đại thực bào, phản ứng viêm tạo thành huyết khối, gây rối loạntuần hoàn cục bộ vi mạch ở lớp dưới niêm mạc Hậu quả là dẫn tới hoại tử ởniêm mạc ruột tại điểm bị vi khuẩn tấn công Ngoài ra, quá trình gây bệnh của

vi khuẩn luôn bắt đầu bằng chứng nhiễm trùng huyết sau và 24 - 72 giờ bệnhnhân mới xuất hiện triệu chứng tiêu chảy dữ dội Khả năng gây bệnh, tăng độc

tố của vi khuẩn Salmonella sẽ tăng lên khi sức đề kháng của cơ thể giảm.

1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

1.3.1 Ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm đang trở thành nỗi lo hàng đầu của người dân, bởi đây

là nguyên nhân gây nhiều căn bệnh đường tiêu hóa và thậm chí là ung thư

Ngộ độc thực phẩm hay còn gọi là trúng độc thức ăn do ăn phải nhữngthức ăn có chứa chất độc, thường xảy ra một cách đột ngột hàng loạt (nhưngkhông phải là các bệnh dịch do vi khuẩn), có những triệu chứng của một bệnhcấp tính, biểu hiện bằng nôn mửa, ỉa chảy và các triệu chứng khác đặc hiệucho mỗi loại ngộ độc

Thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt bò, thịt lợn, thịt gà và cácsản phẩm được chế biến từ chúng rất khó kiểm soát về độ an toàn vệ sinh,trong khi đó lại có nhiều người sử dụng và sử dụng thường xuyên nên nguy cơngộ độc có thể xảy ra bất cứ lúc nào và mọi nơi Theo báo cáo của Bộ Y tế(2001), hơn 60% thức ăn đường phố và thực phẩm chế biến sẵn bị nhiễm vikhuẩn gây bệnh đường ruột Hiện nay thực phẩm được xác định là nguồn lantruyền chủ yếu, ước tính 70% trường hợp tiêu chảy có liên quan đến thựcphẩm ô nhiễm [42] Trong nhóm các vi khuẩn gây bệnh truyền qua thựcphẩm, các nhà khoa học đã đặt ra mối quan tâm nhiều nhất tới vi khuẩn

Salmonella.

1.3.2 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc và vấy

nhiễm vào thịt khi giết mổ Chúng có mặt ở phân và dễ dàng nhiễm vào trứnggia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ Những thức ăn giàu chất dinh dưỡng như

thịt, cá, trứng, sữa rất dễ bị nhiễm Salmonella trong quá trình chế biến, bảo

quản, vận chuyển nếu không đảm bảo vệ sinh Như vậy bất cứ nguồn thựcphẩm tươi sống nào có nguồn gốc động vật như thịt gia súc, gia cầm, các sảnphẩm bơ sữa, trứng và hải sản và một số loại trái cây, rau quả đều có thể bị

nhiễm Salmonella.

Thông thường, 12-24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn bệnhnhân thấy đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, đi ngoài phân lỏng, nhức đầu, nônnao, khó chịu, ra mồi hôi, mặt tái nhợt, sốt 38-40oC trong 2-4 ngày

Salmonella là một trong những thủ phạm chính gây ngộ độc thực phẩm vào mùa hè Ngộ độc do Salmonella có thể biểu hiện từ nhẹ cho tới rất nghiêm trọng và thậm chí gây tử vong Salmonella có khả năng gây ngộ độc thực

phẩm với hậu quả không lường [49]; [64] Chính vì Salmonella là vi khuẩn

nguy hiểm với sức khỏe của con người như vậy nên yêu cầu vệ sinh tối thiểuđặt ra cho tất cả các loại thực phẩm là không được có loại vi khuẩn này trong

25 gram mẫu thực phẩm [34]

Trong 10 năm trở lại đây, nhiều thông báo trong và ngoài nước cho thấynguy cơ gia tăng nhanh số người bị bệnh và ngộ độc thực phẩm do

Salmonella Tuy nhiên việc loại bỏ chúng ra khỏi dây truyền sản xuất chăn

nuôi cũng như thực phẩm là vấn đề hết sức khó khăn Nhiều nước tiên tiếntrên thế giới có những chương trình phòng chống tích cực, song cho tới nayvấn đề này vẫn chưa thực sự có hiệu quả

Đặc biệt các vụ ngộ độc thường gặp chủ yếu nhất do Salmonella Typhimurium gây ra Salmonella Typhimurium gây viêm ruột, thời kỳ ủ bệnh

từ 12-24 giờ, có khi ngắn hơn hoặc kéo dài vài ngày Các dấu hiệu đầu tiên làbệnh nhân thấy nhức đầu, buồn nôn, choáng váng khó chịu, thân nhiệt tăng,sau đó xuất hiện nôn mửa, tiêu chảy nhiều lần, phân toàn nước, đó là triệuchứng của viêm ruột cấp tính do nội độc tố được thoát ra khi vi khuẩn bị phânhủy trong máu cũng như trong ruột

Ở Việt Nam, bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở gia súc, gia cầm đã

được biết đến từ lâu nhưng cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, đặcbiệt trong lĩnh vực vệ sinh thực phẩm

1.4 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella

1.4.1 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Kháng sinh là những hợp chất đặc biệt do vi sinh vật, động vật và thựcvật hay do con người tổng hợp Có tác dụng tiêu diệt, ức chế vi sinh vật vớinồng độ rất thấp mà không gây độc cho người và vật chủ [1]

Thuốc kháng sinh được coi là một giải pháp trong việc điều trị các bệnh

do nhiễm vi khuẩn Nhờ có thuốc kháng sinh mà chúng ta có thể kiểm soátđược nhiều dịch bệnh Tuy nhiên, hiện nay con người đang sử dụng thuốckháng sinh chưa hợp lý, chính điều này đang dẫn đến hiện tượng kháng khángsinh của vi khuẩn

Sự kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn về cơ bản là do gen Nhờ

có gen kháng thuốc mà vi khuẩn có đủ khả năng để chống lại tác dụng củathuốc kháng sinh, từ đó mà chúng có thể tồn tại và tiếp tục gây bệnh [68]

1.4.2 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella

Trong quá trình liên kết lâu dài với vật chủ, Salmonella có cơ chế tinh vi

để điều biến chức năng của tế bào vật chủ Salmonella đã thu nhận rất nhiều gen

liên quan đến tính độc trong quá trình tiến hóa loài, đồng thời các type này

cũng thu nhận các gen kháng kháng sinh từ các loài vi sinh vật khác Do đó,việc điều trị cho các bệnh nhân bị ngộ độc thực phẩm càng trở nên khó khăn.

Vi khuẩn Salmonella có các gen kháng thuốc nằm trong plasmid, chúng

có thể nhân lên và phát tán rộng rãi trong quần thể vi sinh vật Theo thống kê

năm 2000, trong số 27.000 người bị nhiễm khuẩn Salmonella ở Châu Âu, có

tới 43% người nhiễm chủng vi khuẩn kháng lại với kháng sinh

1.5 Gen kháng kháng sinh

Hiện tượng kháng kháng sinh xảy ra khi mầm bệnh hay vi khuẩn không

bị diệt bởi thuốc kháng sinh, chúng vẫn tồn tại, sinh sản ra những thế hệ concháu không có tính cảm ứng với một hay nhiều loại thuốc kháng sinh nào đó

Có rất nhiều nguyên nhân, như việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách bừabãi, không đúng cách, không tôn trọng liều lượng và thời gian trị liệu, cũngnhư không uống hết số thuốc như bác sĩ đã kê đơn Ngoài ra việc lạm dụngthuốc kháng sinh trong chăn nuôi thú y, ngư nghiệp cũng như đóng góp mộtphần không nhỏ trong sự hình thành hiện tượng kháng kháng sinh ở người.Cuối cùng là vấn đề dùng các chất diệt khuẩn để chùi rửa quá thường xuyên,không đúng chỉ dẫn cũng có thể giúp sản sinh ra các dòng vi khuẩn có tínhkháng thuốc Vi khuẩn tiếp nhận tính kháng thuốc từ nhiều cách Từ các vikhuẩn khác có mang sẵn tính chất này hoặc do hiện tượng đột biến tự nhiênnhằm để bảo vệ sự sống còn của một sinh vật Tính đề kháng được gắn trêngen của vi khuẩn hoặc cũng có thể nằm trong những đơn vị phụ thuộc của

nhiễm sắc thể, gọi là những plasmides Đây là những vòng DNA cực nhỏ và

di động Khi vi khuẩn chết đi, các plasmides này sẽ được thải vào môi sinh và

từ đó nhiễm vào các vi khuẩn khác Còn đối với virus khi sinh sản chúng cầnphải xâm nhập vào vi khuẩn để trích lấy plasmides và đem truyền sang chonhững vi khuẩn khác Hiện tượng kháng thuốc có thể xảy ra theo một trongnhững cơ chế sau đây: Làm thay đổi mục tiêu tác động của thuốc trên vikhuẩn, vô hiệu hóa thuốc bằng enzyme β-lactamase hoặc làm giảm độ thẩm

thấu của màng tế bào vi khuẩn lên thuốc không tác động được Có bằngchứng cho thấy vi khuẩn mang tính kháng thuốc có thể vượt hàng rào chủngloại để truyền đặc tính này sang cho những vi khuẩn của một chủng loại khác,thí dụ vi khuẩn gốc ở động vật truyền tính đề kháng sang cho vi khuẩn gốc ởngười Ngoài ra, đa số thuốc kháng sinh bên thú y đều có cùng một cơ cấu hóahọc như thuốc đồng loại bên người Bởi lý do này cho nên khi một vi khuẩn

đề kháng với một loại thuốc thú y thì nó cũng có thể đề kháng với các loạithuốc cùng nhóm bên người

Nhưng không phải “tự nhiên” mà vi khuẩn xuất hiện đoạn gen nguy hạinày Theo bác sĩ Yên Lâm Phúc (2011), việc có được gen kháng thuốc là domột trong những cách thức sau:

Do đột biến, tức là chính thuốc kháng sinh đã làm đột biến hệ vật chất

di truyền của vi khuẩn làm cho hệ vật chất này bị biến đổi Cụ thể ở đây làDNA của vi khuẩn bị biến đổi Sự biến đổi này theo hướng kháng lại thuốckháng sinh và gen bị biến đổi này được gọi là gen kháng thuốc Không phải

dễ dàng có được sự biến đổi này Sự đột biến chỉ xảy ra khi thuốc được sửdụng với liều lượng không đúng quy chuẩn và vi khuẩn có thể sống sót sauđợt điều trị Những “con” vi khuẩn sống sót này sẽ nhận biết và biến đổi DNA

để chống lại tác dụng của thuốc kháng sinh và gen kháng thuốc được tạothành Tuy nhiên, sự đột biến tự thân của vi khuẩn chưa phải là cách chủ đạogây ra sự kháng thuốc lan nhanh [65]

Do sự lai tạo của dòng vi khuẩn động vật với vi khuẩn trên người Vikhuẩn gây bệnh trên người có được gen kháng thuốc là do tiếp nhận đượcnhững gen kháng thuốc từ hệ vi khuẩn trên động vật Quá trình này diễn ranhư sau: ban đầu, vi khuẩn trên động vật kháng thuốc Sau đó, vì một lý donào đó, những vi khuẩn này thâm nhập được vào cơ thể người Những vikhuẩn bị đột biến này sẽ truyền tải gen kháng thuốc theo cơ chế chuyển gencho vi khuẩn trên người Vật mang gen kháng thuốc từ vi khuẩn động vật

sang vi khuẩn người là một “bán sinh thể sống” có tên gọi là plasmid Kết quả

là vi khuẩn trên người có khả năng kháng thuốc [65]

Do sự chuyển gen kháng thuốc giữa những vi khuẩn trên lãnh thổ quốcgia này sang lãnh thổ quốc gia khác thông qua những chủ thể người đi du lịch.Những người đi du lịch có những vi khuẩn kháng thuốc Họ đi sang một quốcgia khác mang theo luôn cả vi khuẩn này Những vi khuẩn này sẽ truyền genkháng thuốc cho những vi khuẩn lành ở quốc gia bị tạp nhiễm Kết quả cuốicùng là tạo ra một dòng vi khuẩn kháng thuốc ở chính quốc gia thứ hai này và

từ đó có thể lan ra toàn cầu

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào nghiên cứu gen kháng

kháng sinh DT104 của vi khuẩn Salmonella Chủng đa kháng thuốc Salmonella Typhimurium DT104 được phát hiện lần đầu tiên ở người mắc

Salmonellosis tại Anh vào năm 1980 Sau đó được quan sát thấy cả ở ngườicũng như vật nuôi trên khắp thế giới vào những năm 90 và hiện đang là mốiquan ngại hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng Gen này thường xuất hiện ở

các chủng S Typhimurium và ít thấy ở các chủng khác Một tổ hợp kháng thuốc điển hình của S Typhimurium DT104 là kháng đồng thời 5 loại kháng

sinh, bao gồm: ampicilin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamide vàtetracyline (ACSSuT) [44] Tuy nhiên, không có điều ngược lại, tức là nếu cáckết quả xác định lâm sàng cho thấy một chủng vi khuẩn kháng với cả 5 loạikháng sinh này thì chưa đủ căn cứ để kết luận là chủng vi khuẩn này có mang

gen kháng kháng sinh DT104 [44] Cũng theo tác giả, có 61,5% số chủng

thuộc serotype S typhimurium có mang gen DT104.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Thu thập và phương pháp lấy mẫu

Thu thập mẫu thịt lợn, thịt gà, thịt bò tại các chợ ở Hà Nội Mẫu đượcbao gói trong các túi vô trùng, bảo quản ở hộp đựng mẫu chuyên dụng (10oC),

đưa ngay về phòng thí nghiệm để phân tích sự ô nhiễm vi khuẩn Salmonella.

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu

* Các loại hóa chất nghiên cứu và giám định vi khuẩn Salmonella spp.

bao gồm: Buffered Peptone Water (CM0509), Muller - Kaufmann TetrathionateBroth Base (CM0343), XLT-4 (Xylose Lactose TergitolTM 4) Agar (CM1061),Modified Semi-solid Rappaport - Vassiliadis (MSRV) Agar (ISO) (CM1112),Kligler Iron Agar (CM0033), Rambach Agar, Brain Heart Infusion Broth (BHI)(CM1136), Mueller-Hinton Agar (CM0337) của hãng Oxoid Ltd., Basingstoke,United Kington Nutrient Agar (Merck 1.05450, Germany)

* Bộ kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O, Salmonellamonovalent O6, O7, O3, O10 và monovalent Hf,g; He,h và Hl,w (SIFIN,Berlin, Germany)

* Các loại khoang giấy kháng sinh gồm: Streptomycine (SPT-68798),Ampicillin (AMN 2-67288), Cephalothin (CF-66218), Amoxicillin (AMX-66138), Gentamycin (GME 30-67318), Tetracycline (TE-67448),Ciprofloxacin (CIP-68648), Ceftazidime (CAZ-66308),Trimethoprime/Sulfamethoxazol (SXT-68898) (Biorad, France)

* Các loại hóa chất dùng trong tác chiết RNA, tổng hợp cDNA, chạyphản ứng RT-PCR và thực hiện các phản ứng sinh học phân tử, bao gồm:TRIZOL® Reagent (Cat No 15596-018, Ambion RNA - Life Technologies,

CA, USA); Isopropyl alcohol (Cat No Darmstadt, Germany); Ethanol (Cat

No M1705), Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Cat No.N2515), Random Primers (Cat No C1181), dNTP Mix (Cat No U1515) củahãng Promega Corporation (Madison, WI, USA); i-TaqTMDNA Polymerase(Cat No 25022, iNtRON Biotechnology, Inc., Korea); DEPC-treated water(Cat No AM9916, Ambion RNA - Life Technologies, CA, USA), RNase-freewater.

* Các cặp mồi xuôi, mồi ngược: 16S, tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB, prmA (nguồn gốc do phòng nghiên cứu hệ gen thiết kế).

* Các vật tư tiêu hao dùng trong các phản ứng sinh học phân tử

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella

Salmonella được nuôi cấy và phân lập theo tiêu chuẩn ISO 6579-2005

được tóm tắt ở sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella

theo tiêu chuẩn ISO 6579 - 2005

Các chủng Salmonella spp dương tính được giữ giống trên môi trường

BHI có bổ sung glyxerin, bảo quản ở -20oC

2.2.2 Định type vi khuẩn Salmonella

Tiến hành xác định serovar của các chủng Salmonella spp phân lập

được bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm, sửdụng kháng huyết thanh O và H chuẩn (của hãng Denka Seiken Co., Ltd.Tokyo, Nhật Bản), sau đó đối chiếu theo bảng phân loại của Kauffmann andWhite Popoff (2001)

Bước thứ nhất là kiểm tra khả năng tự ngưng kết của vi khuẩn bằngcách nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kính sạch Sau đó, dùng que cấyvòng lấy một lượng sinh khối vừa đủ trên môi trường thạch thường, trộn đềunhẹ nhàng trong vòng 30 - 60 giây thành huyễn dịch, quan sát kết quả trênnền tối, tốt nhất là sử dụng kính lúp Nếu huyễn dịch vẫn đục đều thì tiếnhành thực hiện phản ứng kháng huyết thanh với kháng nguyên O và H Chỉthử phản ứng ngưng kết kháng nguyên với những khuẩn lạc thuần không cókhả năng tự ngưng kết Quy trình thử ngưng kết kháng nguyên O thực hiệngiống như thử nghiệm tự ngưng kết, nhưng thay thế giọt nước muối sinh lýbằng kháng huyết thanh O hoặc H Phản ứng dương tính khi xuất hiện nhữnghạt nhỏ trắng li ti ở đáy của huyễn dịch, phản ứng âm tính khi huyễn dịch vẫnđục

2.2.3 Thử khả năng kháng kháng sinh

Tất cả các chủng Salmonella Typhimurium phân lập được thử khả năng

mẫn cảm kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Trong thí nghiệmnày chúng tôi tiến hành thử tính mẫn cảm kháng sinh với 7 loại kháng sinh baogồm: Tetracyline, Sulfonamides, Chloramphenicol, Aminoglycosides,

Aminoglycosides, Betalactams, Quinolones, Colisin Các chủng Salmonella

Typhimurium phân lập được thực hiện kháng sinh đồ trên thạch, sử dụng cáckhoanh giấy kháng sinh có kích thước 6mm đặt lên đĩa thạch, nuôi cấy ở

37oC/24h Đo đường kính của vòng vô khuẩn và so sánh với tiêu chuẩn đánhgiá của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm, Mỹ (The Clinical anLaboratory Standards Institute, CLSI: 2013).

2.2.4 Phương pháp xác định một số gen kháng kháng sinh của chủng Salmonella Typhimurium bằng phương pháp RT-PCR

* Tách chiết RNA tổng số:

Chủng vi khuẩn Salmonella được lựa chọn, nuôi cấy trên môi trường

thạch dinh dưỡng Nutrient Agar Tăng sinh trong môi trường Brain HeartInfusion Broth (BHI) để thu được canh khuẩn đạt nồng độ 108 dùng tách RNA

Quy trình tách RNA thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tómtắt quả trình đó như sau:

- Lấy 1ml dịch canh khuẩn đạt nồng độ 108 vào ống Eppendorf 1,5ml,

ly tâm 14.000 rpm/10 phút/ 4oC Đổ phần dịch ở trên, giữ lại phần cặn dướiđáy ống

- Thêm 1ml dung dịch TRIzol vào ống Eppendorf 1,5ml Nghiền cặn bằng máy sonicate trong 1 phút để hòa tan hoàn toàn

- Thêm 0,2 ml chloroform/1ml TRIzol Trộn đều phần dịch tron 15 giâybằng máy vortex

- Đổ phần dịch ở trên, giữ lại phần cặn dưới đáy ống (cặn đó chính là RNA).

- Rửa cặn RNA bằng cồn Ethanol 75%: Thêm 1ml cồn Ethanol 75%vào ống eppendorf có chứa cặn RNA, lắc nhẹ bằng tay, ly tâm 6000 rpm/5phút/ 4oC

- Đổ phần dịch ở trên, giữ lại phần cặn dưới đáy ống Để khô cặn ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút.

- Pha loãng cặn RNA trong 0,03 - 0,06 ml RNase - free water

- Ủ ống Eppendorf ở 55-60oC/ 5 phút, lấy ra đặt ngay vào hộp đá trong

5 phút

- Mẫu RNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch (OD 260/280) trênmáy đo quang phổ khả biến (NanoDrop) và các hệ số lắng 5S, 18S, 28S củarRNA bằng điện di sản phẩm trên gel agarose 1%

- Bảo quản nhiệt độ ở sản phẩm âm sâu (- 80oC) cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo

* Tổng hợp cDNA:

Các bước tổng hợp cDNA được thực hiện theo các bước sau:

- Mẫu RNA được lấy ra từ tủ âm sâu (- 80oC) đặt vào hộp đá bào để mẫu tan tự nhiên

- Hiệu chỉnh mẫu RNA đạt nồng độ 1 g/ l

- Biến tính RNA ở nhiệt độ 75oC/ 5 phút, lấy ra đặt ngay vào hộp đátrong 5 phút

- Chuẩn bị hỗn hợp cDNA gồm: 5X buffer (4 l); 0.1M DTT (4 l); dNTP(2 l); Random Primer (2 l); RNase Inhibitor (0,5 l); M ML V-RT (1

- Cho 11,8 l hỗn hợp cDNA + 8,5 l mẫu RNA đã hiệu chỉnh (nồng độ