Nhân nhanh cây bìm bịp (clinacanthus nutans (burm f ) lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô​

Nghiên cứu của Gunasekaran năm 2014 về nhân giống cây Bìm bịp, kếtquả đưa ra đã thành công trong việc tạo ra mô sẹo nhưng không có kết quả táisinh cây con, lý do có thể bao gồm không phù

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -*** -

PHÙNG THỊ THANH HẰNG

NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP

(CLINACANTHUS NUTANS (BURM F.)

LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT

NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -*** -

PHÙNG THỊ THANH HẰNG

NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP

(CLINACANTHUS NUTANS (BURM F.)

LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT

NUÔI CẤY MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

TS LA VIỆT HỒNG

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới

TS La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trìnhthực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, BanChủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoaSinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợicho tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm hoàn thành khóa luận của mình

Vì chưa có nhiều cơ hội tham gia nghiên cứu khoa học nên tôi còn nhiều

bỡ ngỡ cũng như kinh nghiệm còn nhiều hạn chế do đó không tránh khỏinhững thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý, xây dựng của các thầy cô

và các bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện hơn nữa.Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

PHÙNG THỊ THANH HẰNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện Các số liệu và kếtquả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và không trùng lặpvới những kết quả đã công bố

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

PHÙNG THỊ THANH HẰNG

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích của đề tài: 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây Bìm bịp 4

1.1.1 Phân loại và phân bố 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học 5

1.1.3 Giá trị dược liệu 6

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 9

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 11

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 11

2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 11

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 11

2.3 Môi trường nuôi cấy 11

2.4 Điều kiện nuôi cấy 11

2.5 Phương pháp nghiên cứu 12

2.5.1.Tạo vật liệu khởi đầu .12

2.5.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro 13

2.5.3 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh 14

2.5.4 Rèn luyện cây con in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 15

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Hoàn thiện giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 19

3.2 Hoàn thiện giai đoạn tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp 20

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro) 20

3.2.2 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro) 22

3.3 Hoàn thiện giai đoạn ra rễ - tạo cây in vitro hoàn chỉnh 25

3.4 Hoàn thiện giai đoạn Rèn luyện cây con in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 27

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

Hydro peroxid

Acid β – indol axeticIndol butyric acid

Kĩ Thuật Nông Nghiệp

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0,05Murashige và Skoog

-napthalene axetic acid

Natri hypochlorite

Bảng 3.1 Hiệu quả tạo vật liệu khởi đầu mẫu cây Bìm bịp 17Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP (Benzyl Adenin Purin) đến khả năng tái

sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp (sau 8 tuần nuôi

cấy) 20Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tái sinh

và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp (sau 8 tuần nuôi cấy) 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của IAA đến sự ra rễ của cây Bìm bịp in vitro (sau

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống sót của cây Bìm bịp in

vitro 27

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây Bìm bịp bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau,

1894) .

Hình 3.1: Quy trình tạo vật liệu khởi đầu giống cây Bìm bịp bằng phương pháp in vitro

Hình 3.2: Mẫu cây Bìm bịp in vitro sau 1 tháng nuôi cấy trên19 môi trường MS0 cơ bản

Hình 3.3: Chồi in vitro của cây Bìm bịp sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng Hình 3.4: Chồi in vitro của cây Bìm bịp sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 24

Hình 3.5: Rễ cây Bìm bịp in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 26

Hình 3.6: Cây Bìm bịp in vitro sau 2 tuần đưa ra môi trường tự nhiên 28

22

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây cỏ thảo dược từ lâu luôn là những loại thuốc có nhiều công dụng tốtđược sử dụng rộng rãi trong nền y học cổ truyền với những bài thuốc dân gian

dưới tác dụng của các loài cây dược liệu Họ Ô rô (Acanthaceae) là một họ lớn

của thực vật hai lá mầm trong Lớp thực vật có hoa, chứa khoảng 214 - 250 chi(tùy hệ thống phân loại) và khoảng 2 500 – 4 000 loài Ở Việt Nam có khoảng

55 chi, khoảng 195 loài Cây Bìm bịp tùy theo địa phương còn gọi là cây Mảnh

cộng hay cây Xương khỉ có tên khoa học Clinacanthus nutans (Burm f.)

Lindau, 1894 là cây cỏ thảo dược lâu năm có khá nhiều công dụng trong y học[1, 2, 6]

Đông y cho rằng, mảnh cộng có vị ngọt, tính bình, có tác dụng mát gan,lợi đảm (tăng tiết mật), tiêu thũng (giảm phù nề), chống đau, hạ sốt, chốngviêm, điều kinh, lá thân tươi của cây giã nát đắp vết thương, cầm máu, bonggân, gãy xương kín,… Được sử dụng để hỗ trợ điều trị viêm gan vàng da, giảmtiết mật, đau nhức do phong thấp, gãy xương Bộ phận dùng làm thuốc là toàncây thu hái quanh năm, dùng tươi hoặc phơi khô để dành [6]

Nghiên cứu trong y học hiện đại chỉ ra rằng thành phần chiết xuất câyBìm bịp hoạt động như một chất chống oxy hóa Tám hợp chất đó là 132 –hydroxyl - (132 - S) - chlorophyll B, 132 – hydroxyl - (132 - R) - chlorophyll

B, 132 –hydroxy (132 S) phaeophytin B, 132 hydroxy (132 R) phaeophytin B, 132 - hydroxy - (132 - S) - phaeophytin A, 132 – hydroxyl -(132 - R) - phaeophytin A, purpurin 18 phytyl ester và phaeophorbide A đượcphát hiện trong chiết xuất từ thân và lá cây [14] Thí nghiệm dược lý đã chứngminh rằng các loại chiết xuất và hợp chất tinh khiết từ loài này thể hiện mộtloạt các đặc tính sinh học như chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa vàchống các bệnh tiểu đường

-Cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) cây nhỏ, mọc

tự nhiên, cho đến nay nguồn giống cây chủ yếu được nhân giống bằng phươngpháp giâm cành từ cây mẹ hay gieo hạt, tuy nhiên tần số gia tăng chồi hìnhthành cây mới thấp và qua thời gian giống bị thoái hóa và nhiễm bệnh từ

cây mẹ để lại, thân lá kém phát triển Bởi vậy, nguồn giống cây ngày càng ít đi

và khó tìm

Nghiên cứu của Gunasekaran năm 2014 về nhân giống cây Bìm bịp, kếtquả đưa ra đã thành công trong việc tạo ra mô sẹo nhưng không có kết quả táisinh cây con, lý do có thể bao gồm không phù hợp điều kiện thí nghiệm, chẳnghạn như nồng độ của chất điều hòa tăng trưởng [15] Ở Trung Quốc, nghiêncứu của Chen B và cộng sự (2015) cũng đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứuphương pháp nhân giống nhanh cho cây Bìm bịp Kết quả cho thấy môi trườngtăng sinh tối ưu cho cây Bìm bịp là Murashige và Skoog (MS) với 1,0 mg/lBAP + 0,02 mg/l NAA cung cấp hệ số nhân nhanh là 3,9 Môi trường tạo rễbao gồm ½ MS + 0,25 mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ cây hình thành 100%

Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về tác dụng sinh học và hóa học từcây Bìm bịp, tiến hành phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinhkhiết cho thấy chiết xuất từ thân cây Bìm bịp mọc tại Việt Nam có hoạt tínhchống viêm Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào về nhân giống cây Bìmbịp ở Việt Nam

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, công nghệ nhângiống vô tính bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật rất có hiệu quả trong sản xuấtcây trồng và hạn chế được những trở ngại mà các phương pháp khác gặp phải,

từ đó tạo ra được những giống cây trồng được trẻ hóa, sạch bệnh và đảm bảochất lượng về mặt di truyền

Từ thực tế nêu trên, góp phần vào việc tạo ra nguồn giống sạch và chấtlượng, vì vậy chúng tôi đã chọn nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh cây Bìm bịp

(Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô”.

- Tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro.

- Tái sinh và nhân nhanh cây Bìm bịp in vitro.

- Ra rễ - Tạo cây Bìm bịp in vitro hoàn chỉnh.

- Rèn luyện cây in vitro thích nghi với môi trường tự nhiên.

4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học: Bổ sung nguồn tài liệu hoàn thiện quy trình nhân

giống cây Bìm bịp

- Ý nghĩa thực tiễn: Hoàn thiện quy trình nhân giống cây Bìm bịp, ứng

dụng vào sản xuất để cung cấp nguồn giống chất lượng cho người trồng dượcliệu

NỘI DUNGCHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây Bìm bịp

1.1.1 Phân loại và phân bố

Hình 1.1 Cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894)

Tên khoa học: Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894

Tên Việt Nam: Bìm bịp (Mảnh cộng hay Xương khỉ)

Cây Bìm bịp (cây Mảnh cộng hay Xương khỉ) có tên khoa học là

Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894 thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) Họ

Ô rô (Acanthaceae) là một họ lớn chứa khoảng 214 - 250 chi (tùy hệ thống phân loại) và khoảng 2500 – 4000 loài Trong họ Ô rô - Acanthaceae bao gồm bốn phân họ, cụ thể là Nelsonioideae, Acanthoideae, Thunbergioideae và Avicennioideae [14] Họ này chủ yếu bao gồm các loài cây bụi, nửa bụi hoặc

gỗ Trong số các loài từ họ này, chỉ có một số ít được phân bố ở vùng ôn đới vàhầu hết các loài phân bố ở khu vực Đông Nam Á Cây Bìm bịp có nguồn gốc

từ các nước châu Á nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao gồm Thái Lan, Malaysia,Indonesia, Việt Nam và Trung Quốc Ở Việt Nam, từ lâu cây Bìm bịp đã đượcbiết đến như một vị thuốc dân gian với nhiều công dụng khác nhau trong y học

cổ truyền, lá của cây Bìm bịp được tìm thấy giàu axit amin, nguyên tố vi lượng

và thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao [2, 12, 15]

- Hoa:

Hoa mọc thành chùm tại đỉnh chồi hoặc gần đỉnh chồi, bông rủ xuống ở ngọn Mỗi bông hoa có một đài hoa với kích thước 0,9 - 1,3 cm, tràng hoa dài

~ 3,5 cm đường kính ~ 3 mm, dần dần mở rộng đến ~ 6 mm khi nở Tràng hoa

có 2 môi, môi ở dưới có 3 răng hướng lên trên Lá bắc hẹp Hoa đỏ hay hồng,bên ngoài có chứa lông tuyến (hình 1.1) [2, 13]

- Quả:

Quả của cây Bìm bịp thuộc quả nang dài ~ 2 cm, quả có chứa 4 hạt, hạt có đường kính ~ 2 mm [13]

1.1.3 Giá trị dược liệu

Việc sử dụng thực vật làm thảo dược vẫn rất phổ biến ở cả thành thị và

xã hội nông thôn Khoảng 80% dân số ở khu vực châu Á và châu Phi cácquốc gia vẫn sử dụng rộng rãi thuốc thảo dược cho một số khía cạnh củachăm sóc sức khỏe cơ bản theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (Edgar, Elias

và Adnan 2002) Cây Bìm bịp là một loại thảo mộc bản địa trong số các nướcĐông Nam Á đặc biệt là ở Thái Lan, phần phía nam của Trung Quốc,Indonesia, Malaysia và cả Việt Nam

Đông y cho rằng, mảnh cộng có vị ngọt, tính bình, có giá trị sử dụng cả

ở trạng tươi hay trạng thái khô Y học dân gian của các nước đã ghi nhận, Bìmbịp có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, độc tế bào, trị côntrùng cắn, sốt, ban da, lỵ, đái tháo đường [9, 16]

Ở nước ta, hiện nay cây đang được rất nhiều người tìm kiếm trong điều trịcác bệnh về xương khớp, dạ dày, viêm gan, vàng da và hơn thế nữa nó còngiúp hỗ trợ điều trị căn bệnh ung thư [5]

Ở Trung Quốc (Hải Nam), người ta dùng thân, lá làm thuốc trị thươngtích và chữa thiếu máu, hoàng đản, phong thấp Thường dùng cành lá khô sắcuống Dùng ngoài lấy lá tươi giã đắp [2]

Ở Thái Lan, một chiết xuất cồn của lá tươi được dùng trị bỏng, sâu bọđốt, côn trùng cắn, kháng khuẩn, chống viêm và giảm đau, một số bệnh ngoài

da như dị ứng và mụn rộp [5]

Trong y học hiện đại ngày nay, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng chiết xuất lácây Bìm bịp chứa nhiều sinh tố, khoáng chất hoạt động như một chất chốngoxy hóa [18] Theo nghiên cứu của Ruhaiyem Yahaya và cộng sự, đã chỉ ra cây

Bìm bịp chứa các hợp chất terpenoids, flavonoid, flavon C-glycosyl, lưu

huỳnh- có chứa glucosides và glycoglycerolipids góp phần vào các hoạt động

dược lý Nghiên cứu dược lý chỉ ra rằng Cây Bìm bịp sở hữu thuốc khángvirus, chống ung thư, chống oxy hóa, trị đái tháo đường, điều hòa miễn dịch,chữa lành vết thương, hoạt động chống viêm và giảm đau [16] Chiết xuất thô

từ lá cây Bìm bịp chứa hoạt chất có hoạt động gây độc tế bào chống lại các tế

bào u ác tính D24, chiết xuất có hoạt tính sinh học này được cho là một

phenolics flaconoid [14].

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chiết xuất của cây Bìm bịp được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới đánhgiá về giá trị hóa sinh, công dụng của các chất có trong thân và lá cây Nghiêncứu của Alam và cộng sự (2016) cho rằng đây là một trong những loài được sửdụng làm thuốc thảo dược quan trọng ở châu Á nhiệt đới, các thành phần khác

nhau của các hợp chất hoạt tính sinh học từ loại cây này là flavonoid,

glycoside, glycolycerolipids, cerebroside và monoacylmonogalatosylglycerol.

Trong thí nghiệm dược lý đã chứng minh rằng các loại chiết xuất và hợp chấttinh khiết từ loài này thể hiện một loạt các đặc tính sinh học như chống viêm,chống virus, chống oxy hóa và chống tiểu đường [11]

Theo nghiên cứu của Sakdarat S và cộng sự năm 2006 thành phần của lácây Bìm bịp từ lâu đã được sử dụng truyền thống ở Thái Lan một loại thuốcchống viêm, để điều trị côn trùng cắn, nhiễm herpes và phản ứng dị ứng [17]

Bộ Y tế công cộng Thái Lan đã coi lá cây này như là một phương thuốc chính

để điều trị viêm da và tổn thương do virus [17]

Các chiết xuất cây Bìm bịp có vai trò chống ung thư được phát hiện ởTrung Quốc (Wang và cộng sự, 2013) Lá của cây Bìm bịp được tìm thấy giàuaxit amin, nguyên tố vi lượng và thành phần hóa học có hoạt tính sinh học.Chiết xuất chloroform thô được tách bằng phương pháp sắc ký và hướng dẫnsinh học kỹ thuật phân đoạn để đưa ra tám hợp chất tinh khiết Cấu trúc làmsáng tỏ các hợp chất cô lập được thực hiện trên cơ sở phân tích quang phổ, baogồm DEPT, COZY, NOESY, HMQC và HMBC Tám hợp chất này có liênquan đến chất diệp lục a và chất diệp lục b, tám hợp chất là 132 – hydroxyl -(132 - S) - chlorophyll B (1), 132 – hydroxyl - (132 - R) - chlorophyll B (2),

132 – hydroxyl - (132 - S) - phaeophytin B (3), 132 – hydroxyl - (132 - R) –phaeophytin B (4), 132 – hydroxyl - (132 - S) - phaeophytin A (5), 132 –hydroxy - (132 - R) - phaeophytin A (6), purpurin 18 phytyl ester (7) vàphaeophorbide A (8) Năm trong số này (hợp chất 1, 2, 4,

5, 6) được xác định là hợp chất mới Các hợp chất này chưa được báo cáotrước đây [12, 17].

Tạp chí quốc tế về nghiên cứu Dược lí và Thực vật học, nghiên cứu củaRuhaiyem Y và cộng sự (2015) cho rằng cây Bìm bịp là một cây thuốc hữu íchcủa Đông Nam Á Các chiết xuất thực vật được báo cáo sở hữu khả năngchống ung thư, chống oxy hóa, chống đái tháo đường, điều hòa miễn dịch,chữa lành vết thương, chống viêm và các hoạt động giảm đau Ngoài ra nghiêncứu về độc tính còn cho thấy rằng cây Bìm bịp không độc hại khi sử dụng vớiliều lượng khuyến cáo [16]

Công trình nghiên cứu của Fong S năm 2015, Trường Đại học RMIT đãthực hiện một số nghiên cứu về thành phần của lá cây Bìm bịp Thí nghiệmnghiên cứu ảnh hưởng của các vị trí thu gom với đặc điểm môi trường khácnhau trên thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư có trên lá cây Bìmbịp được thu ở ba địa điểm khác nhau là Thái Lan, Malaysia và Việt Nam Kếtquả cho thấy rằng, thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của lá câyBìm bịp mọc ở độ cao cao hơn với nhiệt độ không khí thấp hơn - chiết xuất lácây Bìm bịp được trồng ở Chiang Dao, Chiang Mai, Thái Lan - có hoạt độngcao nhất (24 giờ EC50: 0,95 mg/ml và 72 giờ EC50: 0,77 mg/ml) Nghiên cứuthứ hai về ảnh hưởng của các quá trình sau thu hoạch đến các thành phần hóahọc và chất chống ung thư có trong lá cây Bìm bịp Kết thúc thí nghiệm chothấy rằng, chiết lạnh ở nhiệt độ 22°C là phương pháp tốt nhất cho hàm lượng

phenolics và flavonoid tối đa [13, 14].

Ở Malaysia, loài này có tên địa phương là cỏ rắn Sabah, nghiên cứu củaGunasekaran (2014) về nhân giống cây Bìm bịp Trong nghiên cứu này, hai thínghiệm được thực hiện, đó là tạo mô sẹo (callus) và tái sinh cây con Thínghiệm tạo mô sẹo nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng và bóng tối,ảnh hưởng của các loại cytokinin khác nhau đến khả năng cảm ứng callus củacây Bìm bịp từ lá Kết quả đưa ra cho thấy rằng, không có sự khác biệt về kếtquả cảm ứng callus ở điều kiện bóng tối so với điều kiện chiếu sáng, mô sẹohình thành trong môi trường chứa Dicamba nồng độ 3 mg/l có hiệu quả tốtnhất so với các chất điều hòa sinh trưởng còn lại Ở điều kiện ánh sáng, môitrường chứa 3 mg/ l Dicamba cho hiệu quả cảm ứng callus tốt nhất là 8,3 ±

0,58%, còn ở điều kiện tối môi trường chứa Dicamba 3mg/ l cho hiệu quả cảmứng callus tốt nhất với giá trị trung bình là 8,0 ± 1,00% Nghiên cứu này đãthành công trong việc tạo ra mô sẹo nhưng lại không có kết quả tái sinh câycon, lý do có thể bao gồm không phù hợp điều kiện thí nghiệm, chẳng hạn nhưnồng độ của chất điều hòa tăng trưởng [15] Ở Trung Quốc, Chen B vàcộng sự(2015) cũng đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phương pháp nhân giốngnhanh cho cây Bìm bịp Kết quả cho thấy môi trường tăng sinh tối ưu cho câyBìm bịp là Murashige và Skoog (MS) với 1,0 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAAcung cấp hệ số nhân nhanh là 3,9 Môi trường tạo rễ bao gồm ½ MS + 0,25mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ cây hình thành 100% [12].

Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu về các hợp chất có trên lá và thâncủa cây Bìm bịp và công dụng của nó, tuy nhiên các nghiên cứu về nhân giốngcây Bìm bịp thì còn hạn chế Các kết quả nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quantrọng trong việc giúp các nhà nghiên cứu nước ta thừa kế những kinh nghiệm

để đem lại hiệu quả cao trong nhân nhanh nguồn giống và bảo tồn được nguồngiống sạch bệnh

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Tại Việt Nam, những nghiên cứu sâu về tác dụng sinh học và hóa học từcây Bìm bịp còn ít và chưa có hiệu quả cao Nguyên nhân chủ yếu là do câyBìm bịp mới chỉ biết đến với những bài thuốc truyền thống còn hạn chế trong yhọc hiện đại sử dụng những chiết xuất từ thân và lá cây có hoạt tính sinh họccao ứng dụng trong sản xuất dược liệu Tuy vậy cũng có một số nghiên cứu vềcây Bìm bịp sau đây:

- Huỳnh Ngọc Thụy, Nguyễn Thị Trang Đài (2017) bước đầu phân lập vàxác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết phân lập được từ thân câyBìm bịp mọc ở núi Cấm, Châu Đốc, tỉnh an Giang, Việt Nam Với phươngpháp chiết xuất, phân lập: Chiết ngấm kiệt bằng ethanol 96%, phân lập bằngsắc ký cột đã phát hiện bốn hợp chất isoflavonoid phân lập từ thân cây có cấutrúc lần lượt: (+) – 4 – hydroxy – 3 – methoxy - 8,9 -methylendioxypterocarpan (CN6T - 3), (-) – 3 – hydroxy – 4 – methoxy - 8,9

- methylendioxypterocarpan (CN6T - 4), 7 – hydroxy - 4´-methoxyisoflavon (CN22 - 2), 3´,7 – dihydroxyl - 4´,8 - dimethoxylisoflavon (CN22 - 3) [9].

- Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm từ thân cây Bìm bịp Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, Acanthaceae của Nguyễn Thị Trang Đài và cộng sự năm 2017 đưa ra kết quả trên mô hình in vitro, xác định được cao ethanol toàn

phần 96% của thân có tác dụng kháng viêm mạnh hơn rễ và lá, cao phân đoạnethyl acetat có tác dụng kháng viêm mạnh hơn cao dichloromethan và caonước, phân đoạn 4 của cao ethyl acetat có tác dụng kháng viêm mạnh hơn 3

phân đoạn còn lại, còn trên in vivo, cao ethyl acetat liều 1000 và 2000 mg/kg

cho hoạt tính kháng viêm, giảm phù vào ngày đầu điều trị Tuy mức độ tácdụng có kém so với diclofenac 10 mg/kg nhưng cũng chứng tỏ Bìm bịp có tácdụng kháng viêm cấp và các chất có tác dụng kháng viêm cấp nằm nhiều ở caophân đoạn ethyl acetat [4]

- Nghiên cứu thực vật học và đa dạng di truyền của cây Bìm bịp tại ViệtNam của Nguyễn Thị Trang Đài và cộng sự (2017), kết quả cho thấy qua hìnhdạng bên ngoài của lá, qua phân tích kiểu hình và kiểu gen cho kết quả 17 mẫucây Bìm bịp được thu hái ở 12 tỉnh thành tại Việt Nam được xếp thành 4 nhóm

chính, trong đó mẫu cây Bìm bịp CN50 chính là loài Clinacanthus nutans và 3 nhóm còn lại có thể là phân loài của Clinacanthus nutans, kết quả này là cơ sở

trong việc đánh giá đa dạng nguồn gen của các loài Bìm bịp [3]

Tuy nhiên, công trình nghiên cứu đề cập đến vấn đề nhân giống cây Bìmbịp còn chưa có ở Việt Nam Bởi vậy đề tài: “Nhân nhanh cây Bìm bịp

(Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô”

nhằm góp phần tạo ra giống cây Bìm bịp sạch bệnh, chất lượng tốt

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 6/2018 đến tháng 4/2019 tại Phòngthí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2

2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu cây Bìm bịp được thu tại xã Ngọc Thanh - tỉnh Vĩnh Phúc

2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu

Các dụng cụ bao gồm: dao cấy, khay cấy, panh gắp, kéo, túi nilon, bìnhcấy, đèn cồn, pipet, bình xịt cồn, giấy thấm

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị sử dụng bao gồm: nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần,máy đo pH, cân kĩ thuật, tủ lạnh, bếp hồng ngoại, buồng cấy vô trùng

2.3 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS [11] + 30 g/l đường sacharose + 7 g/lagar và chất điều hòa sinh trưởng chứa khoáng đa lượng, vi lượng, pH môitrường là 5,8

2.4 Điều kiện phòng nuôi cấy

Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo:

- Nhiệt độ nuôi cấy: 25°C - 27°C

- Độ ẩm trung bình: 60% - 70%

- Ánh sáng: Sử dụng đèn chiếu sáng Neon với cường độ chiếu sáng 3000 Lux

- Thời gian chiếu sáng: 12h/ ngày

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lầnnhắc lại Các mẫu cấy có kích thước như nhau (3 - 4cm)

2.5.1 Tạo vật liệu khởi đầu

Đây là giai đoạn quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân

giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguồn mẫu vô trùng

dùng cho giai đoạn sau Chúng tôi tiến hành cắt đoạn thân mang chồi nách củacây Bìm bịp ngoài tự nhiên rửa sạch, được lắc trong nước xà phòng loãng từ 15

- 20 phút và rửa kỹ dưới vòi nước chảy Sau đó tiến hành khử trùng mẫu bằngcồn 70° và dung dịch Javel ở các nồng độ và thời gian sau:

Bảng 2.1 Các công thức tạo vật liệu khởi đầu mẫu cây Bìm bịp

Sau khi khử trùng mẫu cây được rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 - 3 lần

và cây Bìm bịp được cắt đốt (3 – 4 cm) cấy lên môi trường cơ bản MS chứa 30g/l saccharose, 7 g/l agar và chuẩn độ ở pH = 5,8 Theo dõi và đánh giá mẫusau 10 ngày dựa theo các tỷ lệ:

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm =

+ Tỷ lệ mẫu chết =

+ Tỷ lệ mẫu sạch sống =

2.5.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro

Tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của mô nuôi cấy và hệ số nhân

nhanh chồi in vitro Môi trường nuôi cấy dinh dưỡng nhân tạo sẽ được bổ sung

các chất điều hòa sinh trưởng BAP hoặc BAP kết hợp với NAA theo 2 thínghiệm như sau:

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi

in vitro

Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP đến

khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro

13