Phân lập tuyển chọn và bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm men candida oleophila ứng dụng trong bảo quản cam tươi

Phân lập, phân loại các loại nấm mốc gây thối hỏng quả cam, tuyển chọn các chủng nấm men đối kháng, nghiên cứu công nghệ nhân nuôi nấm men candida oleophila Phân lập, phân loại các loại nấm mốc gây thối hỏng quả cam, tuyển chọn các chủng nấm men đối kháng, nghiên cứu công nghệ nhân nuôi nấm men candida oleophila

- -

Luận văn thạc sỹ khoa học

“Phân lập, tuyển chọn và bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm

men candida oleophila ứng dụng trong

bảo quản cam tươi”

Ngành: công nghệ sinh học Mã số

Cao thị bích thủy

Người hướng dẫn khoa học: pgs.ts nguyễn Thùy Châu

Hà nội, 2007

- -

Luận văn thạc sỹ khoa học Ngành: công nghệ sinh học

“Phân lập, tuyển chọn và bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm

men candida oleophila ứng dụng trong

bảo quản cam tươi”

Cao thị bích thủy

Hà nội, 2007

Mở đầu

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, đó là

điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loại rau quả Các loại rau quả ở nước ta rất phong phú, trong đó có nhiều loại cho sản lượng hàng năm lên tới hàng trăm ngàn tấn như: vải, cam, xoài, thanh long v.v

Rau quả là thành phần tất yếu trong khẩu phần ăn hàng ngày của con người, nó cung cấp dinh dưỡng, khoáng chất, các vi lượng cần thiết khác cho

sự phát triển của cơ thể Ngoài ra, nó còn cung cấp các thành phần dược liệu quý giúp cơ thể có sức đề kháng chống một số bệnh vô cùng hữu hiệu Kinh tế

do ngành sản xuất rau quả đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp nói riêng và kinh tế quốc dân nói chung Ngoài việc cung cấp cho tiêu dùng trong nước, rau quả còn là nông sản xuất khẩu với giá trị kim ngạch khá cao Riêng kim ngạch xuất khẩu rau quả ở nước ta năm 2000 là 34 triệu USD và năm 2001 đạt 60 triệu USD Theo số liệu thống kê, sản lượng rau quả năm

1985 là: rau 2,1 triệu tấn và quả là 2,3 triệu tấn, năm 1990 rau là 4,5 triệu tấn

và quả là 3,9 triệu tấn, năm 1997 rau là 5,4 triệu và quả là 4,7 triệu tấn Về diện tích so với các cây khác từ năm 1985 đến năm 1995 về rau có giảm từ 7% xuống 6,8%, nhưng quả lại tăng lên từ 2,5% lên 3,3% Về giá trị sản lượng ngành rau quả năm 1995 rau chiếm 6,4% và quả chiếm 7,5% so với ngành trồng trọt

Những cây ăn quả thường có mùa nhất định, thời gian thu hoạch không dài nên lượng quả tại thời điểm thu hoạch tập trung với số lượng rất lớn, vượt quá nhu cầu sử dụng của thị trường Do đó, ngoài việc chế biến các loại quả thành các sản phẩm sử dụng lâu dài còn cần phải bảo quản quả tươi, kéo dài tuổi thọ, giảm thiểu tối đa sự hư hỏng, giữ được các đặc tính vốn có của chúng, đồng thời đảm bảo sự an toàn cho người sử dụng Mặt khác, do tính đa dạng của khí hậu nên mỗi vùng, miền đều có một số loại quả đặc trưng Nhu

cầu tiêu thụ hoa quả của người dân ngày càng tăng cao Vì vậy đòi hỏi việc cung ứng, vận chuyển giữa các vùng với nhau còn gặp nhiều khó khăn, vì khi vận chuyển thường là rất xa, khi tới nơi tiêu thụ hay các nhà máy chế biến thì quả tươi trở thành quả dập, héo không đáp ứng được về chất lượng cũng như

về số lượng, số quả thải loại nhiều Các khu vực chế biến nhiều khi không chủ

động được về mặt nguyên liệu sản xuất nên không thể mở rộng sản xuất được

Đây cũng là vấn đề bức thiết đặt ra cho ngành nông nghiệp của chúng ta

Cho đến nay, hướng nghiên cứu về bảo quản quả tươi nước ta chủ yếu tập trung vào bảo quản nhiệt và hoá chất Trong khi đó, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang trở thành mối quan tâm lớn do việc sử dụng quá mức các hoá chất bảo vệ thực vật độc hại trong bảo quản và chế biến nông sản nói chung và rau quả nói riêng Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm sinh học trong bảo quản là rất cấp thiết Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “ Phân lập, tuyển chọn và

bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm men Candida

oleophila ứng dụng trong bảo quản cam tươi“

mục tiêu của đề tài

- Tuyển chọn được các chủng nấm men có khả năng đối kháng với một

số loài nấm mốc gây thối hỏng quả cam

- Bước đầu tìm được công nghệ sản xuất chế phẩm nấm men Candida oleophila ứng dụng trong bảo quản cam tươi

Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập và phân loại các loài nấm mốc gây thối hỏng quả cam

2 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men đối kháng và nghiên cứu khả năng ức chế nấm mốc của các chủng nấm men phân lập được

3 Nghiên cứu công nghệ nhân nuôi nấm men Candida oleophila

4 Nghiên cứu thành phần tạo màng bao ăn được thích hợp cho sự phát triển của nấm men Candida oleophila

5 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm men Candida oleophila kết hợp

với màng bao ăn được để bảo quản cam tươi

Chương 1 - tổng quan tài liệu

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về bảo quản quả tươi bằng chế phẩm sinh học

Trên thế giới vấn đề nghiên cứu công nghệ bảo quản rau quả, hoa tươi

đã được các nước đặc biệt quan tâm Cho tới nay đã có hàng nghìn công trình nghiên cứu về công nghệ bảo quản rau, quả tươi, trong đó có rất nhiều công trình nghiên cứu công nghệ sản xuất các chế phẩm sinh học và không độc hại cho bảo quản rau quả, hoa tươi nhằm thay thế các hoá chất diệt nấm, diệt khuẩn đang được sử dụng rộng rãi hiện nay

Rau quả là tổ chức thực vật, sự sống của chúng tiếp tục cả sau khi thu hái và chết dần theo hiện tượng già hoá tự nhiên Nguyên nhân chính là do tác

động của sự trao đổi chất, sự phá huỷ của các vi sinh vật và các tác động hoá -

lí thể hiện cụ thể qua ba yếu tố chính: sự trao đổi chất trong quá trình phát triển của vi sinh vật sống trên bề mặt rau quả, hiện tượng hô hấp của tổ chức thực vật và hiện tượng bay hơi Tất cả các biện pháp bảo quản nhằm bảo đảm

và duy trì chất lượng rau quả sau thu hoạch đều hướng tới việc ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật, giảm cường độ hô hấp và hạn chế sự bốc hơi của rau quả [14]

Rau quả là các vi sinh vật sống, vì vậy quá trình hô hấp của chúng xảy

ra trong suốt thời gian bảo quản

Droby[28] và cộng sự đã nghiên cứu và cho thấy rằng sau thu hoạch, các loại rau thường bị thối hỏng do nhiều vi sinh vật khác nhau bao gồm nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc Tác nhân vi khuẩn gây thối hỏng rau phổ biến nhất

là các vi khuẩn như Erwina carotonowa, các loài Pseudomonas, Corynebacterium, Xanthomonas campestris và vi khuẩn lactic Những vi

khuẩn này đã tấn công mạnh mẽ ở tất cả các loại rau Các loại nấm mốc thường gây thối hỏng ở các loại quả như: Asperigllus, Cladosporium, Botritis

Cinerea, các loài khác nhau của chi Altenaria, Aspergillus, Cladosporium, Colletotrichum, Phomopsis, nấm Fusarium, gây bệnh thối hỏng ở quả vải,

nấm Penicillium, Phoma, Phytophthora, Pithyum và Rhizopus gây bệnh thối

hỏng ở cam, Ceratocystis fimbriata, Rhizoctonia solani, Sclerotoni sclerotonum, nấm mốc gây bệnh thối hỏng ở xoài như Colleotrichum gleossproilos Những loài nấm này đã gây nhiều tổn thất cho các loài quả

khác nhau Nhiều loài nấm mốc đã đi vào mô của thực vật thông qua các tổn thương cơ học Bên cạnh các tổn thất về kinh tế, một số loài nấm đã sinh các

độc tố còn gọi là các mycotoxin Holmes, G.J và cộng sự [38] và Droby,S., Hofstein, R [28] cho thấy các mycotoxin thường nhiễm trên các loại rau quả chủ yếu gồm các độc tố của chi Fusarium như Fumonisin, các Trichothecen,

các độc tố của chi Aspegllius như ochratoxin A, các độc tố của chi Penicillium

như Patulin Các độc tố nấm mốc này là nguyên nhân gây các bệnh ngộ độc

cấp tính và mãn tính, một số độc tố có khả năng gây ung thư gan, ung thư thận, ung thư thực quản ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng Thêm vào đó, các loại rau quả thường nhiễm các vi khuẩn gây bệnh, virus và kí sinh trùng và là nguyên nhân của các vụ bùng phát các dịch bệnh nguy hiểm Để giảm sự thối hỏng và hạn chế tác dụng có hại cho sức khoẻ của con người, việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật đối kháng có khả năng ức chế các vi khuẩn và nấm mốc gây bệnh nói trên đã được Bộ nông nghiệp Mỹ, cộng đồng Châu âu và các nước như Nhật, Canada.v.v… nghiên cứu và ứng dụng Hai sản phẩm sinh học là Aspire của hãng Ecogen, Langhorn, USA chứa nấm men

đối kháng Candida oleophila I-182 và chế phẩm Bio-Save 110 của hãng Eco

Scinse, Worcestes, USA chứa vi khuẩn đối kháng Pseudomonas syringae hiện

nay đã được đăng kí chất lượng và công nhận là chế phẩm sinh học an toàn cho bảo quản sau thu hoạch đối với một số loại quả như táo, đào, cam, quýt ở

Mỹ Patino-Vera M và cộng sự [49] đã nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn

và nấm mốc Colleotrichum gleosporoinos gây bệnh hại xoài bằng nấm men

Rhodotorula minuta và đã nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất chế

phẩm nấm men này trên môi trường rẻ tiền ở qui mo pilot, vì vậy việc sử dụng chế phẩm nấm men Rhodotorula minuta để bảo quản xoài có giá thành hạ

thấp tương đương với các chất diệt nấm hoá học

Okingli R.N và cộng sự (2005) đã cho thấy vi khuẩn Baccillus subtilis

đối kháng có khả năng ngăn chặn sự nảy mầm của một số nấm gây thối Chế phẩm Baccillus subtilis đối kháng đã đựợc triển khai ở một số nước đang phát

triển để phòng chống một số bệnh ở quả trong bảo quản Russo và cộng sự (2002) đã nghiên cứu khả năng phòng chống sinh học của Pseudomonas fluorescence biến đổi di truyền nhằm nâng cao các hoạt chất kháng nấm của

chúng bằng việc dùng các polimer alginate để phòng bệnh thối rễ ở củ cải

đường Ibazza-Sancher và cộng sự đã khảo sát tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh trên cà chua bằng axit lactic Kết quả cho thấy sau khi phun axit lactic vi khuẩn gây bệnh đường ruột Salmonella typhumurium và E.Coli tup 0157 : H7

đã không phát hiện thấy trong mẫu cà chua xử lí, và axit lactic đã được đề nghị để thay thế cho chlorin trong vệ sinh quả

ở Việt Nam, việc nghiên cứu các biện pháp bảo quản bằng phương pháp sinh học còn rất mới mẻ Trong những năm vừa qua, PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự phòng vi sinh Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công Nghệ Sau Thu Hoạch đã bước đầu nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên một số loại quả đặc sản Kết quả nghiên cứu sơ bộ cho thấy, các loài

Aspergillus và Rpizopus là những loài nấm mốc chính nhiễm trên thanh long,

nấm Fusarium và Penicillium là những loài nấm mốc chính gây thối hỏng ở

quả vải Tại đây đã bước đầu phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis đối kháng có khả năng ức chế sự phát triển của các nấm Fusarium và Penicilium gây thối hỏng quả vải Một số chủng nấm men thuộc chi Candida

cũng đã được phân lập và tiến hành xác định khả năng đối kháng với các nấm

Aspergillus gây bệnh trên thanh long Tuy nhiên hoạt tính đối kháng của các

chủng phân lập được còn rất thấp và chưa ổn định

1.2 Giới thiệu chung về quả cam

1.2.1 Sản lượng cam ở nước ta

Năm 2000, diện tích quả có múi (cam, chanh, quýt, bưởi) là 68.614 ha chiếm 12,3% diện tích rau quả ở nước ta, năng suất trung bình là 9,1 tấn/ha, một số vùng cho năng suất cao lên đến 40 tấn/ha Cam ở nước ta gồm cam sành (vỏ dầy) và cam chanh (vỏ mỏng) ở miền Bắc năm 2006, sản lượng lớn tập trung ở Hà Giang 24.000 tấn cam sành, Nghệ An 11.000 tấn cam chanh(cam Xã Đoài, Vân Du, Sông Kon) tập trung chủ yếu tại Nông trường 19/5 chiếm 40-50% sản lượng, Hoà Bình 4000 tấn (cam Xã Đoài) tập trung chủ yếu ở Nông trường Cao Phong [15] Mặc dù có sản lượng lớn và giá trị kinh tế cao nhưng cam hiện nay chưa bảo quản đúng kỹ thuật dẫn đến tổn thất cao, chất lượng suy giảm, tiêu thụ khó hiệu quả sản xuất chưa cao Tổn thất sau thu hoạch cam đang rất cao 15-30% [5555],do đó tìm được biện pháp bảo quản có hiệu quả tốt nhất là việc rất cần thiết

1.2.2 Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của quả cam

Lượng nước phân bố không đều trong các mô Nước trong mô chiếm ít hơn trong nhu mô ở cam quýt, hàm lượng nước trong vỏ chiếm 74,7%, còn trong múi chiếm tới 87,2%

* Các hợp chất Gluxit (cacbonhydrat)

Gluxit là hợp phần chủ yếu của các chất khô trong quả, chúng vừa là vật liệu xây dựng vừa là thành phần tham gia chính vào các quá trình trao đổi chất Gluxit là nguồn dự trữ để cung cấp năng lượng cho các quá trình sống của quả tươi khi tồn trữ Gluxit của quả chủ yếu là các thành phần đường dễ tiêu hoá như glucoza, fructoza và sacaroza nên được cơ thể hấp thụ nhanh và triệt để

Đường

Đường là thành phần dinh dưỡng quan trọng và là một trong những yếu

tố cảm quan hấp dẫn người tiêu dùng đối với các loại quả tươi Đường chủ yếu tồn tại dưới dạng glucoza, fructoza và sacaroza

Hàm lượng và thành phần đường trong quả cam (g/100g quả tươi) như sau: [12]

Đường tổng số : 8

Glucoza : 2

Fructoza : 2

Sacaroza : 4

Xenluloza, Hemixenluloza, các chất pectin và lignin

Xenluloza, hemixenluloza, các chất pectin và lignin là cacbonhydrat liên kết với nhau, cấu trúc nên thành phần tế bào Trong quá trình chín, các cacbonhydrat này bị thuỷ phân và sẽ làm trái cây mềm

- Xenluloza và hemixenluloza chủ yếu nằm ở các bộ phận bảo vệ như

vỏ quả, vỏ hạt Trong các loại quả xenluloza và hemixenluloza chiếm khoảng 0,5 – 2%

- Các chất pectin cấu tạo từ các axit polygalacturonic, tồn tại chủ yếu trong thành tế bào Trong vỏ trái cây, pectin chiếm khoảng 1 – 1,5% Pectin thường tồn tại dưới 2 dạng:

+ Dạng không hoà tan còn gọi là protopectin có trong thành tế bào + Dạng hoà tan (axit polygalacturonic) có trong dịch bào

Trong quá trình chín, các protopectin dưới tác dụng của enzym polygalacturonaza sẽ bị thuỷ phân thành đường, rượu etylic và pectin hoà tan làm cho quả trở nên mềm

Axit hữu cơ có trong rau quả dưới dạng tự do, dạng muối và este Một

số axit hữu cơ bay hơi và liên kết với rượu tự do tạo ra este có mùi thơm

Độ axit chung của quả (hàm lượng phần trăm của các axit và muối axit tính theo axit chính của nguyên liệu) thường không quá 1% Độ axit không chỉ phụ thuộc vào từng loại quả mà còn theo giống, độ chín và nơi trồng

Bảng 1.1: Độ axit của một số giống cam [12]

Trong quả có nhiều loại axit nhưng mỗi loại quả chỉ có 1 -2 axit chính Axit chủ yếu của họ citrus là axit xitric

* Vitamin và khoáng chất

ở cam hàm lượng vitamin C chiếm từ 40-90mg/100g quả tươi Vitamin

C (axit ascorbic) có tác dụng chống lại bệnh thiếu máu ở người, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể

Chất khoáng chủ yếu trong rau quả là kali, khoảng 200mg/100g quả tươi Ngoài ra trong rau quả có nhiều sắt và canxi nhưng thường tồn tại dưới các dạng mà cơ thể con người khó hấp thụ

* Hợp chất bay hơi

Các hợp chất bay hơi là những hợp chất có hàm lượng không đáng kể so với khối lượng rau quả nhưng lại có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo hương thơm

đặc trưng cho quả Ví dụ như este octilaxetat cho mùi cam

Caroten tạo màu da cam có trong các loại quả họ citrus, đào và nhất

là gấc (500mg%) Caroten là tiền vitamin A, khi vào cơ thể sẽ thuỷ phân thành vitamin A

Licopin là một đồng phân của caroten, tạo màu đỏ

Xantofin là sản phẩm oxi hoá caroten, tạo màu vàng rực rỡ của lá mùa thu Khi quả chín thì hàm lượng xantofin tăng nhanh làm cho quả có màu đỏ tươi

Antoxian

Đó là sắc tố làm cho rau quả có nhiều màu sắc khác nhau từ đỏ đến tím

Chất màu flavon

Đó là nhóm chất màu glucozit, làm cho quả có màu vàng da cam

1.2.3 Các quá trình biến đổi xảy ra trong quả tươi khi tồn trữ

Trong quá trình tồn trữ rau quả tươi, các biến đổi về vật lý, sinh lý và sinh hoá vẫn tiếp tục xảy ra

1.2.3.1 Các quá trình vật lý

* Sự bay hơi nước

Sự bay hơi nước tuỳ thuộc vào mức độ háo nước của hệ keo trong tế bào, cấu tạo và trạng thái của mô bao che (chiều dày và độ chắc chắn của vỏ, của lớp sáp, lớp phấn ngoài vỏ.v.v ), đặc điểm và mức độ bị dập cơ học, độ

ẩm và nhiệt độ của môi trường xung quanh, độ chín của quả.v.v

Sự mất nước thay đổi trong quá trình tồn trữ Giai đoạn đầu (sau khi thu hái) mất nước mạnh, giai đoạn giữa giảm đi, và cuối cùng khi chín hay khi bắt

đầu hư hỏng lại tăng lên Sự quá chín của trái cây cũng kèm theo sự tăng lượng ẩm thoát ra, vì đó là quá trình lão hoá của các hệ keo, làm giảm tính háo nước

Trong thực tế tồn trữ, để làm giảm sự mất nước của rau quả, người ta thường áp dụng các biện pháp sau: hạ thấp nhiệt độ, tăng độ ẩm và giảm tốc

độ chuyển động của không khí trong kho bảo quản Người ta còn dùng cách xếp quả tươi vào trong hầm đất, vùi trong cát, đựng trong túi polyetylen, gói trong giấy hoặc bọc sáp Tuy nhiên, các biện pháp này có thể làm ảnh hưởng

đến hô hấp của quả Hô hấp yếm khí, độ ẩm cao ở mức độ nhất định lại là

nguyên nhân gây ra hư hỏng cho quả tươi: tế bào quả bị chết, vi khuẩn gây thối và nấm mốc dễ dàng phát triển

* Sự giảm khối lượng tự nhiên

Sự giảm khối lượng tự nhiên là sự giảm khối lượng của quả do bay hơi nước và tổn hao các chất hữu cơ trong khi hô hấp

Khối lượng quả giảm đi trong thời gian tồn trữ dài ngày phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại giống, vùng khí hậu, cách thức chăm sóc, bón phân, mùa, công nghệ tồn trữ, thời gian tồn trữ và mức độ nguyên vẹn cũng như độ chín của quả

1.2.3.2 Một số biến đổi hoá sinh trong quá trình hô hấp

* Thay đổi hương vị

Hương vị là quan hệ giữa hai dặc tính vị và mùi Trong quả, đóng góp cho vị tự nhiên là đường và axít hữu cơ, ngoài ra còn phenolic và tanin Tuy nhiên, quả có đặc tính và hương riêng, phụ thuộc vào sự tác động qua lại giữa

đường, axít hữu cơ, phenolic và các thành phần mùi riêng tạo bởi các chất dễ bay hơi

• Đường và axít hữu cơ

Đường và axít hữu cơ là nguyên liệu của quá trình hô hấp Quả tiếp tục tích luỹ đường trong quá trình chín Trong vài trường hợp (dâu tây và nho)

đường góp phần lớn cho tạo hương Một số quả chín thu hoạch xanh, trong quá trình chín vẫn có khả năng tạo hương đầy đủ Nói chung, axít hữu cơ (malic, citric, oxalic ) giảm trong quá trình chín vì nó là nguyên liệu cho hô

hấp [55], amino axít ( leucine và valine) của chuối tăng đột biến trong quá trình góp phần tạo hương, axít béo cũng bị chuyển hoá thành estes Đường trong quả tăng nhưng chỉ một lượng rất nhỏ[55], do tinh bột chuyển hoá thành Tinh bột chuyển hoá thành glucose, fructose hoặc sucrose nhờ một số enzim chính như α-amilase, β-amilase và phosphorylase Các enzim này có hoạt tình tăng trong quá trình chín [55], tuy nhiên chưa biết rõ cơ chế cho từng loại tinh bột cụ thể của các loại quả Tinh bột chuyển hoá thành sản phẩm cuối cùng là glucose-l-photsphate, nó có thể biến đổi thành glucose-6-photsphate bởi hexokinase hoặc glucose photsphate mutase tương ứng, quá trình này xẩy ra hầu như ở cytoplasm

Mặc dù phenolic trong quả rất thấp, nó có* nghĩa trong việc xác định chất lượng quả, vài thành phần phenolic có thể tách ra được ở dạng phenylalaneni với axít cinamic và coumaric Nhóm enzim quan trọng để chuyển hoá phenolic là polyphenolõydaxe (PPO) ở hai dạng là catechol oxidaxe và laccase phân giải o-diphenol và p-diphenol tương ứng và đựoc phân loại dưới chung là monophenol monoxygenase Hoạt động của PPO là yếu tố quan trọng để xác định chất lượng các sản phẩm chế biến hoa quả và làm nâu hoá mô quả và dịch ép Tuy vậy, các enzim hoạt đọng trong qúa trình chín là chưa rõ, chưa có nhiều nghiên cứu

Tanin là thành phần của phenolic hoà tan trong nước, có trọng lượng phân tử 500 – 3000, có đặc tính đặc biệt như khả năng kết tủa alkaloid và protein [55] Tanin có khả năng gắn kết với protein làm hạn chế hoạt động của các enzim, có tác động qua lại với sự chảy nước protein và glycopotein của chuối, khả năng polyme hoá tanin cao trong quá trình chín để tạo hương vị tốt hơn [55]

• Các hợp chất dễ bay hơi

Mỗi loại quả khác nhau có thành phần hương không giống nhau Tuy nhiên, thành phần quan trọng để xác định hương quả chính là nhóm Ethanol,

Acetandehyde, Ethylacetate, Linanol, Geraniol, Limonene, Limonin và nhiều nhóm hoá học khác (Nursten, 1970-) Các chất dễ bay hơi chiếm tỷ lệ rất thấp (khoảng vài phần triệu) và thường là một tỷ lệ nhất định, nhưng có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo cho mùi đặc trưng của từng loại quả Thí dụ, phân tích mùi của táo và cam chỉ ra ít nhất 230 và 330 thành phần khác nhau tương ứng [55] Sự tổng hợp các chất bay hơi ở một số quả không làm tổn hại tới quả, số khác chỉ khi mô quả bị dập nát Con đường tổng hợp chính có thể

là hoạt động của Liposygenaza đến màng/ hạt lipid ở chỗ dập nát của mô Khó xác định đựơc chính xác thành phần chất bay hơi ảnh hưởng đến hương vị và mùi của quả, đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhưng chỉ mới có táo, cam và cà chua [55]

*Thay đổi màu sắc

Không hẳn tất cả các loại quả thay đổi màu sắc trong quá trình chín (thí dụ nhiều giống táo, lê màu xanh), hầu hết các loại quả đều thay đổi màu sắc trong quá trình chín ở tất cả các tổ chức quả Thay đổi màu, có thể thay

đổi chlorophyyll, β-carotene ở hầu hết các loại quả mất màu xanh đi cùng với tổng hợp chất mang mầu khác như thường là anthocyanin hoặc carotenoid, nhưng việc mất mầu chlorophyll và tổng hợp mầu khác trong quá trình chín là không có quan hệ phụ thuộc nhau Cuối giai đoạn chín, quả sẽ chuyển sang mầu sẫm hơn (nâu hoá)

• Phân huỷ chlorophyll

Chưa rõ cơ chế chính xác phân huỷ chlorophyll, nhưng có thể liên quan

đến cả enzim và phản ứng hoá học Chlorophill được giữ trong màng thylakoid bên trong chloroplast, bước đầu tiên chlorophill dường như “tan hoá” thành chất đệm mang enzim có khả năng tấn công màng thylakoid hoặc trực tiếp chlorophill, nhưng cơ chế chưa rõ Hoặc chlorophill có thể tan, bị oxy hoá tạo thành mất màu và snả phẩm chlorin

• Anthocyanin (thuộc nhóm flavonoit)

Anthocyanin là rất nhiều chất mang màu nằm ở bên trong không bào của tế bào [55] Nó có màu từ đỏ đến xanh da trời ở riêng các loại quả khác nhau Thí dụ : cam biết khoảng 30 loại anthocyanin màu khác nhau Một loại anthocianin nữa là cianidin-3-galactoside là màu chính của táo, mận Một loại anthocianin nữa là dẫn xuất của flavenoid (thành phần mầu vàng nhạt) và

được tổng hợp từ amino axít phenylalanine bằng con đường hoá học với hai enzim chủ yếu là phenylalanine ammonia lyase và flavanone synthase

Carotenoid thường được tổng hợp ở mô màu xanh, sản phẩm chính là carotene, tuy nhiên licopene cũng được tổng hợp trong quá trình chín Sự tích luỹ licopene trong quá trình chín có thể hạn chế sự tổng hợp β-carotene và lycopene mới Đối với cà chua ở nhiệt độ cao30-350C, mặc dù hạn chế tổng hợp licopene, nhưng cũng không có β-carotene nào được hình thành [55] Quan sát quá trình tổng hợp licopene thấy rằng axít mevalovic là trung tâm để tạo ra nhiều thành phần khác nhau như abscisic và gibberellin – nó là bản chất của quá trình chín

β-* Thay đổi trạng thái

Hầu hết quả mềm đi trong quá trình chín, có thể do một hoặc ba nguyên nhân: i/mất nước, ii/phân huỷ tinh bột, iii/phân huỷ thành tế bào Mất nước 5-10% so với khối lượng rau quả ảnh hưởng ít đến quá trình sinh hoá bên trong quả, nhưng có ảnh hưởng lớn đến chất lượng thương mại Sự thay đổi tinh bột làm thay đổi trạng thái rau quả đặc biệt đối với các loại rau quả có hàm lượng

tinh bột cao (như chuối) Thành tế bào chứa 90-95% cacbonhydrate polime (cellulose, hemicellulose, pectin) là thành phần cấu trúc của thành tế bào, trong đó 5-10% hydroxyproline-rich glycoprotein

Thay đổi cấu trúc thành tế bào được quan sát bằng kính hiển vi điện tử với bơ, lê, cà chua Sự thay đổi này bao gồm tăng pectin hoà tan, tổn hao

đường trung tính, đường galactose chiếm ưu thế Mức đường bình thường trợ giúp cho tỷ lệ cellulose và hemicellulose không đổi trong quá trình chín của

cà chua, tuy nhiên cà chua có nguy cơ giảm mức độ polime hoá của hemicellulose [55], hạn chế mất polime hoá cũng chưa đủ để chống lại sự mềm hoá

ít có các nghiên cứu về thành tế bào protein, nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của enzim đến thay đổi thành tế bào trong quá trình quả chín, nhưng nói chung chưa hoàn chỉnh [55], đó là pectinesterase khử nhóm methyn ở vị trí C-6 của axit galacturonic, nó giảm hoạt tính trong quá trình chín; polygalacturonase thuỷ phân liên kết α(1-4) của axit galacturonic, không có trong quả xanh; β-(1-4) glucolase hoặc cellulase là phổ biến nhưng trong vài loại quả không thấy; β-galactosidase trong một vài trường hợp tấn công polime galactan, hoạt tính tăng trong quá trình chín

1.2.3.3 Hệ vi sinh vật trên quả

Rau quả có tương đối đủ các chất dinh dưỡng, vì vậy chúng cũng chính

là môi trường thuật lợi cho nhiều vi sinh vật phát triển

Trên bề mặt quả có một số vi sinh vật với số lượng nhiều ít khác nhau Chúng rơi vào từ đất, không khí, đồ đựng ở các dạng bào tử hoặc tế bào sinh dưỡng Phần lớn các vi sinh vật ở đây là vi khuẩn, nấm mốc, những nấm men sống ký sinh cùng với cây trồng hoặc có ở trong đất hay gió thổi tới, đặc biệt là các quả chín có nhiều nấm nem ở bề mặt

Những vi sinh vật gây thối hỏng quả thường do gió mang tới hoặc qua tay người, các dụng cụ làm vườn Hoa quả tươi và lành lặn thì chỉ có bề mặt

là nhiễm tạp khuẩn, còn bên trong thường vô trùng Trong quá trình vận chuyển và bảo quản, các vi sinh vật xâm nhập vào bên trong và gây ra hư hỏng Nguyên nhân gây ra hư hỏng này là do sự hoạt động chủ yếu của nấm mốc và vi khuẩn ở cam thường xuất hiện các loài nấm mốc thuộc chi

1.3 Một số dạng hư hỏng và các bệnh thường gặp ở cam do vi sinh vật gây ra

1.3.1 Nguyên nhân gây hư hỏng quả trong quá trình bảo quản

Phần lớn các trường hợp hư hỏng quả là do nấm mốc, sự hư hỏng bắt

đầu từ những quả chín, dập nát Trong quá trình chín, đặc biệt là khi thu hoạch, vỏ quả dễ bị dập vỡ tạo điều kiện thuận lợi cho các bào tử nấm thâm nhập vào dịch quả và nẩy mầm ở đó Các sợi nấm đâm xuyên làm hỏng thịt quả Ngoài ra, nhiều nấm mốc tiết ra enzym xenlulaza, phân huỷ xenluloza thành xenlulobioza Kết quả là thành tế bào của quả bị phá hoại, tạo điều kiện cho nấm hiếu khí phát triển tốt trong nước quả giàu dinh dưỡng và gây hư hỏng trầm trọng hơn Sau đó sợi nấm mọc một phần ra ngoài vỏ quả và tạo thành các bào tử, rồi gây nhiễm rộng hơn nữa Nhiều nấm mốc có hoạt tính

pectinaza, phân huỷ các chất pectin làm cho các tế bào và các mô mất tính liên kết, quả bị xốp và hỏng

Trong quá trình dinh dưỡng và hô hấp của nấm mốc, các loại đường bị oxy hoá thành các axit hữu cơ (axit xuccinic, axit malic, axit acetic, axit nitric ), làm cho độ axit trong quả cao lên, một phần đường bị lên men rượu Sau đó các nấm mốc lại oxy hoá các axit hữu cơ, rượu làm cho độ axit trong dịch quả giảm và tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn phát triển Kết quả là quả bị hư hỏng và mất giá trị dinh dưỡng Nấm mốc phát triển trên bề mặt và bên trong quả gây ra những đốm nâu thâm Sự xuất hiện những đốm này có liên quan đến sự oxy hoá chất tannin trong quả của enzym do nấm mốc tiết ra, tạo thành chất flobafen có màu nâu xám

Đôi khi sự hư hỏng là do nấm nem gây ra, điển hình ở đây là khi quả chín, bị nhiễm vi sinh vật, lượng đường trong quả sẽ bị lên men thành rượu và

CO2 Thường thường mùi rượu có lẫn mùi chua ở quả hư hỏng là do vi khuẩn acetic phát triển, tiếp theo đó là chuyển hoá rượu thành axit acetic Có một số trường hợp vi khuẩn là tác nhân đầu tiên gây nên sự hư hỏng quả

1.3.2 Một số bệnh thường gặp trong quá trình bảo quản cam [55]

* Thối nâu

Bệnh do một số loại nấm như Monilia fructigena gây ra làm cho cam bị

thối rữa Nấm này có hệ sợi đơn bào phân nhánh, cuống sinh bào tử có ngăn

và đính bào tử có dạng hình quả chanh Nấm phát triển làm cho quả có đốm màu nâu xám rồi chuyển sang màu nâu Dưới những đốm này thịt quả trở nên xốp và có màu nâu

* Thối xám

Nhiều loại quả, trong đó có họ cam, chanh bị bệnh này Tác nhân gây bệnh là nấm Monilia cinerea (ở giai đoạn sinh túi có tên là Stromatinia cinerea) Sợi nấm mọc theo các mô quả và ở các nhánh cây Các đính bào tử

có mầu xám, vì vậy khi quả có nấm này mọc gây thối, hỏng quả gọi là thối xám

* Thối hồng

Do nấm Gloeosporium fructigena gây ra, làm cam hỏng và có vị đắng

Khi phát triển trên quả ta thấy những đốm tròn màu hồng Cộng sinh với loại nấm này còn có nấm mốc xanh Penicillium glaucum, mốc hồng Trichothecium rosanii

* Bệnh mốc xanh

Mốc xanh là bệnh hay gặp nhất ở cam sau thu hoạch [44][ 47][ 41] Bệnh gây ra do nhiễm các loài nấm mốc thuộc chi Penicillium như P digitatum, P.expansum, P.ilitatum và những loài nấm mốc thuộc chi Aspegillus như A flavus, A.paraciticus nấm này ưa chuộng môi trường ẩm,

phát triển nhanh chóng ở nhiệt độ 26-28oC Khi xâm nhiễm vào quả ban đầu

là một nốt mềm nhỏ, chảy nước, đường kính khoảng 5-10mm, một ngày sau lan rộng khoảng 2-4cm Những quả nhiễm mốc xanh trở nên mềm và co lại

1.4 Các biện pháp bảo quản Cam

1.4.1 Biện pháp vật lý

* Bảo quản lạnh[12]

Bảo quản lạnh là phương pháp bảo quản cam tươi vừa xưa nhất, vừa phổ biến nhất Cam sau khi thu hái được đưa vào kho lạnh để giảm cường độ hô hấp và sự bốc hơi Cần loại bỏ các cá thể bị sây sát, hư giập và cần phân loại theo độ chín

Nguyên liệu nhập kho không kéo dài quá 2 ngày/phòng kho Nếu cam thu hoạch vào thời kỳ nóng thì trước khi nhập vào phòng tồn trữ cần làm mát ở hành lang kho lạnh hoặc ở phòng làm mát sơ bộ Khi chuyển cam từ phòng lạnh ra cũng cần qua giai đoạn nâng nhiệt từ từ Với các loại cam khác nhau thì chế độ bảo quản lạnh là khác nhau đối với cam chanh và cam đường thì

chế độ bảo quản lạnh là: 2-4oC, độ ẩm tương đối: 85-90%, thời hạn tồn trữ:

4-5 tháng (đối với cam chanh) và 16-18 tuần (đối với cam đường)

* Phương pháp chiếu xạ[12]

Những kết quả nghiên cứu về khả năng ứng dụng bức xạ các chất đồng

vị phóng xạ trong công nghệ thực phẩm, đặc biệt là để bảo quản đã có từ gần

50 năm nay nhưng ở thời gian đầu không được triển khai trong thương mại do các đồng vị phóng xạ đắt và hiếm, và do người tiêu dùng e ngại Nhưng đến năm 1991 đã có 37 nước trên thế giới cho phép chiếu xạ khoảng 40 loại thực phẩm từ hạt, gia vị, rau quả tươi cho đến thịt, trong đó có 24 nước đã thương mại hoá phương pháp ứng dụng này như: Mỹ, Liên Xô (cũ), Canada, Anh, Pháp, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, ấn Độ …

Tia bức xạ có thể làm mất khả năng tích tụ ATP, thậm chí phá vỡ liên kết ATP, giảm hoạt độ của enzym tổng hợp ARN và AND – là những yếu tố sinh năng lượng và nhân tố sinh sản trong phát triển tế bào

Tác dụng tiêu diệt vi sinh vật của tia ion hoá không xảy ra ngay lúc chiếu xạ mà là sau vài giờ đến vài ngày Tác dụng này càng mạnh khi có oxi

và độ ẩm cao Nhiệt độ tăng làm giảm tính bền của bức xạ vì khi ấy tốc độ hình thành các ion và các phản ứng hoá học xảy ra càng nhanh

Tác dụng không tốt của tia bức xạ đối với quả tươi là làm giảm sức đề kháng của nó, vì các nguyên nhân sau:

- Làm giảm khả năng tạo màng bảo vệ (da non) ở các vết thương

- Làm mềm quả vì chia cắt mạch xenluloza và protopectin

- Làm tăng độ thẩm thấu của tế bào, do vậy đẩy mạnh quá trình trao đổi chất, làm các thành phần dinh dưỡng bị hao tổn

- Phá hoại một số cân bằng trao đổi chất, chủ yếu là trao đổi năng lượng, do đó hạn chế sự oxi hoá làm cho khả năng tự đề kháng của quả đối với

vi sinh vật giảm

- Hình thái tế bào dài ra, có chỗ phình ra, có chỗ teo lại

Nguồn sản sinh các tia phóng xạ thường là Co60 và Cs137

* Biện pháp bảo quản bằng bao gói khí điều biến (MAP) và trong khí quyển kiểm soát (CA)

Bảo quản MAP được định nghĩa là sự thay đổi nồng độ chất khí và độ

ẩm trong môi trường xung quanh các sản phẩm tươi do sự hô hấp và sự thoát hơi nước khi các sản phẩm tươi được gói kín trong màng chất dẻo [52] Túi LDPE thường được sử dụng để bao gói các sản phẩm tươi Độ thấm khí và hơi nước của màng chất dẻo khác nhau phụ thuộc vào loại, độ dày của màng được

sử dụng Sự thay đổi các khí này có thể có lợi nhưng cũng có thể có hại

Bảo quản trong khí quyển kiểm soát là sự thay đổi các thành phần khí nhằm ức chế tối đa các hoạt động sinh lý sau thu hoạch bất lợi cho việc bảo quản rau quả, ức chế hoạt động và sinh trưởng của vi sinh vật gây hư hỏng rau quả Bảo quản khí quyển điều chỉnh CA được sử dụng để kéo dài sự sống của các sản phẩm rau quả dễ bị thối hỏng theo thời vụ Công nghệ này có thể được

sử dụng cho một vài loại quả và rau sạch và trước đây nó đã trở thành nguyên

lý của phương pháp bảo quản cho các vụ táo trên thế giới [59]

1.4.2 Biện pháp hoá học

* Sử dụng thuốc diệt nấm

Hiện nay để ngăn chặn có hiệu quả đối với nấm mốc, người ta đang sử dụng kết hợp các thuốc diệt nấm nguồn gốc hoá học, có thương hiệu như IMZ, TBZ (Thiabendazole) và SOPP (Sodium orthophenylphenate)

Trong bảo quản, đầu tiên người ta sử dụng TBZ trong một thời gian dài, sau đó đưa IMZ vào thì hiệu quả sử dụng thuốc rất cao Orthophenylphenate

có thể được sử dụng một mình hoặc trong hỗn hợp không có sodium (OPP) trộn với TBZ tạo ra thuốc kháng nấm cho hiệu quả cao với những chủng kháng thuốc (Arras và Chessa, 1982; Dave và cộng sự, 1990) Các chất kháng nấm này bảo vệ các sản phẩm nông sản trực tiếp tiêu diệt các bào tử nấm và

các hệ nấm sợi trên bề mặt quả Nếu quả bị nhiễm từ cây và hệ sợi nấm đã xâm nhập vào bên trong thì thuốc kháng nấm có hiệu quả thấp

Bảng 1.2: Hiệu quả diệt hệ sợi nấm ký sinh khi có bào tử

trên vỏ ngoài quả cam[29]

Ghi chú:

+ : Hiệu quả diệt nấm không như mong muốn

+ + : Hiệu quả diệt nấm tốt

+ + + : Hiệu quả diệt nấm rất tốt

Các thuốc diệt nấm có nguồn gốc hoá học đã mang lại nhiều kết quả lớn nhưng bên cạnh đó nhiều nghiên cứu đã chỉ ra những tác hại cũng như hậu quả dùng thuốc trong một thời gian dài Nó có ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ cũng như môi trường sống và canh tác của con người Mặt khác, sử dụng thuốc không đúng liều lượng có thể tạo ra tính kháng thuốc ở vi sinh vật, gây thảm hoạ bệnh dịch trên diện rộng…

* Sử dụng các hoá chất hấp phụ Etylen

Etylen là chất khí được hình thành tự nhiên trong quá trình bảo quản quả Sự hình thành chất khí này có tác động kích thích sự chín của quả, làm quả chín nhanh hơn dẫn đến rút ngắn thời gian bảo quản quả Đây cũng chính

là trở ngại cho việc bảo quản và mở rộng thị trường tới những vùng xa nơi sản xuất Ngoài tác động thúc đẩy quá trình chín nhanh, etylen còn làm tăng cường độ hô hấp, làm giảm thời gian bảo quản Khi etylen đã được hình thành

ra ngoài môi trường thì việc sử dụng các chất kìm hãm quá trình tổng hợp etylen hay ngăn cản sự hoạt động của etylen nội sinh sẽ không còn tác dụng Lúc này muốn làm giảm tác động xấu của etylen thì biện pháp duy nhất là dùng các chất hấp thụ etylen Các chất hấp thụ etylen sẽ phản ứng ngay với etylen và phân huỷ etylen trước khi etylen kịp gây ra những tác động tiêu cực của mình do hạn chế được những tác động sinh lý có hại của etylen tới rau quả

Các chất làm giảm phản ứng sinh tổng hợp etylen như khí CO2, AOA

và AVG (Vinylglycine L-2-amino-4-alkoxy-trans-3 butenoic axit), cacbonyleyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) Cơ sở khoa học là ức chế các hệ enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp etylen, ngăn chặn sự biến chuyển cACC (1- amimocyclopropane-1-cacboxilic axit) thành etylen hoặc ngăn chặn sự chuyển hoá AdoMet thành ACC, hoặc tạo sự liên kết AACC thành N- Malonyl ACC (MACC) nhờ xúc tác bởi ACC malonyltransferase

Gần đây các nhà khoa học Mỹ (Sylvia.B.2003, Mattheis.j) đã phát hiện

ra các chất ức chế etylen như các ion kim loại, 1- methylcyclopropan MCP), Diaxocyclopentadien (PACP) và các chất khử etylen như Ozon, KMnO4… làm giảm lượng etylen ngoại sinh do hình thành phức dietylen, oxy hoá etylen và ức chế hệ enzym Sự biến đổi độ cứng của quả trong quá trình chín và ức chế etylen ở quả được xử lý bằng 1- methylcyopropan đã được Donald Huber (2001) nghiên cứu

(1-Để hạn chế các ảnh hưởng gây hại của etylen cho quả, trên thế giới đã nghiên cứu sản xuất một số chất hấp phụ etylen như: Recadar của Tây Ban Nha, Retain- kim loại hoạt hoá bề mặt của Mỹ Các chất này được triển khai trong thực tế trên một số đối tượng quả và cũng đã thu được một số kết quả khả quan Tuy nhiên nghiên cứu về kỹ thuật tạo ra các sản phẩm này là bí

quyết công nghệ của các nước này và không có những công trình công bố, chỉ tồn tại các nghiên cứu đề cập đến một số chất riêng biệt có khả năng làm giảm quá trình tổng hợp etylen nội sinh, hấp phụ và khử etylen ngoại sinh

1.4.3 Biện pháp sinh học

Trong những năm gần đây, các báo cáo khoa học, các nghiên cứu mới

đều đưa ra lời cảnh báo về chất bảo quản, cũng như các bệnh trên thực phẩm

đối với sức khoẻ con người, đối với hệ sinh thái chung trên toàn cầu Nhằm hướng tới những phương pháp bảo quản an toàn cho thực phẩm, cho con người

và cho môi trường sống nhiều nghiên cứu đã đi vào ứng dụng thực tế đối với

phương pháp sinh học an toàn

* Bảo quản quả bằng màng bao ăn được [62],[ 56],[ 45],[ 34],[31]

Gần đây, các màng bao có thể ăn được (edible coating film) đã được các nước phát triển dùng trong bảo quản quả tươi Các màng bao ăn được gồm các composit sinh học không độc hại có tác dụng ngăn không cho hơi nước từ quả thoát ra, không cho oxy bên ngoài đi vào trong quả, từ đó hạn chế sự hô hấp của quả, kéo dài thời gian bảo quản quả Ngoài ra, trong thành phần của các màng bao còn có các chất ức chế nấm mốc trên quả Thông thường người

ta sử dụng các chất diệt nấm như carbenazim, Thiabendazole, Sodium orthophenylphenate hoặc các axit hữu cơ không độc hại như axit lactic, axit acetic để bổ sung vào màng bao ăn được trong bảo quản quả

Trong quá trình bảo quản quả tươi vẫn diễn ra các quá trình thoát hơi nước và hô hấp Các quá trình này làm cho quả nhanh chín, làm giảm chất lượng và không thể bảo quản lâu dài Dựa vào thực tế này mà gần đây phương pháp bảo quản quả bằng màng composit sinh học đã được phát triển và ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Anh, Thuỵ Điển, Nhật Bản, Trung Quốc Màng composit sinh học có khả năng hạn chế sự thoát hơi nước và làm giảm sự trao đổi khí nên duy trì được chất lượng của quả lâu hơn Màng composit sinh học bao quanh quả tươi sẽ tạo ra một lớp ngăn cản sự thoát hơi

nước và làm giảm sự trao đổi khí (chủ yếu là khí O2 và khí CO2) của quả được bọc Như vậy, lớp màng này tạo ra sự khác biệt khí quyển giữa phần bên ngoài (môi trường bảo quản) với phần bên trong quả bảo quản, làm giảm lượng oxi bên trong quả, do đó làm chậm quá trình chín của quả tươi Màng composit sinh học còn điều chỉnh quá trình trao đổi khí của quả bảo quản Hơn nữa, nó

có thể bảo vệ, làm giảm những hư hỏng do va chạm trong quá trình vận chuyển Màng bọc sẽ phát huy được khả năng điều khiển quá trình phân huỷ nếu trong quá trình tạo màng ta thêm vào đó các phụ gia như chất điều hoà sinh trưởng, chất chống lão hoá, chất bảo vệ tổn thương do nhiệt và phối hợp với việc sử dụng nấm Candida oleophila như là tác nhân diệt nấm sinh học

Các loại màng bọc sinh học khác nhau đã được thử nghiệm bảo quản các loại quả nhiệt đới và một số loại màng bọc đã được thương mại hoá (Somers E.B, USA, 2004)

Key E và cộng sự (2002)[40] cho thấy tuỳ theo từng loại quả cụ thể và tuỳ vào những đặc tính lý hoá của các loại màng bọc mà chúng ta chọn lấy loại màng bọc phù hợp nhất cho loại quả bảo quản Các tác giả đã kết luận rằng mỗi loại quả khác nhau sẽ xảy ra những quá trình thoát hơi nước khác nhau, nhưng quá trình thoát hơi nước chủ yếu của tất cả các loại quả là thoát qua lớp biểu bì hoặc khí khổng

Các loại màng bọc bằng polysacarit cũng được phát triển nhưng ban

đầu sử dụng chủ yếu cho các sản phẩm quả ở giai đoạn sơ chế Khả năng thẩm thấu CO2 và O2 của màng bọc polysacarit làm chậm quá trình chín của nhiều loại quả nhiệt đới, do đó tăng thời gian bảo quản mà không gây ra sự hô hấp yếm khí làm hỏng quả Trong số các polysacarit sử dụng để tạo màng phổ biến nhất hiện nay trên thế giới là các dẫn xuất là xenluloza như carboxymethylcellulose (CMC), hydroxypropylcellulose (HPC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) Các polyme này là thành phần chính của cấu trúc màng Để tạo nên các tính chất chức năng có lợi cho quá trình bảo quản, người ta phải bổ sung nhiều chất khác nhau như bổ sung thêm các

chất dẫn xuất của axit béo Chất này có tác dụng làm tăng tính kỵ nước của màng, tức là làm giảm quá trình mất nước của quả do bốc hơi nước, bổ sung thêm chất khoáng và vitamin Các chất này có tác dụng ngăn ngừa hiện tượng nâu hoá, mềm hoá Trong những năm gần đây nhiều tác giả như Zhuang RY [66] và cộng sự đã thành công trong nghiên cứu ảnh hưởng của màng bao hydroxylpropyl methylcellulose (HPMC) sinh học lên việc giữ tươi và khả năng bảo quản cà chua Kết quả cho thấy màng bao hydroxylpropyl methylcellulose (HPMC) sinh học đã có thể kéo dài thời gian bảo quản cà chua tươi trong vòng 18 ngày bảo quản

HPMC cũng được Prerez- gago và cộng sự (2002) dùng để bảo quản cam quýt và cho thấy có thể kéo dài thời gian bảo quản trong 1 tháng ở nhiệt

độ thường

Một số vật liệu màng bao polysacarit hoà tan trong nước đã được thương mại trong hơn chục năm qua, chẳng hạn TAL Pro- long, Semperfresh hay gần đây là NatureSealTM Chúng đều có chất nền tạo màng là carboxymethylcellulose (CMC) được bổ sung thêm các phụ gia khác nhau để hạn chế thoát hơi nước

* Bảo quản quả bằng vi sinh vật đối kháng

Bảo quản quả bằng sử dụng các vi sinh vật đối kháng là một trong những phương pháp sinh học rất có hiệu quả, tránh được ngộ độc hoá chất và

ô nhiễm môi trường Trong tự nhiên, nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật khác và chúng thường được gọi là vi sinh vật đối kháng Hiện tượng đối kháng được quan sát ở nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau bao gồm nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn có thể trực tiếp (competition, antibiosis) hoặc không trực tiếp Việc sử dụng hiện tượng

đối kháng này trong công tác bảo quản được gọi là biện pháp bảo quản sinh học bằng vi sinh vật đối kháng Phương pháp này đã được sự quan tâm và đầu tư rất lớn của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới trong nhiều thập kỷ qua [46] Trong quần thể vi sinh vật, mỗi loài đều phải đấu tranh sinh tồn suốt cả

quá trình tiến hóa dưới các hình thức khác nhau và rất linh hoạt Vi sinh vật có thể thay thế các tác nhân cạnh tranh của chúng bằng cách nhân lên với số lượng lớn bằng cạnh tranh về môi trường dinh dưỡng và không gian sống, hoặc có thể hình thành các chất đặc hiệu hay không đặc hiệu trong quá trình chuyển hoá vật chất, nhằm ức chế sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khác Các chất không đặc hiệu có thể là các axít hữu cơ, rượu, enzym, kháng sinh hoặc các hợp chất khác Đặc biệt ở một số loài nấm men, cạnh tranh môi trường dinh dưỡng là cơ chế được sử dụng để loại trừ các tác nhân gây bệnh

do vi sinh vật mà chủ yếu là nấm mốc Những nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ Wilson và cộng sự [63] đã cho thấy nấm men Candida oleophila có

tác dụng ức chế một số loài nấm mốc gây thối hỏng trên quả như Aspergillus niger, A flavus Penicillium digitatum, P.expansum… Nấm Candida oleophila là loài nấm men thường tồn tại tự nhiên trên nhiều loại quả cam, lê,

táo, đào, cà chua… có khả năng ức chế các loài nấm mốc gây thối hỏng các loại quả tươI bằng cơ chế cạnh tranh về nơI cư trú và dinh dưỡng Lợi dụng

đặc tính quý báu này của nấm men Candida oleophila, các nhà khoa học Mỹ

[63] đã nghiên cứu tạo chế phẩm bảo quản quả gồm màng bao ăn được và nấm men Candida oleophila nhằm tạo ra chế phẩm sinh học không độc hại cho

bảo quản một số loại quả tươi như lê, đào, táo…

Cơ sở của phương pháp căn cứ vào sự cạnh tranh có trong tự nhiên của giới sinh vật, cụ thể là các vi sinh vật cùng chung sống trong cùng một môi trường, xét trên diện hẹp thì đó là các vi sinh vật sống trên bề mặt của quả Để giảm sự thối hỏng và hạn chế các tác hại cho sức khoẻ của con người, việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật đối kháng có khả năng ức chế các vi khuẩn và nấm mốc gây bệnh đã được bộ nông nghiệp Mỹ, cộng đồng Châu Âu và các nước như Nhật Bản, Canada nghiên cứu và ứng dụng Hai sản phẩm sinh học

là Aspire của hãng Ecogen, Langhorn, USA chứa nấm men đối kháng

Candida olephila I-182 và chế phẩm Bio-Save 110 của hãng Eco Science,

Worcestes, USA chứa vi khuẩn đối kháng Pseudomonas syringae hiện nay đã

được đăng ký chất lượng và công nhận là chế phẩm sinh học an toàn cho bảo quản sau thu hoạch đối với một số loại quả như táo, đào, nho ở Mỹ Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi nghiên cứu tác dụng của C olephila

– vi sinh vật đối kháng có tác dụng chống lại một số nấm mốc gây bệnh trên cam

* Sử dụng nấm men đối kháng kết hợp với màng bao ăn được ứng dụng trong việc bảo quản quả tươi

Bảo quản quả tươi bằng chế phẩm vi sinh vật đối kháng và bằng màng bao ăn được là các phương pháp sinh học mang lại hiệu quả cao, thể hiện ưu

điểm hơn hẳn các biện pháp bảo quản khác do tránh được ngộ độc dư lượng hoá chất bảo quản và ô nhiễm môi trường Kết hợp hai biện pháp trên trong bảo quản quả tươi đã được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu Nhiều patent và công trình khoa học khẳng định hiệu quả của phương pháp bảo quản kết hợp

đã cao hơn đáng kể so với phương pháp bảo quản riêng lẻ [32] F Devlieghere

và cộng sự [31] đã sử dụng chitosan ở các nồng độ khác nhau từ 40 đến 750 mg/l cùng với một số các thành phần như tinh bột, whey protein, NaCl và dầu

để làm màng bao ứng dụng cho bảo quản một số loại quả và rau xanh Thành công của công trình này là ngoài tác dụng của chitosan và các thành phần trên, các tác giả còn kết hợp bổ sung nấm men Candida lambica Kết quả cho

thấy sự kết hợp này đã có hiệu quả kháng lại các vi sinh vật gây thối hỏng dâu tây và rau diếp lên đến 94%

1.5 Nấm men Candida oleophila

1.5.1 Đặc điểm hình thái [63]

Khuẩn lạc có màu trắng kem, mọc nhỏ, bóng, tròn, nhẵn và có giả khuẩn ty

Điều kiện sinh trưởng và phát triển

- Phát triển trong điều kiện hiếu khí, ở nhiệt độ thích hợp từ 10oC đến

30oC Nhiệt độ tối thích trong khoảng 22oC đến 28oC pH của môi trường dinh dưỡng là trung tính: 6,7 – 7,2

- Thời gian phát triển là thời gian cần cho vi sinh vật phát triển đạt đến thời kỳ ổn định, thời gian này thường từ 40-62h

Candida oleophila có khả năng ức chế các nấm mốc gây bệnh trên quả

như Aspegillus sp Penicilium digitatum, P expansum, Botrytis cinerea, Rhizopus stolinifer, Monilinia fructicola v.v , kéo dài thời gian tồn trữ và bảo

quản quả [ 63], [65],[ 54],[ 44],[ 40]

1.5.2 Công nghệ sản xuất Candida oleophila [4],[63]

Nuôi cấy C oleophila trong điều kiện có khuấy là phương pháp cơ bản

để sản xuất sinh khối Tuy nhiên, sản xuất sinh khối của C oleophila là một

lĩnh vực mới trong những tiến bộ của kĩ thuật lên men công nghiệp Tác nhân

đấu tranh sinh học này không chỉ được sản xuất với hiệu suất cao mà còn có thể duy trì được khả năng sống của tế bào trong quá trình bảo quản, khả năng cạnh tranh và hiệu quả sinh học trong suốt thời gian dài bảo quản quả Sự tối

ưu hoá môi trường không chỉ quan tâm đến hiệu suất sinh bào tử mà còn phù hợp với bào tử dựa trên cơ sở chất lượng như khả năng chịu sấy, khả năng ổn

định của một mẫu khô và hiệu quả đấu tranh sinh học

Điều kiện dinh dưỡng và môi trường sống trong môi trường sinh trưởng

và tạo bào tử, thúc đẩy tổng hợp, dự trữ các chất nội sinh có thể là nhân tố quyết định điều kiện thích hợp cho các bào tử Sau khi thu sinh khối từ canh trường cần được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp cho đến khi ứng dụng Sau bảo quản các tế bào trong canh trường lỏng không chỉ có khả năng sống sót

mà còn phải có hoạt tính đủ để nhanh chóng tạo khuẩn lạc và được đánh giá bằng khả năng ức chế các nấm mốc gây hại

Khi điều kiện môi trường thay đổi theo hướng phù hợp và đầy đủ môi trường dinh dưỡng, nấm sinh trưởng đầu tiên bằng việc phát triển hệ sợi Tuy

nhiên, khi dinh dưỡng trở nên có hại hoặc điều kiện môi trường khó khăn, hệ sợi nấm ngừng phát triển và tạo bào tử Nấm mọc trên môi trường lỏng, đặc biệt là trong các bình lên men rất khác biệt so với chúng mọc trên môi trường cơ chất đặc Hệ sợi có rất nhiều đặc điểm hình thái và xu hướng tạo thành khóm cụm hoặc viên lại Các viên vón này làm giảm hiệu quả lên men trên môi trường lỏng và cuối cùng giảm hiệu quả tạo bào tử [5]

Mặc dù các hệ sợi nấm sinh dưỡng có thể được sử dụng như một thành phần hoạt tính trong các dạng sản phẩm, hệ sợi nấm không dễ dàng định hình

và giữ hoạt tính trong một thời gian dài Do đó, cần rất nhiều nỗ lực cho việc phát triển quá trình lên men để lượng bào tử nấm men đạt được lớn nhất (Stowell, 1991)

1.5.2.1 Môi trường nuôi cấy

* Nguồn cacbon

Cacbon có mặt trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Khoảng một nửa chất khô của tế bào là cacbon Chính vì vậy những hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật

Nguồn cacbon cũng như nồng độ cacbon thích hợp là những yếu tố rất quan trọng cho sự tạo thành sinh khối của nấm men Glucoza được gọi là nguồn cơ chất thích hợp nhất cho sự hình thành sinh khối của nấm men Trong nghiên cứu của khoá luận này, chúng tôi đã tìm ra hai loại môi trường có nguồn cacbon thích hợp để nấm men sử dụng tạo sinh khối đó là môi trường nước chiết malt và môi trường rỉ đường Cả hai loại môi trường này đều đáp ứng đầy đủ dinh dưỡng cho nấm men phát triển, song ở môi trường rỉ đường thành phần chính là đường sacaroza, nên nấm men khó tiêu thụ hơn là môi trường nước chiết malt (có chứa glucoza là chính) Vì vậy khả năng tạo sinh khối nấm men trên môi trường rỉ đường là thấp hơn so với môi trường nước chiết malt

* Nguồn nitơ

Cũng giống như cacbon, nitơ là nguyên tố rất quan trọng đối với đời sống của vi sinh vật Nó tham gia cấu tạo các axit amin, protein Trong nuôi cấy nấm men người ta sử dụng nguồn nitơ vô cơ hay hữu cơ, nhưng trong quá trình nuôi tạo sinh khối nấm men thì nitơ được sử dụng không nhiều Nó có

ảnh hưởng không lớn đối với quá trình tạo sinh khối nấm men

* Vitamin và vi lượng

Ngoài nguồn cacbon và nitơ ra, một vài vi sinh vật rất cần những nguyên tố vi lượng và vitamin cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình Tuy nhiên đối với việc nhân nuôi để tạo sinh khối nấm men thì việc bổ sung các yếu tố vi lượng cũng như vitamin là không cần thiết đối với quá trình nhân nuôi tạo sinh khối nấm men

1.5.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ của môi trường có ảnh hưởng rất lớn tới sự phát triển tạo sinh khối của Candida oleophila Nhiệt độ thích hợp để nấm men phát triển tốt là

trong khoảng từ 22-30oC Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều có ảnh hưởng

đến quá trình tạo sinh khối của vi sinh vật, nó kìm hãm sự phát triển của nấm men Nhiệt độ quá thấp thì nấm men phát triển chậm, thời gian nuôi cấy kéo dài Nhiệt độ quá cao dẫn đến hô hấp quá mạnh không tốt cho quá trình tạo sinh khối nấm men

1.5.2.3 Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến việc tạo sinh khối nấm men Thường thời gian nhân nuôi thích hợp đối với nấm men là 62-72 giờ Trong khoảng thời gian này sinh khối nấm men đạt cực đại Chúng ta điều khiển dừng quá trình tạo sinh khối ở pha sinh trưởng của nấm men (pha log) Nếu thời gian quá ngắn hoặc quá dài thì nấm men cho hiệu quả sinh khối không cao Vì vậy nên dừng quá trình sinh trưởng của nấm men ở pha log là hợp lý nhất

1.5.2.4 pH của môi trường nuôi cấy

pH có ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Nấm men phát triển và sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 6-7 pH quá kiềm hoặc quá axit đều không tốt cho quá trình phát triển của nấm men

Nó có thể ức chế hoặc kìm hãm sự phát triển của nấm men

1.5.3 Aspire, chế phẩm thương mại có chứa nấm men Candida oleophila

dùng để bảo quản quả

Hãng Ecogen đã đưa Aspire, một sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên chứa

Candida oleophila I-182 được ứng dụng để bảo vệ quả khỏi nguồn gây thối

hỏng ở các loại thuộc chi Citrus, quả nho và táo bằng cách bảo vệ bề mặt các

thương tổn trên bề mặt quả khỏi sự tấn công lan rộng của nguồn nấm mốc gây bệnh

Chế phẩm chứa nấm men Candida oleophila(Aspire) ức chế các tác

nhân gây hư hỏng quả thông thường qua cạnh tranh với các bào tử nấm mốc gây bệnh chính trên quả như Penicilium, Aspegillus, Fusarium… về nơi cư trú

và dinh dưỡng Hơn nữa chế phẩm chứa nấm men Candida oleophila(Aspire)

có hiệu quả ức chế cao với bệnh thối chua do Goetrichum candidum gây ra,

trong khi các phương pháp diệt nấm truyền thống không có hiệu quả trên bệnh này Droby[28]

Chương 2 - vật liệu và phương pháp

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu cam thu thập từ các tỉnh Hưng Yên, Hà Giang, Hà Nội, Nghệ

An chưa sử dụng thuốc bảo quản

Các mẫu xoài, lê, chuối thu thập từ một số chợ ở Hà Nội

2.1.2 Thiết bị

- Nồi hấp thanh trùng (Trung Quốc)

- Tủ sấy (Việt Nam)

- Máy đo độ cứng FT 327 (Italia)

- Thiết bị đo mầu, model Color Tec-PCM (Đức)

* Môi trường PDA

Dịch chiết khoai tây : 1000ml

* Môi trường malt- thạch

- Đun sôi hỗn hợp trong 10 phút

- Dùng chiết quang kế xác định độ Bx (khoảng 10o Bx) Điều chỉnh pH đến 6, hấp khử trùng ở 1 at trong 30 phút

* Môi trường nước malt

Thành phần giống như môI trường malt thạch ở trên trừ arga Đây là môI trường dùng để nhân nuôi nấm men

* Môi trường rỉ đường

- Bước 1: Pha loãng rỉ đường với tỷ lệ 1:1 (1kg rỉ đường : 1 lít nước) Thực tế tỷ lệ này càng lớn thì khả năng loại bỏ chất keo lại càng tăng

- Bước 2: Bổ sung axit H2SO4 để điều chỉnh pH = 3,8 - 4,2 pH càng thấp thì khả năng loại bỏ keo càng lớn Để lắng khoảng 12h sau đó đem

đi tách cặn

- Bước 3: Gia nhiệt ở nhiệt độ 110-120oC, thời gian khoảng 60 phút nhằm loại bỏ các tạp khuẩn

Mục đích của việc sử lý rỉ đường là:

- Nhằm loại bỏ các tạp chất và các tạp khuẩn

- Làm tăng độ thuần khiết của rỉ đường (giảm được 20-40% hàm lượng hợp chất keo, các chất phi đường)

Tạo điều kiện pH thích hợp cho nấm men phát triển

* Môi trường rỉ đường + vi lượng

* Môi trường nước chiết giá đậu

Giá đậu 200g, thêm 1000ml nước, đun sôI 30 phút Lọc lấy dịch rồi thêm đủ 1000ml

* Môi trường mạch nha

Lấy lúa đại mạch đã cho nảy mầm, xay nhỏ thành bột Cân 1kg bột này, thêm 3l nước, đường hoá ở 600C cho đến khi hết tinh bột Lọc lấy dịch trong

Điều chỉnh bằng nước để có nồng độ đường đạt 60Brix

* Pha loãng hàng loạt: Lấy 1 ml dung dịch huyền phù của vi sinh vật

cần phân tích, thêm 9ml nước cất vô trùng, trộn bằng máy vortex trong 1 phút,

được dung dịch có nồng độ là 10-1 Hút 1ml dịch có nồng độ 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, trộn bằng máy vortex trong 1 phút , được dung dịch có nồng độ 10-2, làm tương tự như vậy cho đến khi đạt được nồng

độ mong muốn

* Đếm khuẩn lạc theo phương pháp cấy trong môi trường thạch

- Nấm mốc được cấy trong môi trường PDA, nấm men được cấy trong môi trường malt thạch

- Đưa một cách vô trùng 1ml dịch mẫu đã pha loãng có nồng độ 10-4

đến 10-8 vào đĩa Petri vô trùng

- Rót khoảng 15-18ml môi trường thạch đã hoá lỏng trên nồi cách thuỷ (nhiệt độ khoảng 450C) vào mỗi đĩa đã có mẫu Mỗi mẫu làm 4 độ pha loãng liên tiép từ độ pha loãng 10-4 đến 10-8, mỗi độ pha loãng cấy lặp lại 2 hộp

- Trộn theo kỹ thuật được chuẩn hoá Đĩa được xếp trên mặt phẳng ngang cho đến khi thạch nguội

- Lật hộp lại và đem nuôi ở 28oC trong 3-5 ngày đối với nấm mốc, 28oC trong 2-3 ngày đối với nấm men

- Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên đĩa

Để có kết quả chính xác, chỉ tính những hộp có từ 30 đến 300 khuẩn lạc

Số khuẩn lạc trên 1 ml được tính theo công thức sau:

X: khuẩn lạc/ml

Σ C: số khuẩn lạc đếm được trên mỗi hộp Petri

n1: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1

n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2

f1 : hệ số pha loãng của đĩa ở nồng độ pha loãng thứ 1

v : thể tích mẫu cấy vào mỗi hộp Petri

2.2.3 Phân lập nấm mốc [9], [44]

Cân 1g mẫu vỏ cam, cắt nhỏ cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng Lắc trong 30 phút trên máy minishaker, để lắng ở nhiệt độ phòng Hút 30-40àl dịch mẫu trải đều bằng que trang trên đĩa thạch chứa môi trường PDA Nuôi cấy ở 28oC sau 3-5 ngày Khi các khuẩn lạc xuất hiện, tách riêng từng khuẩn lạc và đưa vào các ống nghiệm chứa môi trường giữ giống đã được thanh trùng

2.2.4 Phân lập nấm men [9], [44], [17]

Cân 1g mẫu vỏ quả, cắt nhỏ cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng Lắc trong 30 phút trên máy minishaker, để lắng Hút 1ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ 10-2 và 10-3 ra hộp petri vô trùng Phân phối môi trường malt- thạch lên các hộp petri chứa dịch mẫu, lắc đều sao cho dịch mẫu hoà

(n1 + 0,1 n2) x f1 x v X=