Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) ở việt nam

Nghiên cứu của Heukelekian và cộng sự [39] cho thấy giới hạn nồng độ chấtdinh dưỡng không cố định mà phụ thuộc vào tổng diện tích bề mặt tiếp xúc với môitrường.Jones và cộng sự [43] đã s

-Trần Thúy Hằng

PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH

VẬT (BIOFILM) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011

-Trần Thúy Hằng

PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH

VẬT (BIOFILM) PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm)

1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật

1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên

1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật

1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật

1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật

1.3.1 Mạng lưới ngoại bào

1.3.2 Các thành phần khác

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của màng sinh vật

1.4.1 Các giai đoạn tạo thành màng sinh vật

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật

1.4.3 Điều hòa quá trình hình thành màng sinh vật

1.5 Nghiên cứu ứng dụng màng sinh vật

1.5.1 Ứng dụng màng sinh vật trong việc xử lý nước thải

1.5.2 Ứng dụng màng sinh vật trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại

1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

2.2.2 Máy móc, thiết bị

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 32

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật 32

2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật 33

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt 35

2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn 35

2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram 36

2.3.8 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét 37 2.3.9 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật 39

3.1.1 Phân lập vi sinh vật 39

3.1.2 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng phân lập 40

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo màng sinh vật của các chủng phân lập 42

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 42

3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường 43

3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 44

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 46

3.2.5 Ảnh hưởng của giá thể 47

3.3 Một số đặc tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật phân lập 50

3.3.1 Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt 50

3.3.3 Đặc điểm hình thái 53

3.3.4 Phân loại các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên gen 16S rDNA 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 69

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tạo màng sinh vật của các chủng visinh vật phân lập 44Bảng 2: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự tạo màng sinh vật của các chủng visinh vật phân lập 45Bảng 3: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo màng sinh vật của các chủng visinh vật phân lập 47Bảng 4: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông

qua mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử 3

Hình 2 Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên 4

Hình 3 Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 5

Hình 4 Một số ví dụ về màng sinh vật 8

Hình 5 Mô hình phát triển của màng sinh vật 16

Hình 6 Khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch 39

Hình 7 Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng miến Lại Trạch 40

Hình 8 Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải nhà máy sản xuất bia 41

Hình 9 Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu nước thải làng nghề bún Phú Đô 42

Hình 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh vật từ các chủng phân lập 43

Hình 11 Màng nổi của 4 chủng vi sinh vật sau 5 ngày nuôi cấy 48

Hình 12 Màng sinh vật trên bề mặt nhựa 48

Hình 13 Cấu trúc màng sinh vật của các chủng phân lập 49

Hình 14 Khả năng nhũ tương hóa dầu ăn của các chủng vi sinh vật 51

Hình 15 Hình thái khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học 54 Hình 16 Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn trong màng sinh vật 55

Hình 17 Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA 56

Hình 18 Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA 57

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

Acyl - HSL Acyl - homoserine lactone

COD Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học)

E24 Emulsion index (chỉ số nhũ tương hóa)

OD Optical Density (Mật độ quang học)

SEM Scanning electron microscopy

w/v Khối lượng (g)/thể tích (ml)

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu vi sinh vật học là mô hình nghiên cứu ưu việt để tìm hiểu bản chấtcủa các quá trình sống, đồng thời nó cũng đóng vai trò quan trọng trong các lĩnh vực

y học, nông nghiệp, công nghiệp và môi trường

Tuy nhiên, trong tự nhiên vi sinh vật ít khi tồn tại dưới dạng các tế bào đơn lẻ

mà chúng thường được tìm thấy dưới dạng tập hợp các tế bào liên kết chặt chẽ vớinhau và với các bề mặt thông qua mạng lưới chất ngoại bào gọi là màng sinh vật(biofilm)

Nghiên cứu về màng sinh vật giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát hơn về

sự tăng trưởng, phát triển và thích nghi của vi sinh vật trong mối quan hệ với nhaucũng như với các điều kiện môi trường Đồng thời, việc tìm hiểu về màng sinh vậtcũng giúp chúng ta có những hiểu biết sâu hơn về mối liên hệ bên trong của các tếbào trong một màng sinh vật cũng như các cơ chế điều hòa quá trình tạo màng sinhvật

Nghiên cứu về màng sinh vật góp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụng caotrong cuộc sống như tạo các công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường, xử lý các

sự cố tràn dầu, ứng dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như cácnghiên cứu trong công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm v.v… mà hiện nay tại ViệtNam các nghiên cứu về vi sinh vật tạo màng sinh vật và ứng dụng của chúng còn rấtmới mẻ

Chính từ những ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài:

“Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật phân lập ở Việt Nam”.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm)

Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốnthấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi Vi sinh vật không phải là mộtnhóm riêng biệt trong sinh giới Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật khácnhau và giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau [1]

Lịch sử nghiên cứu và phát triển của vi sinh vật học đã ghi nhận người có côngphát hiện ra thế giới vi sinh vật và cũng là người đầu tiên mô tả hình thái nhiều loại visinh vật - Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723) Với việc tự chế tạo ra trên 400chiếc kính hiển vi, ông đã lần lượt quan sát mọi thứ có xung quanh mình, trong đó có

cả các vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà ông đã gọi là những “động vật vô cùngnhỏ bé” Ông là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng bám dính và phát triển phổbiến của vi khuẩn trên bề mặt răng tạo thành các mảng bám răng, một dạng của màngsinh vật sau này [1]

Cùng với sự ra đời của kính hiển vi quang học hoàn chỉnh vào đầu thế kỷ 19,đặc biệt là việc chế tạo thành công chiếc kính hiển vi điện tử đầu tiên (1934) đã gópphần tạo nên những cống hiến lớn lao của các nhà khoa học trong lĩnh vực vi sinh vậthọc [1] Năm 1936, Zobell và cộng sự [87] đã nghiên cứu cho thấy số lượng vi khuẩnbám dính tại vị trí tiếp xúc giữa nước biển và bề mặt vật rắn lớn hơn nhiều so với các

vị trí xung quanh Lợi ích của bề mặt chất rắn mang lại được đánh giá như một nơi cưtrú của các vi khuẩn giúp tập trung hấp thụ chất dinh dưỡng, tăng cường hoạt độngcủa các enzyme và hấp thụ các chất chuyển hóa Trong những nghiên cứu về hiệu quảcủa bề mặt rắn đối với hoạt tính của vi khuẩn, Zobell [86] đã chỉ ra rằng bên cạnhviệc cung cấp nơi khu trú và tập trung chất dinh dưỡng, bề mặt chất rắn còn làm chậm

sự khuếch tán của các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sự đồng hóa các chất dinh dưỡngthông qua quá trình thủy phân trước khi chúng được hấp thụ

Một loạt những nghiên cứu tiếp theo đó cũng đề cập đến khả năng hoạt động

và tăng trưởng đáng kể của vi sinh vật bằng cách bám dính vào một bề mặt xác

định Nghiên cứu của Heukelekian và cộng sự [39] cho thấy giới hạn nồng độ chấtdinh dưỡng không cố định mà phụ thuộc vào tổng diện tích bề mặt tiếp xúc với môitrường.

Jones và cộng sự [43] đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để chỉ ra sựxuất hiện của màng sinh vật trong bộ lọc nhỏ giọt của một nhà máy xử lý nước thải vàcho thấy rằng chúng bao gồm nhiều loại, nhóm các vi sinh vật khác nhau (dựa trênđặc điểm hình thái tế bào) Bằng cách sử dụng chất nhuộm màu polysaccarit đặc biệt

là đỏ Ruthenimum và cố định bởi Osmium tetroxide (OsO4), các nhà nghiên cứu đãchứng minh rằng vật liệu chất nền bao xung quanh và kết dính các tế bào trong cấutrúc màng sinh vật chính là polysaccarit

Hình 1 Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông qua

mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ( 57700) [43]

Dựa trên những quan sát ở mảng bám răng và một số thí nghiệm khác, năm

1978, Costerton và cộng sự [14] đã đưa ra giả thuyết về màng sinh học: “Trong tựnhiên, các tế bào vi khuẩn gắn kết với nhau và bám dính trên một bề mặt nhất địnhnhờ hệ thống sợi glycocalyx” Giả thuyết này đã góp phần giải thích cơ chế bám dínhcủa vi sinh vật trên các vật liệu vô sinh và hữu sinh và những lợi ích thu được nhờphương thức sinh thái thích hợp này

Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng sinhvật được đưa ra ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn Hiện nay, khái niệm màng sinhvật được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặtcác môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra[26], [56] Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trường vô sinh hay hữusinh và là một hiện tượng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống hay trongnhiều ngành công nghiệp khác nhau.

Hình 2 Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên [26]

Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sốngtrôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhautrên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trưởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặcbiệt nào đó Khả năng bám dính của vi sinh vật là một quá trình phức tạp được điềuhòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trường nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt

tế bào [57]

Vi khuẩn bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động

cụ thể từ môi trường sống như nguồn chất dinh dưỡng và oxy Quá trình tạo thànhmàng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự

10 m 1 m

Hình 3 Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 [57]

do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuấtcác chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóahọc và sinh học gây hại [56]

1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật

1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên

Các vi sinh vật trong tự nhiên ít khi tồn tại riêng rẽ mà thường hình thành tậphợp quần xã vi sinh vật với một loạt các hoạt động chức năng sinh lý và sinh hóa Sựtạo thành màng sinh vật diễn ra tại bề mặt rắn tiếp xúc với môi trường chất lỏng Tạiđây, các mảnh vụn hữu cơ và chất khoáng tập trung lại tạo điều kiện cho phép các visinh vật có thể sinh trưởng và phát triển thành các vi khuẩn lạc và dần hình thành nênmàng sinh vật trưởng thành [13]

Phân tích thành phần vi sinh vật của màng cho thấy sự hiện diện của vi tảo và

vi khuẩn Gallionella spp Đặc biệt khả năng oxi hóa sắt của chủng Gallionella spp gây kết tủa sắt trong đường ống tạo ra những thay đổi không mong muốn về độ đục, màu sắc và mùi của nước [58] Các chủng vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas putrefaciens, Escherichia coli, Bacillus sp, Serratia sp cũng được phân lập Trong

đó, nghiên cứu cho thấy chủng P putrefaciens có khả năng tạo chất ngoại bào giúp

gắn kết các nhóm vi sinh vật với nhau để hình thành màng sinh vật [66]

Trong công nghiệp thực phẩm, khả năng bám dính của các vi sinh vật trên bềmặt các thiết bị chế biến có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị cảm quan của sản

phẩm thực phẩm Nghiên cứu của Sule và cộng sự [78] cho thấy chủng E coli

O157:H7 là tác nhân gây bệnh có thể phân lập từ các mẫu thịt tươi Bằng kỹ thuật

Real-time PCR, 13 trong số 15 gen ở chủng E coli này được nghiên cứu cho thấy có

liên quan đến các chức năng sống như trao đổi chất, phân chia tế bào, hình thànhmàng sinh học và khả năng gây bệnh

Nghiên cứu của Kubota và cộng sự [47] về khả năng hình thành màng sinh vật

trên 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis và Lactobacillus fructivorans đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic gây hư hỏng thực phẩm Đặc điểm của

sự hình thành màng sinh vật ở các chủng vi khuẩn này cung cấp cho chúng ta mộthướng nghiên cứu trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh trong các sản phẩmthực phẩm

Một trong những hướng nghiên cứu ứng dụng của màng sinh vật là kiểm soátsinh học các tác nhân gây bệnh hại ở cây trồng Các chủng vi khuẩn được phân lập từ

rễ cây hoặc đất trồng ở các khu vực canh tác nông nghiệp cũng cho thấy khả năng

hình thành màng sinh vật tương đối cao như: Bacillus subtilis, Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidiosa, Rhizobium leguminosarum… Nghiên cứu của Fall và cộng sự [30] cho thấy Bacillus subtilis bám dính ở rễ cây có khả năng hình thành

màng sinh vật tốt ở nồng độ K+ cao trong môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis cũng

có khả năng ức chế sự lây nhiễm của tác nhân gây bệnh Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 ở rễ cây Arabidopsis nhờ khả năng tạo thành màng sinh vật và sản

xuất surfactin [5] Khả năng cộng sinh với mô thực vật cũng như sự tạo thành màng

sinh vật trên bề mặt chóp rễ của các chủng Agrobacterium tumefaciens, Xylella fastidiosa [69] cho thấy sự tương tác cùng có lợi giữa thực vật và vi khuẩn trong việc

cung cấp chất dinh dưỡng và hạn chế các tác nhân gây bệnh

Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn được thu thập từ khu vực nước thải của cácnhà máy, làng nghề cũng được phân lập nhằm tìm ra những chủng có khả năng hìnhthành màng sinh vật tốt, ứng dụng trong việc xử lý nước thải và vệ sinh môi trường.

1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật

Trong tự nhiên, có thể bắt gặp và quan sát thấy màng sinh vật trong rất nhiềumôi trường khác nhau: từ môi trường tự nhiên như trên bề mặt của các viên đá nằmdưới đáy sông suối, trên bề mặt nước của các hồ, ao tù đến các hệ thống nhân tạo nhưvòi hoa sen, ống dẫn nước

1.2.2.1 Trong môi trường tự nhiên

Môi trường nước trong các hồ, ao, sông, suối là điều kiện thuận lợi nhất choviệc hình thành và phát triển một mạng lưới màng sinh vật Màng sinh vật có thểđược tạo thành ngay trên bề mặt nước (khoảng tiếp xúc với không khí) để hình thànhnên dạng cấu trúc màng nổi (floating biofilm), có thể quan sát dưới dạng những cặnhay váng của vi sinh vật trên mặt ao, hồ hay bể lọc nước

Một dạng khác của màng sinh vật trong tự nhiên được tìm thấy là khi các visinh vật bám dính trên bề mặt vật liệu rắn như các viên sỏi, đá trong nước tạo thànhdạng màng sinh vật bề mặt (hình 4a)

1.2.2.2 Trong các hệ thống thiết bị nhân tạo

Màng sinh vật cũng tồn tại trên bề mặt các thiết bị nhân tạo được cấu tạo chủyếu từ vật liệu vô sinh (nhựa, thủy tinh, thép …) như trên vỏ của tàu thuyền, tronglòng các ống dẫn nước, ống dẫn dầu hay dẫn khí đốt, trên sàn các quầy hàng thựcphẩm

Trong các thiết bị, đồ dùng gia đình cũng có sự xuất hiện của màng sinh vậtkhi các vi sinh vật bám dính trong hệ thống vòi hoa sen, bồn rửa mặt

1.2.2.3 Trong cơ thể sinh vật sống

Ngay trong cơ thể sống con người cũng xuất hiện màng sinh vật chủ yếu làcủa những loài vi sinh vật gây bệnh Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt

lớp tế bào biểu mô như biểu mô ống dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng hay trên răngtạo thành cấu trúc màng sinh vật gọi là mảng bám răng (hình 4c) Thậm chí bề mặtcủa những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể như van tim, niệu quản nhân tạo cũng có thể

là vị trí tồn tại của màng sinh vật

Hình 4 Một số ví dụ về màng sinh vật

(a): Màng sinh vật trên tảng đá; (b): Màng sinh vật trên bề mặt bàn chải đánh răng;(c): Màng sinh vật của vi khuẩn sâu răng hình thành nên mảng bám răng

1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật

Sự tạo thành màng sinh vật là một hiện tượng phổ biến trong đời sống của các

vi sinh vật và trở thành phương thức giúp chúng tồn tại và phát triển trong tự nhiên

1.2.3.1 Bảo vệ tế bào trước những bất lợi của môi trường

Mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật cung cấp nơi khu trú và một hằng sốnội môi thích hợp cho các vi khuẩn tồn tại Nó đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc

và chức năng của các màng sinh vật Chất nền ngoại bào này cũng có khả năng ngănchặn sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn vào trong màng nhờ hoạt tính traođổi anion Điều này cũng có nghĩa là nó sẽ làm hạn chế sự khuếch tán của một số hợpchất từ môi trường xung quanh vào trong màng sinh vật [45]

Màng sinh vật của các chủng vi sinh vật tạo màng giúp chúng kháng lại các tácnhân là các vi khuẩn, các chất kháng sinh hay chất sát trùng Cơ chế bảo vệ của màngsinh vật có thể là: ngăn chặn sự xâm nhập của các chất này vào trong màng

sinh vật; thay đổi tốc độ tăng trưởng của các vi sinh vật trong màng hay các biến đổichức năng sinh lý khác thông qua các phương thức tăng trưởng Đặc tính này phầnlớn phụ thuộc vào tính chất của cả mạng lưới biofim và tác nhân kháng khuẩn vàthường thể hiện rõ với các chất kháng sinh thuộc nhóm ưa nước và tích điện dươngnhư các aminoglycoside [36].

Mạng lưới chất ngoại bào cũng được ghi nhận là có khả năng giúp tế bàochống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo vệ

tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trường như sự thay đổi độ pH, bức xạ tiacực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn [45] Thành phần chính của màng sinh vậtchiếm tới 97% là nước Khả năng giữ nước cao của mạng lưới ngoại bào thông quacác liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo vệ màng chống lại sự khô hạn trongmôi trường tự nhiên Quá trình hấp thụ các nguyên tố kim loại nặng được biết đến dotác dụng của nhóm mang điện tích âm trong mạng lưới chất ngoại bào như nhómphosphate, lưu huỳnh, hay nhóm chức axit [56]

1.2.3.2 Thu nhận nguồn chất dinh dưỡng từ môi trường

Môi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh vật cung cấp phương tiện traođổi dinh dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn, tăngcường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất

có nguy cơ độc hại [23] Các vi khuẩn trong mạng lưới màng sinh vật thường baogồm nhiều quần thể vi khuẩn khác nhau Chúng là kết quả của mối liên hệ giữa cácloài sinh vật đồng trao đổi chất Mối liên kết chặt chẽ này tạo điều kiện thuận lợi cho

sự trao đổi, loại bỏ và phân phối các sản phẩm trao đổi chất trung gian giữa các loài

Màng sinh vật cung cấp một môi trường lý tưởng cho sự thiết lập mối quan hệhợp dưỡng giữa các loài vi sinh vật Hợp dưỡng là một trường hợp đặc biệt của mốiquan hệ cộng sinh, trong đó hai loài (hoặc hai chủng) vi sinh vật khác nhau phụ thuộclẫn nhau về mặt trao đổi chất để sử dụng một số cơ chất nhất định, đặc biệt là cho cácyêu cầu về năng lượng [31]

1.2.3.3 Thu nhận những đặc tính di truyền mới

Quá trình trao đổi gen (horizontal gene transfer) đóng vai trò quan trọng trong

sự tiến hóa và đa dạng di truyền của cộng đồng các vi sinh vật trong tự nhiên Traođổi gen được biết đến là sự di chuyển vật liệu di truyền giữa các loài vi sinh vật khácnhau Hiện tượng này xảy ra trong vi khuẩn là cách kết hợp trực tiếp DNA tự do củacác tế bào vi khuẩn Nhờ việc thu nhận những đặc tính di truyền mới giúp cộng đồng

vi sinh vật trong màng tiếp nhận được những gen cần thiết tham gia tích cực tronghoạt động sống của màng sinh vật [45]

Tầm quan trọng của quá trình trao đổi gen đã được ứng dụng trong nhữngnghiên cứu về khả năng kháng thuốc của vi sinh vật, kỹ thuật di truyền tạo nên chủng

vi sinh vật mới trong các ngành công nghiệp Trong đó cơ chế trao đổi gen phổ biến ở

vi sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp Tuy nhiên khi các vikhuẩn trong tự nhiên tồn tại dưới dạng màng sinh vật, liên kết với nhau thông quamạng lưới chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ đó vi khuẩntrong màng sinh vật có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác [26]

1.2.3.4 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài

Màng sinh vật được hình thành nhờ sự hợp tác cùng chung sống của nhiều loài

vi sinh vật tạo nên một quần xã vi sinh vật có cấu trúc không gian phức tạp Do đó,các loài sinh vật cùng tồn tại trong màng sinh vật thích nghi với những điều kiện dinhdưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong màng Ngoài ra, khảnăng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các vi sinh vật tậndụng được tối đa nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hỗ trợ lẫn nhau theohướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất [4]

Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong màng sinh vật cũng có tác động lớnđến chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên Sự phối hợp của nhiềunhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải một hợp chất hữu

cơ và việc cùng cư trú trong màng sinh vật của các nhóm vi sinh vật sẽ góp phần thúcđẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn [45]

1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật

Quá trình tạo màng sinh vật cần có sự tham gia của nhiều yếu tố để hình thànhnên cấu trúc đặc trưng của màng Tỷ lệ và mức độ bám dính của tế bào vi khuẩn vàomột bề mặt phụ thuộc vào đặc tính kỵ nước của bề mặt tế bào, sự hiện diện của lôngroi, tiêm mao và chất kết dính, ngoài ra còn có protein màng tế bào và sự sản suấtmạng lưới chất ngoại bào [26] Thêm vào đó, các bằng chứng thực nghiệm cho thấyrằng sự phát triển chủ yếu của một màng sinh vật có thể được điều hòa bởi mật độ tếbào - phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của gen được điều khiển bởi các phân tử tínhiệu ngoại bào

1.3.1 Mạng lưới ngoại bào

Mạng lưới chất ngoại bào chứa hàm lượng cacbon chiếm 50 - 90% tổng lượngcacbon hữu cơ trong màng sinh vật và được xem như là vật liệu chất nền chính củamàng sinh vật

Mạng lưới ngoại bào có thể khác nhau về một số tính chất vật lý và hóa họcnhưng nó bao gồm chủ yếu là các polysaccarit Một số polysaccarit là trung tính haymang điện tích âm, như trường hợp chất ngoại bào ở vi khuẩn gram âm Sự hiện diệncủa axit uronic (ví dụ như D - glucuronic, D - galacturonic, và axit mannuronic) hoặcliên kết xeton trong phân tử axit pyruvic đưa đến tính chất của ion âm [79] Tính chấtnày rất quan trọng bởi nó cho phép các phân tử polysaccarit ngoại bào liên kết đượcvới các ion dương hóa trị II như Ca2+ và Mg2+ Từ đó hình thành liên kết chéo giữacác sợi polymer và tạo ra lực liên kết lớn hơn trong cấu trúc màng sinh vật Trong

trường hợp của một số vi khuẩn gram dương như Staphylococcus, thành phần hóa học của mạng lưới ngoại bào có thể hoàn toàn khác nhau và gồm chủ yếu là các ion

dương Hussain và cộng sự [41] đã phát hiện ra rằng màng nhầy của tụ cầu khuẩn tạocoagulase - một loại enzyme cho phép chuyển đổi fibrinogen thành fibrin gây đôngmáu - âm tính có chứa hỗn hợp axit teichoic và một lượng nhỏ protein

Mạng lưới ngoại bào có thể là ưa nước do kết hợp với một lượng lớn các phân

tử nước thông qua liên kết hydro hoặc cũng có thể là kỵ nước Tuy nhiên, phần lớncác dạng chất ngoại bào bao gồm cả ưa nước và kỵ nước Đồng thời mạng lưới ngoạibào cũng có thể thay đổi độ hòa tan của nó [26]

Sutherland [79] đã ghi nhận hai thuộc tính quan trọng của mạng lưới ngoạibào Thứ nhất, thành phần và cấu trúc của các polysaccarit xác định cấu tạo chính củamạng lưới ngoại bào Ví dụ, cấu trúc bộ khung của mạng lưới ngoại bào ở nhiều

vi khuẩn chứa nhiều liên kết 1,3 hoặc 1,4- -D-fructan và có xu hướng làm cho nócứng chắc hơn, ít bị biến dạng và trong một số trường hợp trở nên kém hòa tan hoặckhông hòa tan Các liên kết khác trong phân tử polysaccarit như liên kết 1,2 hoặc 1,6 D-glucan giúp cấu trúc mạng lưới ngoại bào trở nên linh hoạt hơn Thứ hai, mạnglưới ngoại bào của màng sinh vật thường không đồng nhất, có thể thay đổi theo khônggian và thời gian

Leriche và cộng sự [53] đã sử dụng liên kết đặc hiệu của lectin với một loạiđường đơn để đánh giá sự phát triển của màng sinh vật ở các vi sinh vật khác nhau.Kết quả nghiên cứu cho thấy các sinh vật khác nhau sản xuất một lượng chất ngoạibào khác nhau và lượng chất ngoại bào này tăng lên theo thời gian Mạng lưới chấtngoại bào có thể liên kết với các ion kim loại, các cation hóa trị hai hay các đại phân

tử khác như protein, DNA, lipit… Điều kiện dinh dưỡng của môi trường nuôi cấycũng được chứng minh là có ảnh hưởng đến sự sản xuất chất ngoại bào Nghiên cứucho thấy sự dư thừa nguồn carbon sẵn có và sự hạn chế của nitơ, kali, phospho trongmôi trường nuôi cấy đã thúc đẩy quá trình tổng hợp mạng lưới ngoại bào [79]

Sự tăng trưởng chậm của vi khuẩn cũng sẽ làm tăng cường sản xuất chất ngoạibào Sự tích nước trong mạng lưới chất ngoại bào là rất lớn, do đó nó ngăn chặn sựkhô hạn của màng sinh vật trong tự nhiên Mạng lưới chất ngoại bào cũng góp phầnvào đặc tính kháng kháng sinh của màng sinh vật bằng cách cản trở sự vận chuyểnlượng chất kháng sinh qua màng, có lẽ là thông qua việc liên kết trực tiếp với các chấtnày [25]

1.3.2 Các thành phần khác

1.3.2.1 Vai trò của lông roi, tiêm mao và các phân tử bám dính

Những nghiên cứu trước đây đã đưa ra mô hình hóa học đơn giản dựa trên nồng độ chất điện phân và lực liên kết van der Waals để giải thích sự bám dính của

vikhuẩn lên bề mặt [55] Nhưng trong những nghiên cứu gần đây, chủ yếu dựa trên

sự phát sinh đột biến của gen nhảy, lại cho thấy chính các thành phần cấu trúc của tếbào vi khuẩn như lông roi, tiêm mao và các phân tử bám dính đóng vai trò quan trọngtrong sự xâm nhiễm của vi khuẩn lên một bề mặt nào đó

Chức năng chính của lông roi trong sự hình thành màng sinh vật là giúp cho

vi sinh vật di chuyển trong môi trường nước tốt hơn, tạo nên những tương tác banđầu giữa bề mặt và tế bào Thí nghiệm của De Flaun, De Weger cùng các cộng sự[22], [24] đã chứng minh sự thiếu vắng của lông roi làm suy giảm khả năng xâm

nhiễm của Pseudomonas fluorescens lên rễ cây khoai tây, lúa mì và làm giảm độ bám dính tế bào của P aeruginosa và P fluorescens lên bề mặt polystyrene [63] Tương tự, nghiên cứu trên các chủng Vibrio cholerae và Escherichia coli đột biến thiếu lông roi

đã cho thấy không có sự hình thành màng sinh vật như ở các dạng hoang dại củachúng vẫn thực hiện trên bề mặt nhựa polyvinylchloride (PVC) [84]

Tiêm mao và các phân tử bám dính liên kết với tiêm mao cũng có vai trò quantrọng trong sự bám dính và xâm nhiễm bề mặt Nghiên cứu của Schmoll và cộng sự

[73] trên chủng vi khuẩn gây bệnh E coli cho thấy biểu hiện của gen sfaA, một gen

mã hóa cho các phân tử bám dính tiêm mao, được điều hòa tăng cường khi có sự tiếp

xúc của vi khuẩn với bề mặt Ở E coli, khả năng bám dính bề mặt giảm đi khi có sự đột biến ở gen sinh tổng hợp curlin csgA và gen sinh tổng hợp tiêm mao type I fim H,

một loại tiêm mao chứa các phân tử đặc hiệu với mannose [68] Tương tự, đột biến

gen tổng hợp tiêm mao hemagglutinin có độ nhạy cao với mannose ở V cholerae cũng làm giảm độ bám dính bề mặt [84].

Như vậy, có thể nói rằng các loài vi sinh vật có lông roi và tiêm mao cũng sẽ

có ưu thế hơn trong việc di chuyển đến một bề mặt giá thể xác định - nơi có điều

kiện thuận lợi cho việc hình thành màng sinh vật, đồng thời giúp cho việc bám dínhban đầu của tế bào với bề mặt tốt hơn [26].

1.3.2.2 Vai trò của protein màng

Protein màng tế bào được ghi nhận là có ảnh hưởng đáng kể trong sự bámdính cũng như trong giai đoạn phát triển sớm của màng sinh vật Nghiên cứu cho thấy

sự gắn kết của E coli lên bề mặt vô sinh dẫn đến những thay đổi trong thành phần

protein ngoại vi của màng tế bào hay chính là những tương tác vật lý của tế bào với

bề mặt đã làm biến đổi đặc tính bề mặt của lớp màng ngoại bào [65]

Đột biến protein màng tế bào, bao gồm protein liên kết với Ca2+, hemolysin,protein vận chuyển và protein bơm K+, đã gây nên khiếm khuyết trong quá trình bám

dính của P putida KT 2440 lên hạt ngô giống [29].

Nghiên cứu của Whiteley và cộng sự [85] ở Pseudomonas aeruginosa cho thấy biểu hiện của 2 gen tatA và tatB cùng mã hóa cho protein vận chuyển tolA, đóng

vai trò quan trọng trong cấu trúc lớp lipopolysaccarit của màng Một nghiên cứu kháccủa Sauer và cộng sự [72] cũng chứng minh rằng protein porin E1 và protein vận

chuyển ABC cũng được biểu hiện tăng cường ở các tế bào màng sinh vật P aeruginosa.

1.3.2.3 Vai trò của sự cảm ứng mật độ tế bào

Tín hiệu giữa các tế bào với nhau gần đây đã được chứng minh là đóng vai tròquan trọng trong sự bám dính cũng như tách rời của tế bào ra khỏi màng sinh vật

Xie và cộng sự [85] đã chỉ ra rằng mảng bám răng là một màng sinh học phứctạp bao gồm hơn 30 chi đại diện cho hơn 500 loài vi sinh vật khác nhau Mặc dù phứctạp nhưng màng sinh vật này có tổ chức rất cao Những khuẩn lạc đầu tiên hình thành

là các vi khuẩn Gram dương, chủ yếu là liên cầu khuẩn, kế đến là một loạt các loài visinh vật khác và sự xuất hiện lên đến đỉnh điểm trong sự hình thành màng là nhóm vi

khuẩn Gram âm như Porphyromonas gingivalis chiếm ưu thế Nghiên cứu cho thấy những khuẩn lạc ban đầu của Streptococcus gordonii cung cấp

chất nền bám dính cho Porphyromonas gingivalis thông qua sự tương tác của các cặp

thụ thể bám dính, được biết đến là các phân tử protein FimA [11] Ngược lại, tương

tác phân tử giữa các tế bào S cristatus và P gingivalis đã kìm hãm sự biểu hiện của gen fimA và kết quả là P gingivalis không thể tiếp tục bám dính và sẽ được tách rời

khỏi màng sinh vật [48]

Davies và cộng sự [20] đã đưa ra hai hệ thống tín hiệu ngoại bào khác nhau ở

P aeruginosa có liên quan đến sự hình thành màng sinh vật, đó là lasR - las I và rhlR

- rhlI Ở mật độ quần thể tế bào đủ lớn, các tín hiệu này đạt đến nồng độ cần thiết để

kích hoạt các gen liên quan đến sự khác biệt màng sinh vật Các dạng đột biến khôngthể tạo ra cả hai tín hiệu sẽ hình thành một màng khác nhiều so với màng sinh vật củadạng hoang dại như màng mỏng hơn, các tế bào được đóng gói dày đặc hơn và cấutrúc của màng cũng chưa hoàn thiện

Vai trò của tín hiệu nội bào trong màng sinh vật của nhiều loài khác biệt đáng

kể so với màng sinh vật của một loài Những tín hiệu này được phân loại như là mộtsản phẩm truyền tin tích cực hay thụ động làm thay đổi trạng thái của các tế bào vikhuẩn lân cận Chúng bao gồm các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn, các phân tửacyl - homoserine lactone, vật chất di truyền như DNA hay RNA, v.v…Các tín hiệunày có thể làm thay đổi sự phân bố của các loài cụ thể trong màng sinh vật, thay đổi

sự biểu hiện protein trong các tế bào lân cận, đưa đến những đặc điểm di truyền mới ởcác tế bào lân cận và kết hợp các vi khuẩn với nhau trong màng sinh vật [83]

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của màng sinh vật

1.4.1 Các giai đoạn tạo thành màng sinh vật

Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh họcphân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhàkhoa học đã đưa ra một mô hình cấu trúc màng sinh học cơ bản [16] Trong mô hìnhnày, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và được bao quanh bởi một mạng lướichất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có

trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nênnhững kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật Nhờ đó, dịch tế bào

có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinhdưỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải [76]

Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống như một quá trình phát triển của visinh vật và cần phải trải qua một số bước Cơ chế phân tử giữa các vi sinh vật có thểkhác nhau nhưng các giai đoạn trong sự phát triển của màng sinh vật thì luôn đượcbảo tồn Quá trình này lần lượt bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi sinh vật trôi nổi

tự do lên một bề mặt, sự tăng trưởng và liên kết các tế bào thành vi khuẩn lạc, sự tạothành màng sinh vật trưởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời của các tếbào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (hình 5)

Gắn kết

thuận nghịch

Hình 5 Mô hình phát triển của màng sinh vật [76]

1.4.1.1 Giai đoạn 1: Giai đoạn gắn kết thuận nghịch

Trước khi vi sinh vật bám dính lên bề mặt, các phân tử hữu cơ, protein,glycoprotein đã tiếp xúc và hình thành nên một màng điều kiện, đó là một khu vựcgiàu dinh dưỡng giúp thuận lợi cho sự trao đổi chất của các tế bào vi sinh vật [8]

Khi bề mặt điều kiện được hình thành, các thuộc tính của nó thay đổi để thu hút các

visinh vật Sự gắn kết của các vi sinh vật lên bề mặt nhờ lực liên kết van der Waals,lực hút tĩnh điện, tương tác ưa nước và các tương tác đặc biệt khác, hoặc bởi một sựkết hợp các liên kết này, tùy theo mức độ gần gũi của các vi sinh vật với bề mặt bámdính Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử dụng cáctiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ được bao bọctrong một mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [62] Tuy nhiên, các tếbào này chưa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh vật và có thể rời bề mặt

để tiếp tục đời sống phù du

1.4.1.2 Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch

Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không nhữngphải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trưởng để hình thành một màngsinh vật hoàn chỉnh Vì vậy, giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất ngoại bàonhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa tế bào và giáthể [60]

Các nghiên cứu trên gen chỉ thị cho thấy biểu hiện của gen sinh tổng hợp

alginate ở Pseudomonas aeruginosa algC và algD được điều hòa tăng lên trong 15

phút ngay sau khi có sự bám dính đầu tiên của vi khuẩn lên một bề mặt Mặc dù sựsản xuất alginate cũng được xem như là phương thức để hình thành nên bộ khung cấutrúc và hóa học của màng sinh vật [77], nhưng những nghiên cứu gần đây lại chứngminh rằng chính sự hiện diện của mạng lưới chất ngoại bào chứ không phải alginate

là thực sự cần thiết cho sự hình thành màng sinh vật của P.aeruginosa [54].

Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn bám dínhkhông thuận nghịch được thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi bám dính.Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi được đánh giá là quan trọngtrong bước đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận động co rútđược chỉ ra là cần thiết cho sự trưởng thành của màng sinh vật trong điều kiện tĩnh

Cụ thể, nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong màng

sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tương tác giữa các vi khuẩn với bề mặt

để hình thành nên các nhóm tế bào, qua đó giúp tăng cường mức độ bám dính với bềmặt [62]

1.4.1.3 Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới vi khuẩn lạc

Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục được tạo ra bởi các tế bào để liên kếtcác tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vikhuẩn lạc Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể là

từ nhiều loài khác nhau) trong môi trường Kết quả là mật độ tế bào trong một màngsinh vật cũng như lượng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên Một mạng lưới màngsinh vật dần được hình thành [76]

1.4.1.4 Giai đoạn 4: Hình thành một màng sinh vật hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trìnhtrưởng thành của màng sinh vật bắt đầu Trong suốt quá trình này, sự phân chia trựcphân của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các

tế bào phân chia để lan rộng và phát triển đầy lên từ các điểm gắn kết để hình thànhcác vi khuẩn lạc hay các cụm tế bào [40]

Bản chất của bề mặt là nơi bám dính của các vi khuẩn lạc và chính các điềukiện vật lý và hóa học của môi trường sẽ quyết định cơ chế hình thành màng sinh vậtnào là chiếm ưu thế Sự trưởng thành của màng sinh vật dẫn đến sự kế tiếp của cáccấu trúc dạng nấm hay dạng cột xen kẽ với các kênh chứa đầy dịch, và một khi pháttriển đến đầy đủ thì màng sinh vật sẽ cho thấy những mô hình biến đổi trong sự tăngtrưởng của vi khuẩn cũng như sự tương tác sinh lý và hiệu quả trao đổi chất [82]

1.4.1.5 Giai đoạn 5: Tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dưỡngcủa môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào Cácphân tử này được giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dưỡng, sựtích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH,

nguồn cung cấp cacbon, oxy [61] Trong một số trường hợp, khi màng sinh vật đạtđến khối lượng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời

và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc [46]

Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng quá trình tách rời là hết sức phứctạp Sự khác biệt về mặt tế bào và hoạt tính của nó tại các trung tâm của một cấu trúcmàng sinh vật trưởng thành dẫn đến sự phân tách tế bào từ bên trong cấu trúc màng,chuyển sang lấp đầy các khoảng trống của một màng sinh vật khác chưa hoàn thiện

Cơ chế tách rời của màng sinh vật liên quan đến sự phân hủy các tế bào bên trong cấutrúc của nó Enzyme lyase phân hủy polysaccarit đóng vai trò quan trọng trong sựphân rã màng sinh vật ở nhiều loài vi sinh vật bằng cách phân hủy mạng lưới chất nềnngoại bào được tạo ra từ các tế bào [44]

Boyd và Chakarabarty [9] đã chứng minh sự cảm ứng biểu hiện của enzyme

lyase phân giải alginate ở P aeruginosa làm giảm đáng kể tổng lượng sản xuất

alginate, tương ứng với sự tăng số lượng tế bào bị phân tách Điều này giúp các nhà

nghiên cứu khẳng định vai trò của enzyme phân giải alginate ở dạng P aeruginosa

hoang dại có thể là nguyên nhân giải phóng các tế bào khỏi các bề mặt rắn hay cácmàng sinh vật của chúng, làm phát tán những vi sinh vật vào trong môi trường nuôicấy

Quá trình tách rời cũng có nguyên nhân bởi các lực tương tác vật lý Brading

và cộng sự [10] đã nhấn mạnh tầm quan trọng của các tương tác vật lý trong sự táchrời, bao gồm 3 quá trình chính đó là: sự xói mòn hay phân cắt (liên tục loại bỏ nhữngphần nhỏ của màng sinh vật), sự bóc tách (loại bỏ nhanh chóng và với lượng lớn) và

sự bào mòn (sự tách rời do va chạm của lượng lớn các hạt phân tử chất lỏng với màngsinh vật) Characklis [12] nhận thấy rằng tỷ lệ xói mòn tăng lên cùng với độ dàymàng sinh vật và dòng chất lỏng tại bề mặt giao diện với màng sinh vật mà ở đómàng dày lên Với sự gia tăng của tốc độ dòng chảy, thủy động lực học của lớp ranhgiới giảm, dẫn đến sự pha trộn và nhiễu loạn ở gần bề mặt màng sinh vật Sự bóc táchxảy ra ngẫu nhiên hơn sự xói mòn và được cho là kết quả của sự suy giảm chất dinhdưỡng và oxy trong cấu trúc màng sinh vật

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật

Trong tự nhiên, màng sinh vật có thể được hình thành trên các bề mặt khácnhau bao gồm cả các mô sống, các thiết bị, dụng cụ y tế, các hệ thống ống nước cấutạo từ các vật liệu khác nhau Do vậy, để chuyển từ dạng sống tự do sang dạng cấutrúc màng sinh vật đòi hỏi một loạt những điều kiện nhất định Trong đó, ba yếu tốchính quy định nên sự hình thành màng sinh vật bao gồm:

Tính chất bề mặt giá thểĐiều kiện môi trườngĐặc tính tế bào của các chủng vi sinh vật [45]

1.4.2.1 Tính chất bề mặt giá thể

Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế bàobởi vậy mỗi loài vi khuẩn chỉ hình thành màng sinh vật trên một số loại bề mặt vớitính chất nhất định

Sự phát triển của các tế bào bên trong màng sinh vật đã được chứng minh là cótăng lên khi tăng mức độ thô ráp của bề mặt Characklis và cộng sự [12] đã ghi nhậnmức độ bám dính của khuẩn lạc vi sinh vật gia tăng khi các bề mặt càng ghồ ghề.Điều này được giải thích là do ở bề mặt thô nhám, lực tương tác giữa các tế bào với

bề mặt giảm đi và diện tích tiếp xúc được tăng lên đáng kể so với các bề mặt trơnnhẵn

Tính chất hóa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ vàmức độ bám dính của tế bào lên bề mặt Hầu hết các nghiên cứu cho thấy rằng các

vi sinh vật gắn kết với một bề mặt kị nước, không phân cực như Teflon và nhựanhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt một vật liệu ưa nước như thủy tinh hay kim loại[7]

Bên cạnh đó, diện tích bề mặt là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởngđến sự phát triển của màng sinh vật Theo nguyên tắc, diện tích bề mặt càng lớn cànglàm tăng khả năng tiếp xúc với tế bào, qua đó tạo điều kiện cho việc bám dính lên bềmặt giá thể Các hệ thống ống dẫn khác với hầu hết các môi trường tự

nhiên (ao hồ, sông …) là thường có một diện tích bề mặt khá lớn tạo điều kiện choviệc tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn và bề mặt.

1.4.2.2 Điều kiện môi trường

Các đặc trưng hóa lý của môi trường như nhiệt độ, pH, mức độ dinh dưỡng,nồng độ các ion, đóng một vai trò quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ gắn kết của visinh vật lên bề mặt

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng bám dính của vi sinh vật và sự hìnhthành màng sinh vật cũng chịu ảnh hưởng của nhịp điệu mùa ở các lưu vực nước khácnhau [27] Hiệu ứng này có được là do ảnh hưởng của nhiệt độ nước theo mùa lên cácthông số tăng trưởng của vi sinh vật Fletcher và cộng sự [32] cũng đã chứng minh sựgia tăng nồng độ của một số cation (Na+, Ca2+, Fe3+, La+) ảnh hưởng đến khả năng

bám dính của chủng Pseudomonas fluorescens lên bề mặt thủy tinh, bằng cách làm

giảm lực tương tác giữa các tế bào vi khuẩn với bề mặt kính Nghiên cứu của Cowan

và cộng sự [17] cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ thuận với sốlượng gắn kết của các tế bào vi khuẩn lên bề mặt

Việc tạo màng sinh vật có thể coi như là một cách thức tồn tại, phát triển của

visinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của môi trường Cơ chế của quátrình này có thể được hiểu như sau: khi lượng chất dinh dưỡng bao gồm nguồncacbon, nitơ bị giảm sút thì các vi sinh vật sống trôi nổi trong môi trường nước sẽ có

xu hướng tập trung đến nơi có nguồn dinh dưỡng tích tụ Khi các hợp chất hữu cơtích tụ lại trên bề mặt, chúng sẽ thu hút các vi khuẩn, tảo và động vật nguyên sinhđến, theo thời gian sẽ phát triển thành một màng sinh vật

1.4.2.3 Đặc tính của tế bào

Mặc dù màng sinh vật là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong môitrường tự nhiên nhưng không phải vi sinh vật nào cũng có khả năng hình thành màngsinh vật Các đặc tính của tế bào bao gồm các cấu trúc phụ trợ như lông roi, tiêmmao, khả năng di động, bám dính, khả năng tạo các chất ngoại bào (protein,polysaccarit), cảm biến mật độ (quorum sensing) ảnh hưởng lớn đến việc hình thành

màng sinh vật Thí nghiệm so sánh giữa hai chủng Pseudomonas fluorescens của

Davey và cộng sự [19] đã cho thấy chủng di động có khả năng hình thành màng sinhvật nhanh hơn so với chủng không di động

Tuy nhiên, một số loài không có phần phụ trợ tế bào nhưng vẫn có khả nănghình thành màng sinh vật mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp các chất ngoại bào nhưlipopolysaccarit, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng giáp (capsule), màng nhày(slime) bao quanh tế bào Đặc tính này tạo tính tự kết dính cho tế bào và chủ yếu có

trong những loài vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus mutants, Streptococcus salivarius, Xanthomonas, Bacillus anthracis [15].

1.4.3 Điều hòa quá trình hình thành màng sinh vật

Quá trình chuyển từ dạng sống phù du sang kiểu tăng trưởng bám dính trên bềmặt thực hiện theo một con đường phức tạp và cần một cơ chế điều hòa kiểm soát sựhoạt động của các gen biểu hiện sự hình thành màng sinh vật Bằng kỹ thuật di truyền

và sinh học phân tử kết hợp với phương pháp kính hiển vi tiên tiến đã góp phần làmsáng tỏ cơ chế điều hòa và các yếu tố cơ bản của quá trình hình thành màng sinh vật

1.4.3.1 Con đường dẫn truyền tín hiệu hai thành phần

Sự bám dính của tế bào với bề mặt phụ thuộc vào cả yếu tố cơ hội (tức là khảnăng có hay không sự tiếp xúc trực tiếp của vi khuẩn với bề mặt) và cả sự tương tácthuận lợi giữa tế bào và bề mặt tiếp xúc để có thể vượt qua lực đẩy giữa hai bề mặt[35]

Mặc dù sự tiếp xúc ban đầu giữa tế bào vi sinh vật và bề mặt không nhất thiếtđòi hỏi sự điều hòa, nhưng các bằng chứng trong nghiên cứu đã cho thấy rằng sự hìnhthành những tương tác ổn định giữa tế bào và bề mặt được điều hòa bởi hệ thống tínhiệu hai thành phần Hệ thống này bao gồm hai protein: một protein cảm biến kinaseđóng vai trò nhận biết tín hiệu từ môi trường, tự động phosphoryl hóa, sau đó kíchhoạt thành phần protein còn lại, đó là một phân tử điều hòa phản ứng Phân tử điềuhòa phản ứng này hoạt động như là một nhân tố hoạt hóa gen, kích

thích sự phiên mã cho phép vi khuẩn nhanh chóng thích nghi với các điều kiện củamôi trường [52].

1.4.3.2 Các yếu tố điều hòa sự trao đổi Cacbon

Trong hệ gen của một số vi khuẩn có chứa gen mã hóa cho một nhân tố điều

hòa trao đổi nguồn cacbon cần thiết cho sự hình thành màng sinh vật Ở P.aeruginosa

là gen crc còn ở E.coli là csrA Nghiên cứu của O’Toole và cộng sự

[61] chứng minh rằng gen crc được kích hoạt bởi các sản phẩm trung gian của

Nghiên cứu của Jackson và cộng sự [42] về sự ảnh hưởng của nhân tố CsrA

lên sự hình thành màng sinh vật cho thấy: Khác với chủng P aeruginosa, sự gián đoạn trong biểu hiện của gen csrA làm tăng khả năng hình thành màng sinh vật hơn

so với chủng hoang dại Tác dụng chính của nhân tố CsrA được biết đến chỉ như làmột chất điều hòa sự chuyển hóa glycogen - nguồn cacbon chính trong giai đoạn tổnghợp các yếu tố cần thiết như tiêm mao và các chất bám dính trong quá trình hìnhthành màng sinh vật Cho nên một sự tăng cường quá mức CsrA có thể dẫn đến ứcchế sự hình thành màng sinh vật

1.4.3.3 Sự điều hòa phụ thuộc các giai đoạn

Trong nhiều nghiên cứu, người ta đã chứng minh được rằng nhân tố RpoSđóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của màng sinh vật Tuynhiên yếu tố này lại xuất hiện không giống nhau trong các giai đoạn phát triển của

từng loài vi sinh vật Nếu như ở E coli, người ta thấy được sự xuất hiện của RpoS với nồng độ thấp ở pha tăng trưởng lũy thừa và có sự tích tụ lại thì ở P aeruginosa, sự

hiện diện của RpoS được ghi nhận ở đầu pha cân bằng [33]

Sự sản xuất RpoS được điều hòa ở nhiều mức độ khác nhau giúp tế bào đápứng với các điều kiện stress của môi trường, bao gồm cả sự giới hạn về mặt dinh

dưỡng RpoS điều chỉnh độ dày của cấu trúc màng sinh vật cho phép tế bào thu nhậntối đa nguồn chất dinh dưỡng [75].

Khi màng sinh vật đạt kích thước đủ lớn, các tế bào trung tâm giảm hấp thụcác chất dinh dưỡng, dẫn đến kích hoạt RpoS, là tín hiệu giúp tế bào nhận biết sự giớihạn của nguồn chất dinh dưỡng trong màng sinh vật Do đó, các tế bào liên kết trongmàng sinh vật được giải phóng ở dạng tế bào trôi nổi tự do di chuyển đến môi trườngmới thuận lợi hơn [76]

1.4.3.4 Cơ chế cảm biến tới hạn (Quorum sensing)

Thông tin liên lạc nội bào giữa các vi sinh vật được thực hiện chủ yếu thôngqua các sản phẩm của vi sinh vật khuếch tán từ tế bào này sang tế bào khác Một sảnphẩm tiêu biểu cho các phân tử cảm biến tín hiệu được biết đến là acyl - HSL [45]

Nghiên cứu trên chủng P aeruginosa cho thấy các phân tử acyl - HSL chịu

trách nhiệm xác định sự tách biệt các khối tế bào vi sinh vật trong cấu trúc không gian

ba chiều của màng sinh vật, góp phần giữ cho cấu trúc màng sinh vật ổn định Các

chủng P aeruginosa đột biến không sản xuất được acyl - HSL dẫn đến các tế bào

trong màng sinh vật được đóng gói chặt chẽ với nhau và dễ dàng bị phá vỡ bởi SDS.Acyl - HSL cũng là các phân tử trung gian trong bề mặt bám dính ở chủng

Pseudomonas fluorescens [83].

Mặc dù còn khá ít những hiểu biết về vai trò của các tín hiệu nội bào trongmàng sinh vật đa loài, song các nhà nghiên cứu tin rằng có một sự khác biệt đáng kểgiữa chúng với các màng sinh vật đơn loài [45] Những nghiên cứu về các tín hiệu nộibào ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật vẫn đang là một trong những vấn đề

vô cùng thú vị cần được nghiên cứu

1.5 Nghiên cứu ứng dụng màng sinh vật

1.5.1 Ứng dụng màng sinh vật trong việc xử lý nước thải

Xử lý nước thải môi trường, nhất là trong tình hình thực tiễn hiện nay là mộtvấn đề mang tính thời sự cấp thiết Bởi lẽ xử lý nước thải không chỉ nhằm mục đích

cải thiện điều kiện vệ sinh môi trường sống của con người mà xa hơn còn nhằm duytrì cân bằng sinh thái, tạo điều kiện phát triển bền vững lâu dài cho loài người Hiệnnay, việc xử lý nước thải nói chung theo hướng áp dụng các kỹ thuật sinh học rấtđược chú trọng do chúng có tính bền vững, thích nghi với nhiều điều kiện trong tựnhiên.

Trong cấu trúc màng sinh vật, các vi sinh vật liên kết với nhau chặt chẽ, tạo ramột cấu trúc bền vững, hoạt động có hiệu quả hơn trong việc xử lý nước thải Đồngthời, các vi sinh vật trong mạng lưới màng sinh vật sẽ cùng hợp tác trao đổi chất giúpcho quá trình loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong nước diễn ra dễ dàng và hiệu quả[76]

So sánh với việc sử dụng các chủng vi sinh vật trôi nổi để xử lý nước thải thìcông nghệ xử lý sinh học nước thải bằng màng sinh vật mang lại nhiều lợi ích đáng

kể Một là, mật độ các chủng vi sinh vật trong màng sinh vật cao hơn nhiều, tạo điềukiện xử lý tối đa nguồn nước thải Hai là, ngoài việc loại bỏ các chất không mongmuốn trong nước thải thì quá trình tiếp theo là loại bỏ các vi sinh vật này khỏi môitrường Đối với các tế bào trôi nổi, việc khử trùng nguồn nước sẽ tốn một chi phí lớn,

do vậy việc áp dụng màng sinh vật trên các giá thể cố định thể hiện ưu thế lớn Vớinhững ưu điểm này, các nhà khoa học đã đề xuất công nghệ xử lý nước thải ứng dụngmàng sinh vật được xem là giải pháp thân thiện môi trường [50]

1.5.2 Ứng dụng màng sinh vật trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại

Đấu tranh phòng trừ bệnh gây hại cho cây trồng đã và đang là hướng nghiêncứu rất được quan tâm ứng dụng trong ngành nông nghiệp Và một trong những biệnpháp được ưa chuộng đó là đấu tranh sinh học Trong đó, nhiều nghiên cứu cho thấyrằng các vi sinh vật có thể hoạt động như một tác nhân đối kháng với nhiều mầmbệnh khác nhau ở thực vật bao gồm các loại sâu bọ và các mầm bệnh vi sinh vật nhưnấm, xạ khuẩn, vi khuẩn

Các vi sinh vật có thể tồn tại tự do trong đất hoặc bám dính với bề mặt môthực vật thành từng cụm tế bào Mối quan hệ này phần lớn mang lại lợi ích cho cả haibên: thực vật là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng và nơi khu trú lâu dài cho các

quần thể vi sinh vật Mặt khác, các vi sinh vật trong mối tương tác này có thể làmthay đổi môi trường sống xung quanh theo hướng có lợi cho sự phát triển của thựcvật [69].

Một trong những cơ chế giúp các vi sinh vật ức chế mầm bệnh gây hại ở cây

trồng đó là thông qua chất kháng sinh Ví dụ, chủng Bacillus cereus UW85 có khả

năng tổng hợp cả zwittermycin và kanosamine [69] Khả năng tổng hợp chất khángsinh giúp làm tăng tính cạnh tranh giữa các nhóm vi sinh vật; đồng thời cũng là cơ sở

để tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có khả năng phòng trừ bệnh gây hại ở thực vật chủyếu dưới dạng phân bón vi sinh bổ sung vào nguồn đất trồng

Bais và cộng sự [5] đã chứng minh rằng nhờ quá trình hình thành màng sinh

vật trên rễ cây Arabidopsis, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 6051 đã tạo ra surfactin

ức chế sự xâm nhiễm của chủng P syringae gây hại cây trồng.

Khả năng đối kháng của chủng Bacillus thuringiensis chống lại tác nhân gây bệnh cây trồng Erwinia carotovora đã được chứng minh qua nghiên cứu của Morikiwa [56] E carotovora sản xuất các phân tử tín hiệu cảm ứng mật độ tế bào acyl - HSL và biểu hiện gen gây độc, trong khi đó các chủng B thuringiensis có enzyme acyl - homoserine lactonase, làm giảm mạnh acyl - HSL Do vậy, B thuringiensis làm giảm đáng kể khả năng nhiễm và phát triển của E carotovora - tác

nhân gây bệnh thối củ ở khoai tây

1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác

 Ứng dụng của màng sinh vật làm giảm sự ăn mòn kim loại

Vi khuẩn gây ra sự ăn mòn kim loại được biết đến là các chủng vi khuẩn khử

sulfate Desulfosporosinus orientis và vi khuẩn oxy hóa sắt Leptothrix discophora

SP-6 D orientis gây ra sự ăn mòn ở gang, thép cacbon, thép không gỉ và một số hợp kim

khác Hằng năm, thiệt hại do sự ăn mòn kim loại gây ra ở Mỹ là 4 - 6 tỷ USD [34] Vikhuẩn này có chứa enzyme hydrogenase sử dụng hydrogen như một chất cho điện tử

để thu nhận năng lượng gây ra hiện tượng ăn mòn điện hóa ở các bề mặt kim loại

Trong khi đó, vi khuẩn L discophora SP-6 oxy hóa sắt, tự nó không gây ra sự ăn mòn

đáng kể thép nhẹ (thép ít cacbon), nhưng khi có sự kết hợp

với D orientis và Paenibacillus polymyxa 10401 thì tốc độ ăn mòn thép nhẹ sẽ tăng

lên rất lớn [28] Nghiên cứu của Morikawa [56] cho thấy sự hình thành màng sinh vật

ở chủng Bacillus brevis 18-3 đã tạo ra gramicidin làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D orientis và L discophora SP-6.

 Trong công nghiệp lên men

Trong các bồn lên men ở quy mô công nghiệp, màng sinh vật là hình thứchiệu quả để giữ lại sinh khối vi sinh vật [47]

Sau mỗi mẻ lên men, các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng giữ lại trong cácbồn lên men Do đó, mỗi khi tiếp tục một quy trình mới lại phải bổ sung thêm mộtlượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triểntới một nồng độ nhất định mới Quy trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầuvào cũng như mất thời gian vận hành

Ngược lại, khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới màng sinhvật sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lýcũng như tái sử dụng được ở những lần xử lý tiếp theo mà không cần phải bổ sungthêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển

 Ứng dụng trong công nghiệp dầu khí

Nghiên cứu khả năng tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học

(biosurfactant) hoạt tính cao từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, được phân

lập từ nguồn nước thải nhiễm dầu [67] mở ra triển vọng ứng dụng trong công nghiệpdầu khí với các mục đích như nâng cao hệ số thu hồi dầu, xử lý môi trường, làm chấtphân tán và nhũ hóa cặn dầu

Nghiên cứu về màng sinh vật đã và đang là lĩnh vực thu hút sự quan tâm củarất nhiều nhà khoa học, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về tác hại cũng như lợi ích ứngdụng của màng sinh vật trong đời sống Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu thu nhậnđược từ các công trình khoa học nước ngoài Tài liệu về màng sinh vật ở Việt Namcòn tương đối ít và nghiên cứu về màng sinh vật còn chưa nhiều, chưa sâu Đề tàinghiên cứu của chúng tôi với mục đích tạo thêm cơ sở dữ liệu khoa học về các

chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật từ môi trường nước thải giàunguồn cacbon ở các khu vực làng nghề và nhà máy sản xuất và đưa ra một số ứngdụng theo hướng xử lý nước thải môi trường.

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinhvật có khả năng tạo thành màng sinh vật và ứng dụng trong xử lý nước thải cũng như

ức chế các vi sinh vật gây hại, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn và lấy mẫu nước thảitại một số khu vực ô nhiễm làng nghề ở Việt Nam Mẫu được lấy vào thời điểm cácbuổi sáng trong ngày, chứa trong các ống falcon đã khử trùng rồi đem về phòng thínghiệm để phân tích Cụ thể, tại các địa điểm sau:

Thứ nhất, nguồn nước thải tại làng miến Lại Trạch Yên Phú Yên Mỹ Hưng Yên: Hệ thống thoát nước và hồ lắng của làng miến chứa lượng nước thải lớnlẫn cặn bột và bã bột dong Mẫu nước thải được lấy tại các hồ lắng này

-Thứ hai, nguồn nước thải tại làng bún Phú Đô - Mễ Trì - Từ Liêm - Hà Nội:Toàn bộ nước thải của quá trình làm bún được thải trực tiếp ra các cống, rãnh của cảlàng Do vậy, khu vực nước thải làng nghề nơi chúng tôi lấy mẫu có một màu trắngđục, chua và hôi

Thứ ba, nguồn nước thải tại nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp thựcphẩm - Thanh Xuân - Hà Nội: Nguồn nước thải được sử dụng là nước thải của xưởngbia - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã được tách cặn thông qua bể lắng sơ bộ Nguồnnước thải có thành phần COD 2500 - 3000 (mg/l), BOD5 1500 - 2000 (mg/l), pH 4,5 -5,5 Chỉ số COD cao chủ yếu là do trong thành phần nước thải có chứa nhiều tinh bột

và các chất hữu cơ

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định

Các vi sinh vật kiểm định được sử dụng trong đề tài bao gồm: Staphylococcus aureus; Ralstonia solanacaerum; Samonella typhi; E coli; Vibrio parahaemolyticus

do bộ môn Vi sinh thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà

Nội phối hợp cung cấp

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường LB (Luria - Bertani broth hay Luria broth):

Môi trường khoáng cơ bản:

Các môi trường đều được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120phút Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu, đánh giá khả năng tạo màng sinhvật như các loại đường Fructose (Sigma - Mỹ); Arabinose (Merk - Đức), Mannose(Merk - Đức), NaCl (Công ty cổ phần Hóa chất Đức Giang)… đều đạt độ tinh sạchcho mục đích nghiên cứu.

2.2.2 Máy móc, thiết bị

Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản)

Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức)

Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý)

Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức)

Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ)

Máy đo pH (Horiba - Nhật Bản)

Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh)

Tủ ấm (Memmert - Đức)

Tủ sấy (Memmert - Đức)

Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA RET - Đức)

Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nước thải, sử dụng phương pháp pha loãngmẫu trong nước cất vô trùng

Mẫu sau khi pha loãng được cấy gạt dịch ở các nồng độ từ 10-1, 10-2 đến 10-5trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch Các đĩa sau khi cấy trải được nuôi cấytrong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ Các khuẩn lạc xuất hiện vàđược quan sát sau thời gian ít nhất là 24 giờ Các khuẩn lạc sau khi phát triển sẽ đượctách riêng rẽ và được nuôi cấy trên môi trường phù hợp hoặc LB có bổ sung thạch

2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

 Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng

Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch, các

visinh vật được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khửtrùng

Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 37oCtrong thời gian 24 giờ Các ống giống sau khi phát triển sẽ được lấy ra và cho vào tủlạnh giữ ở 4oC Hàng tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môitrường mới

 Phương pháp bảo quản giống lâu dài

Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trongmôi trường glycerol theo tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ lạnh sâu -80oC

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật

Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một sốchủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể Việc pháthiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộmmàu với dung dịch tím kết tinh 1% (w/v) Tím kết tinh (crystal violet hay Gentianviolet) là một thuốc nhuộm hóa học triarylmethane có công thức phân tử là

C25H30N3Cl, công thức cấu tạo là [C(C6H4N(CH3)2)3]Cl - Tris (4-(dimethylamino)phenyl) methylium chloride Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các

tế bào sống, sự thay đổi về cường độ màu thể hiện mức độ và số lượng của các tế bào

vi sinh vật

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [62] Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật sau khi tách riêng rẽ sẽ được nuôi cấy kíchhoạt trong bình tam giác chứa 10ml môi trường LB lỏng trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,3 - 0,4 Hút 100 l dịch nuôi cấy vi khuẩn

bổ sung vào 700 l LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiệntĩnh ở 37oC.

Sau 24 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf Đánh giámật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học

ở bước sóng 620 nm (OD620) dịch nuôi cấy vi khuẩn

Phương pháp quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật:

Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng Sau đó mỗiống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ởnhiệt độ phòng Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lầnbằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kếttinh

Mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng độ hấp thụ ánhsáng ở bước sóng 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]: Sau khirửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tantrong 1ml etanol 70o Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo

độ hấp thụ OD 570 nm

2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật

Mỗi chủng vi sinh vật tùy theo đặc tính sinh học của chúng chỉ có thể tạothành màng sinh vật tốt nhất ở những điều kiện thích hợp về nhiệt độ, pH, các nguồncarbon, nitơ

2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽđược nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện nhiệt độ môi trường khácnhau Các nhiệt độ được lựa chọn nghiên cứu là: 20oC, 30oC, 37oC, 40oC, 50oC và

60oC Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo thành màng sinhvật của các chủng vi sinh vật nghiên cứu bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm theophương pháp của Morikawa và cộng sự [57]