Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng 10 HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---Văn Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10-HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Văn Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10-HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-VĂN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP

10-ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân thành cảm ơn PGS.TS Dương Hồng Anh đã giao đề tài, nhiệt tìnhhướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luậnvăn

Tôi xin trân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Môi trường và Phát triểnBền vững – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện và cung cấp cáctrang thiết bị nghiên cứu, đặc biệt là các anh chị, các bạn trong nhóm Điện di maoquản đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài, luậnvăn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài QG.18.05 của Đại học Quốc gia Hà Nội.Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Hóa học nói chung và Bộmôn Hóa Phân tích nói riêng đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian họctập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên

Bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này

Học viên

Văn Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 SỮA ONG CHÚA 3

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của sữa ong chúa 3

1.1.2.Thành phần hóa học của sữa ong chúa 4

1.1.3.Thu hoạch sữa ong chúa 7

a Quy trình bắt cóc ong chúa 7

b.Quy trình giả làm tổ ong chúa 7

1.1.4.Tác dụng của sữa ong chúa 8

1.2.Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic (10-HDA) 9

1.2.1.Một số nghiên cứu về 10-HDA 11

a.Hoạt tính sinh học 11

b.Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa 13

c.So sánh phương pháp và đề xuất phương pháp thích hợp 17

1.3.Giới thiệu về phương pháp điện di mao quản 18

1.3.1.Dòng điện di thẩm thấu (EOF) 20

1.3.2.Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 21

1.3.3.Kỹ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 22

1.3.4.Các thông số đánh giá trong phương pháp điện di mao quản 23

1.3.5.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện di mao quản 24

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 26

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên CE 26

2.2.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu 27

2.3 Đánh giá phương pháp 28

2.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 30

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 30

2.3.2 Hóa Chất 31

2.4 Thông tin mẫu thực 32

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1.Khảo sát điều kiện tối ưu nhằm phân tích hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa bằng phương pháp CE-C4D 35

3.1.1 Khảo sát thành phần và pH của dung dịch đệm điện li 35

3.1.2 Khảo sát nồng độ và pH của dung dịch đệm điện li 37

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu 39

3.1.4 Khảo sát điện thế tách 41

3.2 Khảo sát và tối ưu quy trình xử lí mẫu 42

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến diện tích píc của 10-HDA 42

3.2.2 Khảo sát dung môi hòa tan 45

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ thành phần dung môi hòa tan 47

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 49

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn, xác định hệ số tương quan 49

3.3.2 Đánh giá độ chụm 51

3.3.3 Độ đúng (độ thu hồi) 52

3.3.4 So sánh với phương pháp tiêu chuẩn HPLC 54

3.3.5 Phân tích mẫu thực tế 55

KẾT LUẬN ………57

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ 4

Bảng 1.2 Thành phần của sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô 6

Bảng 1.3 Đề suất hàm lượng của một số quốc gia và tổ chức 10,11 Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu được nghiên cứu 33,34 Bảng 3.1 Điều kiện thiết bị điện di mao quản 42

Bảng 3.2 Khảo sát diện tích pic trung bình của 10-HDA với các tỉ lệ dung môi khác nhau 48

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ 10-HDA 50

Bảng 3.4 Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường 51

Bảng 3.5 Các thông số đánh giá phương pháp 52

Bảng 3.6 Giá trị độ lệch chuẩn 53

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của 10-HDA 54

Bảng 3.8 Kết quả so sánh giữa CE-C4D và HPLC với số mẫu thực tế 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sự phát triển của ấu trùng bên trong sữa ong chúa 4

Hình 1.2: Sữa ong chúa 4

Hình 1.3: Công thức hóa học của 10-hydroxyl-trans-2-decenoic acid (10-HDA) 9

Hình 1.4: Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơn giản 19

Hình 1.5: Hệ điện di mao quản 1 kênh 19

Hình 1.6: Bộ ghi tín hiệu 19

Hình 1.7: Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong 21

Hình 1.8: Cấu tạo detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 22

Hình 1.9: Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 23

Hình 3.1: Điện di đồ của lựa chọn thành phần đệm (tại pH 9) phân tích 10-HDA (20 mg/L) 36

Hình 3.2 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 20 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 37

Hình 3.3 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 50 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 38

Hình 3.4 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 100 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 38

Hình 3.5 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới tín hiệu của 10-HDA 40

Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách tới tín hiệu 10-HDA 41

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến việc phân tích 10-HDA (mẫu 1) 43

Hình 3.8 Điện di đồ phân tích 10-HDA với ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, lọc bằng PTFE, nilon và xenlulozo axetat 44

Hình 3.9 Điện di đồ phân tích 10-HDA với không ly tâm, lọc bằng PTFE, nilon và xenlulozo axetat 44

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện diện tích pic trung bình của 10-HDA với các dung môi hòa tan 46

Hình 3.11 Điện di đồ phân tích 10-HDA với các dung môi chiết khác nhau (mẫu 1) 46

Hình 3.12 Điện di đồ phân tích 10-HAD với các tỉ lệ dung môi chiết khác nhau (mẫu

4) 48Hình 3.13 Đường chuẩn 10-HDA 50Hình 3.14 Điện di đồ phân tích 10-HDA trong mẫu chuẩn, mẫu thực và mẫu thêm

chuẩn 53Hình 3.15 Điện di đồ phân tích 10-HDA trong một số mẫu sản phẩm sữa ong chúa;mẫu 1: sữa ong chúa tươi, mẫu 3: sữa ong chúa/ấu trùng đông khô dạng bột, mẫu 4

và 5: sữa ong chúa đông khô dạng gel , mẫu 7: mật ong sữa chúa 55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

10-HAD Axit 10-Hydroxy-2-decenoic

C4D Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CHES Axit N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic

GC-MS Sắc kí khí – detector khối phổ

IDL Giới hạn phát hiện của thiết bị

IQL Giới hạn định lượng của thiết bị

Leff Chiều dài hiệu dụng của mao quản

MDL Giới hạn phát hiện của phương pháp

MQL Giới hạn định lượng của phương pháp

MECC Điện di mao quản kiểu mixcelle

MES Axít 2-(N-morpholino) ethanesulfonic

MOPS Axít 3-(N-morpholino) propanesulfonic

UV – Vis Quang phổ hấp thụ phân tử

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, các ngành sản xuất thực phẩm chức năng và sảnphẩm làm đẹp ngày càng phát triển trên toàn thế giới đặc biệt là ở Việt Nam giúp duytrì sức khỏe, cải thiện nét đẹp của con người Các sản phẩm làm đẹp và dinh dưỡnghiện nay tập trung chủ yếu vào những sản phẩm tự nhiên có sẵn như sữa ong chúa,đông trùng hạ thảo, sâm… Trong dân gian, Sữa ong chúa (RJ) đã được biết đến với

nhiều tác dụng như cải thiện trí nhớ, tăng năng lượng, giảm lo lắng hoặc căng thẳng,kháng viêm, chống ung thư, và đặc biệt có khả năng chống oxi hóa, ngăn ngừa lãohóa Nhiều năm trở lại đây, sữa ong chúa đã được sử dụng trong các chế độ ănkiêng, làm đẹp và trở thành sản phẩm thương mại được ưa dùng Với thành phầnhóa học đa dạng phong phú, giàu protein, chứa nhiều axit amin thiết yếu, các axitbéo cần thiết như axit pantothenic (B-5) và pyridoxin (B-6) … sữa ong chúa cónhiều tác dụng tốt với con người ở mọi lứa tuổi

Trong tất cả các sản phẩm làm từ ong như phấn hoa, keo ong, mật ong, … thìđiểm khác biệt giữa sữa ong chúa và những sản phẩm khác là chỉ trong sữa ongchúa có thành phần axit 10-Hydroxy-2-decenoic (10-HDA) Do đó sự hiện diện của10-HDA có thể được sử dụng làm dấu chuẩn (“marker”) để phân biệt sữa ong chúavới các sản phẩm khác Và hàm lượng của 10-HDA có thể được sử dụng như mộtthông số cho chất lượng sữa ong chúa Theo quy định của Bộ Nông nghiệp (MOA)Trung Quốc, hàm lượng 10-HDA không được thấp hơn 1,4% đối với sữa ong chúanguyên chất dạng kem và 4,2% đối với dạng đông khô Đã có nhiều nghiên cứukhẳng định tác dụng chống và ngăn ung thư, kháng viêm và chống oxi hóa,… của10-HDA [9] Với những tác dụng của sữa ong chúa và đặc biệt là 10-HDA đã dẫnđến sự nhập khẩu số lượng lớn sữa ong chúa mỗi năm ở nhiều quốc gia Nhu cầu sửdụng tăng cao dẫn đến sự xuất hiện của các mặt hàng giả, hàng kém chất lượng Vìvậy, các nghiên cứu về thành phần của sữa ong chúa được sản xuất, đánh giá chấtlượng của các sản phẩm thương mại là rất cần thiết

Việc phân tích 10-HDA ở Việt Nam hiện này vẫn là vấn đề mới, chưa có tiêuchuẩn quy định cho sản phẩm cũng như quy trình tiêu chuẩn theo QCVN 10-HDAđược phân tích định tính, định lượng chủ yếu bằng phương pháp sắc ký (như: sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC-MS),…) Các phương pháp nàyđều có độ nhạy, độ chính xác cao, nhưng phải sử dụng thiết bị có chi phí đầu tư lớn và

sử dụng nhiều dung môi hữu cơ Việc xây dựng một phương pháp phân tích nhanh,thuận tiện, dễ áp dụng và kinh tế để xác định 10-HDA là nhu cầu cần thiết trong điềukiện Việt Nam, một trong số các lựa chọn đó là phương pháp điện di mao quản.Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụđiện (CE-C4D) gần đây được biết đến là một công cụ hữu hiệu trong phân tích thựcphẩm với các ưu điểm nổi trội như thiết bị nhỏ gọn có thể chế tạo và linh kiện thay thếsẵn có tại Việt Nam, hoạt động đơn giản, lượng mẫu và dung môi hóa chất ít, chi phíđầu tư và vận hành thấp, từ đó cho chi phí phân tích mẫu thấp hơn so với các phương

pháp phân tích sắc ký Với đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm

lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di

mao quản”, bản luận văn này tập trung vào các mục tiêu nghiên cứu phát triển ứng

dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúctheo kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định 10-HDA trong một số sản phẩmsữa ong chúa

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm của sữa ong chúa

Sữa ong chúa là thức ăn duy nhất của ong chúa và các ấu trùng ong, được sảnsinh từ tuyến tiết niệu và tuyến sau tại vùng hàm dưới của ong thợ trên 7 ngày tuổi [17].Ong thợ chọn một vài ấu trùng nhỏ để phát triển thành ong chúa và cho chúng ăn mộtlượng lớn sữa ong chúa, kiểu cho ăn này kích hoạt sự phát triển về kích thước, khảnăng sinh sản và tuổi thọ Ong chúa dùng loại thức ăn này cả cuộc đời, còn những ấutrùng ong được dùng trong 3 ngày đầu tiên của cuộc đời đến ngày thứ tư thì đượcchuyển qua ăn mật ong và phấn ong, lớn lên thành ong thợ, điều này gây ra sự khác biệtgiữa ong chúa và ong thợ Ong chúa là con ong cái duy nhất có quyền đẻ trứng trongđàn ong, dài và to hơn các ong đực, ong thợ (là ong cái mất khả năng sinh sản và cókhả năng làm ra mật), cánh ngắn hơn thân, có nhiệm vụ đẻ trứng nhưng không làm ramật Tuổi thọ của ong chúa khoảng 5 - 6 năm, gấp 40 lần so với ong thợ là chỉ sốngđược từ 30 - 40 ngày tuổi Vào thời gian sinh sản, ong chúa có thể đẻ lên đến 2000 quảtrứng trong một ngày (lớn hơn cả trọng lượng cơ thể của nó) Kích thước cơ thể củaong chúa lớn gấp rưỡi ong thợ, không có giỏ phấn hóa trên chân sau của mình và không

có tuyến giáp như ong thợ Mỗi tổ chỉ có một con ong chúa, nếu trong tổ có nhiều ong

sẽ tách thành tổ mới, thường vào mùa xuân Ong chúa sinh sản tốt nhất là đầu năm.Nếu mất ong chúa, các ong thợ có thể tạo chúa mới [3, 13, 25]

Ong là côn trùng, không có tuyến vú nên không tiết sữa Sở dĩ gọi là “sữa” vìloại thức ăn đặc biệt này ở nhiệt độ thường sánh như bơ, khi nằm trong nụ chúa, nó

có màu trắng ngà giống sữa, và nó dùng để nuôi các ấu trùng ong non

Hình 1.1 Sự phát triển của ấu trùng

bên trong sữa ong chúa

Hình 1.2 Sữa ong chúa

Quy trình phát triển của ong chúa và ong thợ được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ

1.1.2 Thành phần hóa học của sữa ong chúa

Sữa ong chúa có thành phần hóa học đa dạng và phong phú, bao gồm cácthành phần chính là nước, cacbonhydrat, protein, lipit và axit béo, còn lại là cácvitamin, amino axit tự do, muối khoáng… Hàm lượng của các thành phần trong sữaong chúa được thể hiện trong bảng 1.2 [12, 27]

Hàm lượng các nhóm chất trong sữa ong chúa thay đổi phụ thuộc vào nguồnsản xuất như chất lượng đàn ong, thời tiết, môi trường nuôi; vào điều kiện bảo quảnnhư nhiệt độ, thời gian

Nước (60%-70%): Hàm lượng nước trong sữa ong chúa khá ổn định, chiếm

khoảng 60% với mọi điều kiện thu hoạch, bảo quản khác nhau và có cùng hoạt độ

aw (là lượng nước có trong sữa ong chúa) là khoảng 0,92 Ở bên trong các tổ ong,sữa ong chúa liên tục được tạo ra bởi những con ong thợ cùng sự hút ẩm từ môitrường xung quanh và khả năng hòa tan của một số hợp chất Do đó độ ẩm hay hàmlượng nước trong sữa ong chúa hầu như không thay đổi [4, 12]

Protein: Theo một số nghiên cứu, protein chiếm khoảng 27-41% là một

trong những phần quan trọng nhất của sữa ong chúa khô Các axit amin có mặt với

hàm lượng phần trăm cao nhất là: prolin, lysin, axit glutamic, β-alanin,phenylalanine, aspartatin và serin [11, 12, 27]

Cacbonhydrat: Trung bình phần này chiếm 30% sữa ong chúa khô Giống

như trong mật ong, có hai loại monosaccarit chính chiếm hơn 90% tổng lượngđường là glucozo và chủ yếu là fructozo Saccarozo thường ở nồng độ rất cao, cácoligosaccarit khác như trehalozo, mantozo, gentiobiozo, isomantozo, raffinozo,erlozo, melezitozo mặc dù có nồng độ rất nhỏ nhưng chúng rất hữu ích để so sánhvới mật ong và xác định được tính thật giả của sản phẩm [4, 12, 27]

Lipid và axit 10-hydroxy-2-decenoic: Thành phần này cũng xuất hiện trong

sữa ong chúa cũng khá khiêm tốn, chỉ khoảng 8-19% trong thành phần sữa ong chúakhô Nhưng không thể phủ nhận nó là thành phần quan trọng nhất của các thànhphần của sữa ong chúa Thực tế, phần lipid bao gồm chủ yếu là các axit hữu cơ(chiếm khoảng 80-90%), hầu hết là tồn tại ở dạng tự do, với cấu trúc hiếm gặp trong

tự nhiên Chúng là axit mono-, axit dihydroxy và axit dicacboxylic với 8 và 10nguyên tử cacbon, được sắp xếp theo cách đặc trưng Các axit hydroxy với 10nguyên tử cacbon (như axit 10-hydroxydecenoic và 10-hydroxy-2-decenoic) có thểđược tìm thấy ở nồng độ cao Chúng không chỉ được coi là một thành phần quantrọng để so sánh sữa ong chúa và các sản phẩm khác được làm từ ong, mà còn đượcxác định là chất có các hoạt tính sinh học quan trọng gắn liền với chất lượng của sảnphẩm sữa ong chúa [13]

Các muối khoáng: chiếm khoảng 0,8-3% trong sữa ong chúa Các khoáng

chất này giảm dần theo thứ tự: K, Ca, Na, Mg, Zn, Fe, Cu và Mn

Các vitamin: Vitamin B-complex, vitamin B1 (thiamin), vitamin B2

(riboflavin), axit pantothenoic, biotin, niacin, axit folic, inositol, axetincolin, mộtlượng nhỏ vitamin C Các vitamin tan trong chất béo: A, D, E, K thường không cóhoặc nếu có thì hàm lượng cũng ít [3]

Bảng 1.2 Thành phần của sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô [4]

Sữa ong chúa tươi Sữa ong chúa đông khô

1.1.3 Thu hoạch sữa ong chúa

Sữa ong chúa là một tặng phẩm thiên nhiên mà khoa học chỉ có thể phân tích,xác định mà “không thể tái tạo” Do đó điều mà các nhà khoa học có thể làm lànghiên cứu cặn kẽ mọi sinh hoạt của loài ong để rồi lợi dụng vào đó lấy sản phẩmphục vụ con người

Trong công nghệ nuôi ong lấy mật, con người đã vô tình nhưng may mắnbiết cách tạo nhiều sữa ong chúa qua chu trình tạo ong chúa giống Ngày nay, sữaong chúa được bán trên khắp thế giới chủ yếu là sản phẩm thu được từ công nghệnuôi ong Còn sữa ong chúa được lấy từ tự nhiên hầu như không được làm sảnphẩm thương mại Sau đây là trình bày sơ lược về quy trình sản xuất và thu hoạchsữa ong chúa:

a Quy trình bắt cóc ong chúa

Là quy trình tạo ong chúa mới qua việc bắt đi ong chúa đang trong nhiệm kỳ.Theo đặc tính của loài ong, để cho đàn ong được tồn tại, khi các chú ong thợ thấy mất

đi ong chúa, chúng lập tức chọn một trong những ấu trùng ong thúc dưỡng để trở thànhong chúa Việc bắt cóc, biệt lập hay giết đi ong chúa đương nhiệm nhằm thúc đẩy ongthợ sớm chọn và thúc dưỡng nhiều ấu trùng ong để trở thành ong chúa Quy trình nàychỉ thích hợp dưới dạng tiểu sản xuất, lượng sữa ong chúa thu được ít

b Quy trình giả làm tổ ong chúa

Là quy trình tạo hàng loạt tổ ong chúa bằng cách lấy enzym và những mùi vị từong chúa đem trét vào những tổ ong mới đã chuẩn bị sẵn Mùi vị của các tổ ong giả đãđánh lừa các chú ong thợ Khi các chú ong thợ khám phá ra tổ ong đang bị trống, chúngliền chọn lựa những con ấu trùng ong và thúc dưỡng để trở thành những con ong chúamới Quy trình này hiện đại hơn so với quy trình bắt cóc ong chúa và mang nhiều tínhkhoa học hơn như việc lấy enzym, tạo mùi vị… Nhiều nhà sản xuất với quy mô dạngxuất khẩu, họ có thể tạo hàng loạt ấu trùng ong và đặt máy hút tự động tại các tổ ongchúa lúc còn là ấu trùng ong Sự hút sữa liên tục gây thiếu dinh

dưỡng cho ấu trùng chúa làm cho các ong thợ phải liên tục tiết ra sữa để nuôi ongchúa Do vậy con người thu được nhiều sữa ong chúa hơn.

1.1.4 Tác dụng của sữa ong chúa

Sữa ong chúa có thành phần hóa học đa dạng và phong phú nên nó có nhiềutác dụng tốt đối với cơ thể con người Sữa ong chúa có chứa colagen, lecithin và cácloại vitamin A, E… tất cả đều có lợi cho da Nếu thoa sữa ong chúa lên da hàngngày có thể làm da trắng mịn và chống viêm da Ngoài ra sữa ong chúa còn có nhiềuhợp chất có thể làm giảm hàm lượng cholesterol Một đánh giá cho thấy sử dụng 50

- 100 mg sữa ong chúa mỗi ngày có thể giảm 14% cholesterol và 10% triglycerit Sửdụng sữa ong chúa thường xuyên có thể ngăn ngừa và làm chậm sự phát triển của

xơ vữa động mạch

Trong một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố, sữa ong chúa đượcbáo cáo như một tác nhân làm thay đổi miễn dịch, cũng được báo cáo là có tác dụngđối với hệ thần kinh đệm và các tế bào tủy sống Ngoài ra, sữa ong chúa còn được

sử dụng như một loại thực phẩm chức năng có khả năng chống lại mệt mỏi, chống

dị ứng, chống lão hóa, chống vi khuẩn… rất có lợi cho cơ thể Sữa ong chúa cònlàm tăng khả năng sinh dục ở cả hai giới… [3]

Một số nghiên cứu vào năm 2005, L.A Salazar Olivo [23] và các cộng sự cũng

đã khẳng định sữa chúa có hoạt tính sinh học đa dạng, nó có thể ảnh hưởng tới sự pháttriển tế bào, có khả năng chống lại sự phát triển của các tế bào ung thư của RJP30(phần chiết protein bằng amoni sulfat 30%), ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ởngười, làm giảm mật độ tế bào ban đầu gấp 2,5 lần sau bảy ngày điều trị Šimúth, J.[36] cũng đã quan sát thấy apalbumin-1 và apalbumin-2, hai protein chính trong RJ,kích thích các đại thực bào chuột giải phóng TNF-α (tế bào hoại tử khối u)

Gần đây đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các chất phânhủy enzym (pepsin, trypsin và papain) và protein của RJ [32,33] Thời gian thu hoạch

và tuổi ấu trùng có nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa của RJ và RJ đã thuthập được 24 giờ sau khi chuyển ấu trùng cho thấy có tác dụng chống oxy hóa mạnh

nhất [18] Hoạt tính chống oxy hóa của RJ cũng đã được chứng minh trong các môhình thí nghiệm in vitro khác nhau Năm 2007, Aziza A El-Nekeety [5] đã tiếnhành nghiên cứu thử nghiệm trên chuột và kết quả là RJ có tác dụng bảo vệ chống

lại độc tính của Fumonisins (chất được sinh ra từ nấm, là chất độc hại cho con người

và động vật) Năm 2008, Polona Jamnik [30] đã nghiên cứu trên các tế bào nấm

men Saccharomyces cerevisiae như một sinh vật mẫu, cho thấy rằng RJ làm giảm quá trình oxi hóa nội bào Và khả năng chống lại tổn thương gan do paracetamol gây ra và tác dụng đối với độc tính sinh tinh của cisplatin đã được xác nhận trong

các thí nghiệm trên các động vật thí nghiệm [7, 28, 37]

Hoạt động giống như insulin: có tác dụng chống lại bệnh tiểu đường, RJ cóthể làm giảm lượng đường trong máu thông qua các peptit Và giữ cho lượng đườngtrong máu ở trạng thái bình thường bằng cách tham gia vào quá trình oxy hóaglucozo để thu được năng lượng [6, 7]

Các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của một số peptit thuđược thông qua quá trình thủy phân enzym của RJ đối với chuột bị huyết áp cao

Các peptit đã ức chế enzym chuyển đổi angiotensin 1 (ACE) và áp lực sanguine đã

giảm sau khi uống RJ Hiệu quả chống tăng huyết áp đã lên tới 38% [7]

1.2 Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic (10-HDA)

Tên IUPAC: Axit transhydroxy-2-decanoic hoặc axit (E) hydroxydec-2-enoic (10-HDA) là axit béo dồi dào nhất (FA – fatty acid) và là thànhphần lipid chính của sữa ong

-10-Hình 1.3 Công thức hóa học của axit 10-hydroxy-trans-2-decenoic

Một số tiêu chuẩn của hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa của một số nước

Mặc dù sữa ong chúa là một sản phẩm đầy hứa hẹn với giá trị tài chính ngàycàng tăng cho người nuôi ong và ngành công nghiệp nhưng phát triển thị trường lạikhá chậm Điều mà phần lớn những người nuôi ong không khuyến khích mở rộngkinh doanh là thiếu các tiêu chí chất lượng, kiểm soát tính xác thực và nguồn gốcđịa lý Ngày nay, không có tiêu chuẩn nào ở cấp độ châu Âu hoặc quốc tế cho cácsản phẩm của ong, chỉ có một số quốc gia đã thiết lập các tiêu chuẩn Quốc gia đầutiên đặt tiêu chuẩn cho RJ là Argentina năm 1979, tiếp theo là Bungari năm 1984,

Ba Lan năm 1996, Thổ Nhĩ Kỳ năm 2000, Brazil năm 2001, Serbia năm 2003, Thụy

Sĩ năm 2005 (sửa đổi năm 2014), Nhật Bản và Trung Quốc năm 2008, Ấn Độ năm

2012 và Hàn Quốc năm 2014 Một vài năm trước, một nhóm nghiên cứu của Ủy banong mật Quốc tế (IHC) đã đề xuất sơ bộ về tiêu chuẩn dựa trên những thông tin họthu thập được [9]

Bảng 1.3 Đề xuất hàm lượng của một số quốc gia và tổ chức [9]

Thông số Giới hạn đề xuất của một số quốc gia

1.2.1 Một số nghiên cứu về 10-HDA

Một số tính năng độc đáo và thú vị của sữa ong chúa có được là do sự có mặtcủa các chất béo Axit béo chính trong sữa ong chúa là 10-HDA, một loại axit béokhông bão hòa tự nhiên Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng 10-HDA thúc đẩy

sự tăng trưởng của các tập hợp tế bào lympho T và interleukin-2, điều này có thểgợi ý là loại axit béo này có tác dụng ức chế miễn dịch và chống ung thư Đây làmột hướng điều trị có lợi để hạ đường huyết, chống lão hóa và khối u; vì vậy 10-HDA có giá trị quan trọng trong lĩnh vực điều trị y tế và chăm sóc sức khỏe [19]

a Hoạt tính sinh học

Hoạt tính chống ung thư của 10-HDA

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng sữa ong chúa giúp bảo vệ cơ thể khỏibệnh ung thư Sử dụng thường xuyên thậm chí có thể ngăn ngừa bệnh này xảy ra

Vào năm 1959, trên tạp chí Nature Publishing Group, Gordon F., Townsend

và cộng sự đã khẳng định sữa ong chúa có khả năng chống u biếu Nguyên nhân là

vì trong sữa ong chúa có chứa nhiều loại axit béo, đặc biệt là 10-HAD Sữa ongchúa có khả năng ngăn chặn sự phát triển khối u cổ trướng và bệnh bạch cầu ở AKRchuột [33, 34]

Vào năm 2007, Hiroshi Izuta [14] và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng ứcchế đối với VEGF (vascular endothelial growth factor – yếu tố tăng trưởng mô mạchmáu) trong tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con người (HUVECs – Human umbilicalvein endothelial cells) gây ra sự hình thành tế bào, ức chế sự tăng sinh và di chuyển của

tế bào ung thư dẫn đến ức chế mạch máu khối u Ngoài ra, RJ cũng đã được chứngminh là có hoạt tính chống estrogen bằng cách ức chế sự tăng trưởng của bisphenol(BPA) – một loại estrogen kích thích sự tăng sinh của tế bào ung thư vú ở người

MCF-7 [21, 26] Tuy nhiên, việc điều trị các tế bào MCF-7 bằng các hợp chất lipittrong RJ thì làm tăng sinh các tế bào này, nhưng điều trị đồng thời với tamoxifen thì

sẽ ngăn chặn được sự tăng sinh của tế bào MCF-7, do các hợp lipit ức chế liên kết17b-estradiol với ERb (estrogen b) nhưng không ảnh hưởng đến sự gắn kết của 17-bestradiol với Era (estrogen a) [22]

Vào năm 2017, Chi Chung Peng [9] và các cộng sự đã chứng minh rằng HDA trong RJ có khả năng ức chế hoạt động tyrosinase, ức chế sự biểu hiện củamelanogen bao gồm tyrosinase, TRP-1 và TRP-2 (tyrosinase-related protein 1 và 2)bằng cách ức chế MITF (microphthalmia-associated transcription factor) trong các

10-tế bào u ác tính Đo đó, làm giảm sắc tố của melanin trong 10-tế bào u ác tính B16F10

Một bằng chứng chống ung thư khác là RJ có tác dụng kích thích miễn dịch,bằng cách ngăn chặn sự suy tủy gây ra bởi sự tiến hóa của khối u qua ức chế tạomáu lách ở những người mang khối u hạch (EAT - Ehrlich ascetic tumor) và điều trịtùy thuộc vào thời gian và liều RJ [8]

Hoạt tính chống oxi hóa của 10-HDA

Khi peroxid hóa lipid bị ức chế trong ống nghiệm và trong các thí nghiệm trênchuột, 10-HDA đã được tìm thấy để bảo vệ tế bào DNA khỏi quá trình oxy hóa Nghiêncứu về chế độ ăn kiêng RJ đối với chuột, người ta đã chứng minh rằng sau khi chochuột ăn RJ trong 16 tuần, nồng độ 8- hydroxy-2-deoxyguanosin (một chất chống oxyhóa) đã giảm đáng kể trong DNA và huyết thanh của thận và tuổi thọ trung bình củachuột C3H / HeJ được tăng lên thông qua cơ chế chống oxy hóa [7, 38]

10-Hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA), đã được chứng minh là làm tăng

tuổi thọ của Caenorhabditis elegans (loài giun tròn) không thông qua insulin mà

thông qua chế độ ăn kiêng và tín hiệu TOR (một loại protein trong người), cụ thể là

ức chế mTOR để giảm quá trình lão hóa [41]

Hyejung Gu và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của sữaong chúa sau khi được khử với enzyme (ERJ) bằng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) Tác dụng chống oxy hóa của ERJ là do giảm số phản ứng oxy hóa nội bào

(ROS) và sản sinh oxit nitric (NO) trong các đại thực bào Hơn nữa, ERJ làm tăng

hoạt động chống oxy hóa superoxide effutase (SOD) và glutathione (GSH) Các

hoạt động chống oxy hóa này của ERJ mạnh hơn so với các hoạt động của RJ khôngđược qua xử lý [15]

Một số hoạt tính khác

Tác dụng nơron thần kinh: Theo dân gian, sữa ong chúa đã được biết đến đểcải thiện trí nhớ, ngăn ngừa lão hóa, tăng năng lượng, giảm lo lắng và làm giảm tínhhiếu động 10-HDA của RJ có khả năng làm tăng sự sản sinh tế bào thần kinh vàbảo vệ các tế bào thần kinh của não chuột trưởng thành [7]

Tác dụng kháng sinh, kháng viêm: Axit 10-hidroxy-2-decenoic cũng có hoạt

tính kháng sinh chống lại một số vi khuẩn và nấm (trong đó có Micrococcus

pyogenes, Escherichia coli, Neurospora sitophila) 10-HDA đã được nghiên cứu với

chức năng chống viêm trên các tế bào ung thư ruột của con người (WiDr), cũng như

tác dụng của nó đối với sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh 10-HDA đóng vai trò

là chất diệt khuẩn mạnh chống lại mầm bệnh đặc trưng cho động vật hoặc người,

bao gồm Staphylococcus aureus, Streptococcus alactolyticus, Staphylococcus trung gian B, Staphylococcus xylosus, Salmonella cholearasuis, Vibro parahaem Điều đó cho thấy tiềm năng của nó như là khả năng chống viêm và diệt khuẩn để mang lại

lợi ích cho đường tiêu hóa của con người [40]

Ngoài ra, 10-HDA còn có tác dụng làm đẹp, gia tăng sản xuất collagen.Trong một nghiên cứu in vitro, RJ đã thúc đẩy sự hiện diện sản xuất collagen củacác nguyên bào sợi trong axit theascorbic-2-O-α-glucoside (AA2G) [7]

b Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa

Xác định 10-HDA bằng phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và phađộng là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dướidạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục

giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử vàtính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với phatĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

ra khỏi nhau [11] Đã có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sửdụng phương pháp này, để phân tích 10-HDA có thể kể đến như:

Năm 2007, Jinhui zhou [19] và các cộng sự đã xây dựng phương pháp xácđịnh 10-HDA trong mẫu sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô bằng phươngpháp HPLC pha đảo với chất nội chuẩn methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Các điềukiện sắc kí được dùng để phân tích như sau: Cột sử dụng là cột C18 (3,9 nm 150 nm5µm) với nhiệt độ 30oC, pha động là methanol : nước : axit photphoric có tỉ lệ 50 :

50 : 0,3 (v/v/v), với tốc độ dòng là 0,8 mL / phút, tổng thời gian chạy sắc kí để táchđược 10-HDA là 7,2 phút Trước khi bơm mẫu vào thiết bị HPLC, mẫu sữa ongchúa được chiết bằng etanol tuyệt đối và lọc bằng màng nilon 0,2 µm Phương phápphân tích cho độ thu hồi trung bình là 95,0 - 99,2% với RSD = 1,3% - 2,1%, giớihạn phát hiện LOD = 0,5 mg/kg, giới hạn định lượng là LOQ = 1,5 mg/kg

Năm 2010, Joonyeong Kim [20] và cộng sự đã nghiên cứu xác định hàm lượng10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp HPLC và sử dụng chất nộichuẩn là methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Điều kiện sắc kí để phân tích 10-HDA nhưsau: Sử dụng cột XDB-C18 (150 nm 4,6 nm) với nhiệt độ là 25oC, bước sóng UV là

215 nm, pha động là hỗn hợp metanol : nước : axit photphoric (55 : 45 : 2,7, v/v/v), vớitốc độ dòng chảy là 1,0 mL / phút và tổng thời gian chạy sắc kí là 10 phút Mẫu đượcchiết bằng metanol với tỉ lệ metanol : nước là 50 : 50 (v:v), rồi lọc qua màng nilon 0,2

µm và 0,45 µm rối sau đó được đưa vào thiết bị HPLC với thể tích bơm là 3 µL.Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình trong khoảng 97,4%

- 100,4% với RSD = 2,4% - 3,4%, giới hạn phát hiện LOD = 0,05 µg/mL và giới hạn phát hiện LOQ = 0,25 µg/mL

Năm 2017, Ivana Flanjak [16] và các cộng sự đã xác định 10-HDA trong sữa ong chúa ở Croatia bằng phương pháp HPLC với detector UV, có bước sóng hấp thụ

là 215 nm và sử dụng chất nội chuẩn là methyl 4-hydroxybenzoat (MHB) Điều kiệnphân tích sắc kí 10-HDA là: Sử dụng cột pha đảo C18 (4,6 µm 150 µm) điều chỉnhđến 35 oC, pha động là metanol : nước (50 : 50, v/v) và tốc độ dòng là 1,0 µL / phútthể Mẫu được chiết và hòa tan bằng dung môi metanol với tỉ lệ metanol : nước là

50 : 50 (v:v), sau đó đem lọc lần lượt qua màng lọc nilon 0,2 µm, rồi đưa vào hệ sắc

kí HPLC, trong đó tỉ lệ hỗn hợp giữa thể tích mẫu : thể tích MHB là 75 : 25 (v:v).Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình là 95,0 – 99,0%

Xác định 10-HDA bằng phương pháp GC-MS

Trong sắc kí khí, pha động là một khí mang, thường là một khí trơ như Helihoặc một khí không hoạt động như Nitơ Pha tính là một vi lớp chất lỏng hoặcpolymer được phủ trên một lớp rắn đặt trong cột sắc kí Các hợp chất cần phân tích

sẽ được chuyển sang dạng khí và tương tác với thành cột – được phủ bởi pha tĩnh,dẫn đến từng hợp chất được tách ra tại những thời điểm khác nhau – gọi là thời gianlưu của hợp chất Khi các chất hóa học đi ra ở cuối cột, sẽ được phát hiện và xácđịnh bằng detector như là MS

Năm 1992, Hikoto ohta [42] và các cộng sự đã tiến hành xác định 10-HDAbằng phương pháp sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ (GC-MS) Phươngpháp được thực hiện theo nguyên tắc là dẫn xuất hóa 10-HDA bằng việc cho phảnứng với acetamide N,O-bis (trimethylsilyl) ở pH = 2,5 tại nhiệt độ phòng trong 15phút và sau đó được chiết bằng dichlorometan Mẫu sau khi chiết được đưa vào hệthiết bị GC-MS với điều kiện GC-MS được sử dụng trong nghiên cứu là: Sử dụngcột mao quản (0,25 mm 30 m 0,25µm), với nhiệt độ tách từ 100 oC – 280 oC (tăng 8

decenoic (10-HDA), 3,10-dihydroxydecanoic, 2-octene-1,8-dioic và dioic Dẫn xuất hóa 10-HDA với bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamit (BSTFA) vàpyridin để có thể tách ra được trên máy sắc kí khí Trước khi đưa vào hệ sắc kí, hỗnhợp phản ứng được làm nóng ở 60 oC trong 30 phút Điều kiện thiết bị GC – MS đểphân tích hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa là: Sử dụng cột mao quản silicanóng chảy HP-5MS (30 m 0,25 mm 0,25 µm), với nhiệt độ tách ban đầu là 50 oC vàtăng lên 300 oC với tốc độ tăng 5 oC / phút, nhiệt độ ở buồng tiêm là 250 oC nhiệt

2-decene-1,10-độ ở tranferline là 250 oC, nhiệt độ của nguồn ion là 270 oC và tốc độ dòng khí He

là 1 mL / phút, Kết quả thu được độ nhạy của phương pháp cỡ 0,05 µg/µL

Xác định 10-HDA bằng phương pháp điện di mao quản với detector UV

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di chuyểnkhác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịchchất điện giải (có chất đệm pH), dưới tác dụng của điện trường E nhất định (do thế Vđặt vào hai đầu mao quản sinh ra) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu(EOF) [1,2] trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của chúng

Theo Orlando Munoz [29] và các cộng sự đã nghiên cứu phương pháp xácđịnh 10-HDA với cột mao quản có bước sóng hấp thụ là 215 nm Điều kiện thiết bịđiện di để phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa như sau: Tổng chiều dài mao quản

là 85 cm với chiều dài hiệu dụng là 60 cm, thời gian bơm mẫu vào hệ thiết bị là 20 stại thế cao áp là 15 kV, đệm được sử dụng trong phương pháp phân tích 10-HDA làhỗn hợp 20 mM photphat pH 7,2 và 0,4 mM MTAB Kết quả cho thấy LOD củaphương pháp là 12,618 ppm và LOQ là 42,06 ppm

Ứng dụng của điện di mao quản (CE) để tách và xác định thành phần hoạt chất,

cụ thể là axit 10-hydroxy-2-decenoic trong sữa ong chúa với detector UV ở bước sóng

215 nm được nghiên cứu bởi Li Jia và các cộng sự [24] Phương pháp sử dụng có đầubơm mẫu là catot và đầu gắn với detector là anot Mẫu được bơm vào thiết bị phân tíchtrong 40 s, tại điện áp 20 kV Axit 10-HDA được tách ra và được phát hiện trong cộtmao quản bằng silica có chiều dài là 60 cm với đường kính trong là 75 µm

Dung dịch đệm được sử dụng là đệm photphat ở pH 7,3 Trong nghiên cứu này sửdụng cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) làm chất điều chỉnh dòng điện chophép tách nhanh 10-HDA khỏi các thành phần khác trong sữa ong chúa bằng cáchđảo ngược hướng của dòng điện Kết quả cho thấy độ nhạy của phương pháp cỡ0,02 mg/mL.

c So sánh phương pháp và đề xuất phương pháp thích hợp

Các phương pháp sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao đều có ưu điểm chung

là khả năng tách chất tốt, độ lặp lại và độ ổn định của thiết bị cao Ngoài ra, khi vậnhành với các detector khác nhau kết hợp với làm giàu mẫu có thể mang lại những đặctính ưu việt như giới hạn phát hiện khá thấp (cỡ vài ppm) với các detector FID vàdetector MS Tuy nhiên, đây là các phương pháp sử dụng thiết bị có giá thành cao (GC-

MS hay HPLC) và chi phí phân tích cũng cao khi phải sử dụng pha động là khí mang(như heli) hay dung môi chuyên dụng cho HPLC (như axetonitril, metanol) với độ tinhkhiết cao Hơn thế nữa, quy trình xử lý mẫu khi sử dụng các phương pháp này tươngđối phức tạp, do cần có bước dẫn xuất hóa chất phân tích

Phương pháp điện di mao quản ngoài những ưu điểm là khả năng tách chấtcao, độ lặp lại và độ ổn định của thiết bị khá cao, còn có ưu điểm về giá thành phântích vì chỉ sử dụng pha động là các dung dịch đệm có giá thành thấp, dễ vận hành vàcũng có thể kết hợp sử dụng nhiều loại detector như detector MS, detector UV,… vàđặc biệt quy trình xử lý mẫu khi sử dụng phương pháp điện di mao quản tương đốiđơn giản, không yêu cầu việc dẫn xuất hóa các chất phân tích Hơn thế nữa, ở môitrường pH khác nhau, 10-HDA là chất mang điện, nên việc sử dụng detector đo độdẫn không tiếp xúc (C4D) là phù hợp vì detector này cho sự phân tách tốt giữa cáctiểu phần mang điện Bởi vậy, với ý tưởng phát triển phương pháp điện di mao quảntrong phân tích 10-HDA sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (phương phápCE-C4D) sẽ có thể là sự lựa chọn tiềm năng

1.3 Giới thiệu về phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khácnhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện

ly có chất đệm pH dưới tác dụng một điện trường (E) nhất định được sinh ra do thế V.Hiện nay, CE được phân loại theo các cơ chế tách như sau: điện di mao quản vùng(Capillary Zone Electrophoresis - CZE), điện di mao quản điểm đẳng điện (Isoelectricfocusing - IFF), điện di mao quản đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP), điện di maoquản gel (Capillary Gel Electrophoresis - CGE) và sắc ký điện di mao quản điện độnghọc kiểu micelle (Micellar electrophoresis capillary chromatography

- MECC) Tuy nhiên điện di mao quản vùng (CZE) là phương pháp được sử dụngphổ biến nhất do đơn giản trong vận hành và hiệu quả trong phân tích Trong nghiên cứunày, thuật ngữ CE được hiểu là CZE

Theo phương pháp CE, các ion trong mao quản di chuyển với tốc độ khácnhau theo công thức:

6

Từ công thức (1) có thể thấy, tốc độ di chuyển tỷ lệ thuận với điện tích củahạt mang điện (q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện di (Ƞ), bánkính hyddrat của hạt mang điện (r) Nghĩa là, trong một điện trường E nhất định,chất nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh; với các chất mangđiện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn; với cácchất mang điện có cùng bán kính, chất nào có điện tích lớn sẽ di chuyển nhanh hơn

Hình 1.4 Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơn giản

Mao quản trong điện di có thể được làm từ teflon, polyme, tuy nhiên vật liệuthường dùng là silica, và thường có đường kính trong nằm trong khoảng 25 ÷ 100

³m Dưới đây là hình ảnh của hệ điện di mao quản được sử dụng trong nghiên cứu:

Hình 1.5. Hệ điện di mao quản 1 kênh Hình 1.6 Bộ ghi tín hiệu

Trong đó: (1): dung dịch điện li nền

(2): Detector C4D

Dòng điện di thẩm thấu (EOF)

Dòng điện di thẩm thấu trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên thànhmao quản và chất điện li chứa trong nó Với mao quản silica, các nhóm silanol (Si-OH) trên bề mặt mao quản có khả năng bị deproton hóa chuyển thành SiO- khi tiếpxúc với dung dịch chất điện li, đặc biệt là trong môi trường kiềm Đây là điều kiện

để hình thành nên lớp điện kép, trong đó lớp di động nằm bên ngoài mang điệndương Khi áp vào hai đầu mao quản một điện thế, lớp di động này di chuyển vềphía cực âm với một vận tốc nhất định, tạo thành dòng, gọi là dòng EOF

Độ lớn của dòng EOF tỉ lệ thuận với lực điện trường E do thế V đặt vào haiđầu mao quản, độ lớn của thế ξ, hằng số điện môi và tỉ lệ nghịch với độ nhớt củapha động điện di theo biểu thức sau:

ɛ ξ

4ȠΠTrong đó: ε: hằng số điện môi của dung dịch đệm

ξ: thế zeta của lớp điện tích képDòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điệntrường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn,ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậmhơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyểncùng tốc độ với dòng EOF Do vậy để có được hiệu quả tách cao, cần tìm đượcdòng EOF có cường độ phù hợp với chất phân tích, có nghĩa là phải tối ưu hóa cácđiều kiện của quá trình điện di

Hình 1.7 Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong EOF

1.3.1 Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C 4 D)

Việc phát hiện chất trong CE được thực hiện nhờ detector Một số detectorthông dụng như detector đo quang (hấp thụ phân tử, huỳnh quang), điện hóa (đodòng, đo thế, độ dẫn) và khối phổ Trong đó, detector điện hóa loại đo độ dẫn, đặcbiệt là detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) được sử dụngrộng rãi do có khả năng phân tích rộng và độ nhạy tốt

Nguyên tắc thiết kế của detector độ dẫn không tiếp xúc là sử dụng hai điệncực hình ống đặt vòng quanh và không tiếp xúc với mao quản Khi áp vào một hiệuđiện thế, hai điện cực này sẽ đóng vai trò hai tụ điện còn khối dung dịch trong maoquản giữa hai điện cực đóng vai trò điện môi Sự chênh lệch về giá trị điện trở sẽ tạo

ra các tín hiệu đo Tại đầu ra của điện cực thứ hai, tín hiệu sẽ được thu nhận đưa đến

bộ khuếch đại và xử lý cho ra tín hiệu phân tích Khi sử dụng detector này, tín hiệucủa chất phân tích (pic) thu được là giá trị điện thế dưới dạng tín hiệu số Việc hiểnthị tín hiệu được thực hiện dễ dàng bằng các phần mềm ghi tín hiệu trên máy tính

Hình 1.8 Cấu tạo detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D)

1.3.2 Kỹ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản

Có hai kĩ thuật bơm mẫu chủ yếu được sử dụng, bao gồm bơm mẫu kiểu thủyđộng học và bơm mẫu kiểu điện động học

- Phương pháp thuỷ động học: dùng một áp suất khoảng 50 đến 300 mBar áp vào vùng mẫu ở đầu cột sau một thời gian t nhất định

- Phương pháp thủy tĩnh (xy phông): dựa vào lực hút của trái đất, sự chênh lệch chiều cao giữa hai đầu mao quản tạo ra một lực đẩy dung dịch mẫu đi vào mao quản

- Phương pháp điện động học: dựa vào tính chất điện di thẩm thấu khi có điện

áp được cấp cho mao quản, người ta đã đưa mẫu vào mao quản chính bằng dòng điện di thẩm thấu EOF

Hình 1.9 Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 1.3.3 Các thông số đánh giá trong phương pháp điện di mao quản

Diện tích pic và độ phân giải là hai yếu tố được xem xét để định lượng trong

CE Diện tích pic tỉ lệ với nồng độ chất phân tích đi qua detector Dựa vào giá trịdiện tích pic, ta có thể xác định được nồng độ của chất phân tích có trong mẫu

S = k.CTrong đó: S là diện tích pic thu được (V.s)

k là hệ số tỉ lệ (V.s.mL/mg)

C là nồng độ chất phân tích (mg/mL)Việc xác định diện tích pic được thực hiện đơn giản nhờ các phần mềm ghi dữ liệu

Trong đó: ti và tj là thời gian di chuyển của hai chất i và j (ti > tj ) (s)

wi và wj là độ rộng đáy của hai pic chất i và jTheo lí thuyết, hai pic được coi là tách hoàn toàn khỏi nhau (với độ tin cậy 95%)khi độ phân giải R ≥ 1,5

1.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện di mao quản

Dung dịch điện di nền

Dung dịch điện di nền (BGE) có vai trò quyết định trong quá trình tách chất.Như đã thấy trong công thức (1), chất điện di nền ảnh hưởng tới tốc độ di chuyểncủa các ion, thông qua giá trị độ nhớt của dung dịch và khả năng solvat hóa (thểhiện qua bán kính hiđrat r)

BGE thường được sử dụng là các dung dịch đệm trong môi trường nước.Thành phần của hệ đệm bao gồm một hợp phần mang tính axit, hợp phần còn lạimang tính bazơ Các yếu tố cần quan tâm khi lựa chọn dung dịch điện di nền phùhợp bao gồm thành phần, nồng độ các hợp phần và pH dung dịch

Điện thế tách

Điện trường được tạo ra khi áp vào hai đầu mao quản một hiệu điện thế lớn,

cỡ kV, theo công thức E = V/L Đây là động lực cho quá trình di chuyển của cácion, ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tách chất và tín hiệu thu được Khi hiệu điệnthế nhỏ, chân pic dãn và diện tích pic lớn hơn, tuy nhiên thời gian phân tích dài hơn.Trong khi đó, hiệu điện thế lớn có thời gian phân tích ngắn nhưng diện tích pic thuhẹp lại, đồng thời còn gây ra hiệu ứng nhiệt Do đó, giá trị độ lớn của hiệu điện thếđặt vào là yếu tố quan trọng cần quan tâm

Lượng mẫu đi vào mao quản

Lượng mẫu đi vào mao quản ảnh hưởng lớn tới diện tích và khả năng phân táchcác pic Lượng mẫu ít dẫn tới diện tích pic giảm, làm giảm khả năng phát hiện chất,trong khi lượng mẫu lớn, diện tích pic tăng, làm giảm độ phân giải Đối với một

hệ điện di mao quản đơn giản, vận hành bằng tay, sử dụng phương pháp bơm mẫu

xi phông thì lượng mẫu đi vào mao quản phụ thuộc chủ yếu vào thời gian bơm mẫu.Mặc dù vậy, với phân tích đơn đối tượng, thời gian bơm mẫu thường được giữ cốđịnh

Ngoài ra, còn một số yếu tố khác trên hệ CE ảnh hưởng tới quá trình táchchất như chiều dài và đường kính trong của mao quản Tuy nhiên, thông thường,các yếu tố này được giữ cố định trên mỗi hệ thiết bị

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp điện di mao quản để phân tíchxác định hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa Thực nghiệm bao gồm: khảo sátlựa chọn dung môi chiết thích hợp và vận dụng phương pháp đã xây dựng được tiếnhành xác định hàm lượng 10-HDA trong các mẫu thực tế được thu mua ngoài hiệntrường Trên cơ sở kết quả nghiên cứu cụ thể, tiến hành so sánh, đánh giá vớiphương pháp tiêu chuẩn HPLC

Phương pháp nghiên cứu

Việc nghiên cứu khảo sát một số điều kiện tách 10-HDA được thực hiện trên

hệ thiết bị CE-C4D với cột mao quản có tổng chiều dài 60 cm, đường kính trong 50

µm Mẫu được bơm vào mao quản bằng phương pháp thủy động lực học theo kiểu

xi phông bằng cách nâng một đầu mao quản (đặt trong dung dịch mẫu) lên ở độ cao

10 cm so với đầu mao quản còn lại Độ cao này được cố định trong tất cả các thínghiệm Dung dịch chuẩn của 10-HDA ở nồng độ 20 mg/L được sử dụng để khảosát các điều kiện phân tích Trong các thí nghiệm, điện thế tách được giữ cố định ởgiá trị -15 kV và thời gian bơm mẫu 30 s; trừ các thí nghiệm khảo sát điều kiện điệnthế và thời gian bơm Điều kiện phân tích được lựa chọn trên cho cơ sở đường nền

ổn định, tín hiệu của các chất phân tích có diện tích lớn, hình dạng sắc nét

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích trên CE

Khảo sát thành phần dung dịch điện li nền

Qua tham khảo tài liệu, một số loại dung dịch điện li nền có giá trị pH thấp(pH< 2) là các axit hữu cơ với các nồng độ khác nhau được lựa chọn để nghiên cứuquy trình phân tách 10-HDA, bao gồm axit axetic, axit lactic, hydroxymetylaminometan (Tris), axit 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MES), axít 2-(N-morpholino) etanesulfonic (MOPS), axít N-Cyclohexyl-2-aminoetanesulfonic

(CHES) với cùng một nồng độ là 100 mM và pH = 9 Sau khi lựa chọn được thànhphần dung dịch điện ly nền thích hợp, tiếp tục nghiên cứu sự thay đổi nồng độ và

pH với các giá trị khảo sát pH = 8 ÷ 9 và nồng độ là 20 mM, 50 mM và 100 mM

Khảo sát và tối ưu thời gian bơm mẫu

Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích và hình dạng tín hiệu củachất phân tích được khảo sát với thời gian bơm mẫu thay đổi từ 10 s tới 60 s

Khảo sát và tối ưu điện thế tách

Điện thế đặt vào hai đầu mao quản tạo ra một điện trường, là động lực choquá trình di chuyển của các ion, ảnh hưởng tới quá trình tách chất Trong khảo sátnày, điện thế tách thay đổi từ 10 ÷ 20 kV

2.2.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu

Mẫu trước khi bơm vào thiết bị CE để tách và nhận biết cần phải hòa tantrong dung môi thích hợp và lọc Việc khảo sát quy trình xử lý mẫu được thực hiệnnhư sau:

Khảo sát giấy lọc và quy trình ly tâm mẫu

Ba loại giấy lọc được lựa chọn trong nghiên cứu này là: giấy lọc xenlulosoaxetat, giấy lọc nilon và giấy lọc PTFE đều có cỡ lỗ 0,2 µm Mẫu được hòa tantrong 50 mL nước deion, sau đó được chia làm 2 phần Phần 1 được đem đi ly tâm

1500 rpm trong 15 phút và lọc với từng loại giấy lọc đã nêu trên Phần 2 không lytâm mà được đem lọc trực tiếp trên từng loại giấy lọc Dịch lọc được bơm trực tiếpvào thiết bị CE-C4D và so sánh diện tích tín hiệu 10-HDA thu được

Khảo sát dung môi hữu cơ và hệ dung môi hòa tan

Bốn hệ dung môi dùng để hòa tan mẫu được khảo sát là : nước deion, hỗn hộpcủa nước deion với metanol, etanol và isopropanol có tỷ lệ thể tích nước deion : dungmôi hữu cơ là 1:1 Thực nghiệm được tiến hành với ba loại mẫu: mẫu sữa ong chúatươi, mẫu sữa ong chúa dạng gel và mẫu sữa ong chúa dạng bột Cân lượng chính xác

gần 1 g mẫu, sau đó hòa tan vào 50 mL của bốn loại dung môi nêu trên, lắc, ly tâm

1500 rpm trong 15 phút, lọc qua giấy lọc nilon 0,2 µm Sau đó dịch lọc được bơmlên thiết bị CE-C4D Xác định diện tích tín hiệu 10-HDA và hiệu chỉnh lại theo sốgam mẫu chính xác đã sử dụng để so sánh các giá trị diện tích tìm ra hệ dung môicho kết quả diện tích pic cao nhất

Khảo sát tỉ lệ các thành phần của dung môi chiết

Sau khi chọn được dung môi chiết thích hợp, tiến hành khảo sát và tối ưu tỉ lệthể tích dung môi : nước deion với giá trị thay đổi từ 10 : 90, 25 : 75, 30 : 70, 40 :

60, 50 : 50, 70 : 30 (v:v) Mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu sữa ong chúa dạngbột đồng nhất Cân một lượng chính xác khoảng 1 g, rồi đem hòa tan với 50 mL củatừng tỉ lệ dung môi hòa tan đã nêu trên, lắc, ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, và lọcqua giấy lọc nilon 0,2 µm Sau đó, dịch lọc được đưa vào hệ thiết bị CE-C4D đểphân tích Diện tích tín hiệu 10-HDA thu được được hiệu chỉnh lại theo số gam mẫuchính xác đã sử dụng để so sánh các giá trị diện tích pic và tìm ra tỉ lệ dung môithich hợp chi kết quả diện tích pic cao nhất

2.3 Đánh giá phương pháp

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện của thiết bị IDL: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích

mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫutrắng hay tín hiệu nền Đối với các quá trình trong thiết bị điện di, IDL được tínhbằng nồng độ chất phân tích trong dung môi cho tín hiệu gấp 3 lần nhiễu nền

Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) là giá trị nồng độ thấp nhất củamột chất cần phân tích có độ chính xác đến 99% và nồng độ chất cần phân tích lớnhơn 0

Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL): là nồng độ thấp nhất của chấtphân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ýnghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền