Tổng hợp các alkyl cacboxylat của naphthol as as ol as ca làm cơ chất nhuộm esterase đặc hiệu tế bào bạch cầu dòng mono

Bình thường, phản ứng nhuộm esteraza lên dương tính ở tất cả các dòng tế bào vì thế được gọi là kỹ thuật nhuộm không đặc hiệu, khi sử dụng NaFlàm chất ức chế thì chỉ có dòng tế bào monox

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu hợp chất Naphtol AS-thế cacboxylat 3

1.2 Tổng hợp este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat 4

1.3 Tính chất của các alkyl cacboxylat của 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxthế)carbamoyl]naphtalen-2-ylat 7

1.3.1 Tính chất vật lý 7

1.3.2 Tính chất phổ 8

1.3.3 Tính chất hóa học 8

1.4 Ứng dụng để nhuộm esteraza bạch cầu người 10

1.4.1 Bệnh bạch cầu cấp và phân loại thể bệnh 10

1.4.2 Giới thiệu về esteraza 11

1.4.3 Cơ chất dùng trong nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người 16

CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3 Hóa chất và thiết bị 19

2.3.1 Hóa chất 19

2.3.2 Các dụng cụ và thiết bị 19

2.4 Các phần mềm sử dụng 21

2.5 Sơ đồ phản ứng chung và các quy trình thực nghiệm 21

2.6 Thực nghiệm 22

2.6.1 Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA 22

2.6.2 Quy trình thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng nhuộm enzym 25

3.1 Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL và AS-CA bằng phương pháp truyền thống [5, 7] 29

3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng nhuộm esteraza 43

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất đến kết quả nhuộm 47

KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp 3-( N-phenyl thế)naphtalen-2-yl cacboxylat đã được thương mạihóa 4Bảng 1.2 Bảng phân loại bệnh ung thư máu dòng mono theo FAB bổ sung Marker

và di truyền [8] 14Bảng 2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của phản ứng.22Bảng 2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất tham gia phản ứng đến hiệusuất của phản ứng 23Bảng 2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng 23Bảng 2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất 24Bảng 2.5 Các nhân tố và mức được xét trong mô hình thực nghiệm 26Bảng 2.6 Bảng ma trận mô hình mẫu nhân tố thực nghiệm 27Bảng 3.1 Bảng kết quả tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL vàAS-CA 35Bảng 3.2 Kết quả số liệu phổ IR và ESI-MS của các naphtol AS-thế cacboxylat 37Bảng 3.3 Kết quả dữ liệu phổ 1H-NMR của 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-ylcacboxylat 38Bảng 3.4 Kết quả nhuộm theo phương pháp nhân tố thực nghiệm 43Bảng 3.5 Hiệu suất thu được ở vùng tối ưu 45Bảng 3.6 Độ nhạy và độ đặc hiệu của các cơ chất 3-[(N-phenyl thế)cacbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat tổng hợp được 49Bảng 3.7 Điểm nhuộm của các naphtol AS thế cacboxylat 49

DANH MỤC HÌNH

Sơ đồ 1.1 4

Sơ đồ 1.2 4

Sơ đồ 1.3 5

Sơ đồ 1.4 5

Sơ đồ 1.5 6

Sơ đồ 1.6 6

Sơ đồ 1.7 7

Sơ đồ 1.8 7

Sơ đồ 1.9 9

Sơ đồ 1.10 9

Sơ đồ 1.11 10

Sơ đồ 1.12 16

Sơ đồ 1.13 17

Sơ đồ 1.14 17

Sơ đồ 2.1 21

Sơ đồ 3.1 29

Sơ đồ 3.2 30

Sơ đồ 3.3 30

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của bản chất dung môi đến hiệu suất của phản ứng 31

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ tác nhân tham gia phản ứng đến hiệu suất của phản ứng 32

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng 33

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất của sản phẩm 34

Hình 3.5 Ảnh chụp sắc ký bản mỏng của Naphtol AS-OL butanoat tổng hợp theo phương pháp truyền thống (ảnh trái) và phương pháp cải tiến (ảnh phải) 36

Hình 3.6 Phổ IR của Naphtol AS-OL butanoat 40

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của Naphtol AS-OL butanoat 41

Hình 3.8 Phổ ESI - MS của Naphtol AS-OL butanoat 41

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân mảnh của hợp chất Naphtol AS-OL butanoat (3b3) 42

Hình 3.9 Đồ thị Pareto các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất nhuộm esteraza dòng mono 44

Hình 3.10 Ảnh nhuộm naphtol AS propanoat 50

Hình 3.11 Ảnh nhuộm naphtol AS-CA axetat 50

Hình 3.12 Ảnh nhuộm naphtol AS axetat không có chất ức chế NaF 50

Hình 3.13 Ảnh nhuộm naphtol AS axetat có chất ức chế NaF 50

c.s

Da

THF

DMF

DMSO

EC

NSE

NSE+NaF

FAB

IUB

L1

L2

L3

M1

M2

M3 M4

Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại Burkitt (Acutelymphoblastic)

Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ biệt hóa tối thiểu (Minimallydifferentiated acute myeloid)

Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ không có tế bào trưởng thành (Acutemyeloblastic without maturation)

Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ có tế bào trưởng thành (Acutemyeloblastic with maturation)

Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tuỷ (Acute promyelocytic)

Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ-monoxit (Acute myelomonocytic)

MỞ ĐẦU

Bệnh bạch cầu cấp hay còn gọi là bệnh ung thư máu là một nhóm bệnh của

cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [1] Cũng như cácbệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sửdụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất dacam đioxin do chiến tranh để lại [2] Theo thống kê của tổ chức sức khỏe thế giớiWHO năm 2018, ở Việt Nam, tỉ lệ ca mắc mới bệnh ung thư máu chiếm 3.99% vàđứng thứ 7 và tỉ lệ người chết chiếm 4.55%, đứng thứ 5 trong các bệnh ung thư[24] Đặc trưng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bào non ác tính lấn átcác tế bào tủy và xuất hiện ở máu ngoại vi Đặc điểm của các tế bào này là có sự rối loạn

về protein và cấu trúc tế bào

Bệnh gồm nhiều thể loại khác nhau, theo tiêu chuẩn của các nhà khoa họcPháp, Mỹ và Anh (gọi tắt là tiêu chuẩn FAB) được ký hiệu từ M0 đến M7 và L1đến L3 [22] Việc xác định đúng, nhanh chóng thể bệnh có vai trò quyết định giúpcho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho người bệnh Hiệnnay, việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo tiêu chuẩn FAB chủ yếu dựa trênkết quả của ba phương pháp: miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào.Phương pháp miễn dịch và di truyền được làm trên các máy móc hiện đại nên độchính xác cao, nhưng giá thành đắt, khó tiếp cận đối với bệnh nhân nghèo Do dễthao tác, giá thành thấp hơn so với hai phương pháp trên, nên nhuộm hóa học tế bàovẫn được dùng rộng rãi trong nhiều bệnh viện và cơ sở nghiên cứu ở Việt Nam

Nhuộm hóa học tế bào gồm nhiều kỹ thuật, trong đó nhuộm esteraza không đặchiệu dùng cơ chất naphtol AS axetat ức chế bằng NaF được sử dụng để phân loại tếbào monoxit với dòng tủy Bình thường, phản ứng nhuộm esteraza lên dương tính ở tất

cả các dòng tế bào vì thế được gọi là kỹ thuật nhuộm không đặc hiệu, khi sử dụng NaFlàm chất ức chế thì chỉ có dòng tế bào monoxit bị ức chế hoàn toàn Dựa vào đặc tínhnày để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác Kỹthuật phát hiện enzyme esteraza chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố như: nhiệt độ,thời gian nhuộm, nồng độ cơ chất, tác dụng của chất ức chế và

hoạt hóa, dễ dẫn đến kết quả sai khác so với yêu cầu của phân loại bạch cầu củaFAB dẫn tới nhận định sai kết quả, ảnh hưởng đến hiệu quả khám chữa bệnh và gâytốn kém cho người bệnh.

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS;AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono” là một đề tài có ýnghĩa khoa học, thực tiễn và xã hội sâu sắc

Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu phương pháp mới nhằm nâng cao hiệu

suất tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chấtnhuộm đặc hiệu dòng monoxit tế bào bạch cầu người phục vụ việc khám và điều trịbệnh ung thư máu

Nội dung của nghiên cứu:

1 Nghiên cứu phương pháp tổng hợp cơ chất alkyl cacboxylat của Naphtol AS,

2 Xác định cấu trúc của các hợp chất tổng hợp bằng các phương pháp vật lý vàhóa lý hiện đại (IR, ESI-MS và 1H-NMR);

3 Sử dụng hợp chất tổng hợp được làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng monoxit bạch cầu người phục vụ phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp

Trong đó: R: nhóm ankyl; X là nhóm thế thường ở vị trí octo- hoặc

para-Các dẫn xuất Naphtol AS-thế cacboxylat được ứng dụng rộng rãi trong thựctiễn Vai trò quan trọng nhất của hợp chất này là được sử dụng làm cơ chất cho kỹthuật nhuộm esteraza không đặc hiệu tế bào bạch cầu người Trong khuôn khổ tổngquan này chỉ đề cập đến các tính chất hóa lý cơ bản, những phương pháp tổng hợpquan trọng và một số ứng dụng phổ biến liên quan đến họ hợp chất này

Về cấu tạo, các Naphtol AS-thế carboxylat có hai nhóm chức là amit và este,đây là hai trung tâm phản ứng chính của hợp chất Enzym esteraza trong nguyênsinh chất cả bạch cầu có thể xúc tác phản ứng thủy phân nhóm monoeste cacboxylatcủa các alkyl cacboxylat Sau phản ứng thủy phân, các naphtol AS-thế mới sinh sẽtác dụng với muối diazo tạo thành phẩm màu azo có thể quan sát dưới kính hiển viquang học Thông qua sự xuất hiện màu azo trên các vùng nguyên sinh chất củabạch cầu gián tiếp chỉ ra sự có mặt của enzyme esteraza trên bạch cầu

Hiện nay có một số este thuộc dãy Naphtol AS-thế cacboxylat đã được sảnxuất thươngh mại dùng trong y học để xác định các enzym esteraza đặc hiệu vàkhông đặc hiệu bạch cầu người

3

Bảng 1.1 Các hợp 3-( N-phenyl thế)naphtalen-2-yl cacboxylat đã được thương

mại hóa

Công thức Tên thương mại CAS Công thức cấu tạo phân tử

O

1 Naphtol AS axetat 1163-67-3 C19H15NO3

NH O

1.2 Tổng hợp este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat

Các hợp chất naphtol AS thế cacboxylat được tổng hợp đi từ tiền chất là cácnaphtol AS-thế (tên khoa học là 3-hiđroxi-(N-phenyl thế) naphtalen-2-cacboxamit).Các naphtol AS thế có thể được điều chế bằng phương pháp trực tiếp một giai đoạntrong lò vi sóng hoặc hai giai đoạn từ axit 3-hidroxi-2-naphtoic và amin theo sơ đồ1.1, 1.2 [7]:

4

Anilin CONH

(60%)Phản ứng este hóa trực tiếp các Naphtol AS thế với các axit cacboxylic

thường cho hiệu suất thấp (40-50%) [7] Vì vậy, các este của naphtol AS thế

cacboxylat thường tiến hành theo phương pháp Schotten- Baumann, bằng cách cho

dẫn xuất naphtol tác dụng với clorua axit hoặc anhidrit axit hữu cơ trong môi

trường kiềm hoặc pridin như mô tả trên sơ đồ 1.3 [7, 27]

Sơ đồ 1.3

O

O X

Trong đó: R = alkyl; X = o-CH3, o-OCH3, -Cl, …

Tổng hợp các naphtol AS thế cacboxylat đã được Burstone [5] điều chế lần

đầu tiên trên cơ sở phản ứng của naphtol AS-D với cloaxetyl clorua có mặt bazơ

NaOH trong dung môi THF Phản ứng xảy ra theo sơ đồ 1.4

Về nguyên tắc, quá trình este hóa chia làm hai giai đoạn: Ở giai đoạn 1, trongmôi trường kiềm, nhóm hidroxyl của naphtol AS-D sẽ chuyển hóa thành muối

5

naphtolat, ở giai đoạn 2, muối naphtolat natri sẽ tác dụng với axetyl clorua tạo thành

sản phẩm este 3-[(2-methylphenyl)carbamoyl]naphtalen-2-yl axetat (sơ đồ 1.5)

Sơ đồ 1.5 Giai đoạn 1:

Đây là phản ứng thế nucleophin Phản ứng đƣợc bắt đầu từ sự tấn công

nucleophin của anion naphtolat vào cacbon nhóm cacbonyl của alkanoyl clorua Sản

phẩm naphtol AS-thế cacboxylat đƣợc tạo thành trong quá trình cộng tách nhƣ sơ

Trong đó: X: H, CH3, OCH3, Cl,…

R2: nhóm alkyl

6

Tuy nhiên theo một số tác giả, đây là một phản ứng phức tạp, bởi trong phân

tử có nhiều trung tâm hoạt động Khi tiến hành phản ứng tương tự giữa

2-hiđroxi-N-(octo-toluidin)benzamit với cloaxetyl clorua, Herbst W và c.s đã không thu được

dẫn xuất cloaxetat như mong muốn, mà là sản phẩm axyl hóa nhóm amit Phản ứng

xảy ra như sơ đồ 1.7 [9]

Sơ đồ 1.7

COCH2Cl CONH

CON ClCH2COCl

OH H3C

Hiệu suất este phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện tiến hành phản ứng: Phải

thực hiện ở nhiệt độ thấp để tránh phản ứng phân hủy sản phẩm este và nồng độ

NaOH không quá cao Nếu nồng độ chuyển NaOH>5M, nhóm hidroxyl sẽ phản ứng

với nhóm amit tạo ra đinatri aminnolat, muối này sẽ kết tủa làm cho hiệu suất este

giảm xuống [10,11] như sơ đồ 1.8

3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat là những chất rắn,

không màu, khối lượng phân tử lớn, có nhiệt độ nóng chảy khá cao [7, 25] Tùy

theo nhóm thế vào vòng benzen (X,Y) và gốc axit (R) mà các este 3-[(N-phenyl

thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat có độ phân cực khác nhau, chúng gần như

không tan trong nước, nhưng tan hoàn toàn trong các dung môi hữu cơ như

clobenzen, THF, DMF, DMSO Hầu hết các este này ít hoặc không có mùi Đặc

biệt các hợp chất này rất dễ phân hủy ở nhiệt độ lớn hơn -20oC nên vấn đề bảo quảnchúng phải được thực hiện nghiêm ngặt [25].

1.3.2 Tính chất phổ

Do trong phân tử có hai nhóm chức chính là amit và monoester nên các hợpchất các alkyl cacboxylat của Naphtol AS thế có các phổ đặc trưng như sau [7]:

Phổ IR: Các este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat có

các dao động hóa trị đặc trưng có cường độ mạnh là: dao động hóa trị của nhómC=O este ở vùng 1715-1780 cm-1 với cường độ mạnh, dao động hóa trị của nhóm

NH ở gần vùng 3300 cm-1 và C=O amit cường độ hấp thụ trung bình nằm ở khoảng1648-1692 cm-1 và dao động biến dạng N-H hấp thụ ở vùng 1570-1515 cm-1 Ngoài

ra còn có các băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động biến dạng của vòng benzenthế trong vùng 600-800 cm-1.

Phổ 1 H-NMR: Xuất hiện tín hiệu cộng hưởng ở proton của nhóm amit NH~

10ppm ở vùng trường yếu; và các nhân phenyl và naphtyl ở 7,16-8,42 ppm Tạivùng trường mạnh thì tùy theo nhóm thế vào vòng benzen (X,Y) và gốc axit (R) màeste 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat cho tín hiệu cộnghưởng proton ở giá trị ppm khác nhau Thông thường khi R là các alkyl sẽ cho cáctín hiệu cộng hưởng của proton trong vùng 0-3 ppm

Phổ MS: Các este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat có

cấu trúc kém bền ở điều kiện bình thường, nên các chất thường được ghi phổ

ESI-MS Dưới tác dụng của chùm điện tử, xác suất phân mảnh cao nhất sẽ xảy ra tại liênkết este (O=CO) và phân tử sẽ tạo thành hai gốc chính, sau đó tiếp tục phân hủy tạothành những mảnh nhỏ hơn [26]

1.3.3 Tính chất hóa học

Các phân tử Naphtol AS thế cacboxylat có chứa hai nhóm chức chính là CO-NHamit và C=O este Do phân tử có nhiều trung tâm phản ứng, chúng có thể tham gia cácchuyển hóa khác nhau Ngoài các tính chất chung, nhóm các hợp chất này rất dễ thamgia vào phản ứng thủy phân liên kết este vì thế các hợp chất này thường không bền [4,6] Các phản ứng chính được ứng dụng nhiều trong cuộc sống là phản

ứng thủy phân nhờ xúc tác bởi esteraza tạo thành naphtol tương ứng và sau đó ghép

đôi với muối điazo hóa tạo thành phẩm màu azo [25] (sơ đồ 1.9)

Phản ứng thủy phân xúc tác bởi enzym esteraza trong môi trường nước:

esteraza xúc tác cho quá trình thủy phân các este 3-[(N-phenyl

thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat thành axit cacboxylic và ancol Đây là

phản ứng phổ biến trong mọi tế bào, đặc biệt trong chuyển hóa các chất nội và ngoại

sinh Cơ chế của phản ứng thủy phân các Naphtol AS thế cacboxylat này dưới tác

dụng của esteraza bạch cầu người xảy ra như sơ đồ 1.10 [23]

9

Sơ đồ 1.11

X O

1.4 Ứng dụng để nhuộm esteraza bạch cầu người

Hiện nay, dãy các chất naphtol AS thế cacboxylat được dùng phổ biến làm

cơ chất nhuộm esteraza trong phương pháp nhuộm hóa học tế bào để phân loại thể

bệnh trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn của Hội các nhà Huyết học

Anh-Pháp-Mỹ

1.4.1 Bệnh bạch cầu cấp và phân loại thể bệnh.

Bệnh bạch cầu cấp hay còn gọi là bệnh ung thư máu là một bệnh ác tính của

tế bào tạo máu Tế bào ác tính mất khả năng biệt hóa để tạo thành các tế bào máu

bình thường trưởng thành Những tế bào này tăng sinh một cách không kiểm soát

và lấn át các tế bào bình thường trong tủy xương và ở máu ngoại vi Cũng như các

bệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sử

dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da

cam đioxin do chiến tranh để lại [2] Các bệnh bạch cầu sau khi tiếp xúc với các

chất độc hay hóa trị có thể có những bất thường ở một số nhiễm sắc thể, tuy vậy

nhiều trường hợp vẫn không tìm thấy bất cứ một đột biến nào vì thế vai trò thật sự

của đột biến di truyền trong bệnh sinh vẫn còn chưa rõ

Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp là phát hiện các tế bào non dạng

blast thâm nhiễm trong tủy xương hoặc các tế bào ung thư ở máu ngoại vi Trong

một số trường hợp có thể gặp di căn đến các cơ quan như da, đường dạ dày-ruột,

màng não

Bệnh bạch cầu cấp gồm nhiều thể bệnh Việc chẩn đoán đúng thể bệnh có vai

trò quyết định trong việc điều trị Phân loại bạch cầu cấp hiện nay chủ yếu dựa vào

tiêu chuẩn của Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (FAB) Năm 2001, WHO đã

đưa ra bảng xếp loại riêng, nhưng phương pháp xếp loại FAB vẫn được dùng phổbiến trong các cơ sở nghiên cứu và chữa bệnh Tiêu chuẩn FAB đã đưa ra cáchphân loại ung thư máu dựa trên những đặc điểm về hình thái, hóa tế bào, miễn dịch(marker) và di truyền.

Phương pháp marker dựa vào việc phát hiện các dấu ấn miễn dịch trên tế bàobạch cầu như CD4, CD8, CD34 có tính đặc hiệu cao đặc biệt khi gắn với kỹ thuậtphân tích dòng chảy đã nâng cao rõ rệt về độ nhạy Phương pháp di truyền pháthiện các kết quả đột biến hoặc đảo đoạn của các nhiễm sắc thể Phân tích đột biếndựa trên kỹ thuật PCR và giải trình tự gen cũng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Phương pháp nhuộm hóa học tế bào gồm 6 kỹ thuật: Nhuộm esteraza đặchiệu (EST) và không đặc hiệu với chất ức chế (NSE+NaF), PAS, Sudan B (SD),Peroxydaza (PER), Photphataza axít (P.A) Hai kỹ thuật nhuộm PAS và nhuộmSudan dùng để phát hiện glucozit và lipit, bốn kỹ thuật còn lại là nhuộm phát hiệnenzym Trong đó nhuộm esteraza bạch cầu là một kỹ thuật quan trọng dựa trênnguyên lý kỹ thuật hình thành phẩm màu azo tại vùng enzym

1.4.2 Giới thiệu về esteraza.

Theo phân loại của tiểu ban enzym (EC) thuộc Hội Hóa sinh quốc tế (IUB),esteraza là một enzym hiđrolaza thuộc nhóm cacboxylesteraza (E.C.3.1.1.1) [24]xúc tác các phản ứng thủy phân este cacboxylat thành axit và ancol, trong môitrường nước được gọi là sự thủy phân:

Este cacboxylat + H2O ancol + axit cacboxylicEsteraza có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thể Hàm lượng cao nhất là trong các

tế bào thực bào, sau đó đến tế bào gan, ruột, dạ dày, phổi, tiền liệt tuyến, tụy và ít nhất

là trong tế bào não Trong tế bào, esteraza thường phân bố chủ yếu trong lưới nộinguyên sinh chất, máy golgi, lysosom và màng tế bào [12,19,23] Về cấu tạo esteraza làmột enzym serin có tâm hoạt động được cấu tạo bởi axit amin Ser đóng vai trònucleophin, His đóng vai trò bazơ và một axit amin thứ 3, đóng vai trò axit là Asp, ởmột số isoenzym thì Asp được thay thế bằng Glu và vì thế esteraza không

đặc hiệu còn được gọi là enzym có tâm hoạt động theo cơ chế Ser-His-Asp/Glu [20]hình 1.

Hình 1 Tâm hoạt động của esteraza không đặc hiệu.

Esteraza là nhóm enzym không đồng nhất về mặt cấu trúc [21] Các côngtrình công bố gần đây cho thấy trong các tổ chức khác nhau thì esteraza không đặchiệu có cấu trúc khác nhau Trọng lượng phân tử từ 19.500-180.000 dalton (Da)[13] Kích thước của enzym vào khoảng 2-3 Ǻ Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadexKaphalia và c.s đã xác định được esteraza gồm 2 chuỗi có trọng lượng phân tử là60kDa và phần kia là 180 kDa Phần 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởidiisopropyl flophotphat trong các phản ứng nhuộm, tức nó thuộc loại B esteraza (bị

ức chế bởi hợp chất florua - NSE) [10-12]

Về mặt điện tích thì esteraza là một enzym mang điện tích âm và các isoenzymnằm trong vùng đẳng điện (pI) từ 5,5-6,1 [17] Nhiều isoenzym có tính đặc hiệu khácao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó như một giá trị tham chiếu để nhận dạngdòng tế bào SM Gignac và c.s [5] bằng phương pháp điện di đã tìm ra 5 isoenzymkhác nhau của esteraza trong các tế bào máu, là esteraza mono 1/mono 2 tìm thấy trongcác tế bào bạch cầu mono (NSE); My 1/My 2 dòng tủy (esteraza đặc hiệu), bệnh đa utủy, dòng hồng cầu, dòng tiểu cầu; Lym 1/Lym 2 trong tế bào lympho và cuối cùng làUnc trong tế bào chưa biệt hóa Như vậy có thể khẳng định esteraza là một tập hợpgồm nhiều isoenzym không đồng nhất Bằng phương pháp sắc ký điện di Scott và c.s

đã thu được esteraza tinh khiết từ các tế bào bạch cầu

dòng tủy và tìm ra hai isoenzym của esteraza không đặc hiệu A và B Hai isoenzymnày thường có mặt trong các bào quan của cả hai dòng bạch cầu đoạn và bạch cầumono Nhiều công trình nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hai isozym này khácnhau về sự ức chế bởi nhiệt độ và NaF [2, 3, 16].

Trong tế bào bạch cầu người, esteraza được chia làm hai nhóm là esterazađặc hiệu và không đặc hiệu Esteraza đặc hiệu chủ yếu phân bổ trong các tế bàodòng tủy, xuất hiện từ tiền tủy bào đến bạch cầu đoạn trưởng thành Nhuộmesteraza đặc hiệu chủ yếu dùng các este napthol AS thế 2-clo cacboxylat như:Naphtol AS-D cloaxetat, naphtol AS-D clopropanoat Esteraza không đặc hiệu(NSE) được nhuộm bằng các este napthol AS thế cacboxylat không có nguyên tửclo ở vị trí   như: Naphtol AS axetat, napthol AS-MX butanoat Sở dĩ được gọi

là esteraza không đặc hiệu vì nó có trong hầu hết các dòng tế bào Khi nhuộm bằngcác cơ chất trên với chất ức chế bằng NaF thì chỉ có NSE trong bạch cầu mono bị ứcchế hoàn toàn, không hiện màu trong phản ứng nhuộm màu Dựa vào tính chất khácnhau trong quá trình nhuộm NSE này để phân biệt thể bệnh bạch cầu cấp dòngmonoxit với các dòng tế bào khác theo tiêu chuẩn FAB (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Bảng phân loại bệnh ung thư máu dòng mono theo FAB bổ sung Marker và di truyền [8]

Hình thái học và số lượng tế bào tủy Hóa học tế bào Marker CD Di truyền

M4

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu; Peroxidaza, Sudan B, esteraza 1) CD (+): 13, t(9; 11) (p22;2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts; đặc hiệu dòng tủy, esteraza 14, 15, 33; q23)

3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao gồm cả blasts; không đặc hiệu có và không 2) HLA-DR (+)

4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít; có chất ức chế NaF dương

5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất; tính

6) Số lượng bạch cầu monoxít trong máu >5.109 hoặc

<5.109 kèm tăng lysozym trong huyết tương

M4eo

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu; Peroxidaza, Sudan B, esteraza 1) CD (+): 13, t(16; 16)2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts; đặc hiệu dòng tủy, esteraza 14, 15, 33; inv(16)

3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao gồm cả blasts; không đặc hiệu có và không 2) HLA-DR (+)

4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít; có chất ức chế NaF dương

5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất; tính

6) ≥5% tế bào không phải dòng hồng cầu là bạch cầu ưa

axít và gặp các tế bào ưa axít bất thường;

7) Số lượng bạch cầu monoxít trong máu >5.109 hoặc

<5.109 kèm tăng lysozym trong huyết tương

Hình thái học và số lượng tế bào tủy Hóa học tế bào Marker CD Di truyền

M5a

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts; âm tính hoặc dương tính yếu; 14, 15, 33; (p22:q23)3) ≥80% tế bào không phải dòng hồng cầu là monoxít; 2) Esteraza đặc hiệu dòng 2) HLA-DR (+)

5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất 3) Esteraza không đặc

hiệu dương tính mạnh và bị ứcchế bởi NaF

M5b

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts; âm tính hoặc dương tính yếu; 14, 15, 33; (p11:p13)3) ≥80% tế bào không phải dòng hồng cầu trong tủy là 2) Esteraza đặc hiệu dòng 2) HLA-DR (+)

5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất hiệu dương tính mạnh và bị ức

chế bởi NaF

Như vậy, trong các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào thì kỹ thuật nhuộm pháthiện NSE là một xét nghiệm quan trọng giúp phân biệt ung thư máu thể M4 và thểM5 với các thể khác Đó là các thể ung thư hỗn hợp dòng tủy – monoxit (M4) vàdòng monoxit (M5) Ở các thể này NSE dương tính rất mạnh nhưng ở thể M5 thì bị

ức chế hoàn toàn bởi NaF [18] và đây là cơ sở để phân biệt bạch cầu cấp dòngmonoxit với các dòng tế bào khác

1.4.3 Cơ chất dùng trong nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người

Hiện nay, nhiều hợp chất được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộmNSE bạch cầu người, trong đó phổ biến nhất là naphtol AS axetat Cơ chế của phảnứng nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người xảy ra qua hai giai đoạn[3,14,15]

Bước 1: Nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người

Giai đoạn 1: Enzym esteraza thuỷ phân các dẫn xuất este 3-[(N-phenylthế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat thành Naphtol ban đầu (Sơ đồ 1.12)

Sơ đồ 1.12

Trong đó: X, Y: các nhóm thế trên vòng benzen; R: nhóm alkyl

Nó có thể tồn tại dưới 3 dạng cân bằng hỗ biến tùy thuộc vào pH của môitrường Trong môi trường trung tính nó tồn tại dưới dạng naphtol, trong môi trườngkiềm chuyển dần sang naphtolat và dạng quinoid như miêu tả trong sơ đồ 1.13

tử cơ chất (este) phải phù hợp với tâm hoạt động của enzym như “ổ khóa và chìakhóa” thì phản ứng mới diễn ra thuận lợi.

Bước 2: Ức chế bằng NaF thì tế bào dòng monoxit bị mất hoạt tính

Tiến hành nhuộm giống như bước 1 nhưng bổ sung thêm NaF với nồng độ 5mg/1ml dung dịch nhuộm thì nếu là bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit thể M4 đặcbiệt là M5 sẽ bị ức chế hoàn toàn Như vậy, do phải tiến hành qua hai bước nhưtrên nên thời gian nhuộm thường kéo dài, ảnh hưởng thời gian phục vụ chẩn đoán

và theo dõi bệnh

Tóm lại, sử dụng cơ chất trên cơ sở các dẫn xuất của napthol AS thếcacboxylat để nhuộm esteraza là một kỹ thuật quan trọng giúp phân loại dòng tế bàobạch cầu người trong bệnh bạch cầu cấp Các cơ chất thương mại hiện nay ở ViệtNam đều phải nhập ngoại với giá thành cao (7.000.000 đ/1 g), cơ chất lại dễ bị phânhủy, nhuộm không đặc hiệu vì vậy "Nghiên cứu tổng hợp các alkyl cacboxylat củaNaphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono" làmột đề tài có ý nghĩa khoa học và xã hội sâu sắc

CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tổng hợp và sử dụng các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono

2.2 Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp tổng hợp hữu cơ;

 Phương pháp vật lý và hóa lý xác định cấu trúc;

 Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào;

2.3 Hóa chất và thiết bị

2.3.1 Hóa chất

 Acetyl clorua 98%; Propaonyl clorua 98%; Butanoyl clorua 98%; Pentanoyl

clorua 98%, loại P sản phẩm của Sigma Aldrich;

 Naphtol AS 99%; Naphtol AS-OL 95%; Naphtol AS-CA 99% sản phẩm của

 Dung môi etylenglycol monometyl ete; THF, DMF, DMSO, Hematoxylin, Etanol 99%, formadehyt loại P sản phẩm của Sigma Aldrich;

 Axeton 99,5 %, loại ACS, sản phẩm của sigma Aldrich;

 NaOH; Axetonitrin; n- Hexan; Etyl axetat; Axit xitric; Natri xitrat, Natri clorua loại P, sản phẩm của Trung Quốc;

 Muối điazo: Fast red violet LB salt, sản phẩm của Acros;

 Na2HPO4 99%, KH2PO4 99%, Etylenglycol loại PA của Merck;

2.3.2 Các dụng cụ và thiết bị

Healcare, Nhật Bản tại Bệnh viện 19-8;

Quốc, phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, trường đại học

KHTN-ĐHQGHN;

 Cân các mẫu bằng cân phân tích Sartorius độ chính xác 10-4, tại Bệnh viện 19-8;

 Sắc ký bản mỏng: được thực hiện với bản mỏng làm từ silicagel 60 F254

tráng trên lá nhôm của hãng Merck (Đức), được hiện thị bằng máy soi UV Gelogic

200 của Mỹ tại Bệnh viện 19-8;

 Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy:

+ GX của hãng PerkinElmer (Mỹ) tại khoa Hóa học, trường Đại học ĐHQGHN; 400-10.000cm-1; mẫu được ép viên với KBr;

KHTN-+ SIGNA của hãng Nicolet, Viện Hóa học – Viện KH&CN Việt Nam;

600-4000 cm -1; mẫu được ép viên với KBr

 Phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy:

+ GC-MS phân giải cao (EI, 70ev) của hãng Micromass Waters, Khoa Hóahọc, trường Đại học KHTN-ĐHQGHN;

+ LC-MSD-Trap-SL của hãng Agilent Technologies (Mỹ), Viện Hóa học –Viện KH&CN Việt Nam

 Phổ cộng hưởng từ ghi trên máy:

+ ADVANCE Spectrometer (Bruker 500Mv), tần số 500MHz, tại Viện Hóa học -Viện KH&CN Việt Nam; dung môi DMSO-d6; chất chuẩn nội TMS;

+ BRUKER, tần số 500 MHz, tại khoa Hóa học, trường Đại học ĐHQGHN; dung môi DMSO, chất chuẩn nội TMS

KHTN- Thử nghiệm hoạt tính sinh học:

+ Ủ nhiệt tiêu bản nhuộm bằng máy điều nhiệt CW-20GS (0-500C) tại nhiệt độ

370C của Hàn Quốc, độ chính xác ±0,10C, tại Bệnh viện 19-8;

+ Soi tiêu bản bằng kính hiển vi hai mắt Nikon với độ phóng đại 1.000 lần cógắn máy chụp ảnh, tại Bệnh viện 19-8;

+ Đo pH dung dịch bằng máy InoLab pH 730, CHLB Đức, độ chính xác 10-3, tại Bệnh viện 19-8;

+ Pipet tự động của hãng Thermo kèm đầu côn 0,2; 1,0 và 10 ml của hãngGilson

2.4 Các phần mềm sử dụng

 Phần mềm thống kê minitab 18;

 Chembio draw ultra view 12.0

2.5 Sơ đồ phản ứng chung và các quy trình thực nghiệm

NH X OH N

trong tế bào mono

- Phản ứng 2: Phản ứng thủy phân este hóa trên nguyên sinh chất tế bào mono củacác cơ chất tổng hợp đƣợc về Naphtol ban đầu;

- Phản ứng 3: Phản ứng ghép đôi muối Fast red violet LB salt với Naphtol AS thếđƣợc tạo thành

2.6 Thực nghiệm

2.6.1 Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA.

a Tổng hợp theo phương pháp truyền thống [7].

Hòa tan 1g (0,00343 mol) naphtol AS-OL vào trong 10 ml THF Nhỏ từ từ0,648 ml dung dịch NaOH 5M vào dung dịch trên và duy trì nhiệt độ phản ứng ở 0oC.Sau đó tiếp tục nhỏ từ từ 0,343 ml butanoyl clorua lạnh 98% d= 1,026 (g/ml) vào dungdịch trên và khuấy trong thời gian 1 h Kết thúc phản ứng, thêm nước lạnh vào lọc thusản phẩm thô Kết tinh sản phẩm trong dung môi axeton và etanol (tỉ lệ 3:1 v/v), tinhthể được hình thành sau 48h Sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,69 dung môi n-

hexan:etylaxetat = 3:7 v/v), Tnc: 94-96oC (94-95 oC [7]) Hiệu suất đạt 52%

Hiệu suất thu được sau phản ứng chưa cao do đó đã tiến hành khảo sát cácđiều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng: Nhiệt độ, dung môi, tỉ lệ chất tham gia

và thời gian phản ứng

b Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp: dẫn suất este phenyl)nahthalen-2-yl cacboxylat.

3-(N-b.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi

Giữ nguyên điều kiện phản ứng ở nhiệt độ 0oC, tỉ lệ tỷ lệ Naphtol AS-OL:butanoyl clorua = 1: 1,1, thời gian phản ứng 1 giờ; thay đổi dung môi hòa tan NaOHtrước khi nhỏ vào phản ứng bằng các dung môi khảo sát: THF, axeton; acetonitrin,DMF, DMSO và etylenglycol monometyl ete (EGME) Các dung môi được sử dụngkhảo sát đều được làm khan trước khi tiến hành thí nghiệm Phản ứng được tiến

hành trong các điều kiện tương tự phương pháp truyền thống (mục 2.6.1.a) Kết quả khảo sát được trình bày trên bảng 2.1

Bảng 2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của phản ứng

phản ứng

Khi sử dụng dung môi EGME cho hiệu suất cao nhất, do đó yếu tố này là cố

định để khảo sát các yếu tố khác ảnh hưởng đến phản ứng

b.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ chất tham gia phản ứng

Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự phương pháp truyền

thống (mục 2.6.1.a), nhiệt độ phản ứng 00C, dung môi etylenglycol monnometyl

ete, tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua thay đổi như sau: 1:1,1; 1:1,2; 1: 1,3; 1 :

1,5 và 1 : 2 Kết quả khảo sát được trình bày trên bảng 2.2

Bảng 2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất tham gia phản ứng đến

hiệu suất của phản ứng

gia phản ứng

Tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua =1:1,5 và 1:2 cho hiệu suất không chênh

lệch nhiều so với tỷ lệ 1:1,3 Nên tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua =1:1,3 được

chọn làm yếu tố cố định để khảo sát các ảnh hưởng khác đến phản ứng

b.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu suất phản ứng

Do cơ chất rất không bền ở nhiệt độ trên >-20oC [24], do đó đã tiến hành

khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất sản phẩm Phản ứng được thực

hiện trong tủ ẩm lạnh MIR-154 để duy trì nhiệt độ ổn định tròn suốt quá trình Phản

ứng được tiến hành trong các điều kiện dung môi etylenglycol monnometyl ete, tỷ

lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua = 1:1,3, thời gian phản ứng 1 giờ, nhiệt độ khảo

sát ở 10, 5, 0, -5 và -10oC Sau khi xử lý hiệu suất sản phẩm 3b3 được trình bày

Ở nhiệt độ 00C, phản ứng cho hiệu suất cao nhất, do đó nhiệt độ này được

chọn là nhân tố cố định tiếp theo để khảo sát các yếu tố khác

b.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Giữ nguyên điều kiện phản ứng ở nhiệt độ 0oC, dung môi sử dụng etylenglycolmonnometyl ete, tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Naphtol :cacboxyl clorua = 1: 1,3;thời gian phản ứng thay đổi từ 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h Kết quả khảo sát sự ảnhhưởng của thời gian phản ứng được thể trình bày trên bảng 2.4

Bảng 2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, đã tìm được điều kiện

thích hợp để sản phẩm Naphtol AS-OL butanoat (3b3) đạt hiệu suất cao nhất (80%) là: + Dung môi etylenglycol mono metyl ete;

+ Tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Naphtol : cacboxyl clorua = 1:1,3;

+ Nhiệt độ phản ứng ở 0 o C;

+ Thời gian phản ứng: 2h.

Bằng quy trình tương tự đã tổng hợp được 10 este 3-[(N-phenyl) cacbamoyl]

naphtalen-2-yl cacboxylat:

 3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl axetat, hiệu suất 62% (NaOH 5M); Tnc

= 160-1620C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,60 dung môi n-hexan:etylaxetat =

3:7) (3a1);

 3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl propanoat, hiệu suất 69% (NaOH 5M);

Tnc = 154-1560C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,62 dung môi

n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3a2) chất mới;

 3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl butanoat, hiệu suất 72% (NaOH 5M);

 3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl axetat, hiệu suất 65%(NaOH 5M); Tnc = 130-1310C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,63 dung môi n-

2.6.2 Quy trình thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng nhuộm enzym.

a Chuẩn bị dung dịch nhuộm - Dung dịch cố định:

+ Dung dịch cơ chất pha trong DMF

+ Dung dịch fast red violet LB salt

b Quy trình nhuộm chung:

Bước 1: Cố định tiêu bản trong dung dịch cố định trong thời gian 10 giây;