Nghiên cứu xác định hàm lượng một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---Bùi Cao Tiến NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Bùi Cao Tiến

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

-Bùi Cao Tiến

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG CÁC SẢN PHẨM THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ HAI LẦN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo Hướng dẫn 2: TS Trần Cao Sơn

Hà Nội – 2018

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích, trườngĐại học Khoa học tự nhiên đã nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thứccần thiết, quan trọng và bổ ích.

Đồng thời, xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thựcphẩm Quốc gia, các đồng nghiệp trong Viện đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoànthành đề tài

Cuối cùng, con xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình vàngười thân đã luôn ở bên quan tâm, động viên con trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực hiện đề tài, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệmthực tiễn còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mongnhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn đồng nghiệp

Xin chân thành cảm ơn !

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về nitrosamin 2

1.1.1 Công thức cấu tạo của nitrosamin 2

1.1.2 Sự tạo thành nitrosamin 3

1.1.3 Tính chất hóa lý của nitrosamin 3

1.1.4 Độc tính 3

1.1.5 Nguồn nitrosamin từ thực phẩm 4

1.1.6 Quy định hiện hành về nitrosamin 5

1.2 Phương pháp xác định các nitrosamin trong thực phẩm 5

1.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu Error!Bookmarknotdefined6. .

1.2.1.1 Chưng cất 6

1.2.1.2 Chiết lỏng - lỏng 6

1.2.1.3 Vi chiết pha rắn 7

1.2.1.4 Chiết pha rắn 7

1.2.1.5 Kỹ thuật QuEChERS 8

1.2.1.6 Các kỹ thuật chiết khác 9

1.2.2 Phương pháp phân tích 9

1.2.2.1 Sắc ký lỏng khối phổ 9

1.2.2.2 Sắc ký khí 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt nướng 13

2.2.1.1 Khảo sát các điều kiện xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS 13

2.2.1.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 13

2.2.2 Thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt nướng 14

2.2.3 Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng trên địa bàn Hà Nội 14

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 14

2.3.1 Thiết bị 14

2.3.2 Dụng cụ 14

2.3.3 Hóa chất, chất chuẩn 15

2.3.4 Pha dung dịch chuẩn 15

2.3.4.1 Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL và 1 µg/mL 15

2.3.4.2 Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL 15

2.3.4.3 Dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL và 1 µg/mL 16

2.3.4.4 Dung dịch chuẩn làm việc 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Quy trình xử lý mẫu 16

2.4.2 Phương pháp phân tích bằng GC-MS/MS 17

2.4.3 Phương pháp thẩm định 17

2.4.3.1 Tính chọn lọc 17

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 18

2.4.3.3 Khoảng làm việc và đường chuẩn 18

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 18

2.4.4 Phương pháp xử lý kết quả 19

2.4.5 Phương pháp lấy mẫu 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong thịt nướng 20

3.1.1.2 Điều kiện GC 21

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 23

3.1.2.1 Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu 23

3.1.2.2 Khảo sát muối chiết 25

3.1.2.3 Khảo sát phương pháp chiết 26

3.1.2.4 Khảo sát thời gian chiết 27

3.1.2.5 Khảo sát bột làm sạch 29

3.1.2.6 Khảo sát lượng C18 sử dụng 30

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nền 32

3.2 Thẩm định phương pháp 33

3.2.1 Độ đặc hiệu 33

3.2.1.1 Tính số điểm IP 33

3.2.1.2 Tỷ lệ ion 33

3.2.1.3 Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn 35

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 35

3.2.3 Khoảng làm việc 36

3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 38

3.2.5 Độ lặp lại khác ngày 40

3.3 Ứng dụng phương pháp để sơ bộ xác định hàm lượng nitrosamin trong thịt nướng lấy ở địa bàn Hà Nội 41

3.3.1 Kết quả xác định hàm lượng nitrosamin trong mẫu thực tế 41

3.3.2 So sánh các cách chế biến khác nhau ảnh hưởng đến lượng nitrosamin tạo thành 42

KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

CE Collision energy (Năng lượng va chạm)

CI Chemical ionization (Ion hóa hóa học)

d-SPE Dispersive solid phase extraction (Chiết pha rắn phân tán)

EI Electron impact (va chạm electron)

ESI Electrospray inonization (ion hóa bằng nguồn phun điện tử)

GC-MS/MS Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí khối

phổ hai lần)

LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng

khối phổ hai lần)LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of Qualification (Giới hạn định lượng)

ME Matrix effect (Ảnh hưởng nền)

NDBA N-Nitroso di-n-butyl amine

NDEA N-Nitroso diethyl amine

NDMA N-Nitroso dimethyl amine

NDPA N-Nitroso dipropyl amine

NDPhA N-nitroso diphenyl amine

NPYR N-Nitroso pyrollidine

NPD Nitrogen-phosphorus detector (detector nitơ –photpho)

hiệu quả, ổn định, an toàn)

SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

SPME Solid phase microextraction (Vi chiết pha rắn)

TEA Thermal energy analyser (Bộ phân tích năng lượng nhiệt)

Bảng 1.1 Một số nitrosamin thường gặp 2

Bảng 1.2 Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin 4

Bảng 1.3 Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống 5

Bảng 1.4 So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS 8

Bảng 1.5 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS 11

Bảng 2.1 Các nitrosamin được sử dụng trong nghiên cứu 13

Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc 16

Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích nitrosamin 20

Bảng 3.2 Chương trình nhiệt độ xác định nitrosamin 22

Bảng 3.3 Tỷ lệ ion và sai số cho phép 34

Bảng 3.4 Khoảng làm việc và độ chệch 38

Bảng 3.5 Độ lặp lại và độ thu hồi của NDMA 38

Bảng 3.6 Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPA 39

Bảng 3.7 Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPhA 40

Bảng 3.8 Độ lặp lại khác ngày của các nitrosamin nghiên cứu 41

Bảng 3.9 Kết quả phân tích mẫu thực tế 41

Bảng 3.10 So sánh các cách chế biến khác nhau 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của nitrosamin 2

Hình 3.1 Sắc ký đồ khi phân tích nitrosamin với cột DB5-MS và cột DB1701 21

Hình 3.2 Sắc ký đồ tổng ion (TIC) của các nitrosamin nghiên cứu 22

Hình 3.3 Sắc ký đồ các nitrosamin trong dung môi ACN và ACN:DCM (1:1/v:v) 23 Hình 3.4 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu dự kiến 24

Hình 3.5 Sắc ký đồ ảnh hưởng của muối chiết 26

Hình 3.6 Sắc ký đồ ảnh hưởng của phương pháp chiết 27

Hình 3.7 Sắc ký đồ ảnh hưởng của thời gian chiết 28

Hình 3.8 Sắc ký đồ ảnh hưởng của bột làm sạch 29

Hình 3.9 Sắc ký đồ ảnh hưởng của lượng bột làm sạch 30

Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 31

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nền mẫu 33

Hình 3.12 Tỷ lệ ion của các nitrosamin (mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn) 34

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn 35

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ LOQ = 0,5 ng/g 36

Hình 3.15 Đường chuẩn các nitrosamin nghiên cứu 37

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại, việc sử dụng thực phẩm chế biếnsẵn, trong đó có các sản phẩm từ thịt như thịt nướng, thịt hun khói, xúc xích, ngàycàng phổ biến Những sản phẩm này, một mặt mang lại sự thuận tiện cũng như sựngon miệng, mặt khác có thể gây ra những hậu quả lâu dài Các nghiên cứu đã chỉ ranhiều hóa chất độc hại có thể sinh ra từ quá trình chế biến thực phẩm bằng cáchnướng hoặc rán

Nitrosamin là một nhóm hóa chất độc hại có thể sinh ra do quá trình chế biếnthực phẩm đặc biệt là nhóm sản phẩm thịt Thịt gia súc, gia cầm vốn có chứa hàmlượng acid amin cao, nếu được tẩm ướp các phụ gia có chứa nitrat, nitrit và dưới tácđộng của điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp có thể tạo thành nitrosamin Một số hợpchất thuộc nhóm nitrosamin được tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) phânloại là nhóm chất có thể gây ung thư trên người Do đó, việc kiểm soát hàm lượngnitrosamin trong các sản phẩm chế biến từ thịt, đặc biệt là thịt nướng có đóng gópquan trọng, giúp phòng ngừa nguy cơ mắc ung thư, góp phần bảo vệ sức khỏengười tiêu dùng

Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác địnhnitrosamin trong thực phẩm Tuy nhiên, ở Việt Nam lĩnh vực này mới chỉ đượcquan tâm trong thời gian gần đây Đặc biệt chưa có một phương pháp tiêu chuẩn

nào đã và đang được áp dụng Do đó, đề tài “Nghiên cứu xác định hàm lượng một

số nitrosamin trong các sản phẩm thịt bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần” được thực hiện không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có ý nghĩa thực

tiễn lớn Mục tiêu của đề tài như sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số

nitrosamin trong các sản phẩm thịt

2 Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt trên địa bàn Hà Nội

1

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

1.1 Giới thiệu về nitrosamin

1.1.1 Công thức cấu tạo của nitrosamin

Nitrosamin là hợp chất hóa học có cấu trúc R1-N(-R2)-N=O, trong đó mộtnhóm nitroso liên kết với một amin bậc 2 hoặc muối amoni bậc 4 Công thức cấutạo chung của nitrosamin và công thức cấu tạo của một số nitrosamin thường gặpđược giới thiệu ở hình 1.1 và bảng 1.1 [3]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của

nitrosamin Bảng 1.1 Một số nitrosamin thường gặp

1 N-Nitrosodimethyl amine (NDMA) N N O

Khối lương ̣ phân tử

74

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

1.1.2 Sự tạo thành nitrosamin

Nitrosamin được tạo thành từ phản ứng giữa tác nhân nitroso hóa và nhómamin bậc 2 hoặc muối amoni bậc 4 Các amin bậc nhất khi phản ứng với tác nhânnitroso hóa sẽ tạo thành sản phẩm không bền và bị phân hủy thành olefin hoặc alcol[3]

Các tác nhân nitroso hóa gồm các oxit của nitơ (NOx), trong đó tác nhân chủyếu là N2O3 Các nitrit cũng là tác nhân tạo thành nitrosamin qua các phản ứng:

Có thể thấy rằng, sự tạo thành nitrosamin phụ thuộc vào pH, nồng độ củanitrit và của amin Theo các nghiên cứu, khoảng pH từ 2,5-3,5 là pH tối ưu cho sựtạo thành nitrosamin từ nitrit Mặc dù nhiều loại thực phẩm ít có tính acid như trên,nitrosamin vẫn có thể tạo thành trong điều kiện acid của dạ dày khi có mặt đồngthời nitrit và các amin Ngoài ra, tác động của nhiệt độ cũng làm quá trình sinhnitrosamin diễn ra nhanh hơn [5]

1.1.3 Tính chất hóa lý của nitrosamin

Các nitrosamin thường tồn tại ở dạng lỏng, màu vàng nhạt Các nitrosamin

có thể phân thành 2 loại: dễ bay hơi và khó bay hơi, phụ thuộc vào các nhóm thế (R1

và R2) Các nitrosamin dễ bay hơi thường được nghiên cứu nhiều hơn do nguy cơgây ung thư cao hơn Nhiệt độ bay hơi của các nitrosamin nhóm này dao động trongkhoảng 120-180oC ở điều kiện thường Các nitrosamin dễ bay hơi thường là cácchất có tính phân cực trung bình, có thể tan được trong nước và một số dung môiphân cực như methanol, ethanol, acetonitril

Các nitrosamin thể hiện tính chất chung của nhóm N-nitroso (-N-N=O) Đây

là nhóm chất có hoạt tính cao và là tác nhân có thể gây ung thư hoặc phá hủy tế bàotrên người [14]

1.1.4 Độc tính

Các nitrosamin có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người và đông ̣ vâṭ.Chúng là một trong những nguyên nhân gây ung thư gồm nhiều loại ung thư khácnhau như ung thư dạ dày, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, ung thư phổi

Ngoài ra, nitrosamin có thể gây tổn thương DNA, gây chết tế bào, thoái hóa não,các bệnh về gan và béo phì [3].

Các nitrosamin đã được nhiều tổ chức phân loại là các chất có thể gây ungthư Hiện nay, NDMA và NDEA đã được tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế(IARC) xếp vào nhóm 2A, còn NDPA được xếp vào nhóm 2B là nhóm có nguy cơgây ung thư trên người [3]

1.1.5 Nguồn nitrosamin từ thực phẩm

Bên cạnh những nguồn chứa nitrosamin từ môi trường, khói thuốc lá, nướcuống, một số sản phẩm thực phẩm cũng có nguy cơ lớn có chứa nitrosamin Nếutrong sản phẩm thực phẩm đồng thời tồn tại nhóm amin và nitrit, sản phẩm đó cónguy cơ chứa nitrosamin cao Bảng 1.2 tóm tắt một số đối tượng thực phẩm thường

có chứa nitrosamin [21],[22]

Bảng 1.2 Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin

Ghi chú: KPH là Không phát hiện

Sự tạo thành nitrosamin phụ thuộc đáng kể vào lượng nitrat/nitrit, phươngpháp chế biến, nhiệt độ và thời gian chế biến cũng như điều kiện bảo quản thựcphẩm Trong nhóm đối tượng sản phẩm chế biến từ thịt, hiện chưa có các thông tin

về hàm lượng nitrosamin trong thịt nướng đặc biệt là thịt nướng có tẩm ướp gia vị

vì nhóm này có chứa hàm lượng nitrit khá cao Với tác động của nhiệt độ, nguy cơtạo thành nitrosamin trong các đối tượng này khá rõ rệt

Các nghiên cứu thực hiện vào năm 1981 đã cho thấy trung bình mỗi ngàychúng ta hấp thụ khoảng 1 µg nitrosamin từ thực phẩm Qua 20 năm, lượng hấp thụtrung bình nitrosamin đã thấp hơn do hiệu quả của việc cắt giảm sự hình thànhnitrosamin trong thực phẩm và đồ uống, nhưng lượng nitrosamin đang có nguy cơ

4

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

gia tăng trở lại bởi xu hướng ưa chuộng sản phẩm đồ ăn nhanh với nhiều loại thịthun khói, thịt nướng như hiện nay

Để giảm sự tạo thành nitrosamin trong thực phẩm, nhiều giải pháp đã đượcnghiên cứu Việc loại bỏ hoàn toàn nitrat và nitrit trong chế biến thực phẩm khôngphải là giải pháp hữu hiệu do các chất này giúp bảo quản thực phẩm trước sự phát

triển của một số vi sinh vật gây bệnh như Clostridium botulinum Người ta có thể sử

dụng acid ascorbic hoặc α-tocopheral trong chế biến thực phẩm do các chất nàyphản ứng với N2O3 Tuy nhiên, cho đến nay việc loại trừ hoàn toàn nguy cơ tạothành nitrosamin vẫn chưa thể thực hiện được Do đó, nitrosamin vẫn tiếp tục đượctìm thấy trong nhiều sản phẩm thực phẩm [22]

1.1.6 Quy định hiện hành về nitrosamin

Hiện nay, mới chỉ có các quy định về hàm lượng tối đa của nitrosamin trongnước ăn uống, chưa có quy định cho đối tượng thực phẩm

Bảng 1.3 Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống[7]

TT Quốc gia, khu vưc ̣ Mức tối đa trong nước uống

(NDPA)

2 Canada 0,04 μg/L (tổng nitrosamin)g/L (tổng nitrosamin)

Bô ̣Nông nghiêp ̣ Mỹgần đây đa ̃cónhững nghiên cứu vềnguy cơ của cácnitrosamin trong thiṭhun khói vàkhuyến cáo hàm lương ̣ tối đa trong thiṭhun khói đốivới NPYR (chất có hàm lượng cao nhất) là10 µg/kg Đối với các nitrosamin khác,mặc dù hàm lượng khuyến cáo đến nay chưa được đưa ra nhưng đối với nhiềunghiên cứu đánh giá nguy cơ hiện nay đòi hỏi phương pháp phân tích phải đạt đượcmức LOQ đến 0,5 µg/kg [7],[25]

1.2 Phương pháp xác định các nitrosamin trong thực phẩm

Có nhiều nghiên cứu xác định các nitrosamin trong thực phẩm nói chung và

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

đầu tiên các nitrosamin được tách ra khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp.Sau đó, một kỹ thuật phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượngnitrosamin trong dịch chiết từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu

1.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu

Xác định các nitrosamin trong các nền mẫu thịt và sản phẩm thịt gặp phảinhiều khó khăn do hàm lượng nitrosamin thường rất thấp (vài ppb) và do ảnh hưởngcủa nhiều các hợp chất sinh học trong nền mẫu có thể gây nên ảnh hưởng nền lớn

Vì thế, mục tiêu của quá trình xử lý mẫu ngoài việc đạt được tối đa hiệu suất chiếtnitrosamin, còn phải làm giảm được càng nhiều tạp chất càng tốt Nhiều kỹ thuật xử

lý mẫu đã được sử dụng bao gồm chưng cất, chiết bằng dung môi, chiết với sự hỗtrợ vi sóng, chiết pha rắn, và QuEChERS

1.2.1.1 Chưng cất

Theo kết quả của Sen và Seaman, mẫu thịt hun khói được kiềm hóa và chưngcất với dầu khoáng trong thiết bị chưng cất chân không và thu nitrosamin vào mộtthiết bị bẫy hơi, sau đó bẫy được chiết lại bằng DCM DCM sau đó được cô để làmgiàu và phân tích bằng sắc ký khí [20] Kỹ thuật chưng cất này có hiệu quả tốt đốivới nitrosamin đặc biệt là NDMA là chất có nhiệt độ bay hơi thấp Phương pháp nàysau đó đã được AOAC chấp nhận và trở thành phương pháp chuẩn AOAC 982.22[5]

Al-Kaseem và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật chưng cất hơi nước để cất cácnitrosamin Mẫu thịt được đồng nhất trong nước sau đó chưng cất nitrosamin vàopha nước Mẫu sau chưng cất được chiết lại bằng DCM và làm sạch bằng SPE [15]

Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này ít được áp dụng do sự phức tạp của hệthống chưng cất (yêu cầu hệ thống chưng cất đặc biệt và cần có N2 để làm mát).Việc sử dụng sắc ký khí với bộ phân tích TEA cũng ít phổ biến ngày nay

1.2.1.2 Chiết lỏng - lỏng

Đối với một số mẫu dạng lỏng như bia, nước uống, kỹ thuật chiết lỏng lỏng

có thể được áp dụng để chiết nitrosamin Ngày nay, kỹ thuật chiết lỏng lỏng vớichất nhồi Celite hay Extrelut có thể được sử dụng Nitrosamin được hấp phụ vàolớp nước bao quanh các hạt nhồi, sau đó được chiết lại bằng dung môi hữu cơ thích

hợp như DCM hay hỗn hợp DCM và n-hexan Phương pháp này có thể đạt độ thuhồi từ 74-85% với giới hạn phát hiện 0,5 µg/L Một trong những phương pháp nàysau đó đã trở thành phương pháp chính thức của AOAC, áp dụng cho nền mẫu bia[6].

Kỹ thuật chiết lỏng lỏng này cũng đã được nghiên cứu trên những nền mẫuthực phẩm khác như thịt và dầu ăn Theo Yurchenko và cộng sự, bột Extrelut(diatomaceous earth) được nhồi vào cột thủy tinh và thực hiện chiết lỏng lỏng vàohỗn hợp n-hexan:DCM (4:6) Tuy nhiên, độ thu hồi của các nitrosamin thu được rấtkhác nhau, tốt nhất là NPYR (90%) nhưng chỉ thu được 27% đối với NDEA [29],[30]

Kỹ thuật chiết lỏng lỏng này tuy có nhiều ưu điểm so với chiết lỏng lỏngtruyền thống, nhưng vẫn sử dụng lượng lớn dung môi và không đạt hiệu quả cho tất

cả các nitrosamin

1.2.1.3 Vi chiết pha rắn (SPME)

Kỹ thuật SPME cũng được một số tác giả nghiên cứu để xác định nitrosamintrên nền mẫu thực phẩm như bia, xúc xích [9], [23] Một loại pha tĩnh được phủ lên

bề mặt của sợi hấp phụ, sau đó được nhúng trực tiếp vào mẫu để hấp phụnitrosamin Tiếp theo, các nitrosamin được giải hấp và phân tích bằng sắc ký khí.Nhiều loại chất hấp phụ khác nhau đã được nghiên cứu như polydimethylsiloxane–divinylbenzene (PDMS–DVB), và divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane(DVB/CAR/PDMS) Perez và cộng sự đã sử dụng SPME với GC-MS để xác địnhNDMA trong bia[9] Andrale và cộng sự đã ứng dụng SMPE để chiết NDMA,NDEA, NPIP và NPYR từ xúc xích[23]

Kỹ thuật SPME đòi hỏi cần tối ưu tất cả các điều kiện để đảm bảo độ lặp lạicần thiết, bao gồm điều kiện về thời gian hấp phụ, giải hấp, nhiệt độ và loại muốitạo cân bằng giữa các pha Thực tế, hiệu quả ứng dụng của kỹ thuật này để xác địnhnitrosamin không đáp ứng được yêu cầu phân tích hiện đại ngày nay

1.2.1.4 Chiết pha rắn

Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật được ứng dụng rất phổ biến ngày nay trongphân tích hàm lượng vết do khả năng làm giàu và làm sạch mẫu rất tốt Kỹ thuật

7

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

này có thể phối hợp với các kỹ thuật chiết khác như chiết lỏng hoặc chưng cất trongquá trình chuẩn bị mẫu để xác định nitrosamin

Nhiều loại pha rắn đã được sử dụng để chiết và làm sạch mẫu khi xác địnhnitrosamin Yurchenko và cộng sự nghiên cứu nhiều loại cột khác nhau như florisil,cyano, silicagel, aminopropyl, alumina cho thấy florisil cho hiệu quả tốt nhất khiphối hợp với chiết lỏng lỏng bằng cột extrelut Phương pháp này sau đó được nhiềutác giả sử dụng trên các nền mẫu khác nhau như thịt cừu, rau, xúc xích và các sảnphẩm thịt khác [8], [9], [26],[29], [30]

1.2.1.5 Kỹ thuật QuEChERS

Năm 2015, Lehotay và cộng sự sử dụng kỹ thuật QuEChERS để xác định cácnitrosamin trong thịt hun khói Các tác giả sử dụng acetonitril để chiết nitrosamin từnền mẫu thịt có bổ sung nước Lớp acetonitril được tách khỏi nước bằng phân bốlỏng lỏng nhờ sự có mặt của MgSO4 và HCO2NH4 Dịch chiết acetonitril sau đóđược làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với hỗn hợp chất hấp phụ gồmMgSO4, PSA, C18 và bột Z-Sep [25]

Kỹ thuật chiết QuEChERS ngày càng được nhiều tác giả nghiên cứu để xácđịnh nitrosamin trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau [32], [33], [34] Một sốnghiên cứu chính được tóm tắt ở bảng 1.4

Bảng 1.4 So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS

Ứng dụng của QuEChERS để xác định nitrosamin hiện nay mới chỉ bắt đầuđược nghiên cứu nhưng đã thu được nhiều hiệu quả tốt Việc kết hợp giữaQuEChERS với các phương pháp khối phổ hiện đại là xu hướng tương lai của việcxác định nitrosamin trong nền mẫu thực phẩm.

Một số tác giả sử dụng kỹ thuật chiết siêu tới hạn với ưu điểm là không sửdụng dung môi độc hại [13], [31] Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi hệ thống chiếtvới chi phí cao và không phù hợp cho tất cả các loại nitrosamin do tính chất phâncực khá khác nhau

1.2.2 Phương pháp phân tích

Sau khi đã chiết nitrosamin ra khỏi nền mẫu, cần phải sử dụng các phươngpháp phân tích phù hợp để có thể xác định và định lượng được chính xác hàm lượngcủa chúng Với tính chất dễ bay hơi, sắc ký khí là kỹ thuật được sử dụng phổ biến

để xác định các nitrosamin Ngoài ra, sắc ký lỏng kết nối với khối phổ hai lần cũngđược sử dụng do ưu điểm về độ nhạy và tính chọn lọc

1.2.2.1 Sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng với các detector thông thường ít được sử dụng để xác địnhnitrosamin do khó đáp ứng được yêu cầu về độ nhạy Theo một nghiên cứu củaCardenes và cộng sự, nitrosamin được dẫn xuất dansyl hóa và xác định bằng sắc kýlỏng với detector huỳnh quang Phương pháp đã được ứng dụng để xác địnhnitrosamin trong bia và khói thuốc lá, nhưng chỉ có thể xác định ở nồng độ khoảng

từ 2,5 µg/kg trở lên

Một số nghiên cứu gần đây sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để xácđịnh nitrosamin trong nước, bia, và sản phẩm thịt [16], [24], [27] Bản thân cácnitrosamin không đáp ứng tốt với nguồn ESI cũng là yếu tố tạo nên sự khó khăn khi

9

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

ứng dụng LC-MS hoặc LC-MS/MS Các nghiên cứu đều sử dụng nguồn APCI đểion hóa Aerola xác định 4 nitrosamin trong xúc xích sử dụng kỹ thuật LC-APCI-

MS để tạo các ion có số khối [M+H]+ với LOD khá thấp dao động từ 0,2 đến 1,0µg/kg tùy từng nitrosamin [24] Herrmann cũng sử dụng LC-APCI-MS/MS để xácđịnh đồng thời 14 nitrosamin trong sản phẩm thịt thu được kết quả khá tốt với LOD

từ 0,2 đến 1,0 µg/kg Các kết quả cũng cho thấy LOD có sự khác biệt trên nhiều đốitượng mẫu khác nhau, cho thấy ảnh hưởng của nền mẫu tới tín hiệu phân tích rấtđáng kể

Mặc dù, phương pháp LC-MS/MS cũng thu được một số kết quả khá khảquan trong việc xác định nitrosamin nhưng việc sử dụng nguồn APCI tạo nên sựkhông thuận lợi cho các phòng thí nghiệm khi áp dụng trong thực tế do đòi hỏi vềthiết bị cũng như kinh nghiệm sử dụng loại nguồn này Ảnh hưởng nền khá lớncũng là một yếu tố cần cân nhắc khi sử dụng phương pháp LC-MS/MS

1.2.2.2 Sắc ký khí

Do các nitrosamin có thành phần N nên có thể sử dụng GC-NPD để xác địnhcác nitrosamin Grebel đã thực hiện so sánh việc sử dụng GC-NPD với GC-MS đểxác định nitrosamin cho thấy không có sự khác biệt quá lớn về độ chính xác của kếtquả Giới hạn phát hiện của NDMA có thể đạt đến 4 µg/L (trên dịch bơm mẫu).Phương pháp này cho thấy có thể được áp dụng, tuy nhiên cần bước làm giàu mẫu

để đạt được độ nhạy yêu cầu [12]

GC-TEA là kỹ thuật rất được ưa thích trước đây để xác định nitrosamin do

có độ nhạy và độ chọn lọc rất tốt Thiết bị TEA gồm một lò đốt hoạt động ở nhiệt độthích hợp để giải phóng gốc –NO trong khi vẫn duy trì cấu tạo còn lại của cácnitrosamin Gốc –NO được chuyển đến bộ phản ứng, tại đây được xử lý với O3 vàtạo thành NO2 NO2 khi qua detector quang hóa sẽ phát năng lượng dưới dạng ánhsáng ở bước sóng đặc trưng Ánh sáng này được đo, khuếch đại để phát hiện và địnhlượng nitrosamin Phương pháp này được chấp nhận bởi AOAC [3] và USDA trongnghiên cứu đánh giá nguy cơ với nitrosamin [25] Một số tác giả cũng sử dụng GC-TEA để xác định nitrosamin trong thực phẩm như nghiên cứu của Andrade kết hợpSPME và GC-TEA thu được LOD là 3 µg/kg [23] TCVN 10069:2013 và TCVN

11602:2016 cũng sử dụng GC-TEA để xác định nitrosamin trong cao su [1] và thịt[2] Ngày nay, phương pháp này ít được sử dụng do những ưu điểm của phương pháp GC-MS/MS.

GC-MS và GC-MS/MS là nhóm các phương pháp được sử dụng phổ biến đểxác định nitrosamin trong thực phẩm Chất đầu tiên và quan trọng nhất trong nhómnitrosamin là NDMA có khối lượng phân tử rất thấp (M=74) và các ion sản phẩm(m/z 42 và m/z 44) thường được tạo ra bởi nhiều chất khác Kỹ thuật CI đã đượcEPA chấp nhận để xác định nitrosamin trong nước uống [10] Kỹ thuật EI đã khôngđược EPA chấp nhận do độ nhạy không đáp ứng để xác định nitrosamin trong nước.Ngoài yêu cầu về nguồn ion, EPA còn yêu cầu sử dụng bộ bơm mẫu thể tích lớn ví

dụ như PTV để tăng giới hạn phát hiện của phương pháp [10]

Rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng CI để xác định nitrosamin trong nhiều đốitượng thực phẩm khác nhau Gần đây, nhiều nghiên cứu cố gắng cải thiện hiệu quảcủa nguồn EI trong việc xác định nitrosamin và cũng đã thu được một số kết quả tốt.Một số nghiên cứu sử dụng GC-MS(/MS) để xác nitrosamin trong thực phẩm đượctóm tắt ở bảng 1.5 Giới hạn phát hiện của NDMA là tiêu chí quan trọng để đánh giáphương pháp do đây là chất quan trọng nhất trong nhóm nitrosamin và là

chất kém nhạy nhất

Bảng 1.5 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS

Tác giả,

Nền mẫu Kỹ thuật bơm Cột sắc Nguồn ion LOD NDMA

11

Tác giả,

Nền mẫu Kỹ thuật bơm Cột sắc Nguồn ion LOD NDMA

Kết luận: Các số liệu nêu trên cho thấy, việc sử dụng nguồn EI với phương

pháp GC-MS/MS, kết hợp kỹ thuật QuEChERS hoàn toàn có thể thu được hiệu quảtốt nếu chọn được điều kiện thích hợp Sỡ dĩ nguồn EI được ưu tiên hơn vì sự phổbiến của nó so với nguồn CI

12

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

2 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu này là 3 nitrosamin (thường phát hiện trong mẫuthực phẩm) được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các nitrosamin được sử dụng trong nghiên cứu

phân tử phân tử

3 N-nitroso diphenyl amine NDPhA C12H10N2O 198

Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

và ứng dụng phương pháp bao gồm một số nền mẫu thịt nướng gồm có thịt lợnnướng, thịt bò nướng và thịt gia cầm nướng

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt nướng

2.2.1.1 Khảo sát các điều kiện xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện sắc ký khí: tìm các điều kiện tách sắc ký bao gồm cột sắc

ký, điều kiện nhiệt độ

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS và MS/MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp để định tính và định lượng

2.2.1.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

Trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trước đây và thực hiện các khảo sát thực tế sử dụng phương pháp QuEChERS:

- Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu gồm: o Khảo sát muối chiết

13

o Khảo sát cách thức và thời gian chiết

- Khảo sát ảnh hưởng nền khi áp dụng cho các nền mẫu thịt nướng

2.2.2 Thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt nướng

Đánh giá các thông số cơ bản của phương pháp gồm có:

▪ Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá hàm lượng nitrosamin theo

một số kiểu chế biến thịt khác nhau

2.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.3.1 Thiết bị

• Hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần gồm máy GC 7890 và MS 7000B của

Agilent

• Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

• Máy rung siêu âm S100H, Elma

• Máy lắc ngang HS260, IKA

• Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg) XS105, Metter Toledo

2.3.2 Dụng cụ

• Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20-200 µL, 100-1000 µL và

1000-5000 µL

14

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

• Nội chuẩn NDMA-d6 (Dr Ehrenstorfer) (Lot: D-2937)

• Acetonitril (ACN) (Merck)

• Primary secondary amin (PSA) (Agilent)

• NaCl (tinh khiết phân tích)

• (NH4)2CO3 (tinh khiết phân tích)

• NH4Cl (tinh khiết phân tích)

2.3.4 Pha dung dịch chuẩn

2.3.4.1 Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL và 1 µg/mL

Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc 2000 µg/mL vào bìnhđịnh mức 20 mL, định mức bằng ACN, thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 10µg/mL Bảo quản ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 6 tháng

Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL vàovial, thêm 900 µL ACN, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 µg/mL Phamới khi sử dụng

2.3.4.2 Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL

Cân chính xác 10 mg nội chuẩn NDMA-d6 vào bình định mức 10 mL, địnhmức tới vạch bằng ACN, thu được dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL Bảo quản

ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 3 năm

2.3.4.3 Dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL và 1 µg/mL

Dùng pipet hút chính xác 100 µL nội chuẩn gốc 1000 µg/mL vào bình địnhmức 10 mL, định mức bằng ACN, thu được dung dịch nội chuẩn gốc 10 µg/mL.Bảo quản ở nhiệt độ -18oC, sử dụng trong 12 tháng

Dùng pipet hút chính xác 100 µL dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL vào vial,thêm 900 µL ACN, lắc đều, thu được dung dịch nội chuẩn 1 µg/mL Bảo quản ởnhiệt độ -18oC, sử dụng trong 6 tháng

2.3.4.4 Dung dịch chuẩn làm việc

Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 – 100 ng/mL, với nồng

độ nội chuẩn là 50 ng/mL vào lọ mẫu để tiến hành dựng đường chuẩn Thể tích cácdung dịch cần sử dụng để pha dãy chuẩn được thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc

Nồng độ V dd chuẩn hỗn hợp V dd nội chuẩn 1 V ACN V DCM

vi sóng; để nguội và xay nghiền nhỏ, bảo quản ở -3oC, sử dụng trong 3 tháng

Phân tích lặp lại 10 lần, xác định mẫu trắng không cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích

16

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

• Cân chính xác khoảng 5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL

• Thêm 50 µL dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL và để yên trong khoảng 15 phút

• Thêm vào mẫu 10 mL acetonitril : nước (1:1), lắc trong 1 phút

• Thêm 5,5 g NH4Cl, lắc đều trong 1 phút, lắc ngang hoặc siêu âm trong 30 phút

17

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP)yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 củaChâu Âu.

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tíchmẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích.Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.4.3.3 Khoảng làm việc và đường chuẩn

Để xác định khoảng làm việc chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn cónồng độ thay đổi từ 0,5 đến 100 ng/mL (tương đương 0,5 đến 100 µg/kg trên nềnmẫu) và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong phụthuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khikhông còn làm việc

Sau khi xác định được khoảng làm việc của các chất, chúng tôi đã xây dựngđường chuẩn trên nền mẫu thực (pha trên nền mẫu trắng), nhằm mục đích loại trừảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệtín hiệu chất ngoại chuẩn nồng độ ngoại chuẩn (trục hoành x)

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôitiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khácnhau là 0,5; 10 và 100 µg/kg (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%).:

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

2.4.4 Phương pháp xử lý kết quả

Kết quả phân tích trên thiết bị được xử lý bằng phần mềm Mass Hunter củaAgilent Kết quả thẩm định phương pháp được xử lý bằng phần mềm MicrosoftExcel

2.4.5 Phương pháp lấy mẫu

- Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

- Tổng số mẫu nghiên cứu: 30 mẫu thịt nướng

- Địa điểm lấy mẫu: Các chợ và cửa hàng ở Hà Nội

3 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong thịt nướng

3.1.1 Khảo sát điều kiện GC-MS/MS

3.1.1.1 Điều kiện MS/MS

Nguồn ion hóa EI được lựa chọn sử dụng trọng nghiên cứu này nhằm tạothuận lợi khi ứng dụng rộng rãi phương pháp Để xác định các ion phân tử và ionsản phẩm của các nitrosamin nghiên cứu, tiến hành bơm dung dịch chuẩnnitrosamin có nồng độ 1 µg/mL vào khối phổ và thực hiện khảo sát ion mẹ, ion contrên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu trước đây [17],[23] Hai ion con được lựachọn cho mỗi chất, ion có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng, ion cònlại dùng để xác nhận

Các điều kiện nguồn EI và tứ cực

- Năng lượng: 70 eV, chế độ ion dương

- Nhiệt độ nguồn ion: 250oC

- Nhiệt độ tứ cực 1 và 3: 150oC

- Khí va chạm ở tứ cực 2: He

- Năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu theo phần mềm của thiết bị Kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích nitrosamin

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

Nhận xét: Qua khảo sát, điều kiện khối phổ hoàn toàn phù hợp với công

thức phân tử của các nitrosamin với ion mẹ có số khối là [M]+, chỉ có riêng NDPhAion mẹ có số khối [M-NO]+ Các kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứutrước đây theo Lehotay và Campillo [17],[23]

3.1.1.2 Điều kiện GC

Đầu tiên, cột DB5-MS được ưu tiên khảo sát do tính chất phổ biến rộng rãicủa loại pha tĩnh 5% phenyl methylpolysiloxan và đã có một số nghiên cứu trướcđây sử dụng loại cột có bản chất pha tĩnh này Tuy nhiên, kết quả khảo sát cho thấypic sắc ký của các nitrosamin, đặc biệt là NDMA, rất doãng và kém đặc hiệu Độrộng chân pic > 0,5 phút và tín hiệu thu được không đáp ứng được yêu cầu Sắc ký

đồ của NDMA và NDMA-d6 được đưa ra ở hình 3.1

NDMA-d6 cột DB5-MS

NDMA cột DB5-MS

Hình 3.1 Sắc ký đồ khi phân tích nitrosamin với cột DB5-MS và

Nhận xét: Các nitrosamin là các hợp chất kém phân cực nên có thể tương tác

mạnh với pha tĩnh ít phân cực của cột DB5-MS Để tăng hiệu quả tách, chúng tôikhảo sát với cột DB1701 với bản chất pha tĩnh là (14%-Cyanopropyl-phenyl)-methylpolysiloxan, đây là loại cột có tính phân cực trung bình Sắc ký đồ NDMA,NDMA-d6 (hình 3.1) cho thấy pic sắc ký thu được rất nhọn với độ rộng chân pic chỉkhoảng 0,05 phút Do đó, cột DB-1701 đã được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếptheo

Nitrosamin có khối lượng phân tử nhỏ, dễ bay hơi nên thời gian lưu ngắn, vìvậy chương trình nhiệt độ cho cột phân tích ban đầu cần thấp và tăng lên từ từ đểđảm bảo cột phân tích có thể lưu giữ và tách được các nitrosamin Qua khảo sát đãđưa ra được chương trình nhiệt độ để tách các nitrosamin như bảng 3.2 Sắc ký đồtổng của các nitrosamin nghiên cứu được giới thiệu ở hình 3.2

Bảng 3.2 Chương trình nhiệt độ xác định nitrosamin

Tốc độ Nhiệt độ Thời gian giữ Tổng thời gian

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

Một yếu tố khác có ảnh hưởng đến hình dạng pic sắc ký là hệ dung môi pha

chuẩn Theo kết quả phân tích, khi sử dụng dung dịch chuẩn được pha trong ACN,

nhận thấy pic của các nitrosamin bị tách ở phần đầu píc (hình 3.3B) Qua các tài liệu

tham khảo [23], khi pha chuẩn trong ACN:DCM (1:1), pic của các nitrosamin nhọn,

sắc nét, không bị chẻ pic (hình 3.3A) Vì vậy chúng tôi lựa chọn ACN:DCM

(1:1/v:v) là dung môi pha chuẩn Mẫu được xử lý theo phương pháp QuEChERS

với dung môi ACN sẽ được bổ sung lượng DCM để tạo tỷ lệ ACN:DCM (1:1) trước

khi phân tích bằng GC-MS/MS

(A: Dung môi pha chuẩn: ACN:DCN 1:1)

(B: Dung môi pha chuẩn: ACN) Hình 3.3 Sắc ký đồ các nitrosamintrong dung môi ACN và ACN:DCM (1:1/v:v)

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

3.1.2.1 Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu

Với nhiều ưu điểm, phương pháp QuEChERS được lựa chọn để chiết

nitrosamin [23] Quy trình xử lý mẫu ban đầu được tóm tắt ở hình 3.4

Cân ~ 5 g mẫu/ống ly tâm 50 mL

+50 µL dung dịch IS 10 µg/mL, để 15 phút

Lắc ngang/siêu âm 30 phút, ly tâm 6000 rpm/5 phút

Hút 2 mL/ chiết d-SPE (MgSO 4 + C18/PSA)

+2 ml n-hexanLắc và ly tâm ở 6000 rpm/5 phút

+Bỏ lớp n-hexanHút 0,5 mL lớp ACN

+0,5 mL DCMBơm 1 µL vào GC-MS/MS

Hình 3.4 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu dự kiến

Từ quy trình dự kiến ở trên, chúng tôi thấy cần phải khảo sát muối chiết,phương pháp chiết, thời gian chiết, loại và lượng bột làm sạch trong bước d-SPE đểthu được hiệu suất chiết tối ưu Cố định nồng độ thêm chuẩn là 100 ng/g để thựchiện các bước khảo sát (50 µL dung dịch chuẩn 10 µg/mL)

24

Bùi Cao Tiến – K26 Hóa học – Trường ĐHKHTN

3.1.2.2 Khảo sát muối chiết

Một số muối chiết thông thường sử dụng cho phương pháp QuEChERS được

tiến hành khảo sát: MgSO4 + NaCl, (NH4)2CO3, NH4Cl Cố định các bước chiết

theo quy trình trên, sử dụng mẫu thịt nướng đã được xác định là không có

nitrosamin Sau khi cân mẫu, thêm nội chuẩn và chất chuẩn, để yên 15 phút, thêm

10 mL ACN:H2O (1:1) và tiến hành chiết mẫu với 3 loại hỗn hợp muối chiết khác

nhau (A) 4g MgSO4 + 1,5 g NaCl; (B) 5,5 g (NH4)2CO3; (C) 5,5 g NH4Cl, tiến hành

các bước tiếp theo như quy trình trên Kết quả thu được thể hiện trong hình 3.5

Nhận xét: Sử dụng muối chiết là MgSO4 cho hiệu suất cao với NDMA tuy

nhiên với NDPA và NDPhA lại cho hiệu suất thấp Sử dụng NH4Cl cho hiệu suất

cao nhất đối với NDPA, NDPhA và hiệu suất chấp nhận được với NDMA Do vậy

NH4Cl được sử dụng là muối chiết cho các bước nghiên cứu tiếp theo

x10 4

+ TIC MRM NH4Cl-72889 NDMA

7 + TIC MRM MgSO4l-75914 6.5

6

+ TIC MRM NH4)2CO3-81614

5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5

1.6

Counts vs Acquisition Time (min)

25