Nghiên cứu xây dựng quy trình realtime RT PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊNTRẦN VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME RT-PCR CHẨN ĐOÁN VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM LUẬN VĂN THẠC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN VĂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME RT-PCR CHẨN ĐOÁN VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN VĂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME RT-PCR CHẨN ĐOÁN VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Sáng,

Bộ mộ Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội,

là thầy đồng hướng dẫn, đã luôn luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên tôitrong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Chủ nhiệm đề tài, Ban điều hành, các anh chị đồng nghiệp đã cùng tôi tham giathực hiện đề tài Tay Chân Miệng cấp Thành phố và đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thuthập số liệu nghiên cứu

- Các anh chị em đồng nghiệp tại khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn chân thành đến tập thể Giáo sư,Tiến sĩ trong Hội đồng khoa học chấm luận văn

Tôi vô cùng biết ơn gia đình và những người bạn thân thiết đãđộng viên,chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luậnvăn này

Xin trân trọng cảm ơn!

Trần Văn Thịnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng 3

1.2.Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam 3

1.2.1 Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới 3

1.2.2 Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam 4

1.3 Cấu trúc phân tử và cơ chế gây bệnh Tay Chân Miệng của vi rút EV71 6

1.3.1 Cấu trúc phân tử của vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng 6

1.3.2 Phương thức truyền bệnh của EV71 8

1.4 Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng hiện nay và các ưu, nhược điểm 8

1.5 Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe 9

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.2 Vật liệu nghiên cứu 11

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị 11

2.4 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman probe đểkhuếch đại gen đặc trưng của Vi rút EV71 12

2.4.1.Các nguyên tắc thiết kế mồi 12

2.4.2 Các nguyên tắc thiết kế Probe 12

2.4.3 Các phần mềm sử dụng 13

2.4.4 Phương pháp tiến hành 13

2.5 Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ chủng vi rút EV71 14

2.6.Phản ứng Realtime RT-PCR 15

2.7 Phương pháp điện di 16

2.8 Tối ưu hóa phản ứng Realtime RT-PCR để chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng 16

2.8.1 Phương pháp RT-PCR nhân gen đặc trưng của virus EV71 16

2.8.2 Tối ưu nhiệt độ kéo dài 17

2.8.3 Tối ưu nồng độ Magie 17

2.9 Xác định độ nhạy của phản ứng Realtim RT - PCR 17

2.9.1 Phương pháp đo nồng độ xác định số bản sao plasmid 17

2.9.2 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng RT-PCR 18

2.10.Xác định độ đặc hiệu của phản ứng trên các chủng vi rút khác nhau 19

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Phân tích, so sánh trình tự bằng phần mềm ClustalX 21

3.2 Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò 22

3.3 Kết quả khảo sát hoạt động của hệ mồi trên thực nghiệm 25

3.4 Kết quả tối ưu nhiệt độ của phản ứng RT-PCR 26

3.5 Kết quả tối ưu nồng độ Magie của phản ứng RT-PCR 28

3.6 Kết quả khuếch đại và đường chuẩn của phản ứng RT-PCR 30

3.7 Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng 31

3.8 Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên virut EV71 nuôi cấy 32

3.9 Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtimr RT- PCR trên các chủng vi rút khác nhau 33

KẾT LUẬN 41

KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCRkhuếch đại vùng gen đặc

trƣng của EV71 15

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71 16

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71 18

Bảng 3.1: Mã số truy cập các trình tự gene của EV71 21

Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi và mẫu dò thiết kế 22

Bảng 3.3: Các thông số đặc tính của mồi và mẫu dò 23

Bảng 3.4: Chu kỳ ngƣỡng của RT-PCR ở nồng độ Magie khác nhau 29

Bảng 3.5: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng 31

Bảng 3.6: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên vi rút nuôi cấy 32

Bảng 3.7: Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc bộ gen EV71 7

Hình 3.1: Kết quả sắpdóng cột các trình tự của EV71 22

Hình 3.2: Kết quả BLAST trình tự mồi xuôi trên NCBI 23

Hình 3.3: Kết quả BLAST trình tự mồi ngược trên NCBI 24

Hình 3.4: Kết quả BLAST trình tự mẫu dò trên NCBI 24

Hình 3.5: Kết quả phản ứng Realtime RT-PCR trên 10 chủng vi rút nuôi cấy 25

Hình 3.6: Kết quả điện di sau khi chạy PCR trên 10 chủng vi rút nuôi cấy 26

Hình 3.7: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 52o C 26

Hình 3.8: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 55o C 27

Hình 3.9: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 58o C 27

Hình 3.10: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 60o C 28

Hình 3.11: Đường khuếch đại RT-PCR ở nồng độ Magie khác nhau 29

Hình 3.12: Đồ thị khuếch đại của mẫu plasmid pha loãng 30

Hình 3.13: Đường chuẩn RT-PCR từ plasmid pha loãng 30

Hình 3.14: Điệndi đồ sản phẩm RT-PCR từ plamid tách dòng pha loãng 31

Hình 3.15: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi rút nuôi cấy pha loãng 32

Hình 3.16: Điện đi đồ sản phẩm RT-PCR từ vi rút nuôi cấy pha loãng 33

Hình 3.17: Đồ thị phản ứng RT-PCR xác định tính đặc hiệu 34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

µl

Aci

BLAST

bp

CA

CA16

CB

CMV

Ct

DNA

dNTPs

E coli

Microlit

Acinetobacter baumannii

Basic Local Alignment Search Tool

Base pairs Coxsackievirus A Coxsackievirus A16 Coxsackievirus B Cytomegalovirus Threshold Cycle Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleotide Triphosphate

Escherichia coli

Kilobase pairs

Klebsiella pneumoniae

MillilitMillimolNational Center for Biotechnology InformationPolymerase chain reaction

Ribonucleic AcidReverse Transcription-Polymerase Chain ReactionThành phốHồ Chí Minh

Untranslated RegionsUltra violet

MỞ ĐẦU

Tay Chân Miệnglà bệnh truyền nhiễm lây từ người sang người, dễ gâythành dịch Bệnh do các vi rút đường ruột (enterovirus) gây ra Trong những nămgần đây, bệnh Tay Chân Miệng là một trong những bệnh truyền nhiễm mới nổi vàđược đặc biệt quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới Các vụdịch Tay Chân Miệng thường xảy ra hằng năm trên toàn quốc bao gồm cả hai miềnBắc và Nam từ tháng 3 đến tháng 11 Các biến chứng như: hôn mê, co giật, phùphổi cấp, viêm cơ tim nếu không được điều trị kịp thời sẽ có tỷ lệ tử vong cao Hơnnữa, các biến chứng thần kinh do EV71 gây nên kéo theo di chứng tàn tật suốt đờicho trẻ sẽ là gánh nặng cho bệnh nhân, gia đình và xã hội

Xét nghiệm chẩn đoán xác định vi rút EV71 bằng phương pháp nuôi cấy, phânlập thường đòi hỏi thời gian và kỹ thuật cao Tại Việt Nam chỉ có một vài đơn vị có đủđiều kiện thực hiện được kỹ thuật này Vì vậy, rất khó thực hiện rộng rãi tại các cơ sở y

tế và bệnh viện, gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị kịp thời

Hiện nay, khi các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời, mở ra một kỷ nguyên mớicho việc chẩn đoán các căn nguyên gây bệnh nói chung và bệnh Tay Chân Miệngnói riêng Công nghệ chẩn đoán dựa trên kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng côngnghệ Taqman probe chẩn đoán đặc hiệu EV71 không những cho kết quả nhanh,chính xác mà nó còn có thể xác định được từ bệnh phẩm là vết loét trên bệnhnhân[50] Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn rất nhiều so với kỹ thuậtPCR thông thường Ngoài ra kỹ thuật Realtime RT-PCR cho phép chúng ta chẩnđoán các ca bệnh ở giai đoạn sớm và rút ngắn rất nhiều thời gian xét nghiệm so vớiphương pháp PCR thông thường và các phương pháp xét nghiệm miễn dịch khángnguyên - kháng thể Với những đặc điểm nổi trội như vậy, kỹ thuật này nên được

áp dụng ở các bệnh viện đặc biệt là ở các bệnh viện có khoa truyền nhiễm, viện vệsinh phòng dịch, giúp chẩn đoán sớm và định hướng cho điều trị bệnh nhân, tránhđược những biến chứng đáng tiếc xảy ra do chậm trễ trong quá trình chẩn đoán vàđiều trị Ngoài ra việc chẩn đoán bệnh sớm giúp cho các cơ sở y tế có các biện phápphòng bệnh hiệu quả, giám sát chặt chẽ tình hình dịch bệnh xảy ra Việc phòngchống bệnh Tay Chân Miệng đã được Bộ Y tế chính thức đưa vào nhóm các bệnhtruyền nhiễm bắt buộc phải khai báo Và trong những năm gần đây, số ca mắc, chết

do bệnh Tay Chân Miệng tăng lên nhanh chóng

Hiện nay ở Việt Nam, việc chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệngđều sử dụng các bộ kit thương mại thường được nhập khẩu từ nước ngoài, có giáthành cao và nhiều khi chẩn đoán không chính xác các chủng vi rút đang lưu hành ởViệt Nam Ở trong nước chưa có đơn vị nào xây dựng và phát triển quy trìnhkỹthuật One-Step Realtime RT - PCR chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng Đây là mộthạn chế trong việc chủ động và nhanh chóng phòng chống dịch bệnh trong nước,tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân Các bộ kit thương mại sử dụng test nhanh cho tỉ lệdương tính giả hoặc âm tính giả cao và chỉ xét nghiệm được ở bệnh phẩm là máu.

Kỹ thuật chẩn đoán bằng nuôi cấy và phân lập chỉ được thực hiện ở một vài cơ sở

có phòng xét nghiệm an toàn cấp 3 Do vậy việc nghiên cứu xây dựng quy trìnhRealtime RT-PCR là một bước tiến trong công nghệ chẩn đoán giúp chẩn đoánnhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân Đềtài nghiên cứu sẽ tập trung vào mục tiêu:Nghiên cứu xây dựng quy trình RealtimeRT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em, có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao

Để đạt được các mục tiêu trên, góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị vàphòng bệnh kịp thời dịch bệnh Tay Chân Miệng do EV71 gây nên, chúng tôi tiếnhành đề tài với các mục tiêu nghiên cứu sau:

- Nghiên cứu thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman Probe để khuếch đại gen đặc trưng của vi rút EV71 bằng kỹ thuật Realtime RT - PCR

-Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng Realtime RT - PCR

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm về bệnh Tay Chân Miệng

Bệnh Tay Chân Miệng là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút gây nên, haygặp ở trẻ em Bệnh lây truyền qua đường tiêu hóa, có thể lây do tiếp xúc trực tiếpvới niêm mạc, nước bọt và phân của người bệnh Đặc điểm thường thấy của bệnhbao gồm sốt, phát ban dạng phỏng nước ở tay, chân và trong niêm mạc miệng Bệnh

có thể tự hồi phục, tuy nhiên trong các vụ dịch có một tỷ lệ người bệnh có bệnhcảnh lâm sàng nặng, với các biến chứng về thần kinh, tim mạch và dẫn đến tử vongnhanh sau vài giờ cho đến vài ngày

Bệnh Tay Chân Miệng do một nhóm vi rút thuộc chi Enterovirus gây nên.Enteroviruslà thành viên của họ Picornaviridae Chi Enterovirus bao gồm

Enterovirus 68 đến 71, Coxsackie A vi rút (CA), Coxsackie B vi rút (CB), polio virút và echo vi rút Tác nhân thường gặp nhất là Coxsackie A16 (CA16) vàEnterovirus 71 (EV71), chúng là tác nhân gây nên các đại dịch Tay Chân Miệng lớn

ở các nước trên thế giới

1.2.Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình bệnh Tay Chân Miệng trên Thế giới

Trong những năm gần đây, các vụ dịch Tay Chân Miệng do EV71 đã được ghinhận ở Trung Quốc, Hồng Kông, Macao, Đài Loan, Mông Cổ, Việt Nam, Malaysia vàSingapore Tại Singapore, tỷ lệ mắc Tay Chân Miệng tăng dần theo từng năm Năm

2000 có 3.790 trường hợp mắc và đã tăng lên đến 16.228 trường hợp vào năm 2002[40] Theo các báo cáo, chỉ trong vòng 8 tháng năm 2008, Singapore có 29.686 cabệnh, trong đó có 4 trường hợp viêm não và 1 trường hợp tử vong [47] Tại Đài Loan,trong vụ dịch năm 1998, có 129.106 trường hợp mắc với

405 ca nặng và 78 ca tử vong [7],[11],[28] Năm 2006-2007, tại Đài Loan cũng xảy

ra một vụ dịch với tỷ lệ tử vong cao [21]

Tại Malaysia, trường hợp Tay Chân Miệng phát hiện đầu tiên vào năm 1997,tại Sarawak Các vụ dịch do EV71 cũng xảy ra vào năm 1997, 2000, 2003 và 2006.Năm 2006 có 14.875 ca mắc với 13 ca tử vong [39] Từ năm 2011-2012, gần 2.000bệnh nhân chủ yếu từ 1-3 tuổi bị bệnh tay chân nhập viện ở Trung Quốc [29]

Các số liệu nghiên cứu cho thấy trẻ em dưới 5 tuổi có nguy cơ nhiễm bệnhcao nhất Trẻ trai thường có tỷ lệ mắc cao hơn trẻ gái Một nghiên cứu ở Singaporecho thấy có 1/124 (0,8%) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng EV71 ở trẻ từ 1-23tháng và tỷ lệ huyết thanh dương tính tăng lên 12%/năm ở trẻ từ 2-5 tuổi, điều nàygợi ý rằng hầu hết các trường hợp bị nhiễm đều xảy ra ở trẻ trong độ tuổi trước khi

đi học[25] Một số nghiên cứu đã tìm hiểu về các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm

và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến mức độ nặng của bệnh Nghiên cứu tạiSingapore trong vụ dịch năm 2000 cho thấy các dấu hiệu: nôn, bạch cầu tăng và một

số biểu hiện không điển hình khác như phát ban trên da nhưng không loét miệng,sốt, tiêu chảy có liên quan với tình trạng nặng [30],[36],[37] Một nghiên cứu ở ĐàiLoan cho thấy có sự khác biệt lâm sàng giữa EV71 với CA16 [12]

Kể từ lần đầu tiên được phân lập tại Mỹ năm 1969, EV71 đã được xác định

là một căn nguyên phổ biến của bệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em và trẻ nhỏ Các vụdịch lớn liên quan đến EV71 đã được công bố ở Mỹ, châu Âu, Úc, châu Á đã chothấy vai trò quan trọng của vi rút này đối với vấn đề sức khỏe toàn cầu [6],[50].Mặc

dù nhiễm trùng do EV71 hầu hết biểu hiện ở dạng nhẹ, tự khỏi với biểu hiện là sốt,tổn thương dạng nốt phỏng ở tay, chân, niêm mạc họng miệng Một tỷ lệ nhất địnhcác trường hợp cấp tính có liên quan đến các tổn thương hệ thần kinh, thậm chí gây

tử vong như viêm não, viêm màng não vô khuẩn, hội chứng liệt giống bại liệt [9],[10], [13], [17], [24], [40], [52] Những tổn thương nặng như vậy đã được báo cáolần đầu tiên tại Bulgari vào năm 1975 và Hungary năm 1978 [32] Tuy nhiên, các vụdịch lớn với tỷ lệ tử vong cao xuất hiện vào những năm 1990 như ở Malaysia năm

1997 [3],[11],[18],[30].Vụ dịch tại Đài Loan năm 1998 được coi là vụ dịch lớn vớihơn 100.000 người mắc, hơn 400 trẻ phải nhập viện với các biến chứng ở hệ thầnkinh trung ương, 78 trẻ tử vong [7], [17]

Như vậy, với tất cả các vụ dịch xảy ra ở vùng châu Á - Thái Bình Dươngtrong 10 năm qua do các dưới nhóm EV71 gây ra làm tăng sự lo ngại về nguồn gốc,đặc điểm di truyền và dịch tễ học của vi rút này

1.2.2 Tình hình bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam

Bệnh Tay Chân Miệng được ghi nhận lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm

2003 [4] Năm 2008, Bộ Y tế chính thức đưa bệnh Tay Chân Miệng vào nhóm các

bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo và số ca mắc, chết do bệnh Tay ChânMiệng tăng lên nhanh chóng.

Theo số liệu của Bộ Y tế, năm 2006 có 2.284 trường hợp, năm 2007 có2.988 trường hợp, và chỉ trong 4 tháng đầu năm 2008 đã có gần 3.000 trường hợpmắc bệnh Ở Việt Nam, bệnh Tay Chân Miệng xảy ra rải rác quanh năm nhưng caođiểm nhất là vào mùa hè và mùa thu [1] Bệnh thường xảy ra ở trẻ dưới 6 tuổi [25],

tỷ lệ nam nhiều hơn nữ 1,5 lần, biểu hiện lâm sàng nhẹ, có thể tự khỏi và còn ítđược quan tâm

Tại Bệnh Viện Bệnh nhiệt đới TPHCM, năm 2008 có 328 ca, năm 2009 có

255 ca nhập viện điều trị Tỷ lệ các biến chứng chiếm 15-40% số trường hợp, bao gồm viêm não - màng não, phù phổi cấp, sốc, liệt mềm,…

Một nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi đồng 1 vào năm 2005 [43] cho thấy: trong

số 764 trẻ nhập viện với chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng có 53.8% (411 trẻ) phânlập được vi rút đường ruột từ các bệnh phẩm dịch nốt phỏng, dịch họng và phân,trong đó có 173 (42.1%) là EV71 và 214 (52.1%) là CA16 Trong số trẻ nhiễmEV71 có 51 (29.5%) trẻ có biến chứng thần kinh và 3 (1.7%) trẻ tử vong Phân tích

23 trường hợp nhiễm EV71 của năm 2005, cho thấy trong nửa đầu năm là do 3dưới nhóm gen C1, C4 và C5 và nửa thời gian sau của năm là do dưới nhóm genC5 của EV71

Một nghiên cứu khác tại Bệnh viện Nhi đồng 1 từ 3/2007-3/2008, sàng lọc

449ca mắc Tay Chân Miệng có 419 (93,3%) có kết quả RT-PCR dương tính Trong

số đó có 180 (43%) có biến chứng, bao gồm viêm não, phù phổi và viêm cơ tim và

có 6 ca tử vong (1.4%)

Nghiên cứu của Ngô Văn Huy về đặc điểm dịch tễ, lâm sàng, cận lâm sàngviêm não do Enterovirus ở trẻ em trong 2 năm 2006-2008 tại Bệnh viện Nhi Trungương (dựa vào xét nghiệm PCR trong dịch não tủy) có nhận xét căn nguyênEnterovirus chiếm 8%

Theo số liệu của Cục Y tế Dự phòng – Bộ Y Tế, trong 9 tháng đầu năm

2011, cả nước đã ghi nhận 61.805 trường hợp mắc bệnh tay - chân - miệng tại 61địa phương, trong đó đã có 114 trường hợp tử vong tại 24 tỉnh, thành phố

Do tầm quan trọng của dịch Tay Chân Miệng, nhiều đơn vị nghiên cứu trong

cả nước trong đó có Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương đã triển khai nghiêncứu về vi rút này Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương phối hợp với nhiều bệnhviện trên toàn quốc thực hiện đề tài nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng,phương pháp chẩn đoán, điều trị, dự phòng bệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam.Các chủng vi rút gây bệnh Tay Chân Miệng trên cả nước đã được phân lập và nuôicấy, chuẩn bị cho việc sản xuất vaccine Đặc điểm dịch tễ học phân tử, lâm sàng củabệnh Tay Chân Miệng ở Việt Nam đã được xác định Bên cạnh đó phương phápchẩn đoán sớm, quy trình điều trị có hiệu quả, phương pháp dự phòng bệnh TayChân Miệng đang được xây dựng Đây là những thông tin quan trọng và là cơ sởkhoa học cho tính khả thi của đề tài này

1.3 Cấu trúc phân tử và cơ chế gây bệnh Tay Chân Miệng của vi rút EV71

1.3.1 Cấu trúc phân tử của vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng

EV-71 là thành viên chi Enterovirus thuộc họ Picornaviridae Cùng với các

coxackie vi rút nhóm A, EV71 là một loại vi rút đường ruột được xếp vào mức loài

A.Vi rút hình cầu 20 mặt, kích thước nhỏ, không có vỏ bao, bên trong chứa RNA,

là thành phần di truyền, nhân lên và gây nhiễm của vi rút RNA là một sợi dương cókhoảng 7.400 base

Vi rút có lớp capsid hình cầu đối xứng, được tạo bởi 60 đơn vị giống nhau,mỗi một đơn vị gồm 4 protein cấu trúc (từ VP1-VP4) Trình tự nucleotide hoànchỉnh của chủng EV71 đã được xác định Khung đọc mở mã hóa một polyproteingồm 2.194 acid amin và được hỗ trợ bởi vùng không dịch mã (UTRs) tại đầu 5’ và3’, và có một nhánh poly-A nằm ở điểm cuối của vùng 3’ Mỗi Polyprotein đượcchia thành 3 phần nhỏ hơn là P1, P2 và P3 P1 mã hóa cho 4 protein cấu trúc 1A-1D(VP1-VP4); P2 và P3 mã hóa cho 7 protein không cấu trúc 2A-C và 3A-D 11protein của EV71 dễ phân biệt với vi rút polio và các vi rút đường ruột khác (Sơ đồcấu trúc bộ gen của EV71 ở Hình 1)

Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc bộ gen EV71[41]

EV71 được chia thành 3 nhóm di truyền (genogroup) ký hiệu là A, B và C.Ngoài ra, trong nhóm B và C có một số dưới nhóm khác Khi nghiên cứu 628 trình

tự gen VP1 của các chủng EV71 trong giai đoạn 1970-2008, nhóm B và C có một

số dưới nhóm khác là B1 đến B5 và C1 đến C5 [10],[11],[14],[38],[46] Nhìn chungdưới nhóm gen C thường xuất hiện ở Trung Quốc và Việt Nam, dưới nhóm gen Bphổ biến ở Malaysia và Singapore, trong khi cả hai dưới nhóm gen B và C là nhữngtác nhân gây dịch ở Đài Loan [10],[21],[30]

Protein VP1 bộc lộ ra phía ngoài và là đích tác động của các kháng thể trunghòa khiến cho gen VP1 chịu áp lực chọn lọc của hệ miễn dịch Sự chọn lọc này làmcho vi rút có những sự thay đổi ở vùng capsid dẫn đến sự ấn định trình tự acid amintrong những quần thể vi rút Vì gen VP1 của Enterovirus được cho là đóng vai tròquan trọng trong cơ chế bệnh sinh và độc lực của vi rút [8],[35],[55], sự hiểu biết vềnhịp độ cũng như cách thức tiến hóa của protein capsid có thể cung cấp những hiểubiết mới về biến đổi dịch tễ học của EV71 [38],[45] Điều này nhằm dự đoán cácthay đổi về di truyền cũng như qui luật của các vụ dịch do EV71 gây ra trong tươnglai Nghiên cứu của Tee và cộng sự năm 2010 đã làm sáng tỏ một số vấn đề liênquan đến động học tiến hóa và lịch sử di truyền của các chủng EV71 Qua nghiêncứu này, các nhà khoa học có thể ước đoán thời điểm xuất hiện các dưới nhóm củaEV71 được xác định trong những vụ dịch Tay Chân Miệng gần đây

1.3.2 Phương thức truyền bệnh của EV71

Trong các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ phân lập được EV71 trong dịch hầuhọng thường cao hơn so với dịch ngoáy trực tràng hoặc bệnh phẩm phân ở các bệnhnhân nhiễm EV71 thể nặng, ngoài ra, người ta còn có thể phân lập được EV71 ởtrong phân của các bệnh nhân sau đó 5 tuần [11] Điều này cho thấy, cả hai conđường truyền bệnh miệng – miệng và miệng – phân đều là những phương thứctruyền bệnh tiềm tàng, một quá trình ủ bệnh lâu dài cũng có thể tạo ra một đợttruyền bệnh Tay Chân Miệng trên quy mô lớn, mà chủ yếu là các trường hợp nhiễmpolio và coxsackie vi rút [12],[13],[14] Các tài liệu ghi nhận rằng, việc truyền bệnh

ởmôi trường gia đình đóng vai trò vô cùng quan trọng trong công việc phát tán củaEV71 ra cộng đồng, và tỷ lệ truyền bệnh ở môi trường gia đình của EV71 rất caođối với trẻ em, nhưng thấp hơn đối với người lớn [17],[18] Vì vậy, việc khôngkiểm soát được các nguồn gây bệnh từ khu vực gia đình, đi cùng với nồng độ vi rútcao và thời gian ủ bệnh dài cũng có thể là nguyên nhân gây ra tỷ lệ truyền bệnh caocho trẻ em

1.4 Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng hiện nay và các ưu, nhược điểm

- Các xét nghiệm nuôi cấy, phân lập vi rút thường đòi hỏi thời gian và kỹthuật cao Để thực hiện được kỹ thuật này yêu cầu các cán bộ phải được đào tạonâng cao và có kiến thức chuyên sâu Ngoài ra, kỹ thuật này phải được thực hiện ởcác phòng xét nghiệm an toàn cấp 3 trở lên với các điều kiện thực hiện nghiêm ngặt

- Kỹ thuật phát hiện kháng thể IgM kháng EV71 đang tiếp tục được phát triển nhưng có thể cho kết quả dương tính giả

- Kỹ thuật nuôi cấy virút: các mẫu bệnh phẩm dùng để nuôi cấy virút baogồm dịch ngoáy họng, dịch nốt phỏng, phân, dịch não tủy và huyết thanh Các kỹthuật xác định EV71 sau khi nuôi cấy bao gồm:

- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)sử dụng kháng thể đơndòng kháng EV71 cho kết quả chẩn đoán nhanh Đây là một kỹ thuật đơn giảnnhưng giá thành cao

-Kỹ thuật RT-PCR sử dụng các gen đích khác nhau (5’UTR, VP1, VP4)

-Kỹ thuật Realtime RT-PCR: có thể sử dụng được với các loại bệnh phẩmkhác nhau Kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng công nghệ Taqman probe hiện đang

là kỹ thuật chẩn đoán và xác định các căn nguyên gây bệnh tiên tiến nhất trên thếgiới Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao so với các phương pháp khác.Ngoài ra kỹ thuật Realtime RT-PCR cho phép chúng ta chẩn đoán các ca bệnh ở giaiđoạn rất sớm và rút ngắn rất nhiều thời gian xét nghiệm Xét nghiệm sử dụng kỹthuật này không những cho kết quả nhanh, chính xác mà nó còn có thể xác địnhđược từ các loại bệnh phẩm Điều này giúp chúng ta chẩn đoán sớm và định hướngcho điều trị bệnh nhân, tránh được những biến chứng đáng tiếc xảy ra do chậm trễtrong quá trình chẩn đoán và điều trị Ngoài ra việc xác định căn nguyên gây bệnh ởgiai đoạn sớm giúp cho các cơ sở y tế có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả, giámsát chặt chẽ tình hình dịch bệnh xảy ra

1.5 Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe

Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe là kỹ thuật khuếch đại đoạnADN đích sử dụng probe có thể phát huỳnh quang Taqman Probe là những đoạnOligonucleotid có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên AND đích và trình

tự này có chiều dài khoảng từ 24-30 nucleotid với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnhquang gọi là reporter, đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh quang phát ra từ reporter gọi làquencher Ngoài ra kỹ thuật này còn phải sử dụng enzyme Taq polymerase có hoạttính 5’-3’ exonuclease để cắt bỏ probe sau khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn Saumỗi chu kỳ nhiệt nếu chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ sợiAND đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do huỳnh quang phát ra từ đầu 5’

sẽ bị quencher ở đầu 3’ hấp phụ Phản ứng sẽ không phát huỳnh quang khi nhậnnguồn ánh sáng kích thích Khi có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thìTaqman probe bắt cặp đặc hiệu vào sợi khuôn ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp thì sẽ bịenzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để cắt bỏ để kéo dài mồitổng hợp Khi đó reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát huỳnhquang khi nhận được nguồn ánh sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đạixuất hiện thì cường độ phát huỳnh quang càng nhiều và máy sẽ ghi nhận được tínhiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn ánh sáng kíchthích

Tại Thành phố Hồ Chí Minh đã có một công trình nghiên cứu về phát hiệnEnterovirus 71 bằng phương pháp Realtime RT- PCR Tuy nhiên phương pháp này

sử dụng công nghệ two-step real-time PCR Hạn chế của phương pháp này là thờigian thực hiện xét nghiệm lâu hơn, dễ bị nhiễm chéo trong quá trình thực hiện phảnứng do phải thực hiện phản ứng nhiều bước, độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân (dịch ngoáy họng) đã được chẩn đoán dươngtính với vi rút EV71, đã kiểm tra bằng giải trình tự gen

- 10 chủng vi rút được nuôi cấy và phân lập từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trungương trong đề tài cấp Nhà nước nghiên cứu về bệnh Tay Chân Miệng “Nghiên cứuđặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, dịch tễ học, phương pháp chẩn đoán và điều trịbệnh Tay Chân Miệng ở trẻ em tại Việt Nam” của Bộ Khoa học và Công nghệ (2011– 2014)

- Mẫu bệnh phẩm dương tính với Cytomegalovirus (CMV), Hepes simplex

virus (HSV), vi khuẩn Acinetobacter baumannii (Aci), Klebsiella pneumoniae (Kp),

E coli được Khoa Xét nghiệm-Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương cung cấp.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Cặp mồi và probe nhân gen đặc trưng của hãng IDT

- Kit tách chiết RNA của QIAGEN (QIAamp RNA Mini Kit)

- Kit One-step RT-PCR của Invitrogen

- Máy Realtime PCR 7500 Fast

- Máy ly tâm 5424 của Eppendorf

2.4 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu và mẫu dò Taqman probe đểkhuếch đại gen đặc trưng của Vi rút EV71

2.4.1.Các nguyên tắc thiết kế mồi

Việc thiết kế mồi phải tuân thủ theo một số nguyên tắc như sau:

- Phải bắt cặp với trình tự đích 80% trở lên

- 5 nucleotide ở đầu 3’ phải bắt cặp hoàn toàn với trình tự đích

- Thành phần G-C từ 40-60%

- Chiều dài mồi từ 18-25 nucleotide

- Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”

- Tránh cấu trúc kẹp tóc trong thành phần mỗi mồi

- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi dao động trong khoảng 55- 65°C Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá 5°C

- 5 nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ không nên chứa hơn 2 G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản kí sinh trong phản ứng PCR

2.4.2 Các nguyên tắc thiết kế Probe

Việc thiết kế probe phải tuân thủ một số nguyên tắc sau đây:

- Thành phần G-C khoảng 40-60%

- Chiều dài dưới 30 nucleotide

- Tránh nucleotide loại G ở đầu 5’ vì G có thể hấp thụ ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi mẫu đã bị thủy giải bởi Taq polymerase

Nếu phải chọn mẫu dò trong vùng có nhiều GC thì nên chọn mạch bổ sung củamẫu dò có nhiều C hơn G

- Nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò lớn hơn Tm của mồi từ 5 đến 100C nhằmđảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với mạch DNA khuôn trong bước bắt cặp vàkéo dài của chu kỳ PCR

2.4.3 Các phần mềm sử dụng

- ClustalX 2.0.10 (EMBL, Châu Âu)

- Annhyb 4.943 (Olivier Friard, Hoa Kỳ)

- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ)

- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ)

2.4.4 Phương pháp tiến hành

Chúng tôitải các trình tự gen của vùng gen VP1 của Enterovirus 71từ ngânhàng dữ liệu NCBI Tiếp theo, tiến hành sắp dóng cột các trình tự tải về bằng phầnmềm ClustalX Sử dụng chương trình BioEdit để chọn ra các vùng bảo tồn đặc

trưng cho Enterovirus 71 và tiến hành thiết kế mồi và mẫu dò.

Dựa vào kết quả sắp dóng cột trình tự gen VP1 của EV71 và CA16 từchương trình ClustalX, chúng tôi thiết kế mồi ngược, mồi xuôi và mẫu dò Trongquá trình thiết kế có sử dụng các nucleotit thay thế để đảm bảo sự bắt cặp đặc hiệuvới tất cả các chủng Hiệu quả đặc hiệu của các cặp mồi sẽ được đánh giá chính xáchơn trong quá trình thực nghiệm

Sau đó, chúng tôi dùng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer (IDT) để kiểmtra và chỉnh sửa các mồi và mẫu dò cho phù hợp với các tiêu chuẩn (kích thước,

%GC, Tm, các cấu trúc thứ cấp) Hiệu quả của mồi và taqman probe sẽ được đánhgiá thông qua việc xác định giá trị Ct của phản ứng Realtime RT-PCR từ 10 chủng

vi rút được nuôi cấy và phân lập tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Ct: là chu kỳ ngưỡng mà máy ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng và vượt tín hiệu huỳnh quang nền Sự sai khác về giá trị Ct của cùng

1 mẫu thử nghiệm < 3 chu kỳ là điều kiện lý tưởng cho việc đánh giá sự ổn định,

cũng như hiệu quả của phản ứng trong các điều kiện khác nhau

Để kiểm tra đặc tính của mồi và mẫu dò về nhiệt độ lai, kích thước mồi, cáccấu trúc thứ cấp,… chúng tôi sử dụng phần mềm Annhyb và phần mềm trực tuyếnOligo Analyzer 3.1 (IDT, Hoa Kỳ)

Sau đó, chúng tôi sử dụng công cụ BLAST trên NCBI để kiểm tra độ đặchiệu của mồi và mẫu dò Chương trình này cho phép tìm kiếm toàn bộ cơ sở dữ liệunucleotide của tất cả các ngân hàng gen nổi tiếng trên thế giới để tìm ra tất cả những

trình tự tương đồng với những trình tự mồi và mẫu dò của chúng tôi (nếu có) Từ kết quả này, chúng tôi xác định được mồi và mẫu dò có đặc hiệu hay không.

2.5 Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ chủng vi rút EV71

Chứng âm là nước cất được khử trùng được tiến hành tách chiết đồng thời với các mẫu bệnh phẩm để đảm bảo quá trình tách không bị nhiễm

RNA tổng số của chủng vi rút dương tính và mẫu bệnh phẩm được tách chiết theo kít QIAamp Viral RNA Mini Kit của QIAGEN Các bước thực hiện như sau:

- Hút 560 µl lysis buffer AvL vào ống eppendorf 2 ml đã có sẵn 5.6µl carrier RNA

- Cho 140 µl bệnh phẩm vào ống eppendorf có chứa hỗn hợp Buffer AVL - carrier RNA Trộn đều bằng cách votex trong 15 giây

Chú ý: Để đảm bảo cho quá trình ly giải đạt hiệu quả tối đa, quá trình vortex

phải được làm cẩn thận

- Ủ ở nhiệt độ 560C trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm nhẹ để đẩy những dung dịch bám ở nắp ống xuống phía dưới

- Bổ sung thêm 560µl ethanol (96 – 100%), trộn đều bằng máy votextrong 15 giây Sau khi trộn, ly tâm nhẹ để đẩy lượng dung dịch nhỏ bám ởnắp

ống xuống phía dưới

- Cẩn thận chuyển toàn bộ dung dịch ở bước 5 lên cột lọc (đã có ốnghứng loại 2 ml ở dưới) Đóng nắp và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1phút Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứngmới

- Lặp lại bước 6 đến khi cho hết dịch lên cột

- Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa bằng 500 µl Wash buffer AW1 Đóngnắp và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ ống hứng có chứadịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới

- Mở nắp cột lọc cẩn thận, rửa lại bằng 500 µl Wash buffer AW2.Đóng nắp và ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút Loại bỏ ống hứng cóchứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mới

14

- Đặt cột lọc vào một ống eppendorf 1,5 ml mới và loại bỏ ống hứng

có chứa dịch Mở nắp cột lọc cẩn thận và cho 50 µl Elution buffer AE.Đóng nắp và

ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Ly tâm ở 8.000 vòng/ phút trong 1 phút

Mẫu ARN sau khi tách được bảo quản ở -800C đến khi thực hiện các thínghiệm tiếp theo

2.6.Phản ứng Realtime RT-PCR

Nguyên tắc của Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phươngpháp này cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khiphản ứng đang xảy ra

Phản ứng RT-PCR được thực hiện một bước từ RNA tổng số bằng kitSuperScript® III One-Step RT-PCR của Invitrogen

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCRkhuếch đại vùng gen đặc

trưng của EV71

Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 2%, để kiểm tra kíchthước của sản phẩm khuếch đại có đúng như thiết kế mồi không

2.7 Phương pháp điện di

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của cácnucleic acid Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khichịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

Sự phát hiện được quan sát bằng mắt thường dưới đèn UV nhờ sự phát màu củaethidium bromide gắn xen trong DNA

+Cách tiến hành: Sản phẩm RT-PCR được điện di trong gel agarose 1,5% sửdụng thuốc nhuộm GelRed 1X

- Chuẩn bị Agarose 1,5% có bổ sung GelRed

- Đun nóng chảy agarose bằng lò vi sóng (2-3 phút), để nguội đến

55-600C, đổ bản điện di di đã khô, có thể tiến hành điện di

+Thành ph n 1 gi ng đi n diầ ế ệ

Sau khoảng 20 phút, bản điện i như sau:

- 4 µl sản phẩm PCR (hoặc thang marker)

2.8.1 Phương pháp RT-PCR nhân gen đặc trưng của virus EV71

Phản ứng RT-PCR được thực hiện một bước từ RNA tổng số bằng kitSuperScript® III One-Step RT-PCR của Invitrogen Thành phần phán ứng theohướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71

Chu trình nhiệt chạy RT-PCR: 1 chu kỳở 52oC – 15 phút, 95°C- 2 phút, tiếptheo là 45 chu kỳ (95°C – 30 giây, 60°C – 30 giây) và đọc huỳnh quang ở bước 60°C.

2.8.2 Tối ưu nhiệt độ kéo dài

Chương trình luân nhiệt real-time PCR dùng taqman probe thường chỉ có 2giai đoạn nhiệt độ là: biến tính 94-95oC trong 15-30 giây, kế đó là giai đoạn vừa bắtcặp vừa kéo dài ở 60oC trong 30-60 giây và thiết bị thu tín hiệu huỳnh quang sẽ hoạtđộng ở bước này Ở giai đoạn nhiệt độ 60oC thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợiđích trước vì đây là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của Taqman probe (thấp hơn Tm củaTaqman probe là 65-70oC, nhưng cao hơn hoặc bằng Tm của mồi là (55-60oC) rồisau đó mồi mới bắt cặp vào Chính nhờ vậy mà khi Taq polymerase tổng hợp sợi bổsung, enzyme này mới có cơ hội thuỷ giải Taqman probe cản đầu nó Nếu mồi bắtcặp trước vào sợi đích thì sẽ không có cơ hội để Taqman probe bắt cặp vào sợi đích,

và như vậy nó không bị thuỷ giải khi enzyme Taq polymerase kéo dài tổng hợp sợi

bổ sung (nghĩa là máy sẽ không thu được tín hiệu huỳnh quang nào từ reporter củaProbe) Điều này giải thích tại sao phải thiết kế mồi có Tm khoảng 55-60oC và thấphơn Tm của Taqman probe 5-10oC

Dựa vào Tm của Taqman probe và Tm của cặp mồi đã được thiết kế, chúngtôi tiến hành tối ưu nhiệt độ của RT-PCR nhằm tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho sự bắtcặp của Taqman probe mà không ảnh hưởng đến sự bắt cặp của primer Chúng tôitối ưu nhiệt độ ở bước kéo dài và đọc huỳnh quang là 52oC, 55oC, 58oC và 60oC

2.8.3 Tối ưu nồng độ Magie

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất trong 2X reaction mix đã bao gồm magie

ở nồng độ cuối cùng là 3mM, nồng đồ này là cần thiết cho hầu hết các tác nhânđích Tuy nhiên trong từng đối tượng cụ thể có thể tối ưu nồng độ magie trongngưỡng từ 3-6mM Trong nghiên cứu này chúng tôi tối ưu nồng độ magie ở 3ngưỡng nồng độ cuối cùng là 4mM, 5mM và 6mM

2.9 Xác định độ nhạy của phản ứng Realtim RT - PCR

2.9.1 Phương pháp đo nồng độ xác định số bản sao plasmid

Plasmid pCR2.1 mang gen đặc trưng của EV71 (pCR2.1/EV71) được chúngtôi xác định nồng độ trên máy đo Qubit 2.0 Qubit là hệ thống máy huỳnh quang đểbàn thế hệ mới, cho phép định lượng nhanh, chính xác DNA, RNA, Protein và có

độ nhạy cao Thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng trong phương pháp trên chỉliên kết với phân tử mục tiêu cụ thể, kể cả ở nồng độ thấp, giảm thiểu sự ảnh hưởngcủa các chất gây nhiễm Từ nồng độ đo được và kích thước plasmid mang genchúng tôi sử dụng phần mềm online (trên trang web: http://scienceprimer.com) đểtính toán số lượng bản sao plasmid ban đầu.

2.9.2 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng RT-PCR

SuperScript® III RT/ Platinum® Taq MixPrimer F

Primer RProbeMgCl2

RNA tổng số, plasmidTổng thể tích

Chu trình nhiệt chạy RT-PCR: 1 chu ky ơ 52oC –

̀̀ theo là 45 chu kỳ (95°C – 30 giây, 55°C – 30 giây), đọc huỳnh quang ở bước

55°C a Xác định độ nhạy khi sử dụng ARN khuôn là vi rút EV71 nuôi cấy

- Pha loãng 10 lần các dung dịch có chứa 107 vi rút/ml để có các nồng

độ vi rút từ 106, 105 đến 101, 100 vi rút/ ml

- Tiến hành tách chiết RNA tổng số theokit QIAamp Viral RNA Mini Kit của QIAGEN

- Tiến hành chạy RT-PCR

18

b Xác định độ nhạy khi sử dụng ADN khuôn là plasmid mang gen của EV71

- Pha loãng 10 lần các dung dịch plasmid có chứa 107copies/ml để có các nồng bản sao plasmid từ 106, 105 đến 101, 100 vi rút/ml

- Tiến hành chạy RT-PCR

- Độ nhạy của phản ứng RT-PCR (giới hạn phát hiện) được xác định

là nồng độ plasmid thấp nhất cho kết quả RT-PCR dương tính

Để xác định độ nhạy của phản ứng RT-PCR chúng tôi pha loãng plasmidtách dòng như đã trình bày ở trên, độ nhạy là nồng độ plasmid thấp nhất cho kếtquả dương tính

2.9.2.2 Xác định hiệu quả khuếch đại và đường chuẩn của phản ứng RT-PCR

Việc thiết lập đường chuẩn khi làm real-time PCR chẩn đoán là rất cần thiết,đặc biệt khi để xác định chính xác số lượng bản sao đích ban đầu có trong mẫu thử.Biểu đồ chuẩn trước tiên là để đánh giá thao tác pipet của người làm có đạt haykhông, sau là để xác định số lượng tác nhân đích ban đầu có trong mẫu thử Đườngbiểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản sao có trong cácmẫu chuẩn được gọi là đường chuẩn (standard curve)

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng plamid tách dòng đã pha loãng racác nồng độ tương đương số lượng bản sao từ 106 đến 101. Sau đó tiến hành phảnứng RT-PCR trên hệ thống ABI 7500 fast (Applied Biosystems), mỗi độ pha loãngđược lặp lại 3 lần Đường chuẩn được thiết lập từ giá trị logarit lượng DNA banđầu của từng độ pha loãng với giá trị Ct Hiệu quả khuếch đại được tính toán từ độdốc của đường chuẩn Kết quả được thể hiện trong hình 2.12 và hình 2.13

2.10.Xác định độ đặc hiệu của phản ứng trên các chủng vi rút khác nhau

Phương pháp tiến hành:

- Pha loãng chủng vi rút nuôi cấy xuống nồng độ 105 vi rút/ml

- Tiến hành tách chiết theo quy trình trên

- Tiến hành chạy RT-PCR

Độ đặc hiệu được xác định là tỷ lệ các chủng Âm tính với RT-PCR trên tổng

số các chủng được thử

Để xác định tính đặc hiệu của phản ứng RT-PCR dùng trong chẩn đoán Tay Chân Miệng dương tính EV71, chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR trên 2 chủng

vi rút EV71 nuôi cấy, 4 mẫu bệnh phẩm đã được xác định là dương tính với EV71

và 5 chủng vi rút, vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm: Klebsiella pneumoniae (Kp), Cytomegalovirus (CMV), Acinetobacter baumannii (Aci), Hepes simplex virus (HSV) và vi khuẩn E coli được khoa xét nghiệm-Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung

Ương cung cấp

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân tích, so sánh trình tự bằng phần mềm ClustalX

Chúng tôi thu thập trình tự các gen VP1 từ ngân hàng gen NCBI, các trình tựđược chọn ngẫu nhiên, chọn lọc từ các vùng phân lập có địa lý khác nhau, ưu tiêncác trình tự trích dẫn từ các công trình thực nghiệm đã được công bố trên các tạpchí quốc tế uy tín Mã số truy cập các trình tự này được liệt kê trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Mã số truy cập các trình tự gene của EV71.

STT

123456789101112131415161718

Sau khi tải trình tự của các chủng trên thế giới về, chúng tôi tiến hành sắpdóng lại và tìm ra những điểm chung nhất giữa các trình tự đó Từ đó, chúng tôithiết kế mồi và probe