Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hoạt chất nhóm glycoside tim bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến

Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa Việt Nam và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình, kết hợp với các p

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về nhóm thuốc glycoside tim 2

1.1.1 Lịch sử ra đời, phân bố trong tự nhiên nhóm glycoside tim 2

1.1.2 Cấu trúc phân tử nhóm glycoside tim 2

1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của nhóm glycoside tim 3

1.1.4 Tính chất dược lý và tác dụng của nhóm glycoside tim 4

1.1.5 Hấp thu và đào thải thuốc glycoside tim 5

1.1.6 Một số hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim 6

1.1.7 Tá dược trong thuốc glycoside tim 8

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích glycoside tim 9

1.2.1 Phương pháp sắc ký 9

1.2.2 Phương pháp quang phổ hồng ngoại 12

1.3 Thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất trong cùng hỗn hợp 16

1.3.1 Nguyên tắc phương pháp hồi quy đa biến 16

1.3.2 Một số ứng dụng thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất 21

1.3.3 Giới thiệu phần mềm Matlab 22

1.4 Phương pháp NIR kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng 23

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 25

2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Thiết bị 27

2.3 Phương pháp phân tích 27

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 27

2.3.2 Phương pháp phân tích 28

2.4 Câu lệnh thực hiện hồi quy đa biến trong Matlab 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ hồng ngoại tới quá trình xác định đồng thời digoxin và digitoxin trong hỗn hợp 32

3.1.1 Khảo sát lựa chọn số sóng thích hợp 32

3.1.2 Khảo sát tỷ lệ trộn mẫu với bột KBr 38

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng quá trình ép viên mẫu 39

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường 39

3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mẫu chuẩn 40

3.1.6 Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên 41

3.2 Xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng digoxin trong mẫu dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đa biến 42

3.2.1 Chuẩn bị số liệu đầu vào của mô hình hồi quy đa biến 42

3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 46

3.2.4 Phân tích mẫu thực tế 47

3.3 Xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định đồng thời các hoạt chất50 3.3.1 Chuẩn bị số liệu đầu vào 50

3.3.2 Lựa chọn số cấu tử chính 52

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) 55

3.3.4 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 56

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của glycoside tim 2

Hình 1.2 Công thức cấu tao của digoxin 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của digitoxin 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của lactose 9

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn 28

Hình 3.1 Phổ hồng ngoại truyền qua của digitoxin trong vùng 4000-400 cm -1 .33

Hình 3.2 Phổ hồng ngoại truyền qua của digoxin trong vùng 4000-400 cm -1 .34

Hình 3.3 Phổ hồng ngoại truyền qua của digitoxin trong vùng 3600-2800 cm -1 35

Hình 3.4 Phổ hồng ngoại truyền qua của digoxin trong vùng 3600-2800cm -1 .35

Hình 3.5 Phổ tổng cộng của digoxin và digitoxin 35

Hình 3.6 Phổ hồng ngoại truyền qua của lactose trong vùng 4000-400cm-1 và 3600 – 2800 cm -1 36

Hình 3.7 Phổ hồng ngoại truyền qua magie stearat trong vùng 4000-400cm-1 và 3600 – 2800 cm -1 .37

Hình 3.8 Phổ hồng ngoại truyền qua talc trong vùng 4000-400cm-1 và 3600 – 2800 cm -1 .37

Hình 3.9 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định digoxin 49

Hình 3.10: Sắc đồ của mẫu thực (D1 và D2) 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Công thức các hợp chất glycoside tim 3

Bảng 1.2 Đặc tính dược động học của một số glycoside tim 5

Bảng 1.3 Thành phần các glycoside trợ tim chính 6

Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng với bột KBr đến độ hấp thụ quang tại một số đỉnh pic đặc trưng 38

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát quá trình ép viên 39

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 40

Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mẫu 40

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên tại một số đỉnh pic đặc trưng 41

Bảng 3.6 Khối lượng các chất trong Ma trận hàm lượng 43

Bảng 3.7 Hàm lượng digoxin và tá dược trong ma trận kiểm tra 44

Bảng 3.8 Độ lệch chuẩn của mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng digoxin với các PC từ 1-4 46

Bảng 3.9 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định riêng digoxin 47

Bảng 3.10 Mẫu dược phẩm chứa hoạt chất digoxin đang lưu thông trên thị trường 47 Bảng 3.11 Khối lượng trung bình của một viên thuốc và khối lượng digoxin trong một viên thuốc 48

Bảng 3.12 Hàm lượng digoxin trong mẫu thực tính theo HPLC 50

Bảng 3.13 Khối lượng các chất trong Ma trận hàm lượng các chất chuẩn trong ma trận chuẩn xác định đồng thời digoxin và digitoxin 51

Bảng 3.14 Khối lượng các hoạt chất và tá dược trong ma trận kiểm tra 52

Bảng 3.15 Độ lệch chuẩn tương đối của mô hình hồi quy tuyến tính đa biến xácđịnh đồng thời digoxin và digitoxin với số cấu tử từ 1-4 54

Bảng 3.16 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồngthời digoxin và digitoxin 56

Bảng 3.17: Hàm lượng digoxin và digitoxin trong mẫu thêm chuẩn xác định theo

mô hình hồi quy đa biến tuyến tính 57

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Bình phương tối thiểu thông thường

CLS(classical least square)

Bình phương tối thiểu nghịch đảo

ILS(inverse least square)

Bình phương tối thiểu từng phần

PLS(partial least square)

Hồi qui cấu tử chính (principal

PCRcomponent regression)

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High

HPLCperformance liqid chromatography)

Giới hạn phát hiện

Giới hạn đinh lượng

MỞ ĐẦU

Glycoside tim đại diện cho một trong những nhóm dược liệu quan trọng củacác tác nhân điều trị bệnh tim Tuy nhiên các hoạt chất thuộc nhóm này có cơ chếtác dụng đặc biệt lên tim, đặc tính động học cao, thời gian tích lũy trong cơ thể rấtlâu vì thế khi ngộ độc thì bị kéo dài, dễ gây tử vong cho người bệnh Chính vì thếcần xác định chính xác hàm lượng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đưavào điều trị đạt hiệu quả cao Yêu cầu đặt ra là phải có phương pháp phù hợp địnhlượng các glycoside tim trong dược liệu, dược phẩm một cách nhanh chóng vàchính xác Để định lượng chính xác glycoside có rất nhiều phương pháp như HPLC,HPLC kết hợp với detecto UV…, tuy nhiên nhược điểm của các phương pháp này

là là phải thực hiện trên các trang thiết bị hiện đại, tốn dung môi và yêu cầu xử lýmẫu, tách chất nên khá mất thời gian … không thể dùng để phân tích nhanh, đại trà[11,13]

So với các phương pháp trên thì phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểmnổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, phân tích nhanh, không sử dụngdung môi độc hại, có thể tiến hành đo trực tiếp mẫu rắn rất phù hợp cho việc phântích nhanh Nhưng do vùng phổ hồng ngoại gần và trung bình gồm các bước sóngcủa các liên kết cơ bản (C-C, C-H, N-H…) do vậy xảy ra sự chồng phổ, khó táchphổ và quá trình phân tích mẫu rắn gặp rất nhiều khó khăn nên việc định lượng hoạtchất trong dược phẩm rất khó khăn

Trước thực trạng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất nhóm glycoside tim bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến” Với việc kết hợp phương

pháp phổ hồng ngoại với kỹ thuật thống kê đa biến ta có thể định lượng đồng thờinhiều hoạt chất trong dược phẩm mà không cần tách chiết chất

Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa Việt Nam

và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần

và trung bình, kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để kiểm địnhnhanh chất lượng thuốc Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định xu hướng đưa cácphép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh trong thực tế, đồngthời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăng tính thời sự của côngtác giám định chất lượng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về nhóm thuốc glycoside tim

1.1.1 Lịch sử ra đời, phân bố trong tự nhiên nhóm glycoside tim

Glycoside tim bắt đầu được sử dụng trong y học bởi Withering vào năm 1985,đây là những glycoside steroid có tác dụng đặc biệt lên tim, được dùng để điều trịsuy tim Trong số hơn 300 loại glycoside tim có trong tự nhiên thì digoxin vàdigitoxin được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị hiện nay

Glycoside tim có trong hơn 45 loài thực vật chủ yếu thuộc các họ:

Apocynaceae, Asclepiadaceae, Celastraceae (Dây gối), Cruciferae,Euphorbiaceae, Fabaceae, Liliaceae, Meliaceae, Moraceae, Ranulculaceae,Scrophulariaceae, Sterculiaceae, Tiliaceae (Đay) và trong một số côn trùng Ởtrong cây glycoside tim có ở các bộ phận: lá, hoa, vỏ thân, rễ, thân rễ, nhựa mủ [8,11,13,23]

1.1.2 Cấu trúc phân tử nhóm glycoside tim

Glycoside tim cũng như các glycoside khác cấu trúc hoá học gồm hai phần:phần đường và phần không đường (aglycon hoặc genin) được nối với nhau bằngdây nối glycoside Công thức cấu tạo chung của glycoside tim được trình bày ở hình1.1 và bảng 1.1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của glycoside tim

Bảng 1.1 Công thức các hợp chất glycoside tim.

- Phần không đường (aglycon hoặc genin) có thể chia thành hai phần nhỏ:

+ Phần hydrocacbon: là dẫn xuất của 10,13 – dimetylxyclopentanopehydro phenantren

+ Phần mạch nhánh là vòng lacton, có tác dụng chống suy tim, được nối vào vịtrí C-17 của khung

Đính vào nhân này còn có các nhóm chức có oxy

- Phần đường không có tác dụng dược lý, được nối vào -OH ở C-3 của aglycon Phần không đường có thể chia thành hai phần nhỏ:

+ Mạch nhánh là vòng lacton

- Các loại dây nối:

+ Dây nối axetal gồm: O- glycoside, C- glycoside, S- glycoside, N- glycoside.+ Dây nối este: Pseudoglycoside [11,13,23]

1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của nhóm glycoside tim

* Tính chất hóa học

Các glycoside tim rất nhạy cảm với thay đổi pH môi trường, những glycosidetim có đường 2-desoxy rất dễ thuỷ phân khi đun với axít vô cơ 0,05 N trongmetanol 30 phút trong khi những glycoside khác trong điều kiện đó không thuỷphân được

Trong môi trường kiềm các cacdenolid chuyển thành các dẫn chất iso và cácdây nối este bị cắt (nếu có) không hoạt tính Glycoside dễ bị thuỷ phân bởi cácenzim Thường thì các enzim này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớt phầnglucose để chuyển thành các glycoside thứ cấp Ví dụ: digilanidaza trong lá digitanlông, digipuapidaza trong lá digitan tía, strophantobiaza trong hạt Strophanthuscourmonti, xilarenaza trong Scilla maritima [11,13,23]

1.1.4 Tính chất dược lý và tác dụng của nhóm glycoside tim

Phần quyết định tác dụng lên tim là phần aglycol bao gồm nhân steroid vàvòng lacton chưa bão hoà Nếu giữ vòng lacton, thay nhân steroid bằng nhân benzenhoặc naphtalen thì mất tác dụng Nếu giữ nhân steroid mà thay đổi vòng lacton bằngvòng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất nhiều Phần đường có ảnh hưởng đếntác dụng nhưng ít, chủ yếu là ảnh hưởng đến độ hoà tan.Sự hấp thu qua dạ dày, tátràng, ruột non phụ thuộc vào số lượng nhóm -OH của phần aglycon

Digitoxin dễ hấp thu qua đường tiêu hoá và tái hấp thu qua thận và gan thì chỉ

có một nhóm -OH tự do trong phần aglycon Digitoxin tích luỹ trong cơ thể

Các hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim tác dụng lên tim theo cùng một cơchế Glycoside tim làm tâm thu ngắn và mạnh, tâm trương dài ra, nhịp tim chậm lại

Do đó bệnh nhân đỡ khó thở và nhịp hô hấp trở lại bình thường Glycoside tim cònlàm giảm dẫn truyền nội tại và tăng tính trợ của cơ tim nên nếu tim bị loạn nhịp,thuốc có thể làm đều nhịp trở lại

Khi dùng với liều lượng cao, sẽ có hiện tượng nhiễm độc dẫn tới các dấuhiệu tâm thần mê sảng, lú lẫn, giảm thị giác, nôn, chán ăn, tim đập chậm lại, loạn

nhịp ngoại tâm thu nhĩ, cuối cùng là ngừng đập Điều trị ngộ độc bằng cách dùngthuốc ức chế gắn tiếp tục glycoside tim vào tim (kali) và thải trừ calci là chất hiệpđồng tác dụng với digitalis trên cơ tim (EDTA) và các thuốc chữa triệu chứng loạnnhịp tim Điều trị chủ yếu dựa vào mức độ nhiễm độc nặng hay nhẹ với các triệuchứng loạn nhịp ra sao [8]

1.1.5 Hấp thu và đào thải thuốc glycoside tim

Glycoside tim được khuếch tán thụ động qua ống tiêu hóa (dạ dày, tá tràng,ruột non): thuốc càng tan tốt trong lipid, càng dễ khuếch tán Các nhóm -OH củagenin là những cực ưa nước, làm hạn chế độ tan trong lipid của thuốc Digitoxin cómột nhóm -OH tự do ở C14, nên dễ tan trong lipid, được hấp thu hoàn toàn khiuống Digoxin có 2 nhóm -OH tự do, hấp thu qua đường tiêu hóa tốt hơnuabaigenin, nhưng không hoàn toàn như digitoxin

Glycoside tim gắn nhiều vào mô, đặc biệt là tim, gan phổi, thận vì những cơquan này được tưới máu nhiều [8]

Đặc tính dược động lực học của một số glycoside tim được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc tính dược động học của một số glycoside tim

tiêu hóa tương

5

1.1.6 Một số hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim

Trong số hơn 300 glycoside tim có trong tự nhiên thì chỉ có digoxin vàdigitoxin được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim

và được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay Vì vậy chúng tôi chỉ đi sâu nghiên cứu vàohai hoạt chất digoxin và digitoxin trong luận văn này

Bảng 1.3 Thành phần các glycoside trợ tim chính

Digitoxin(digitalin) Digitoxigenin 3 digitoxose Digitalin

phần acetic

Lanataglycoside C Digoxigenin 3 digitoxose + 1 Xedilanid

glucose+ phầnacetic

glucose

Công thức: C41H64O14 (780,95)

Tên quốc tế: Digoxin

Loại thuốc: thuốc chống loạn nhịp tim Digoxin làm tăng sức bóp cơ tim và

giảm tính dẫn truyền xung điện qua nút nhĩ thất, do đó thường dùng trong điều trịsuy tim, kiểm soát nhịp tim trong rung nhĩ,cuồng động nhĩ, nhịp nhanh kịch pháttrên tâm thất

Hình 1.2 Công thức cấu tao của digoxin

Tính chất vật lý: digoxin là chất kết tinh không màu Tan trong cồn, pyridin,

hay hỗn hợp clorofom – ancol, tan nhiều trong cồn nóng 80% Độ tan trong nước64,8 mg/L ở 25 °C và điểm nóng chảy ở 249 °C Không tan trong ete, axeton…

Digoxin có thể dùng bằng cách uống hoặc tiêm tĩnh mạch Thể tích phân phốitrung bình khoảng 7,3 l/kg Thải trừ qua thận gần như hoàn toàn Sự thải trừ khôngphụ thuộc pH của nước tiểu [3]

Công thức: C41H64O13 (764,95)

Tên quốc tế: Digitoxin

Loại thuốc: thuốc chống loạn nhịp Là chất độc bảng A Có cấu trúc và hiệu

ứng tương tự như digoxin, mặc dù các hiệu ứng lâu dài không giống như digoxin(được loại bỏ ra khỏi cơ thể qua thận), nó được thải trừ qua gan, do đó có thể được

sử dụng ở những bệnh nhân có chức năng thận kém hoặc thất thường

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của digitoxin

Tính chất vật lý: Digitoxin là chất kết tinh không màu Tan tốt trong cồn,

clorofom, tan ít trong nước (1gam/100 lít ở 20oC) Không tan trong dung môi hữu

cơ benzen, ete….[3]

1.1.7 Tá dược trong thuốc glycoside tim

Dạng thuốc là sản phẩm cuối cùng của quá trình bào chế; có bao gồm dượcchất, tá dược, và bao bì Dược chất hay hoạt chất chính là thành phần chính củadược phẩm có tác dụng dược lý Dược chất dùng để trị bệnh, phòng bệnh hoặcchuẩn đoán bệnh

Tá dược hay tá chất là các loại chất phụ thêm vào dược phẩm nhằm làm thuậnlợi cho quá trình sản xuất thuốc, tạo cho dược phẩm có thể chất, khối lượng, màusắc, mùi vị thích hợp hoặc tiện dụng, dễ bảo quản, tăng độ ổn định của thuốc, giảiphóng được chất tại nơi mong muốn, phát huy được tối đa tác dụng của dược chất,hạn chế tác dụng phụ và độc tính Như vậy, tá dược có vai trò là chất độn, chấtmang, dung môi hòa tan, và chất bảo quản

Do thành phần tá dược trong mỗi mẫu thuốc glycoside tim đều thay đổi theomỗi nhà sản xuất Tuy nhiên trong quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy lactose,magie stearat, talc… là 3 loại tá dược được sử dụng nhiều nhất và chiếm khối lượngphần trăm lớn (gần 98%)

Bột talc là magie silicat tự nhiên đã được lựa chọn và làm thành bột mịn

Công thức hóa học Mg3Si4O10(OH)2 Cấu trúc của talc bao gồm lớp bát diệnmagie liên kết kẹp giữa hai lớp tứ diện silic

Tính chất: bột talc rất mịn, nó cho cảm giác trơn bóng như xà phòng Talc có

tính chất cách điện, cách nhiệt, nhiệt độ nóng chảy cao, độ giãn nhiệt thấp, bền hóahọc, hấp thụ dầu, kị nước, ưu hợp chất hữu cơ và diện tích bề mặt lớn [2]

1.1.7.2 Magie stearat

Magie stearat là stearat là hỗn hợp các muối của magie và các axit béo

Công thức: C36H70MgO4

Tính chất: magie stearat có dạng bột trắng mịn, là thành phần tá dược có tác

dụng chủ yếu để bôi trơn, chống dính, làm chất độn, không tan trong nước, etanolhoặc ete, chủ yếu được sử dụng như một chất bôi trơn

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của lactose Tính chất

Lactose có dạng bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng Dễ tan nhưng tan chậmtrong nước, kém tan trong etanol 96%

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích glycoside tim

1.2.1 Phương pháp sắc ký

Trong những năm gần đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trongmọi lĩnh vực khác nhau, nhất là các lĩnh vực của hóa dược, sinh hóa, hóa thựcphẩm, nông hóa, hóa dầu, hóa học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụngđộc hại, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất

1.2.1.1 Phân tích định lượng bằng HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trìnhvừa có tính chất hóa học lại vừa có tính chất lý hóa Trong cột sắc ký xảy ra nhữngcân bằng động giữa pha tĩnh và pha động Chất tan luôn được vận chuyển và phân

bố lại giữa hai pha Pha động chảy liên tục qua cột tách với tốc độ và thành phầnnhất định Do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độdịch chuyển trung bình của mỗi chất là khác nhau, thời gian bị giữ lại trong cột sắc

ký khác nhau, dẫn đến quá trình tách của các chất trong cột sắc ký

Đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách,dựa vào thời gian lưu này để định tính chất đó thông qua mẫu chuẩn Sau đó dựavào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) đề định lượngcác chất

H = k1.Cb

S = k2.CbTrong đó: H chiều cao pic sắc ký của chất

S diện tích pic sắc ký của chất

k hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

Youichi Fujii và các cộng sự đã đưa ra quy trình tách và định lượng cácglycoside tim trong thuốc bằng phương pháp micro – HPLC với điều kiện: CộtJasco SC-01 (165x0,5mm I.D), pha động là hỗn hợp acetonitrin –metanol – nướcvới tỉ lệ thể tích bằng 1:1:1, tốc độ dòng 4 l/phút, detector UV đặt tại bước sóng ở

220 nm, thể tích bơm mẫu là 0,1l Thứ tự các chất ra khỏi cột là: digoxin,lanatoside B, gitoxin, lanatoside A, digitoxin, thời gian tách thay đổi trong khoảng

30 đến 45 phút.[26]

Digoxin và digitoxin cũng đã được nhóm nghiên cứu của Federica Pellatiphân tích xác định và tách trong lá cây mao địa hoàng với phương pháp HPLC trêncột LiChrospher RP-18 (125 mm × 4.0 mm I.D.), Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6

mm I.D.); SB-Aq (150 mm × 4.6 mm I.D); Symmetry C 18 (75 mm × 4.6 mm I.D.,trong điều kiện dung môi pha động là hỗn hợp của acetonitrin và nước, chạygradient từ 0- 35phút với tỉ lệ H2O/ACN là 80:20, từ phút 35 đến 40 với tỉ lệ

H2O/ACN là 70:30 và tỉ lệ H2O/CAN bằng 60:40 được giữ trong 3 phút, nhiệt độcột đặt ở 20oC, thể tích bơm là 10l, tốc độ dòng là 1ml/phút, detector đặt tại bướcsóng 220nm Tổng thời gian phân tích mẫu là 48 phút Thứ tự các chất ra khỏi cột:digoxigenin; 2,deacetyllanatoside C; 3,digoxigenin-bis-digitoxoside; 4,gitoxigenin;

5, digoxin; 6, lanatoside C; 7, digitoxigenin; 8, -acetyldigoxin; 9, -acetyldigoxin;

10, lanatoside B; 11, gitoxin; 12, lanatoside A; 13, digitoxin.[19]

Sử dụng phương pháp HPLC với detector UV để xác định digoxin trong thuốccũng đã được công bố bởi A Jedlicka và các cộng sự Digoxin sau khi được chiếtpha rắn được đưa vào phân tích với điều kiện: cột C18 (RP-18e, 5m, 125x4,0mm),pha động là hỗn hợp của nước và acetonitrin với tỉ lệ H2O/ACN = 72:28, phát hiệnchất ở bước sóng 118nm, thể tích bơm mẫu là 100l, nhiệt độ cột 50oC, tốc độ dòng1,1ml/phút.[13]

1.2.2 Phương pháp quang phổ hồng ngoại

Vùng phổ hồng ngoại gần được phát hiện vào năm 1800 bởi WilliamHerschel Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành tổng hợp hữu cơ, các máy đoquang phổ hồng ngoại càng trở nên thông dụng ở các phòng thí nghiệm cho mụcđích định dạng các vật liệu tinh khiết và cấu trúc của chúng, đã đóng góp rất nhiềucho các công trình nghiên cứu về nông nghiệp, thực phẩm, dệt, polymer, xăng dầu,dược phẩm…

Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phântích khá hiệu quả Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổhồng ngoại vượt trội hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác đó là nó cóthể cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các tính toán haycông đoạn chuẩn bị mẫu quá phức tạp

* Các yếu tố ảnh hưởng làm dịch chuyển tần số đặc trưng

Tần số dao động của các nguyên tử phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử củachất nghiên cứu và tương tác giữa các phân tử này Ngoài ra còn có ảnh hưởng củadung môi, nồng độ, nhiệt độ và trạng thái tập hợp tới vị trí của cực đại hấp thụ:

- Dung môi: có ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí của các cực đại hấp thụ tùy theo độ phân cực của chúng

- Nồng độ dung dịch: cũng gây ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí của đỉnh hấpthụ, đặc biết đối với các chất có khả năng tạo cầu liên kết hidro như ancol, phenol,amin…

- Ảnh hưởng của nhóm thế: Các nhóm thế trong phân tử cũng gây ra ảnhhưởng đến sự thay đổi vị trí đỉnh hấp thụ tùy theo nhóm thế gây hiệu ứng cảm ứng hayliên hợp

- Phức chất: khi tạo phức, tần số hấp thụ đặc trưng của nhóm chức thay đổi theo kim loại trung tâm và số phối trí [9, 12, 13]

Ngoài ra H2O cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn tới phổ hấp thụ hồng ngoại,

do H2O hấp thụ mạnh trong vùng này nên các mẫu đem đo phổ phải đảm bảo khôngchứa nước (mẫu phải bảo quản trong bình hút ẩm)

Máy quang phổ hồng ngoại dùng để ghi phổ trong vùng từ 10000 cm-1 đến

670 cm-1 hoặc trong một vài trường hợp tới 200 cm-1 Máy quang phổ hồng ngoạichuyển đổi Fourier (FTIR) sử dụng bức xạ đa sắc và tính toán phổ theo dải tần số từ các

dữ liệu gốc bằng chuyển đổi Fourier

Thông thường phổ được xem là hàm số của độ truyền qua T: là tỷ số củacường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ tới

Độ hấp thụ ánh sáng (A) là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền qua [2]

Phổ hồng ngoại (IR) là một trong các kỹ thuật phân tích quan trọng Một trongcác lợi thế vượt trội của nó là có thể phân tích được hầu hết các dạng vật chất: chấtlỏng, dung dịch, bột nhão, bột khô, phim, sợi, khí và các bề mặt…

Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm toànphần trong đó phổ truyền qua hay được sử dụng nhiều nhất

Phổ IR của các hợp chất có thể được ghi ở pha hơi, pha lỏng hay ở pha rắn

Chuẩn bị mẫu

1 Pha hơi: Hơi hay khí được đưa vào trong cuvet đặc biệt thường có độ dài

10 cm và có thành làm bằng NaCl cho phép bức xạ IR truyền qua

2 Dạng màng chất lỏng: Giọt mẫu chất lỏng được nhỏ lên bề mặt một tấm cửa

số NaCl, lấy tấm cửa sổ NaCl còn lại xoa nhẹ để tạo lớp màng chất lỏng mỏng giữa

hai tấm cửa sổ đo Đây là kỹ thuật ghi phổ đơn giản nhất, thường sử dụng cho chất lỏng có độ nhớt cao và ít bay hơi.

3 Dạng dung dịch: Thông thường dung dịch 1-5% của hợp chất được đưa vàocuvet đặc biệt có độ dài 0,1-1 mm và được làm bằng NaCl Kỹ thuật thường sử dụng chocác chất lỏng có độ nhớt thấp và dễ bay hơi

4 Ở trạng thái rắn: Đo mẫu dạng rắn có hai phương pháp đo:

Phương pháp Nujol: trộn mẫu với parafin lỏng, nghiền kỹ và đều rồi bôi mộtlớp mỏng lên mặt tấm cửa sổ, sau đó đặt vào giá cuvet để đo trên máy

Phương pháp ép KBr (film): trộn mẫu với bột KBr, nghiền kỹ bằng cối mãnão, sau đó cho vào cối ép thành màng mỏng, đặt vào giá đỡ cuvet để đo trên máy.Một vài yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chuẩn bị mẫu đo theo phương pháptrộn KBr: nghiền không kỹ, trộn không đều, độ ẩm, các tạp chất trong môi trườngphân tích [2, 9, 12, 13]

Log = Đối với trường hợp đo trong dung dịch: theo phương trình trên, ở một bướcsóng xác định, sự hấp thụ ánh sáng tỉ lệ với nồng độ C và chiều dày cuvet d và bảnchất của mẫu đo Như vậy, khi phân tích một chất, đo ở một bước sóng xác định vớimột cuvet có chiều dày d đã biết thì độ hấp thụ quang A chỉ còn tỉ lệ với nồng độ C

Phương pháp phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại cũng thực hiện theocách lập đường chuẩn Pha một loạt mẫu với nồng độ khác nhau của chất cần xácđịnh ở dạng tinh khiết rồi đo giá trị A của chúng, sau đó vẽ đồ thị biểu diễn sự phụthuộc A vào nồng độ C Sau khi thiết lập được đồ thị đường chuẩn, cần chú ý làđường chuẩn này chỉ sử dụng được trong phạm vi giới hạn nồng độ ứng với đoạnđường thẳng của đường biểu diễn, bởi vì trong giới hạn này mới có sự tuyến tínhgiữa độ hấp thụ quang A và nồng độ dung dịch [9]

Ứng dụng phổ hồng ngoại trong phân tích dược phẩm

Phổ hồng ngoại gần chứa thông tin về cả các tính chất chất hóa học và các tínhchất vật lý của mẫu đo Do đó, các thông số dược phẩm khác nhau có thể được phântích bằng NIRS như độ cứng, kích thước hạt, lực nén, độ ẩm Theo tài liệu thamkhảo, việc phân tích định lượng bằng NIR đầu tiên là việc xác định độ ẩm của mẫunhờ vào dải phổ đặc trưng cho các liên kết trong phân tử của nước hấp thụ tại bướcsóng 1450 và 1940 nm

- Kích thước hạt: sự khác nhau về kích thước hạt thường được quan sát thấydưới dạng một đường nền dốc, tăng lên về phía các bước sóng dài Năm 1985, tác giảCiurczak đã chứng minh rằng có sự liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ tại bất kì bướcsóng nào với kích thước hạt

- Độ ẩm: Do nước gây ra hệ số suy giảm lớn nhất trong phổ NIR của các vậtliệu dược phẩm nên nó cũng là một trong những chất được đo đạc nhiều nhất bằng NIR.Derksen và đồng nghiệp đã sử dụng NIR để xác định nước thông qua độ ẩm

của mẫu với nhiều loại hoạt chất

- Độ cứng: Một trong các ứng dụng về quản lý chất lượng của phổ NIR đó làxác định độ cứng của viên thuốc mà không cần phá mẫu Sự thay đổi về độ cứng củathuốc có thể được quan sát dưới dạng đường phổ nền dốc dịch chuyển khi độ cứng tănglên thì độ hấp thụ cũng tăng lên Điều này rõ rệt hơn ở các bước sóng dài bởi hiệu ứngtán xạ của ánh sáng

- Xác định thành phần của hoạt chất trong các viên nén và viên con nhộng, Xác định liều lượng nguyên vẹn trong thuốc… [9, 12, 13, 27]

L.K Hearn và các cộng sự cũng đã sử dụng phổ hồng ngoại gần để xác địnhhàm lượng glycoside có trong lá cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) Đã làm thí nghiệm

33 mẫu lá được thu hoạch ở nhiều thời điểm khác nhau trong năm, sau đó cắt nhỏ,sấy khô trong 48h ở nhiệt độ 800C và đem đi đo phổ hồng ngoại gần Kết quả thuđược hàm lượng glycoside chiếm từ 4,3 đến 11,1 % hàm lượng lá khô [21]

1.3.1 Nguyên tắc phương pháp hồi quy đa biến

Phương pháp hồi quy đa biến là một mảng quan trọng trong Chemometric,hiện nay được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hóa học, phương pháp nàygiúp giải quyết các bài toán xác định đồng thời nhiều cấu tử có mặt trong hỗn hợp

mà không cần tách loại ra trước khi phân tích

Thuật toán này đã được ứng dụng rộng rãi để giải quyết nhiều bài toán địnhdạng phức tạp Về nguyên tắc, chỉ cần xây dựng dãy dung dịch chuẩn có mặt tất cảcác cấu tử cần xác định với nồng độ biết trước trong hỗn hợp (các biến độc lập x),

đo tín hiệu phân tích của các dung dịch này dưới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc

y và thiết lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biếnđộc lập x (nồng độ các chất trong hỗn hợp) Dựa trên mô hình này có thể tìm đượcnồng độ của các cấu tử trong cùng dung dịch định phân khi có tín hiệu phân tích củadung dịch đó

Nếu các cấu tử có mặt trong hỗn hợp cho tín hiệu đo có tính chất cộng tính thì

có thể sử dụng phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính thông thường (multiple

linear regression- MLR) như phương pháp bình phương tối thiểu thông thường

hoặc hiệu quả hơn như bình phương tối thiểu từng phần, phương pháp hồi qui cấu tửchính, … Nhưng nếu trong hỗn hợp, các cấu tử có sự tương tác lẫn nhau làm mất

Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phương pháp hồiqui đa biến tuyến tính thành 2 nhóm chính: các phương pháp hồi qui đa biến tuyếntính sử dụng phổ toàn phần như phương pháp CLS, PLS, và phương pháp sửdụng dữ liệu phổ riêng phần như ILS.

Trong phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính nếu giả thiết rằng trong dungdịch cần phân tích có n cấu tử (x1, x2, xn), tín hiệu phân tích của hỗn hợp này là

y, thì phương trình hồi quy đa biến mô tả quan hệ giữa y và các biến xi (i = 1,2, n)

có dạng:

y = k1x1 + k2x2+ + knxn + e (1)

với e là tín hiệu nền gây ra sai số khi phân tích

Để tìm nồng độ của n cấu tử thì cần có ít nhất n phương trình hồi quy Vì vậy,khi xây dựng đường chuẩn cần tiến hành số thí nghiệm m n, khi đó sẽ lập được mphương trình hồi quy đa biến Phương trình trên có thể biểu diễn dưới dạng tổngquát như sau:

Y=XK+ETrong đó: K là véc tơ chứa các hệ số của phương trình hồi quy

Y là véc tơ cột chứa m giá trị y1, y2 ym

X là ma trận có m hàng (ứng với m thí nghiệm) và n cột (ứng với n cấu tửtrong hỗn hợp)

E là véc tơ cột chứa tín hiệu nền của m thí nghiệm

)

Để giải bài toán theo phương pháp hồi đa biến tuyến tính thì tín hiệu phân tíchcủa những cấu tử trong hỗn hợp phải thỏa mãn tính chất cộng tính Phương trình hồiquy này sẽ cho biết:

- Những cấu tử nào có ảnh hưởng lớn (nếu giá trị tuyệt đối của hệ số hồi quy lớn) đến tín hiệu phân tích.

- Biết được chiều ảnh hưởng khi thay đổi nồng độ của cấu tử cần phân tíchđến tín hiệu phân tích (hệ số hồi quy mang dấu dương sẽ ảnh hưởng cùng chiều đến kếtquả phân tích và ngược lại)

- Tính được nồng độ các cấu tử trong dung dịch cần phân tích từ việc đo tín hiệu phân tích của mẫu chưa biết

Các thuật toán hồi quy đa biến thường được sử dụng để phân tích đồng thời các cấu tử trong cùng hỗn hợp mà không phải tách là:

- Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS)

- Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS)

- Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS)

- Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)

* Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS) Từ dạng tổng quát Y=

XK + e

Với y là vecto (mx1); X là ma trận (mxk), và e là vecto số dư (mx1)

K là vecto hệ số của phương trình hồi qui dạng hàng (kx1) nếu y là véc tơ cộtbiểu diễn tín hiệu đo của một dung dịch chuẩn; K là ma trận (kxp) nếu y là số liệudạng ma trận (mxp) biểu diễn tín hiệu của dung dịch chuẩn được đo tại nhiều thờiđiểm (ví dụ đo độ hấp thụ quang tại p bước sóng)

Nếu có giá trị nhập vào là biến độc lập X và biến phụ thuộc y sẽ tính được giátrị hệ số b Theo phương pháp bình phương tối thiểu, ma trận hệ số K sẽ được tínhnhư sau:

K= (XTX)-1 XTy

Với mẫu chưa biết cần tìm giá trị X0 từ giá trị y0 ta sẽ có:

X0 = y0 KT (KKT)-1

Ưu điểm của CLS : Trong phương pháp hồng ngoại, phương pháp CLS ghi

tín hiệu phân tích dạng ma trận được xem là phương pháp định lượng phổ toànphần, do vậy đạt được độ chính xác cao so với các phương pháp chỉ sử dụng một sốbước sóng và cho phép tính toán đúng với tất cả các phổ trong hỗn hợp

Nhược điểm của CLS : là cần phải biết tất cả các phổ của những chất gây ảnh

hưởng đến vùng phổ được đo vì chúng đều đóng góp vào đường chuẩn Điều này cóthể được loại trừ đáng kể bằng cách phân tích dải phổ tại một thời điểm sau khi gộpkết quả vào phép phân tích thống kê Nó cho phép loại bỏ dải phổ không tuân theođịnh luật Lambe-Bia hoặc những phổ có chứa tín hiệu của ion cản Vì vậy cần thiếtphải xác định xem trong hỗn hợp có những chất nào đóng góp vào tín hiệu phổ

* Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS)

Phương pháp này giả thiết rằng nồng độ chất phân tích là hàm của tín hiệuphân tích theo phương trình:

X = y.P+eTrong phương pháp này, hệ số P trong phương trình hồi qui là thành phần của

ma trận (mxk) được tính theo phương pháp bình phương tối thiểu suy rộng

(generalized):

P= (yTy)-1 yTXViệc phân tích nồng độ chất chưa biết (X0) được thực hiện bằng cách nhân trựctiếp gía trị tín hiệu đo y0 của dung dịch cần phân tích với P

X0= y0.P

Nhược điểm của phương pháp ILS: tín hiệu mẫu phân tích phải được ghi ở

số ít nhất thời điểm chính xác nhất (ví dụ trong trắc quang phải chọn được số ít nhấtcác bước sóng phản ánh đấy đủ tín hiệu của tất cả các chất trong hốn hợp) Vì ma

trận hệ số P tính theo phương trình trên là ma trận nghịch đảo, do đó kích thước của

ma trận này phải bằng số bước sóng sử dụng và phải nhỏ hơn số dung dịch chuẩnđem dùng Một vấn đề khác là tính cộng tính của tín hiệu đo và đường chuẩn khi cónhiều bước sóng được sử dụng sẽ xảy ra làm cho độ chính xác giảm

* Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS)

PLS là phương pháp đa biến dùng để mô hình hoá mối quan hệ giữa biến độclập X và biến phụ thuộc Y PLS mô hình hoá cả 2 biến X và Y đồng thời để tìm ra

biến ẩn (latent variables- LVs) trong X mà từ đó sẽ đoán được biến ẩn trong Y.

PLS1 dùng để chỉ những trường hợp có 1 tín hiệu phân tích ở một thời điểm vàđược nhập dưới dạng véc tơ cột, trong khi PLS2 có thể cho ta một số kết quả Y đồngthời Nói cách khác số liệu của liệu Y trong phương pháp PLS2 được mô tả dướidạng ma trận Trong mô hình PLS, số liệu được chia thành 2 nhóm biến: biến X(descriptor: biến mô tả hay biến độc lập, thường là nồng độ chất phân tích) và biến Y(respone: kết quả hay tín hiệu phân tích)

Mục đích của PLS là mô hình hoá X sao cho có thể đoán được thông tin trong

Y PLS sẽ tối ưu hoá giá trị đồng phương sai (covariance) giữa ma trận X và Y Hai

ma trận X và Y được phân tích thành hai ma trận trị số (score matrices) T, U và ma trận trọng số (loading matrices) P và Q.

Trái ngược với PCA, có hai dạng khác nhau của giá trị trọng số trong PLS,

tương đương với PCA loading là PLS weights (trọng số PLS) (W) Loading weight

(W) được dùng là trực giao để tối ưu hoá đồng phương sai giữa hai biến X và Y Số

tối ưu các biến ẩn có thể được ước đoán bằng dùng thuật toán đánh giá chéo (

cross-validation) hoặc tập số liệu kiểm tra riêng biệt.

Nói cách khác phương pháp PLS khác với các phương pháp hồi qui khác ở chỗ

nó thích hợp cho những tập số liệu có số thí nghiệm ít hơn số biến và sự tương quangiữa các biến độc lập và có tính chất cộng tính cao

Mục đích của PLS cũng là giảm số biến và tạo ra các cấu tử không liên quansau đó biểu diễn phương trình bình phương tối thiểu với những cấu tử này.

* Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)

PCR gồm 2 quá trình: Phân tích cấu tử chính chuyển sang tập dữ liệu mới,chứa một số ít các yếu tố quan trọng, cần thiết Sau đó sử dụng phương pháp bìnhphương tối thiểu nghịch đảo (ILS) để phân tích tập dữ liệu mới này

Trước tiên, chiếu tập số liệu đó lên không gian có ít chiều hơn theo PCA màkhông làm mất đi các thông tin quan trọng và tiến hành phân tích hồi qui đa biếntrên không gian mới này Nó giả thiết rằng mỗi thành phần trong tập số liệu có thểđược gán một giá trị định lượng đầu tiên cần tạo mô hình PCA cho tập số liệu và sử

dụng gía trị riêng của các biến ảo (score) để xây dựng phương trình hồi qui đa biến

tuyến tính trong đó giá trị y là giá trị hàm mục tiêu

Ưu điểm PCR: Giá trị nhiễu nền được chuyển vào trong sai số dư và loại ra

khỏi mô hình hồi qui vì trong phương pháp này các vector riêng có trị riêng thấp chỉ

chiếm phần phương sai thấp Từ hỗn hợp có rất nhiều cấu tử, bằng phương pháp

PCA có thể giảm số chiều trong tập hợp và do vậy chỉ làm việc với số ít biến

Nhược điểm PCR: Việc giảm kích thước của tập số liệu đôi khi có thể loại bỏ

nhầm tín hiệu và giữ lại sai số trong các PC

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhóm nghiên cứu đã thu được từ nhiềunăm qua, hiện thuật toán hồi qui đa biến về xác định đồng thời các cấu tử dựa trên

dữ liệu phổ toàn phần bằng phần mềm MATLAB đã được hoàn chỉnh Vì vậy chúngtôi sẽ kế thừa những nghiên cứu này đối với tập số liệu phổ hồng ngoại [10]

1.3.2 Một số ứng dụng thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất

Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến cho phép giám sát liên tục để phân tích đồng thờiglycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [24]

Tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích thuộc AgroParisTech, nhóm nghiên cứuứng dụng các thuật toán để xử lý các tín hiệu phân tích của hỗn hợp các chất trong

sự tương tác phức tạp đa biến và đưa ra các kết quả của từng biến đã có rất nhiềunghiên cứu thu được kết quả tốt Đặc biệt, việc áp dụng các thuật toán đã mở ranhững kỹ thuật đo nhanh mà có thể đưa các phép phân tích ra khỏi phạm vi phòngthí nghiệm [14, 15, 16, 18, 24]

Tại Việt Nam, việc áp dụng thuật toán hồi quy đa biến để xác định đồng thờicác chất cũng đã thu hút nhiểu sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Tácgiả Kiều Thu Hà đã đã kết hợp thuật toán này với phương pháp động học–trắcquang để xác định đồng thời sunfit và sunfua của mẫu nước ngầm ở khu vực xã Dân

Hạ - Kỳ Sơn – Hòa Bình, kết quả đạt được có độ tin cậy cao [2]

1.3.3 Giới thiệu phần mềm Matlab

Matlab (Matrix laboratory) là một công cụ phần mềm của Math Work, banđầu được phát triển nhằm phục vụ chủ yếu cho việc mô tả các nghiên cứu kỹ thuậtbằng toán học với phần mềm cơ bản là ma trận Trên cơ sở ban đầu đó, các nhà lậptrình đã phát triển phần mềm này để sử dụng cho các ngành khoa học như cơ học,vật lý, hóa học … đối với cả dữ liệu rời rạc và liên tục

Trong Matlab các câu lệnh viết sát với các mô tả kỹ thuật nên lập trình ngônngữ này thực hiện nhanh, đơn giản hơn so với nhiều ngôn ngữ thông dụng khác nhưPascal, Fortran … Đặc biệt Matlab cho phép đọc, xử lý và đưa tín hiệu đầu ra, đầuvào ngay trên các file Exel – rất tiện lợi cho quá trình xử lý tập số liệu phức tạp.Ngoài ra với ưu điểm cài đặt đơn giản, có thể liên kết được với các thư viện hỗ trợnhư Simulink, Fuzzy, Toolbox…., Matlab đã thực sự trở thành công cụ phổ biếnđắc lực trong các môi trường khác nhau [5, 7]

Với ưu thế là bộ chương trình phần mềm lớn trong lĩnh vực toán số và môphỏng, chúng tôi lựa chọn phần mềm Matlab để nghiên cứu lập phương trình hồiquy đa biến định lượng các hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim

Ở Việt Nam bằng ứng dụng phần mềm Matlab tác giả Nguyễn Văn Đông đãnghiên cứu phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính như sử dụng sai số trong phép đoquang, phương pháp bình phương tối thiểu cổ điển (CLS), phương pháp bình phương tốithiểu nghịch đảo (ILS), phương pháp bình phương tối thiểu từng phần

(PLS) để xác định đồng thời hai kim loại điển hình là sắt và mangan luôn đi kèmnhau trong các mẫu nước ngầm mà không phải tách và làm giàu, dựa trên phản ứngvới formandoxim [1]

Tác giả Đoàn Thị Hưng đã áp dụng kỹ thuật đa bước sóng và thuật toán hồiquy đa biến tuyến tính như phương pháp bình phương tối thiểu cổ điển (CLS),phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS), phương pháp bình phương tốithiểu từng phần (PLS) sử dụng phần mềm Matlab để xác định đồng thời sắt và titantrong xi măng và vật liệu chịu lửa bằng thuốc thử điantipyrin metan mà không phảitách và làm giàu cho kết quả tốt [3]

Kết hợp phổ hồng ngoại gần NIR với Chemometric đã trở thành một công cụmạnh mẽ cho ngành công nghiệp dược phẩm, phù hợp cho việc phân tích các hìnhthức dược phẩm cả dạng rắn và lỏng, cũng như trong ngành công nghệ sinh học.Đồng thời, quang phổ hồng ngoại gần còn có thể sử dụng trong quá trình kiểm soátchất lượng dược phẩm

Năm 2011, Mafalda Cruz Sarraguça và các cộng sự đã nghiên cứu xác địnhnhanh aminoglycosides bằng phép đo hồng ngoại gần mà không cần sử dụng cácphản ứng dẫn xuất hoặc xử lý mẫu Phương pháp này đã được phát triển dựa trênnền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulphate và ba tá dược là lactose, bộttalc và magie stearat Các mẫu tổng hợp và mẫu thêm đã được chế tạo cho mục đíchnày, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắn thương mại để thực hiệnviệc nghiên cứu xác định neomycin sulphate Mẫu được tiến hành đo phổ hồngngoại gần với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier Phương pháp hồi quy đabiến đã được sử dụng để hiệu chỉnh phổ hồng ngoại gần phù hợp với hàm lượng

neomycin sulphate Để kiểm tra hàm lượng neomycin sulphate trong các mẫuthương mại, người ta đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Kết quảthu được cho thấy neomycin sulphate đã được xác định thành công bằng phươngpháp đo phổ hồng ngoại gần với sai số 6,6% [22]

Đối với roxithromycin thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định Tuy nhiên phươngpháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký S.T.H.Sherazi đã sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác địnhroxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tíchthống kê đa biến Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống cònkhoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu [25]

Payal Roychoudhury và các cộng sự cũng đã ứng dụng thành công phương pháp

đo phổ hồng ngoại gần kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến để phân tích đồng thờiglycerol và clavulanic axit trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [24]

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu tập trung vào phân tích hai hoạtchất được sử dụng nhiều nhất trong nhóm glycoside tim là digoxin và digitoxin.Nhằm mục đích xây dựng quy trình phân tích hai hoạt chất này trong nguyên liệudược và dược phẩm

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để xây dựng qui trình phân tích xác định các hoạt chất nhóm glycoside tim bằngphương pháp hồng ngoại gần kết hợp với chemometrics cần giải quyết các vấn đề sau:

1 Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu để đo phổ hồng ngoại của hai hoạtchất digoxin và digitoxin

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần tá dược đến tín hiệu đo độ hấp thụ quang của chất phân tích trong vùng hồng ngoại

3 Nghiên cứu xây dựng thuật toán hồi qui đa biến tuyến tính: PLS, ILS, CLS,PCR, lựa chọn các thông số tối ưu của các mô hình sử dụng mẫu chuẩn, xây dựng

cơ sở dữ liệu về phổ hồng ngoại, xây dựng các mô hình đường chuẩn của phươngpháp thống kê đa biến

4 Đánh giá các thông số chính của phương pháp phân tích như giới hạn pháthiện, giới hạn định lượng, đánh giá độ lặp lại, độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn trênnền dược phẩm

5 So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệunăng cao)

6 Ứng dụng phương pháp nghiên cứu để định lượng nhanh thành phần hoạt chất trong các mẫu thuốc đang lưu thông trên thị trường

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

Nguyên tắc xác định hàm lượng hai hoạt chất digoxin và digitoxin trong dượcphẩm như sau:

Chuẩn bị ma trận hàm lượng chất chuẩn của 30 mẫu chuẩn đo độ hấp thụquang của các mẫu trên bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần, ghi ma trận phổ củacác mẫu trên ta được ma trận tín hiệu đo, đưa các ma trận này vào phần mềmMatlab, sử dụng các thuật toán hồi quy đa biến để thu được ma trận chuẩn và matrận kiểm tra Ta xây dựng được mô hình hồi quy đa biến

- KBr (sử dụng để đo phổ hồng ngoại Merck)

26

- Talc (99,2% khan, Nơi sản xuất Hungary)

- Magie stearat (99,3% khan, nơi sản xuất Hungary)

- Lactose (99,2% khan, Nơi sản xuất Mỹ)

- Thuốc viên Digoxin – Richter (hãng sản xuất GedeonRichter – Hungary)

- Thuốc viên Digoxine – Nativelle (hãng sản xuất Teofarma – Pháp)

2.2.2 Thiết bị

- Cân phân tích Sartorious độ chính xác ± 0,0001g

- Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer, dải bước sóng đo 7500-2800 cm-1

- Bộ dụng cụ ép viên: Agilent Technologies standard sampling kit (part no:Pike- 162- 1000)

- Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD –M10Avp

- Phần mềm Matlab 7.0: Chương trình hồi qui đa biến tuyến tính PLS, CLS,ILS và PCR để phân tích đồng thời các cấu tử trong cùng hỗn hợp

2.3 Phương pháp phân tích

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu

Quy trình chuẩn bị các mẫu chuẩn

Chuẩn bị 40 mẫu chứa hỗn hợp dược phẩm có tổng khối lượng là 3g với thànhphần: 0% – 0,3 % digoxin, 0% – 0,3 % digitoxin, 60 – 70 % lactose, 23 – 30 % talc,

7 – 9 % magie stearat, sau đó tiến hành xử lý mẫu theo quy trình 2.1

3 g mẫu

Nghiền và trộn 15 phút

3 mg hỗn hợp + 97 mg KBr

Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn

Mẫu phải được xử lý trong phòng có máy hút ẩm và mẫu sau khi trộn phải bảoquản trong bình hút ẩm để tránh sự hấp thụ nước Yêu cầu đối với viên nén phảitrong suốt

Quy trình chuẩn bị các mẫu thực

Cân 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình của một viên thuốc, sau đónghiền nhỏ trong vòng 5 phút, sau đó thực hiện quy trình như Hình 2.1

2.3.2 Phương pháp phân tích

Phép phân tích các glycoside tim được thực hiện bằng phương pháp đo phổhồng ngoại truyền qua ở bước sóng 2800 – 3000 cm-1 (đo phổ hấp thụ hồng ngoại ở

106 bước sóng)

Sau khi có được ma trận hàm lượng chất chuẩn và ma trận tín hiệu của 30 mẫuchuẩn và 10 mẫu kiểm tra Nhập các dữ liệu này vào phần mềm Matlab, dùng thuậttoán hồi quy đa biến trong Matlab để định lượng hai hoạt chất digoxin và digitoxin.Phép phân tích các glycoside tim cũng được thực hiện trên hệ sắc kí lỏng hiệunăng cao của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh: bộ điều khiển, lò cột, bộtrộn dung môi và detector photo-diode – array (PDA) đặt ở bước sóng 225 nm Cácđiều kiện chạy máy được tóm tắt như sau:

- Nhiệt độ cột 30oC

- Hệ pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O, kênh C là ACN

- Chế độ chạy đẳng dòng, với tốc độ pha động là 0,7ml/phút Tổng thời gian chạy 1 mẫu là 15 phút

2.4 Câu lệnh thực hiện hồi quy đa biến trong Matlab

Trong các phương pháp CLS, ILS, PLS, PCR chỉ có PCR phù hợp với quy trình phân tích:

- CLS gặp sai số do mô hình này tính toán trên cơ sở tập số liệu thô ban đầu,kết quả tính toán cuối cùng là kết quả tính toán trung bình nên toàn phổ phụ thuộcvào giá trị tuyệt đối của độ hấp thụ quang A mà giá trị này lại thay đổi theo từngphép đo và bị ảnh hưởng rất lớn của nền mẫu và của KBr

- Phương pháp ILS , sai số lớn do chỉ sử dụng một số giá trị hấp thụ tại một sốbước sóng đặc trưng do đó nếu số bước sóng lựa chọn không phù hợp sẽ gây ra nguồn saisố

- Mô hình PLS không phụ thuộc vào tập số liệu thô đưa vào mà phụ thuộc vàocác mô hình trung gian lựa chọn Tuy nhiên, khi áp dụng mô hình này lại có sai số rấtlớn, nguyên nhân do mô hình này giống với mô hình ILS chỉ sử dụng một số giá

trị số sóng đặc trưng nên mô hình trung gian tìm được chưa phù hợp với hệ 3 cấu tử.

Do vậy, chúng tôi chỉ sử dụng thuật toán PCR để phân tích tập số liệu

Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)

* Các bước tính toán PCR trong phần mềm Matlab:

- Nhập các ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE

+ Nhập ma trận hàm lượng chất chuẩn X0 (mxk) của m dung dịch chuẩn chứa

k cấu tử (m hàng, k cột)

+ Nhập ma trận tín hiệu phân tích Y0 (mxn) (n là số tín hiệu đo)

+ Nhập tín hiệu phân tích Y của mẫu cần định phân

- Lưu các dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : PCR.mat [6]

% Tu gia tri phan tram phuong sai cua cac PC, can cu vao yeu cau cu the cua

% bai toan de quyet dinh so PC lam co so cho khong gian moi cua tap so lieu

f = V(:,1:n);

% Chuyen doi tap so lieu ban dau va tinh ma tran he so hoi qui:

Yj = Y0*f;

F = inv(Yj'*Yj)*Yj'*X0;

Fj=f*F

% Nhap ma tran bien phu thuoc cua k mau can dinh phan va tinh nong do mau

% Nhap ma tran do hap thu quang cua mau kiem tra:Yktra

%Tinh nong do mau kiem tra theo PCR:

Xktra=Yktra*Fj;

%Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu PCR:

Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra ;

% TINH LOD, LOQ CUA PHUONG PHAP

%Nhap ma tran do lech chuan cua tin hieu do lap lai mau trang: Z

%Tinh toan cac gia tri LOD, LOQ theo PCR:

LOD=(3*Z)*Fj;

LOQ=(10*Z)*Fj;

do hap thu quang cua mau thuc: Y

X=Y*Fj;

- Lưu lại M-file vừa thực hiện được: PCR.m

- Gọi hàm M-file vừa viết được trong cửa sổ COMMAND WINDOW :

>> PCR