Nghiên cứu tách và định lượng beta sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội

Hợp chất β-sitosterol là một được tìm thấy nhiều trong thực vật trong đó có cả cây lô hội, nó làhợp chất phi dinh dưỡng hay còn có tên là hóa chất thực vật, với các chức năng cơbản giống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -

Trần Thị Khánh Hòa

NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BETA-SITOSTEROL TRONG CÂY LÔ HỘI

VÀ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY LÔ HỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2018

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Trần Thị Khánh Hòa

NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BETA-SITOSTEROL TRONG CÂY LÔ HỘI

VÀ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY LÔ HỘI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS ĐỖ THỊ VIỆT HƯƠNG PGS.TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – Năm 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới

TS Đỗ Thị Việt Hương, Bộ môn Hoá dược – Khoa Hoá học – Đại học Khoa học tựnhiên – ĐHQG Hà Nội và PGS.TS Tạ Thị Thảo, Bộ môn Hoá phân tích – Khoa Hoáhọc - Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, đóng gópnhững ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thựchiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học,đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá phân tích, đã cho em những kiến thức quýgiá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Hoá dược đãgiúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2018

Trần Thị Khánh Hoà

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH VẼ vii

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về lô hội 3

1.1.1 Mô tả thực vật 3

1.1.2 Sự phân bố 4

1.1.3 Thành phần hóa học của lô hội 4

1.1.4 Nghiên cứu dược lý của cây Lô hội 6

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp chiết tách β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội 14

2.3.2 Phương pháp phân tích 18

2.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích 19

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu 19

2.4.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 19

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Tối ưu điều kiện xác định trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 21

3.1.1 Khảo sát thành phần pha động 21

3.1.2 Khảo sát tốc độ dòng của pha động 23

3.1.3 Khảo sát độ lặp lại của thiết bị 24

3.1.4 Điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích β-sitosterol 26

3.2 Tối ưu quá trình tách chiết β-sitosterol từ cây Lô hội 26

3.2.1 Khảo sát cấu trúc các hợp chất phân lập được từ các cặn chiết 26

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết mẫu lô hội thô ban đầu 29

3.3 Đường chuẩn xác định β-sitosterol 31

3.3.1 Dựng đường chuẩn 31

3.3.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 32

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích 33

3.4.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu 33

3.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 34

3.5 Phân tích mẫu thực tế 37

KẾT LUẬN 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

v

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thành phần hoá học của cây Lô hội

Bảng 3 1 Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của β-sitosterol

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H1

Bảng 3 3 Diện tích pic phân tích β-sitosterol trong các hệ dung môi chiết khác nhau

Bảng 3 4 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của β-sitosterol

Bảng 3 5 Bảng kết quả LOD, LOQ của β-sitosterol

Bảng 3 6 Độ lặp lại quy trình phân tích β-sitosterol trong mẫu lô hội thô

Bảng 3 7 Kết quả diện tích pic đánh giá hiệu suất thu hồi β-sitosterol

Bảng 3 8.Kết quả hiệu suất thu hồi xác định β-sitosterol

Bảng 3 9.Kết quả phân tích mẫu lô hội thực tế

Bảng 3 10 Hàm lượng β-sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1 1 Cây lô hội được tác giả trồng tại vườn nhà thuộc tỉnh Nam Định và thu

hoạch để làm mẫu nghiên cứu 3

Hình 1 2 Vỏ ngoài và lớp gel của cây lô hội 3

Hình 1 3 Cấu trúc của các hợp chất anthraquinone tìm thấy trong gel lô hội 6

Hình 1 4 Các hợp chất phytosterol có trong gel lô hội 7

Hình 1 5 Cấu trúc của hợp chất β-sitosterol 8

Hình 2 1 Mẫu lá cây lô hội 13

Hình 2 2 Quy trình điều chế các cặn chiết n-hexan 15

Hình 2 3 Sắc ký lớp mỏng TLC khảo sát cặn chiết EH 17

Hình 2 4 Phân tách các phân đoạn cặn chiết n-hexan (EH) 18

Hình 3.1 Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 22

Hình 3.2 Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung môi MeOH/AcOH 0,1% 22

Hình 3.3 Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 0,6 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 23 Hình 3.4 Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 23 Hình 3.5 Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 1 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 24 Hình 3 6 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 1 25

Hình 3 7.Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 2 25

Hình 3 8 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 3 25

Hình 3 9 Phổ 1H NMR (CDCl3) của chất H1 27

Hình 3 10 Phổ DEPT của chất H1 27

Hình 3 11 Cấu trúc của H1: 3β-Stigmast-5-en-3-ol. 28

Hình 3 12 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu lô hội 29

Hình 3 13 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết MeOH tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 30

vii

Hình 3 14 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết EtOH tại tốc độ dòng 0,8

ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1%

Hình 3 15 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ β-sitosterol

Hình 3 16 Sắc đồ HPLC mẫu trắng thiết bị

Hình 3 17 Sắc đồ HPLC mẫu không chứa β-sitosterol

Hình 3 18 Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lượng β-sitosterol 5 ppm

Hình 3 19 Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lượng β-sitosterol 10 ppm

Hình 3 20 Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lượng β-sitosterol 20 ppm

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

chromatographykl/kl

ix

MỞ ĐẦU

Nước Việt Nam chúng ta nằm trong vùng nhiệt đới cho nên những điều kiệnkhí hậu như nhiệt độ, lượng mưa, ánh sáng…và hơn hết điều kiện thổ nhưỡng đặctrưng thích hợp cho nhiều loài thực vật có giá trị tồn tại và phát triển Đó là nguồntài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được Từ thời xa xưa chođến xã hội loài người hiện nay đều khai thác nguồn tài nguyên này để làm thựcphẩm, thuốc chữa bệnh, các vật liệu cũng như nhiên liệu cho cuộc sống thườngngày

Lô hội là một loại thực vật được sử dụng nhiều y học cổ truyền thuộc họ

Liliaceae Hơn 360 loài lô hội được biết đến, trong đó loài Aloe vera Linne.var Sinensis Beger tức cây lô hội lá nhỏ là loài duy nhất được tìm thấy ở Việt Nam [4].

Lô hội có hai phần chính, phần lá xanh bên ngoài chứa phần lớn các hợp chấtanthraquinon, được sử dụng như một loại thuốc xổ và thuốc tẩy nhẹ; phần thứ hai

là một lớp gel màu sáng được dùng làm thực phẩm, chữa trị vết bỏng nhiệt hay cácvết thương khác [18, 22]; trị viêm da hay các vết thương do côn trùng cắn [13, 19];viêm khớp, mụn trứng cá, bệnh gout [7]; hen suyễn, bệnh do nấm Candida, chứngmệt mỏi mãn tính, eczema, viêm loét, rối loạn tiêu hóa [19, 27, 37] Hợp chất β-sitosterol là một được tìm thấy nhiều trong thực vật trong đó có cả cây lô hội, nó làhợp chất phi dinh dưỡng hay còn có tên là hóa chất thực vật, với các chức năng cơbản giống như cholesterol trong động vật như điều chỉnh tính lưu động của màng

tế bào thực vật và các chức năng khác trong thực vật Các hoạt động chức năng gan

(GDP, GOP) có thể được cải thiện với β-sitosterol [39], và điều này có thể làm giảm ung thư tuyến tiền liệt và tăng trưởng tế bào ung thư ruột kết [7, 12] β-sitosterol cũng được chứng minh làm ức chế khả năng tăng glucose trong máu trong thí

nghiệm trên chuột được gây bệnh tiểu đường type 2 do streptozotocin gây ra [23]

Do tính chất sử dụng rộng rãi của cây lô hội hiện nay cũng như tác dụng hữu

ích của hợp chất β-sitosterol có trong cây lôi hội, nên nhiều công trình khoa học

nghiên cứu về loài cây này Để góp phần vào việc nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị

sử dụng của lô hội, chúng tôi chọn đề tài: ―Nghiên cứu tách và định lượng

β-1

sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội‖ và từ đó đưa ra hướng khai

thác, ứng dụng loài lô hội này trong lĩnh vực thực phẩm chức năng Vì vậy, mục tiêucủa đề tài nhằm:

1 Xây dựng quy trình tách và định lượng β- sitosterol từ dịch chiết cây lô

hội

2 Từ đó đánh giá hàm lượng β- sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ

cây lô hội

2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về lô hội

Aloe vera thuộc họ lô hội (L.var.chinesis (Haw) Berger), chi Aloe Chi Aloe

là chi quan trọng và được biết đến nhiều nhất, gồm hơn 400 loài, trong đó chỉ có 4loài được sử dụng làm thuốc bổ dưỡng và chữa bệnh, một số loài có độc tố Hai

loài được chú ý nhiều nhất là Aloe Ferox Mill và Aloe Vera [11] Theo sách ―Cây

cỏ Việt Nam‖ của Phạm Hoàng Hộ thì Aloe ở nước ta chỉ có 1 loài là Aloe Vera L.sinensis.Beger tức là cây lô hội lá nhỏ [4].

Hình 1 1 Cây lô hội được tác giả trồng tại vườn nhà thuộc tỉnh Nam

Định và thu hoạch để làm mẫu nghiên cứu

1.1.1.Mô tả thực vật

Theo Võ Văn Chi (1991), Đỗ Thanh Hội (1997), lô hội là 1 loại cây mọngnước, sống lâu năm, không có thân hoặc thân rất ngắn, thân ngắn hóa gỗ, lá màuxanh không cuống, mọc sát nhau Lá dài, dễ gẫy và có gai hai bên mép, trên mặt cónhững đốm trắng [2, 3]

Lô hội trưởng thành có lá mập, dài 30-50 cm, rộng 5-10 cm, dày 1-2 cm Lá lôhội gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp xanh, khi cắt ngang chảy ra nhựa màu vàng

dạng gel Hoa nở vào mùa thu và hè, mọc thành chùm dài màu vàng lụchoặc phớt hồng Quả nang có hình bầu dục, lúc đầu có màu xanh, sauchuyển sang vàng Ở Việt Nam, lô hội thường được trồng làm cảnh; lá,

có biên độ sinh thái khá rộng, thích nghi với nhiều loại đất, kể cả đất cát pha hoặcchỉ có cát Chúng chịu hạn và khô nóng rất giỏi vì chúng có khả năng tồn trữ nướctrong lá, sinh trưởng phát triển mạnh trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ và ra hoaquả nhiều

1.1.3 Thành phần hóa học của lô hội

Có rất nhiều nghiên cứu tập trung phân lập các hợp chất trong Aloe vera vàkiểm tra các đặc tính dược phẩm của chúng Aloe vera gel được báo cáo chứa chủyếu các glycoprotein, anthraquinones, saccharides và chất có trọng lượng phân tửthấp [33] Các hợp chất anthraquinoes được nhận dạng trong lô hội là aloin, aloe

emodin, balaloin và emodin (bảng 1.1) với các cấu trúc thể hiện trong hình 1.3 [38].

4

Nhóm chất

Anthraquinones/anthrone

cả các hợp chất hữu

cơ và chất béo

Axit amin

Protein

Hình 1 3 Cấu trúc của các hợp chất anthraquinone tìm thấy trong gel lô hội

1.1.4 Nghiên cứu dược lý của cây Lô hội

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các polysaccharides trong lô hội cókhả năng kiểm soát lượng đường trong máu, kích thích sản xuất chất chống oxyhóa của cơ thể và giảm cholesterol Nó làm giảm lượng đường và triglycoside chobệnh nhân tiểu đường [19, 21, 22,24]

Nước Aloe vera giúp tăng cường hấp thu các chất dinh dưỡng và duy trì cânbằng lượng đường trong máu bằng cách cải thiện hoạt động tiêu hóa Aloe vera cóthể tăng cường tác dụng các loại thuốc hoặc các chế phẩm thảo dược được sử dụngvới insulin cho bệnh đái tháo đường [36]

Nghiên cứu ảnh hưởng của Aloe vera lên đường huyết và lipid đã cho thấykết quả khác nhau trên các mô hình động vật khác nhau Trong mô hình động vậtgặm nhấm, kiểm soát mãn tính của Aloe vera với alloxan (chất phá hủy tế bào betacủa tuyến tụy - nơi tiết ra insulin) dẫn đến giảm đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểuđường Mức độ insulin trong máu, huyết tương lúc đói và làm giảm nồng độcholesterol, triglycerid và acid béo tự do trong huyết tương, gan và thận của chuột

bị tiểu đường [23, 26, 31]

Trong nghiên cứu thử nghiệm của Kim và cộng sự, tác dụng trị đái tháo đườngcủa Aloe vera gel đã được nghiên cứu trên chuột bệnh béo phì (DIO) Uống gel giảmnồng độ đường trong máu đến mức độ bình thường, giảm đáng kể insulin huyết tương,

và hạ mức chất béo trung tính trong gan và huyết tương của chuột DIO [24]

Năm 2006, Tanaka Mvà cộng sự thuộc phòng thí nghiệm nghiên cứu SinhHóa, Kanagawa, Nhật Bản trong nghiên cứu đánh giá tác dụng chống tăng đườnghuyết của Aloe Vera đã tách được một số hợp chất từ gel Trên cơ sở dữ liệu quangphổ, các hợp chất này được xác định thuộc nhóm phytosterol gồm lophenol, 24-methyl-lophenol, 24-ethyl- lophenol, cycloartanol, và 24 - methylene –cycloartanol [35]

H

H

HO

H H

1.2 Tổng quan về β-sitosterol

β-sitosterollà mọ ̂tphytosterol, khối lượng mol phân tử 414,718g/mol trong thiên nhiên thường ở dạng

ester ho ặc glycoside (hai dangg̣ này dê ̃hòa tan ho ̛n), hoặc ở dạng đo ̛n hay phối hơpg̣ với các phytosterol khác

β-sitosterol có cấu trúc hoá học tương tự như cholesterol β-β-sitosterol có màu trắng, dạng tinh thể và có mùi đặc

trưng, không tan trong nước nhưng tan trong ancol [8].

β-sitosterolcũng được tìm thấy trong các loài lô hội, nó có cấu trúc hoá học

tương tự cholesterol, trong phân tử có chứa 1 liên kết đôi rất dễ bị oxi hoá từ đóđược đặc trưng bởi đặc tính chống ung thư và chống xơ vữa Nó có tác dụng làmgiảm cholesterol trong máu do phong toả sự hấp thu cholesterol, kích thích chức

năng miễn dịch, kiểm soát sự tăng sinh tế bào Ngoài ra, β-sitosterol còn làm giảm lượng đường trong máu và là tác nhân kháng khuẩn, kháng vi rút và kháng nấm β- sitosterol có nhiều trong giới thực vật và đã được tìm thấy trong các loại hạt, quả

bơ, hạt bông, lúa mì [8, 15, 29, 32]

β-sitosterolcòn là một trong những thành phần chính của một số loại thảo

dược, nó có tác dụng kiểm soát hàm lượng cholesterol, giảm hoạt động của tế bàoung thư, thúc đẩy sức khoẻ tuyến tiền liệt, tăng khả năng miễn dịch trong cơ thể

người β-sitosterol cũng đã được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng

cao từ một số loại thảo mộc và dầu thực vật [20]

Hình 1 5 Cấu trúc của hợp chất β-sitosterol

8

Trong một nghiên cứu đánh giá về khả năng kháng viêm của β-sitosteroltrên loài chuột, các tác giả tiến hành nghiên cứu khả năng kháng viêm của β- sitosterolvới hội chứng phù nề chân của chuột, chuột phù tai và viên màng phổi ở

chuột Các kết quả thu được đều cho thấy tác dụng ức chế từ 50% đến 70% vớichuột phù nề chân, với chuột viêm phổi thì lượng dịch giảm tới 46%, còn với chuộtphù tai khả năng ức chế là 75% Từ các kết quả cho thấy khả năng kháng viêm của

β-sitosterolkhá tốt [46].

1.3.Tổng quan về phương pháp tách và định lượng β-sitosterol

Một số nghiên cứu đã tách và xác định hàm lượng β-sitosterol cùng với các

sterol thực vật khác bằng các phương pháp sắc kí khí thường hoặc có kết nối nhưkết nối với đầu dò ngọn lửa, hoặc kết hợp khối phổ có kĩ thuật ion hoá điện tử như

2 nghiên cứu được trình bày dưới đây:

TheoSorenson WR và Sullivan D [40]thì β-sitosterolđược tách ra từ cây Saw

Palmetto và được định lượng bằngphương pháp sắc kí khí với đầu dò ion hoá ngọnlửa(GC-FID) Mẫu cây Saw Palmetto sau khi thực hiện xà phòng hoá ở nhiệt độ caovới dung dịch KOH và dung môi ethanol, phần không xà phòng hoá có chứa nhữngphytosterol được chiết với toluene Sau đó được mang đi định lượng bằng phương

pháp sắc kí khí với đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC-FID) Hàm lượng của β-sitosterol được phát hiện ở nồng độ khá lớn, đường chuẩn xác định β-sitosterol cho hệ số

tương quan lớn hơn hoặc bằng 0,995, với độ lệch chuẩn tương đối RSD là 1,39 10,5%, hiệu suất thu hồi từ 85 – 103%

-Trong một nghiên cứu khác [43], cholesterol và 4 phytosterol trong đó sitosterol đã được xác định trong thực phẩm không dẫn xuất (dầu thực vật, trứng,

cóβ-sữa, nước giải khát) bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ có kết hợp kĩthuật ion hoá điện tử (GC-EI-MS/MS) Các mẫu phân tích được xà phòng hoá vớiKOH 7,5% trong methanol, đun nóng trong thời gian 60 phút để quá trình xà phònghoá xảy ra hoàn toàn Dung dịch thu được đem chiết với hỗn hợp n-hexane/ ete dầuhoả (50:50,v/v) Dịch chiết thu được tiến hành cô quay chân không để đuổi bớtdung môi sau đó rửa giải với tetrahydrofuran Lớp tetrahydrofuran được lọc vớimàng lọc 0,22mm và bơm vào hệ thống GC Giới hạn định lượng với cholesterol và

4phytosterol là 2 mg/kg Hiệu suất thu hồi của cholesterol và 4 phytosterol từ thực phẩm trong khoảng 91% đến 100% [42].

Trong một nghiên cứu khác [45], β-sitosterol và cholesterol đã được chiết

tách và xác định hàm lượng từ các mẫu dầu đậu tương và dầu hướng dương Trongnghiên cứu, các tác giả đã đồng nhất các mẫu dầu với Triton X-100, sau đó thêmmethanol để tạo 2 pha Sau đó tiến hành li tâm để thu được phần chiết Triton X-

100, sau đó được xử lí bằng hỗn hợp nước và chloroform (1000 μL:300 μL) đểchiết chất phân tích trong pha chloroform bằng hệ thống rung siêu âm Sau khi lytâm, lớp chloroform được bơm vào hệ thống GC-FID Sự ảnh hưởng của một sốyếu tố đến kết quả phân tích đã được đánh giá Trong quá trình tối ưu hoá các điềukiện thực nghiệm, khoảng tuyến tính của phương trình đường chuẩn trong khoảng1,0 – 30,0 mg/L, với hệ số tương quan là 0,994 cho các chất phân tích Giới hạnphát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,2 – 0,7 mg/L Giới hạn định lượngtrong khoảng 0,7 – 2,4 mg/L Trong cùng ngày, độ lệch chuẩn tương đối trongkhoảng 1,0 đến 2,7% Các điều kiện phân tích đã được áp dụng thành công và cho

kết quả đáng tin cậy trong việc xác định hàm lượng β-sitosterolvà cholesterol trong

mẫu dầu đậu nành và dầu hướng dương Hiệu suất thu hồi trung bình dao động từ93,6% đến 105,0%

Ngoài ra β-sitosterolcòn được định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng,

sau đó định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, hoặc định lượngbằng sắc kí lỏng hiệu năng cao với các loại detector, và các loại dung môi pha độngkhác nhau như:

Susmlta Chawla và Yogendra Kumar Bansal [41] đã định tính và định lượng

β-sitosterol từ việc nuôi cấy in vitro vỏ thân và vỏ của cây Helicteres Isora L Trongnghiên cứu này, dung môi chiết axetone được sử dụng cho phương pháp sắc kí lớpmỏng với thành phần pha động là toluene : diethyl ether : ethylacetate : axit acetic

(80:10:10:0,2) đã định tính được sự có mặt của β-sitosterol Sau đó sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng được β-sitosterol tại bước sóng 196nm.Hàm lượng β-sitosterol tối đa được xác định trong thân và vỏ

của cây Helicteres Isora L bằng nuôi cấy in vitro là 0,18%

10

Một báo cáo cũng đã được đưa ra về sử dụng phương pháp HPLC để phân

tích β-sitosterol trong một số dược liệu và dầu thực vật Báo cáo cho thấy phương pháp HPLC là phương pháp thích hợp để xác định β-sitosterol Một số điều kiện về

thành phần pha động đã được bài báo đưa ra với các mẫu phân tích khác nhau

Phân tích hàm lượng sitosteroltrong mẫu sitosterolchuẩn và viên nén sitosterolđược thực hiện với thành phần pha động là 100% acetonitril ở pH 6,5 cho

β-thấy thời gian lưu là 67,25 và 67,89 Với thành phần pha động là 95% acetonitrile

và 5% ethanol cho thấy thời gian lưu đều là 55,75 với 85% acetonitrile và 15%ethanol cho thấy thời gian lưu lần lượt là 36,23 và 36,81 Trong một số loại dầu

thực vật, khi xác địnhβ-sitosterolthì tài liệu cũng đưa ra thời gian lưu như: với dầu

mầm lúa mì là 36,91; dầu hạt bông là 36,21; dầu đậu phộng 36,12 [41]

Nair VD, Kanfer I và Hoogmartens J[42] đã định lượng đồng thời stigmasterol, β-sitosterolvà stigmastanol trong các loại thảo dược bằng phương

pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector ELSD Các hợp chất được xác định trên

hệ thống HPLC, pha tĩnh là cột C18, pha động là methanol: nước (95:5 v/v), tốc độdòng 1ml/phút, với thời gian lưu là 12 phút Trong nghiên cứu các tác giả đã sửdụng cholesterol (50 microg/ml) là chất chuẩn nội, methanol là dung môi chiết tách.Các thông số giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là 2 và 5microg/ml Giá trị độ lệch chuẩn (%RSD) 3%, hiệu suất thu hồi từ 97 đến 103% khiphân tích 5 sản phẩm thảo dược Từ đây, các tác giả đã nhận định phương pháp này

có thể được dùng để khảo sát các sản phẩm thảo dược có sẵn công thức nhằm kiểmsoát chất lượng sản phẩm

Bên cạnh đó β-sitosterolcũng được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng

hiệu năng cao với kĩ thuật ion hoá tia điện và kết hợp với khối phổ như ở nghiêncứu sau đây: Hàm lượng các phytosterol tự do (cholesterol, ergosterol, stigmasterol,

β-sitosterol) đã được xác định từ lá cây thuốc lá bằng phương pháp sắc kí lỏng siêu

hiệu năng với kĩ thuật ion hoá tia điện kết hợp với khối phổ Việc tách 4 phytosterol

hoá tại áp suất khí quyển (API) được sử dụng kết hợp với phổ khối cho thấy hiệuquả cao trong việc phân tích Quá trình định tính và định lượng các chất phân tíchđược thực hiện ở chế độ khảo sát đa phản ứng (MRM), từ đó cho hiệu suất thu hồi

khả quan, dao động từ 86,3% đến 106,4% ở nồng độ thấp trong lá thuốc lá Độchính xác của phép đo trong ngày và độ chính xác của phép đo giữa các ngày trongkhoảng 0,43% và 2,42% Giới hạn định lượng (LOQ) là 4,8 đến 9,7 ng/mL Từ đónhóm tác giả nhận định đây là phương pháp đơn giản, có độ nhạy cao, thời gianphân tích nhanh cho quá trình phân tích các phytosterol tự do trong lá thuốc lá [44].

Như vậy trong rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nguồn gốc thực vật của sitosterol, như có trong các loại hạt, quả, và đặc biệt có trong cây lô hội, một loại

β-cây rất dễ trồng và được trồng khá phổ biến ở Việt Nam, cùng với những lợi ích

đáng kể của β-sitosteroltrong hỗ trợ điều trị một số chứng bệnh, chúng tôi nhận thấy việc phân tích đánh giá hàm lượng β-sitosteroltrong dịch chiết cây lô hội và cây lô

hội là rất cần thiết Theo điều kiện phòng thí nghiệm cùng với việc nghiên cứu cáctài liệu tham khảo, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng caolàm phương pháp phân tích Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1200,

tích bằng phương pháp HPLC chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố thành phần

pha động và thời gian lưu của chất phân tích Để tách β-sitosterolra khỏi cây lô hội

chúng tôi dự kiến chiết bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi phâncực như các ancol, và chúng tôi dự kiến khảo sát các loại dung môi chiết để phân

tách β-sitosterol.

12

CHƯƠNG 2 -NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần gel của lá cây lô hội được nuôi trồng ở vườnnhà tại tỉnh Nam Định và được thu hái vào tháng 9/2017

Hình 2 1 Mẫu lá cây lô hộiMẫu thực vật được xác định là loài Aloe Vera Linne var Sinensis Beger bởigiáo sư Nguyễn Thế Nhã, Khoa Quản lý tài nguyên rừng và môi trường, ĐH LâmNghiệp, Hà Nội kết hợp với tham khảo tài liệu

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

+) Thiết bị

với ống ly tâm 50 mL

+) Chất chuẩn

Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ tinh khiết của hợp chất

đã được xác định bằng các phương pháp vật lý

chuẩn β-sitosterol bằng cân phân tích có độ đọc là 0,0001g, hòa tan và định mức tới

+) Các loại hóa chất, dung môi khác:

Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid acetic băng (Merck),ethylacetat (Trung Quốc), n-hexan (Trung Quốc) Nước cất hai lần, nước cất deion

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết tách β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội

2.3.1.1 Điều chế các cặn chiết từ dịch chiết cây lô hội β-sitosterollà một hợp chất thuộc nhóm steroid, có độ phân cực thấp, vì vậy

nó tan tốt trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực kém như benzene, diethylether, n-hexan, toluene, chloroform, ancol Lá lô hội có đặc điểm có lớp vỏ khá dày

và phần gel chứa một lượng nước khá lớn, đồng thời là mẫu thực vật có chứa rấtnhiều các hợp chất hữu cơ thuộc các lớp chất khác nhau như phân cực trung bình vàrất phân cực, vì vậy việc loại bớt các hợp chất này là cần thiết để làm giảm khả năngảnh hưởng của chúng đến quá trình phân tích, từ đó việc chọn phương pháp chiếtlỏng-lỏng là phù hợp Do trong mẫu thực vật có chứa nhiều các hợp chất hữu cơ nêntrước hết phải dùng một dung môi có độ phân cực cao để tách toàn bộ phần

14

hữu cơ ra khỏi phần vô cơ và các chất xơ của mẫu thực vật Từ đó chúng tôi tiếnhành khảo sát loại dung môi chiết mẫu thô ban đầu, cụ thể là 2 loại dung môiethanol và methanol Sau đó tiến hành chiết dịch chiết ethanol và methanol vớidung môi có độ phân cực kém Qua tham khảo các tài liệu 42, chúng tôi lựa chọndung môi chiết lần 2 là n-hexan và khảo sát cấu trúc của các hợp chất có thể phânlập từ các cặn chiết n-hexan Quy trình điều chế cặn chiết n-hexan được thể hiện ở

sơ đồ dưới đây:

Hình 2 2 Quy trình điều chế các cặn chiết n-hexan2.3.1.2 Xử lí mẫu nghiên cứu

Thu hái khoảng 2 kg lá lô hội, rửa sạch, tráng bằng nước cất sau đó phơi khôtrong bóng râm cho ráo nước trong Tách lấy phần gel lô hội khỏi lớp vỏ xanh, phần

ngâm gel lô hội thô trong 2 loại dung môi là methanol và ethanol, rung siêu âm 30

đó lọc lấy dịch chiết 3 lần và gộp dịch chiết Tiến hành cô quay dịch chiết ở áp suấtthấp để loại bớt dung môi (Büchi, Rotavapor R215) Các dịch chiết methanol vàethanol thu được lại mang chiết với dung môi n-hexan Dịch chiết này lại được côquay ở áp suất thấp để loại bớt dung môi thu được các cặn chiết ở dạng cao lỏngtương ứng n-hexan là cặn EH Sau đó tiến hành xác định thành phần và phân tíchhàm lượng trong cặn EH

2.3.1.3 Phân lập β-sitosterol từ cặn chiết cây lô hội β-sitosterol là một hợp chất thuộc nhóm steroid, có độ phân cực thấp, vì vậy

theo dự đoán hợp chất này sẽ nằm chủ yếu trong cặn chiết n-hexan EH, nên chúngtôi tiến hành phân lập β-sitosterol từ cặn chiết EH

Trước khi thực hiện phân lập β-sitosterol từ cặn chiết n-hexan (EH) bằng

phương pháp sắc ký cột thường CC, việc khảo sát hệ dung môi tách tốt nhất trên sắc

ký lớp mỏng TLC để có thể thu được các hợp chất tinh khiết là điều cần thiết Tiếnhành khảo sát các cặn chiết trên sắc ký lớp mỏng TLC: sử dụng bản mỏng silica geltráng DC Alufolien 60F254 để khảo sát hệ dung môi tách tốt nhất cho các cặn chiết.Sau khi triển khai sắc kí, quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại (bước sóng  =

các vết tách hiện trên TLC, nhận thấy cặn chiết EH tách tốt nhất với hệ dung môi hexan/etylacetat 19:1 (v/v) Sau đó tiến hành tách cặn chiết thành các phân đoạntrong trên sắc kí cột nhồi silicagel bằng phương pháp rửa giải gradient với hỗn hợpdung môi khác nhau, và triển khai sắc kí lớp mỏng TLC để gom các phân đoạngiống nhau

n-16

EH7 Tiếp tục tiến hành phântách nhóm phân đoạn bằng sắc kí cột nhanh FC trên chất hấp phụ silicagel, dung

EH2.3) và

EH3.4), sau một thời gian để bay hơi hoàn toàn dung môi ở nhiệt độphòng, ở phân đoạn EH3.3 có xuất hiện các tinh thể bám lên thành ống nghiệm,chúng tôi có thu các tinh thể này vào ống eppendorf, kí hiệu tinh thể thu đƣợc làH1 Quá trình phân tách dịch chiết và các nhóm phân đoạn của cặn chiết EH đƣợc

tóm tắt trong hình 2.4.

Hình 2 4 Phân tách các phân đoạn cặn chiết n-hexan (EH)

Tốc độ dòng pha động: 0,8mL/phút

Hệ dung môi pha động ACN:AcOH 0,1%

18

2.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu

Các điều kiện tối ưu trên hệ thống phân tích sử dụng cũng như quá trình xử

lý mẫu đã được khảo sát theo phương pháp đơn biến

Trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, pha động ảnh hưởng tới quátrình tách các chất và tín hiệu của chất phân tích Với kĩ thuật sắc ký lỏng hiệu năngcao, khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic có thể cho thêm vào để tăng

độ ion hóa của phân tử, do vậy các chất này được sử dụng trong pha động Bêncạnh đó, cột tách sử dụng là cột C30, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môiphân cực nên chúng tôi đã khảo sát 2 hệ dung môi pha độngACN:AcOH 0,1% vàMeOH:AcOH0,1%

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, chúng tôi khảo sát tốc độ dòng củapha động Tốc độ pha động ảnh hưởng đến thời gian rửa giải và lượng dung môitiêu tốn Nếu tốc độ dòng lớn thì quá trình tách các chất trong mẫu sẽ kém hiệu quả,các chất chưa đủ thời gian để tách ra khỏi nhau mà đã ra khỏi cột phân tích Nếu tốc

độ dòng quá nhỏ, thời gian phân tích kéo dài, không hiệu quả vê mặt thời gian chocác nhà phân tích Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ở tốc độ pha động 0,6mL/phút; 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút

2.4.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Phương pháp phân tích thể hiện tính đúng đắn trước tiên phải thể hiện độ lặplại Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khichọn các điều kiện tối ưu Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tíchcủa cấu tử trong dung dịch khảo sát Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới

hạn tuyến tính của đường chuẩn β-sitosterol đã chọn Mẫu được bơm vào hệ 3 lần

sau đó lấy diện tích pic và tính được giá trị % RSD Giá trị này đánh giá độ lặp cầnkhảo sát

Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ưu, tiến hành dựng đường chuẩn sitosterol đã khảo sát, thu được phương trình đường chuẩn Đánh giá sai số hệ

β-thống qua các hệ số của phương trình hồi quy và kết luận Sau khi thu đượcphương trình hồi quy mới tiến hành phân tích mẫu thực tế