Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh dạng hạt có khả năng kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn bacillus megaterium VACC 118 và chất mang được xử lý chiếu xạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH DẠNG HẠT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG TỪ VI KHUẨN Bacillus mega

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH

DẠNG HẠT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH

SINH TRƯỞNG TỪ VI KHUẨN Bacillus megaterium VACC

118 VÀ CHẤT MANG ĐƯỢC XỬ LÝ CHIẾU XẠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH

DẠNG HẠT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH

SINH TRƯỞNG TỪ VI KHUẨN Bacillus megaterium VACC

118 VÀ CHẤT MANG ĐƯỢC XỬ LÝ CHIẾU XẠ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN MINH QUỲNH

PGS TS BÙI THỊ VIỆT HÀ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Chiếu xạ

Hà Nội (Viện Năng lƣợng nguyên tử Việt Nam) đã tạo mọi điều kiện để tôi được

học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Minh Quỳnh đã tận tình chỉ

bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

và thực hiện luận văn này Xin cảm ơn các nghiên cứu viên phòng Nghiên cứu

Công nghệ Bức xạ đã giúp đỡ và thảo luận với tôi trong suốt quá trình tiến hành thí

nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà đã luôn

đồng hành cùng tôi tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, chia sẻ với tôinhững kỹ năng, kinh nghiệm trong suốt quá trình nghiên cứu và góp ý cho tôi đểhoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, TrườngĐại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Visinh vật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian họctập và thực tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã tạocho tôi động lực và điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn này

Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài Khoa học và Côngnghệ cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN 19/16 do TS Trần Minh Quỳnh làm chủnhiệm

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viênNguyễn Thị Thu Thủy

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cây phát sinh của một số loài thuộc chi Bacillus căn cứ vào trình tự 16S

rRNA [49] 10

Hình 2 Bố trí hệ thống thiết bị tạo hạt phân bón 25

Hình 3 Quy trình sản xuất phân bón vi sinh vật dạng hạt 26Hình 4 Hạt phân bón được tạo ra từ thiết bị tạo hạt và thành phẩm sau khi sấy khô34

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Một số nhóm VSV sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh 5

Bảng 2 Thành phần hóa học của rỉ đường mía [13] và nước chiết đậu [12] 12

Bảng 3 Nồng độ muối khoáng cần thiết đối với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn 13

Bảng 4 Điều kiện nhân sinh khối đối với B.megaterium VACC 118 20

Bảng 5 Các môi trường nuôi cấy và nhân sinh khối vi khuẩn 21

Bảng 6 Hỗn hợp đệm pH pha môi trường nước chiết đậu 23

Bảng 7 Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát triển của B.megaterium VACC 118 28

Bảng 8 Ảnh hưởng của pH và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát triển của B.megaterium VACC 118 29

Bảng 9 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA 30

Bảng 10 Ảnh hưởng của lượng khí cấp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA 31

Bảng 11 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA 32

Bảng 12 Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp 1 đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA 33

Bảng 13 Chất lượng của phân vi sinh vật dạng hạt 35

Bảng 14 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến mật độ tế bào trong hạt phân bón 35 Bảng 15 Tỉ lệ sống sót của B.megaterium trong hạt phân bón sau thời gian bảo quản 36

Bảng 16 Ảnh hưởng của phân vi sinh dạng hạt đến đặc điểm nông học của cà chua .37

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về phân bón vi sinh vật 4

1.1.1 Định nghĩa phân bón vi sinh vật 4

1.1.2 Phân loại phân bón vi sinh 4

1.1.3 Vai trò của phân bón vi sinh với cây trồng 6

1.1.4 Hạn chế của phân bón vi sinh 7

1.2 Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với đất trồng và sự sinh trưởng phát triển của thực vật 8

1.3 Vi sinh vật sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật Bacillus megaterium 9

1.4 Một số đặc điểm nuôi cấy vi sinh vật 10

1.4.1 Nguồn dinh dưỡng 10

1.4.2 Điều kiện nhiệt độ 14

1.4.3 Hàm lượng O2 14

1.4.4 pH môi trường 14

1.4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống 15

1.5 Đặc điểm của chất mang sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh 15

1.6 Bọc tế bào VSV trong chất mang nguồn gốc alginate 16

1.7 Xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn 16

1.8 Tính mới của đề tài 17

1.9 Mục đích nghiên cứu 18

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.2 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 20

2.3 Môi trường nuôi cấy VSV sử dụng trong nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Hoạt hóa chủng B.megaterium VACC 118 22

2.4.2 Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118 phù hợp 22

2.4.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát triển của B.megaterium VACC 118 22

2.4.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 22

2.4.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 23

2.4.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng cấp khí và tốc độ khuấy đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 23

2.4.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ giống gốc đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 24

2.4.3 Tạo hạt phân bón vi sinh vật 24

2.4.4 Đánh giá chất lượng của phân bón vi sinh dạng hạt 26

2.4.5 Đánh giá ảnh hưởng của phân bón VSV đối với cây rau 27

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Xác định điều kiện lên men thích hợp cho chủng Bacillus megaterium VACC 118 và đánh giá chất lượng của sản phẩm phân bón vi sinh dạng hạt 28

3.1.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh trưởng của

B.megaterium VACC 118 29

3.1.1.3 Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường lên men đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 30

3.1.1.4 Đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng cấp khí và tốc độ khuấy lên men đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 31

3.1.1.5 Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến quá trình sinh trưởng của B.megaterium VACC 118 33

3.1.2 Đánh giá chất lượng phân bón vi sinh dạng hạt 34

3.2 Đánh giá hiệu quả phân bón trên cây rau 37

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 42

SX BAĐCTN1

MỞ ĐẦU

Phân bón là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng bổ sung cho cây, giúp tăngsản lượng cây trồng Song theo các nhà khoa học đất đai và dinh dưỡng thực vật,cây trồng chỉ có thể sử dụng chưa tới 50% lượng đạm (nitrogen) từ phân khoánghóa học cho sự phát triển, khoảng 50% còn lại được cung cấp từ phân chuồng, phânhữu cơ, và một phần khá lớn do hoạt động của vi sinh vật (VSV) hữu ích trong đất

trồng như các chủng VSV cố định đạm (Azotobacter, Azospirilium, Rhizobium…), VSV phân giải hợp chất phosphat thành dạng dễ tiêu (Bacillus, Pseudomonas…) hay VSV sinh tổng hợp các hormon sinh trưởng thực vật (Azotobacter, Bacillus).

Theo định nghĩa, phân vi sinh là chế phẩm “inoculant” gồm các VSV sốngđược bổ sung vào đất với khả năng cung cấp hoặc chuyển hóa chất dinh dưỡng giúpcây trồng sinh trưởng tốt hơn, với năng suất và chất lượng cao hơn Phân bón visinh có thể được dùng ở dạng lỏng để phun trực tiếp vào đất hoặc ngâm với hạtgiống trước khi gieo Tuy nhiên, ở dạng này, khả năng sống của các tế bào VSV vàmật độ của chúng trong quần thể nhanh chóng bị giảm xuống trong quá trình vậnchuyển và bảo quản Trong những năm qua, các chế phẩm vi sinh dạng rắn trên nềnchất mang (carrier) đã được phát triển với các nguyên liệu sẵn có trong tự nhiên nhưthan bùn, đất sét, bentonite và các phế thải nông nghiệp… song các chất mang nàyđòi hỏi điều kiện đặc biệt để khử trùng do có mức độ tạp nhiễm ban đầu cao, và dễ

bị nhiễm tạp nên chỉ giữ được hiệu quả trong thời gian 3-6 tháng Vì vậy, các nhàkhoa học đã quan tâm hơn đến việc làm thế nào để cải thiện tính ổn định của sảnphẩm và tăng thời gian bảo quản chúng

Gần đây, các chất mang nguồn gốc polymer đã được các nhà khoa học quantâm nhờ khả năng hình thành cấu trúc mạng lưới không gian cho phép cố định các tếbào sống để bảo vệ chúng chống lại các kích thích ngoại lai, giúp các tế bào vikhuẩn ở trạng thái tiềm sinh dễ dàng nảy mầm khi được bón vào đất Các tế bào cóthể được bọc vào trong gel polymer bằng cách phối trộn trước với chất mang hoặcđược hấp phụ vào trong chất mang dạng gel Việc bọc “encapsulation” các tế bào

1

VSV trong lớp vỏ polymer như các polyacrylamide, alginate… có thể ngăn chặnnhiễm tạp một cách hiệu quả, và kéo dài hoạt lực của các VSV Nhiều loại chấtmang polymer đã được nghiên cứu và sử dụng như giá thể cố định enzyme, tế bàoVSV Đáng chú ý nhất trong số đó là sodium alginate, một polysaccharide tích điện

âm có khả năng tạo gel khâu mạch với các ion tích điện dương Vì vậy, các hạt(bead) khâu mạch hình thành giữa alginate và ion calcium (Ca2+) đã được sử dụngphổ biến như chất mang để vận chuyển các chất có hoạt tính sinh học, các enzym và

tế bào Kết quả là, một số sản phẩm phân bón trên nền chất mang dạng gel calcium đã được phát triển [7, 29]

alginate-Tuy nhiên, do alginate là polysaccharide có kích thước phân tử lớn và độnhớt cao, dung dịch alginate thường chỉ có nồng độ thấp, làm cho gel tạo đượckhông đồng nhất và có tính bền cơ học kém Hơn nữa, polymer này rất ưa nước, nênsản phẩm dễ bị nhiễm tạp Vì vậy, một số polymer khác đã được sử dụng như chấtđộn (filler) để cải thiện tính bền cơ lý của hạt, đồng thời giảm chi phí làm khô, bảoquản Gần đây, người ta thấy rằng tinh bột biến tính có thể được sử dụng như chấtđộn bổ sung vào công thức để tạo thành chất mang có tính bền cải thiện mà vẫnphân hủy sinh học Bên cạnh đó, polysaccharide này cũng có thể được các VSV tậndụng như nguồn cacbon để duy trì khả năng sống trong quá trình bảo quản

Trong những năm qua, kỹ thuật khử trùng sử dụng công nghệ bức xạ đã đượcnghiên cứu và ứng dụng tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội để diệt côn trùng, nấm mốc,đảm bảo chất lượng hàng hóa và kéo dài thời gian bảo quản Xử lý chiếu xạ cũng cóthể tạo các hiệu ứng khâu mạch, cắt mạch và ghép mạch polymer tạo cho chúngnhững đặc tính mới phù hợp với ứng dụng Phương pháp này đã được áp dụng đểbiến tính tinh bột sắn tạo sản phẩm tinh bột biến tính có khả năng tan trong nước tốthơn, dễ phân hủy sinh học hơn, với các đặc tính hóa lý phù hợp cho nhiều ứng dụngkhác nhau thay vì chỉ sử dụng như thành phần thực phẩm hoặc thức ăn gia súc nhưhiện nay Quá trình chiếu xạ với liều phù hợp cũng có tác dụng thanh trùng, giúp tậndụng tinh bột biến tính bức xạ như thành phần chất mang chất lượng cao trong sảnxuất phân bón vi sinh trên nền chất mang khử trùng

Nhằm cung cấp lựa chọn mới cho người dân, giảm thiểu sử dụng phân bónhóa học, cũng như thúc đẩy ứng dụng năng lượng nguyên tử vì hòa bình, cụ thể là

xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản

xuất phân bón vi sinh dạng hạt có khả năng kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn Bacillus megaterium VACC 118 và chất mang được xử lý chiếu xạ”.

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về phân bón vi sinh vật

1.1.1 Định nghĩa phân bón vi sinh vật

Phân bón vi sinh hay phân vi sinh là chế phẩm có chứa các loài vi sinh vật(VSV) sống, mà khi được bón vào đất hay tiếp xúc với bề mặt rễ sẽ kích thích sựphát triển của cây trồng bằng cách tăng lượng dinh dưỡng hữu ích cho cây trồng[58]. Phân bón sinh học nói cách khác là một dạng phân bón hữu cơ hiện đại kếthợp với sự có mặt của lợi khuẩn [55] Theo Mohammadi và Sohrabi công bố năm

2012, phạm trù phân bón vi sinh có thể được sử dụng để chỉ tất cả các loại phân bónhữu cơ giúp kích thích sinh trưởng thực vật thông qua sự tương tác giữa vi sinh vật

có trong phân bón đó với đất hoặc với cây trồng [44]

1.1.2 Phân loại phân bón vi sinh

Phân bón vi sinh được phân loại thành nhiều loại tùy thuộc vào chức năngcủa các nhóm VSV chứa trong đó Bảng 1 trình bày một số loại phân bón vi sinhđược sử dụng phổ biến trong canh tác nông nghiệp hiện nay

Phân bón vi sinh cố định nitơ (Nitrogen fixing bio-fertilizers - NFB): Ví dụ

Rhizobium spp., Azospirillum spp và bèo hoa dâu; chúng cố định nitơ trong khí

quyển chuyển thành dạng nitơ hữu cơ (cây có thể sử dụng) trữ trong đất hoặc trongnốt sần của rễ như ở cây họ đậu [18]

Phân bón vi sinh hòa tan phosphate (Phosphate solubilizing bio-fertilizer –

PSB): Một số VSV được sử dụng phổ biến để sản xuất phân bón loại này gồm

Bacillus spp., Pseudomonas spp và Aspergillus spp Các VSV này hòa tan

phosphate không tan trong đất chuyển thành dạng hòa tan, giúp cây trồng dễ dànghấp thu Trong thực tế, phốt pho trong đất hầu hết tồn tại ở dạng không tan và câytrồng không thể sử dụng [15] Tuy vậy, một vài nhóm vi khuẩn và nấm trong đất cótham gia vào quá trình chuyển hóa phốt phát bằng cách tiết ra axit hữu cơ làm giảm

pH đất, giúp hòa tan các hợp chất phosphate không tan [15]

Phân bón vi sinh chuyển hóa phosphate (Phosphate mobilizing bio-fertilizer –

PMB): Ví dụ nấm rễ Mycorrhiza sẽ biến đổi các hợp chất phosphat thông qua quá

trình khoáng hóa và hòa tan phốt pho cung cấp cho cây Hiện nay, cơ chế và chứng

năng của PMB vẫn chưa được hiểu rõ [17]

Bảng 1 Một số nhóm VSV sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh

Sống cộng sinh

Nấm cộng sinh

(Arbuscular Mycorrhiza

(Ectomycorrhiza Ericoid Mycorrhiza Orchid Mycorrhiza

Nguồn tham khảo: "Biofertilizer, a way towards organic agriculture: A review", in

trên tạp chí African Journal of Microbiology Research năm 2014 [10]

Phân bón vi sinh kích thích sinh trưởng thực vật (Plant growth promoting

bio-fertilizer – PGPB) Nhóm này gồm các VSV vùng rễ như Pseudomonas spp….

Nhiệm vụ của nhóm VSV này là sản xuất ra các hocmon và chất kháng chuyển hóa(anti- metabolites) giúp kích thích rễ phát triển, phân hủy chất hữu cơ, thúc đẩy quátrình khoáng hóa trong đất, làm tăng năng suất cây trồng [11, 44]

Phân bón vi sinh hòa tan kali (Potassium solubilizing bio-fertilizer – KSB).

Thuộc nhóm này gồm Bacillus spp và Aspergillus niger Kali trong đất chủ yếu tồn

tại dạng khoáng silicat và cây trồng không sử dụng được kali dạng này Một số VSVtổng hợp ra các axit hữu cơ gây phân giải silicat, chuyển kali từ dạng khó tan thànhdạng dễ tan giúp cây dễ dàng hấp thụ

Phân bón vi sinh làm di động kali (Potassium mobilizing bio-fertilizer –

KMB) Đại diện được sử dụng trong nhóm này bao gồm Bacillus spp Các VSV này

sẽ thu hút kali dạng khó tan về khu vực chúng hoạt động và phân giải kali Một số

phân bón vi sinh hòa tan phosphate có chứa Bacillus spp và Aspergillus spp., đồng

thời cũng có khả năng di động kali [31]

Phân bón vi sinh oxi hóa sulfur (Sulfur oxidizing bio-fertilizer – SOB):

Thiobacillus spp là một trong số các VSV có khả năng này Chúng oxi hóa sulfur

thành sulfate giúp cây dễ dàng hấp thụ [31]

1.1.3 Vai trò của phân bón vi sinh với cây trồng

Phân bón vi sinh đóng vai trò quan trọng trong cải thiện độ màu mỡ của đất.Bên cạnh đó, chúng cải thiện cấu trúc đất và giảm việc lạm dụng phân bón hóa học.Tại các vùng đất ngập nước, việc sử dụng tảo xanh (blue green algae – BGA) cùng

với Azospirillum giúp cải thiện đáng kể năng suất của các cây họ lúa Phân bón vi sinh kết hợp Azotobacter, Rhizobium và Vesicular Arbuscular Mycorrhiza bón kèm

phosphate vô cơ giúp các cây họ lúa đạt năng suất tối đa [10] Bèo hoa dâu (Azolla)

6

vừa không tốn kém, kinh tế lại thân thiện môi trường góp phần quan trọng trongviệc làm giàu carbon và nitơ cho đất.

Đối kháng sinh học (antagonis) là một đặc điểm khác mà phân bón vi sinh có

thể mang lại Các chủng nấm Trichoderma đã được chứng minh là có khả năng

kiểm soát bệnh thối rễ ở cây đậu [10] Tốc độ sinh trưởng, năng suất và chất lượng

là những thước đo cơ bản để đánh giá hiệu quả tác động của phân bón vi sinh lêncây trồng, trong đó phải kể đến một số phân bón chứa các nhóm VSV hữu ích phổbiến như nhóm vi khuẩn cố định đạm, hòa tan phosphate và kali [44]

Tóm lại, phân bón vi sinh có vai trò quan trọng trong nông nghiệp mà trong

đó phải kể tới 5 hiệu quả chính yếu sau: (1) kích thích sinh trưởng thực vật; (2) bảo

vệ cây trồng khỏi sự tấn công của sâu bệnh; (3) cải thiện độ màu mỡ của đất; (4)thay thế một phần và giảm sử dụng phân bón hóa học; (5) tham gia vào chu trình táitạo đất tự nhiên và cải thiện lượng mùn hữu cơ

1.1.4 Hạn chế của phân bón vi sinh

Hạn chế quan trọng nhất của phân bón vi sinh là hàm lượng dinh dưỡng củachúng so với phân bón vô cơ Điều này có nghĩa rằng, khi chỉ sử dụng phân bón visinh sẽ dẫn tới sự thiếu hụt một số chất trong quá trình sinh trưởng của cây trồng.Tuy nhiên, vấn đề này có thể được cải thiện bằng cách bổ sung một số cơ chất nhưbột xương (giàu phốt pho), tro gỗ (giàu kali) hoặc các cơ chất khác có nguồn gốc tựnhiên như quặng apatit để bổ sung vào phân bón vi sinh Ngoài ra việc sử dụng cácphụ phẩm nông nghiệp giàu dinh dưỡng như khô dầu cọ (giàu kali), tro gỗ (giàukali)… làm thành phần phân bón vi sinh cũng cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng chođất Mahimairaja và cộng sự đã cho thấy việc bổ sung phốt pho từ các phụ phẩmnông nghiệp giúp phân bón sinh học cân bằng hơn và giảm hao hụt nitơ [40]

Một điểm hạn chế nữa của phân bón vi sinh là kém bền và dễ bị giảm chấtlượng sau một thời gian bảo quản do VSV bị chết hoặc nhiễm tạp Thông thường,phân vi sinh được đóng vào các túi polyethylene (PE) có độ dày khoảng 50-70 µm,

và bảo quản ở nhiệt độ thấp (4°C) hoặc trong phòng không bị chiếu sáng trực tiếp(25°C) [43] Thời gian sử dụng ngắn, chất mang không phù hợp, nhiệt độ cao, và

những khó khăn trong vận chuyển, bảo quản là những vấn đề cần được cải thiện đểgiúp phân bón vi sinh trở nên phổ biến trong nông nghiệp.

1.2 Vai trò của vi khuẩn vùng rễ đối với đất trồng và sự sinh trưởng phát triển của thực vật

Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth PromotingRhizobacteria- PGPR) là vi khuẩn trong đất, sinh sống xung quanh hoặc trên bề mặt

rễ, trực tiếp hoặc gián tiếp tham gia kích thích sinh trưởng và phát triển thực vậtthông qua sản xuất và tiết ra những chất hóa học khác nhau vào vùng rễ cây [34]

PGPR phát triển qua ba giai đoạn: phát tán từ hạt giống, nhân nhanh mật độ trongvùng rễ, bám vào bề mặt rễ và phát triển trong hệ thống cây [33] Sự giảm tác dụngcủa PGPR trong các thí nghiệm ngoài đồng ruộng thường là do vi khuẩn thiếu khảnăng bám trụ vào rễ cây [9, 14] Các nhà khoa học phỏng đoán có nhiều gene chịutrách nhiệm giúp vi sinh vật xâm nhập vào rễ cây, tuy nhiên, hiện tại mới có một số

ít gene được giải mã [9, 38] Các gene này chi phối khả năng di động của vi sinh vậtnhư khả năng hình thành tiêm mao hoặc roi, khả năng sản sinh ra những chất đặcbiệt giúp bám trên bề mặt rễ cây hoặc khả năng sản sinh các chất cảm ứng [38]

PGPR tạo điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng thực vật bởi trực tiếp hoặc hỗtrợ việc thu thập nguồn dưỡng chất (đạm, lân và các khoáng chất thiết yếu) hoặcđiều chỉnh hormone thực vật, hoặc gián tiếp làm giảm các tác nhân gây bệnh khácnhau ức chế sinh trưởng thực vật Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, PGPR kích thíchsinh trưởng thực vật nhờ khả năng hòa tan phốt pho [21, 50], kali [48] hoặc cố địnhnitơ [59] từ dạng tự do trong không khí Không chỉ vậy, PGPR còn thúc đẩy sự tăngtrưởng thực vật thông qua việc sản xuất các phytohormone như auxin, cytokinin vàgibberellin [52] Ngoài ra, các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOCs - Volatile organiccompounds) như acetoin và 2,3-butanediol có tác dụng điều hòa nội cân bằng auxin

trong cây cũng được Bacillus subtilis, Bacillus amyloliqufaciens và Enterobacter cloacae tạo ra như các chất kich thích tăng trưởng thực vật [30, 60] Các cofactorPQQ (pyroquinoline quinine) cũng là tác nhân kích thích tăng trưởng thực vật được

tìm thấy ở Pseudomonas fluorescens [30] Bên cạnh khả năng sinh tổng hợp các

8

chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng, một số chủng vi khuẩn cũng sinh enzymephân hủy các hợp chất hữu cơ, góp phần cải tạo đất, hoặc sinh tổng hợp cácphytoalexin có hiệu quả kích thích khả năng chống chịu của thực vật đối với một sốdịch bệnh do virut, vi khuẩn gây ra [22] Nhiều nghiên cứu cũng đã ghi nhận việcứng dụng PGPR trong trồng trọt làm tăng sức đề kháng và năng suất của các loạicây trồng khác nhau trong cả điều kiện bình thường và bất lợi [11] Các vi khuẩn cólợi ở vùng rễ thực vật có thể làm giảm sự phụ thuộc vào nông dưỡng nguy hại gâybất ổn cho hệ sinh thái nông nghiệp Do những đặc tính trên, PGPR đã đươc ứngdụng rất nhiều trong sản xuất.

1.3 Vi sinh vật sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật Bacillus

megaterium

B.megaterium lần đầu được miêu tả bởi Anto De Bary từ năm 1884 [6] Tên

“megaterium” do vi khuẩn này có kích thước lớn, thực tế đây là vi khuẩn lớn nhất

trong số các bacilli với kích thước từ 1.5 - 4µm Rất lâu trước khi Bacillus subtilis được sử dụng như một sinh vật đại diện cho nhóm Gram Dương, B.megaterium đã

được nghiên cứu trong lĩnh vực hóa sinh như một bacteriophages [20]

B.megaterium là vi khuẩn Gram Dương, có hình que, có bào tử và được xếp

là loài chìa khóa (key species) trong quá trình phát sinh loài của nhóm Bacillus Vị trí của B.megaterium trong cây phát sinh được mô tả trong Hình 1.

B.megaterium có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp B.megaterium là một trong số những sinh vật được sử dụng áp dụng công

nghệ gene để sản xuất B12 [23] Đặc biệt, B.megaterium được chứng minh có thể

tổng hợp vitamin B12 trong điều kiện có hoặc không có oxy [25] Bên cạnh đó,

B.megaterium được sử dụng như sinh vật chuyển gene để sản xuất protein tái tổ hợp

nhờ có vùng multiple cloning sites và khả năng tạo protein thể vùi dễ tinh sạch [51]

Trong nông nghiệp, B.megaterium được chứng minh có khả năng hòa tan phosphate

vô cơ, tổng hợp IAA – một loạt chất kích thích sinh trưởng thực vật, chuyển hóa sắt

vô cơ và tổng hợp một số chất có hoạt tính kháng nấm [16]

Hình 1 Cây phát sinh của một số loài thuộc chi Bacillus căn cứ vào trình tự 16S

10

thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện thích hợp về thếoxy hoá - khử, pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion… Chất dinh dưỡng phải lànhững chất có tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào [39]

Cacbon là nguyên tố quan trọng nhất, hình thành nên các hợp chất hữu cơ

thiết yếu cho sự sống Các hợp chất chứa cacbon cũng có thể bị thủy phân và lànguồn năng lượng chính cho hoạt động sống của tế bào Các hợp chất hữu cơ chứanhiều cacbon trong tự nhiên là các loại hydrat cacbon, mà khi thủy phân sẽ tạothành các gốc đường Mặc dù, các chủng VSV khác nhau có thể sử dụng các nguồncacbon khác nhau, nhưng đường thường được bổ sung vào môi trường nhân sinhkhối, do chúng dễ dàng được các VSV hấp thụ và chuyển hóa cho hoạt động sốngcủa các VSV Trong sản xuất công nghiệp, rỉ đường và nước chiết đậu thường đượcdùng như nguồn cung cấp cacbon và năng lượng Rỉ đường cũng chứa nhiều nguyên

tố vi lượng cần thiết cho sản xuất sinh khối (Bảng 2) Cellulose cũng có thể đượcđưa vào các môi trường nuôi cấy VSV phân giải cellulose dưới dạng giấy lọc, bônghoặc các loại bột cellulose (cellulose powder, avicel )

Thành phần rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, đất trồng và điều kiện canhtác, cũng như công nghệ sản xuất đường Thông thường, rỉ đường chứa lượng chấtkhô chiếm 80-85%, còn lại là nước Thành phần chính của chất khô gồm đường,hợp chất hữu cơ chứa nitơ dưới dạng axit amin, các chất hữu cơ không chứa nitơ vànhiều nguyên tố vi lượng khác [13]

Nitơ Chỉ một số chủng VSV cố định nitơ có khả năng chuyển hóa N2 tự do

trong không khí, còn lại phần lớn các VSV bao gồm các chủng VSV kích thích sinhtrưởng chọn không thể đồng hóa N2 không khí [41] Do rỉ đường chứa ít nitơ (Bảng2), khi nhân sinh khối sử dụng rỉ đường, thường phải bổ sung nguồn nitơ dưới dạngure hoặc amon sulfat Nguồn dinh dưỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sựphát triển của vi sinh vật Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH3 và

NH4+ Muối nitrat là nguồn thức ăn chứa nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấmsợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nấm men và vi khuẩn Sau khi vi sinh vật

sử dụng hết gốc NO3 các ion kim loại lẫn trong muối hoặc trong rỉ đường sẽ làm

kiềm hoá môi trường Đối với, nhân giống cấp 1 trong phòng thí nghiệm, các hợpchất hữu cơ chứa nitơ như pepton cũng có thể được sử dụng để cung cấp nitơ choVSV phát triển.

Bảng 2 Thành phần hóa học của rỉ đường mía [13] và nước chiết đậu [12]

Nguồn tham khảo: Thành phần nước chiết đậu -"Chemical composition of some

faba bean cultivars", đăng tạp chí Canadian Journal of Plant Science năm 1974 [12] Thành phần gỉ đường - Composition of Came Juce and Cane Final Molasses đăng tạp chí Advances in carbohydrate chemistry năm 1953 [13].

Ngoài việc cung cấp các nguyên tố đa lượng từ các hợp chất hữu cơ, một sốchất khoáng cũng được bổ sung như thành phần môi trường trong nuôi cấy VSV Vìlượng chất khoáng cần thiết đối với VSV thay đổi theo loài, giai đoạn phát triển vàđiều kiện sống của VSV, cần phải nghiên cứu lựa chọn hàm lượng khoáng phù hợpcho từng loại VSV cụ thể Đối với VSV kích thích sinh trưởng lựa chọn trong

12

nghiên cứu này, nguồn chất khoáng cần thiết tương tự như đối với các loài nấm và

Nguồn tham khảo: "Effects of pH, temperature, and mineral nutrition on

cellulolytic fungi", đăng tạp chí American Journal of Botany năm 1951 [53] Và cuốn Brock biology of microorganisms 13th edition năm 2010 [39]

Các nguyên tố khoáng này có thể không cần thiết khi nhân sinh khối VSVtrong các môi trường tự nhiên như môi trường nước chiết đậu, nước canh thịt, sữa,huyết thanh, pepton, giá đậu… Ngược lại, khi làm các môi trường tổng hợp (dùngnguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đầy đủ các nguyên tố khoáng

Vi sinh vật muốn phát triển bình thường không những đòi hỏi phải được cung

13

VSV khác Hầu như không có chất nào là chất sinh trưởng chung đối với tất cả cácloài VSV Tuỳ theo từng loại VSV mà chúng ta bổ sung vào môi trường nuôi cấynhững chất sinh trưởng khác nhau.

1.4.2 Điều kiện nhiệt độ

Hoạt động trao đổi chất của tế bào VSV có thể coi là kết quả của các phảnứng hoá học Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt

độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào [39] Mỗi loại VSVthích ứng với khoảng nhiệt độ khác nhau Tuỳ theo quan hệ với các vùng nhiệt khácnhau, có thể phân chia thành:

- Nhóm VSV ưa lạnh: sinh trưởng tốt nhất ở dải nhiệt độ từ 6 - 15°C

- Nhóm VSV ưa ấm: Đa số vi sinh vật thuộc loại này, nhiệt độ tốt nhất choloài vi sinh vật này nằm trong khoảng từ 25 - 37ºC

- Nhóm VSV ưa nhiệt: Sinh trưởng tốt nhất trong khoảng nhiệt độ từ 50 60°C, một số loài không sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 30ºC, nhiệt độ sinhtrưởng cực đại của các vi sinh vật nằm trong khoảng 75 - 80°C

-Do quá trình lên men luôn có sự toả nhiệt rất mạnh, cần thiết phải kiểm soátnhiệt độ trong thiết bị lên men trong khoảng phù hợp cho sự sinh trưởng và pháttriển của VSV, nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả lên men Thông thường, cầnphải bổ sung hệ thống làm mát khi nhân giống trên quy mô công nghiệp

1.4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống

Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn.Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suấtthu hồi sinh khối thấp Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rútngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển quá nhanh làmcho nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quátrình sinh trưởng [39] Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm giống,đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men

1.5 Đặc điểm của chất mang sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh

Phân bón vi sinh thường phải sử dụng chất mang để tăng hiệu quả, chấtlượng và thời gian bảo quản Theo Somasegaran và Springer [54], một chất mangtốt cần phải thỏa mãn các đặc tính sau: (1) Rẻ và dễ kiếm (2) Dễ khử trùng bằnghấp tiệt trùng hoặc xử lý chiếu xạ gamma (3) Dễ xử lý, chế biến mà không bị vóncục (4) Không độc hại cho vi sinh vật và thực vật (5) Có khả năng hấp thụ ẩm tốt

và có thể giữ nước trên 50% (6) T tạo được cấu trúc tốt cho sự bám dính của vi sinhvật (7) Có pH phù hợp, ổn định và chứa hàm lượng chất hữu cơ cao

Khosro và Yousef [44] cho rằng việc kết hợp các vi sinh vật vào chất mangcho phép quá trình tạo phân bón vi sinh trở nên dễ dàng, đồng thời kéo dài thời gianlưu trữ lâu dài và hiệu quả của phân Họ cũng cho rằng khử trùng chất mang là điềucần thiết để giữ số lượng lớn VSV có ích trong thời gian dài Một vài ví dụ về chấtmang thông dụng hiện đang được sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh bao gồmmùn cưa, đất sét, phân chuồng, phân giun đất Trong vài thập niên trở lại đây, mộtvài chất mang mới nguồn gốc polymer đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sảnxuất phân bón như polyacrylamide [24] hoặc sodium alginate [26] Các chất mangpolymer này đều dạng bột, cấu trúc mạng lưới, cho phép bắt giữ VSV trong mạnglưới của chúng, bảo vệ VSV khỏi các áp lực từ môi trường trong quá trình bảo quản(nhiệt độ, ánh sáng,…) và khi gặp điều kiện thuận lợi, các polymer này sẽ lại từ từgiải phóng VSV vào trong đất [32] Các chất mang dạng gel polymer cho phép các

tế bào có thể tồn tại với hoạt tính lâu dài [7]

15

Xử lý chiếu xạ gamma là một cách hữu hiệu để khử trùng chất mang, bởi vìquá trình này không làm thay đổi tính chất vật lý và hóa học của vật liệu Mộtphương pháp khác để khử trùng chất mang là khử trùng nhiệt khô (sấy) hoặc ẩm(hấp) Tuy nhiên, hấp khử trùng có thể làm thay đổi đặc tính của một số chất mangdẫn tới gây độc cho một số chủng vi khuẩn

1.6 Bọc tế bào VSV trong chất mang nguồn gốc alginate

Alginate là vật liệu tổng hợp, dạng bột khô, dễ sử dụng, cấu trúc đồng nhất,

dễ bị phân hủy bởi vi sinh vật trong đất và không hề gây độc cho tế bào sống Trênthực tế, nhiều nghiên cứu đã sử dụng alginate làm vật liệu bọc vì nó có thể ngay lậptức khâu mạch với các ion kiềm thành cấu trúc mạng lưới có tính bền cơ lý phù hợpvới các cation đa hóa trị Hơn nữa, các hạt alginate có thể bẫy một lượng lớn các tếbào VSV, bảo đảm chất lượng phân vi sinh dạng hạt tạo được [29] So với việc phuntrực tiếp dịch vi sinh vào môi trường, sử dụng các tế bào được bọc trong chất nềnpolymer sẽ giúp bảo vệ chúng khỏi các kích thích từ môi trường, đồng thời làm tăngkhả năng sống và hoạt tính sinh học của VSV Tuy nhiên, phương pháp bọc cần cânbằng được các yếu tố chính như tính bền cơ học, giải phóng kiểm soát, đáp ứng môitrường, phân hủy sinh học, giá thành, và quan trọng nhất là các tế bào VSV này cóthể nảy mầm, sinh trưởng và phát triển sau khi chủng đi vào vùng rễ của cây

Phối trộn hỗn hợp dịch phân bón cần chứa các thành phần có hoạt tính sinhhọc trong chất mang phù hợp với chất phụ gia như chất làm đầy để ổn định và bảo

vệ các tế bào VSV trong quá trình bảo quản, vận chuyển đến đồng ruộng Các hạtchất mang nguồn gốc alginate có thể được kết tủa khâu mạch trong dung dịch CaCl2trước khi ngâm vào dịch vi sinh hoặc được phối trộn đồng nhất với dịch vi sinh với

tỉ lệ phù hợp trước khi tạo hạt Các công thức phối trộn hỗn dịch nuôi với alginatetrước khi kết tủa giúp tạo được hạt phân bón chứa lượng lớn tế bào VSV đủ khảnăng cạnh tranh với các nhóm VSV khác khi chúng đi vào vùng rễ

1.7 Xử lý chiếu xạ biến tính tinh bột sắn

Bức xạ ion hóa là bức xạ với mức năng lượng đủ cao để gây ra các sự kiệnion hóa và kích thích trong các phân tử, nguyên tử bị chiếu xạ Trong số các bức xạ

ion hóa năng lượng cao, tia gamma phát ra từ các đồng vị phóng xạ và chùm tiađiện tử (EB) tạo ra từ máy gia tốc là các nguồn chiếu xạ phổ biến nhất Các thiết bịchiếu xạ gamma hiện có thường sử dụng đồng vị cobalt-60 và caesium-137 [35].

Hình dạng và kích thước của tinh bột phụ thuộc vào nguồn gốc, quy trình sảnxuất và một số yếu tố khác Vi hạt tinh bột thường có dạng hình cầu, bầu dục, đagiác với kích thước dao động từ 2 -120 µm và khác nhau ngay cả đối với cùng loạinguyên liệu Hạt tinh bột gạo có kích thước nhỏ nhất và tinh bột khoai tây là lớnnhất, trong khi tinh bột sắn chủ yếu có dạng hình cầu, với một số hạt có mặt trũng,

có xu hướng kết tụ với nhau [37] Nghiên cứu về cấu trúc tinh bột, người ta thấyrằng nó được cấu thành từ amylose và amylopectin, trong đó hàm lượng amylosemạch thẳng thấp hơn, và tỉ lệ amylose/amylopectin khác nhau cũng ảnh hưởng đáng

kể đến đặc tính sản phẩm [36]

Tinh bột sau khi xử lý chiếu xạ, tùy thuộc vào liều chiếu, tinh bột ngoài việcđược xử lý khử trùng, còn có những biến đổi về tính chất vật lý của vật liệu Khităng liều chiếu lên tinh bột, sự phân mảnh của tinh bột do chiếu xạ tăng lên, trongkhi độ nhớt tương đối của dung dịch tinh bột giảm nhanh theo liều chiếu, tính tancũng tốt hơn, nhiệt độ hồ hóa giảm [19]

1.8 Tính mới của đề tài

Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên phối hợp alginate và tinh bột chiếu xạ

để tạo hạt phân bón Hạt calcium alginate được biết đến là một cấu trúc mạng lướilỏng lẻo được lấp đầy bởi một lượng nước lớn [46] Do đó, việc sử dụng một mìnhalginate làm chất mang để tạo hạt phân bón thì không thể bảo vệ các tế bào VSVkhỏi sự mất nước trong quá trình làm khô, đồng thời sự mất nước nhanh chóng làmcho hạt phân bón tạo ra dễ biến dạng và có kích thước không đồng nhất Các chấtlàm đầy như tinh bột khi thêm vào cùng alginate để tạo chất mang sẽ làm tăng khốilượng khô của hạt, chống lại các biến đổi cơ học và cho phép giải phóng dần VSVvào đất [7] Tiếp nối những nghiên cứu về tổ hợp chất mang trong tạo hạt phân bón,chúng tôi thay thế tinh bột bằng tinh bột biến tính, được chứng minh với nhiều đặctính lý hóa nổi trội hơn tinh bột thông thường Công nghệ chiếu xạ cắt mạch

17

polysaccharide là một trong những kỹ thuật mới, hiện đại và thân thiện môi trường,ngoài việc khử trùng tinh bột, tia gamma còn làm thay đổi tính tan của tinh bột cũngnhư nhiệt độ hồ hóa Theo nghiên cứu của Hyun-Jung Chung và cộng sự năm 2010,

độ nhớt giảm đáng kể trong khi tốc độ phân hủy và tính tan thì tăng khi tăng liềuchiếu xạ [19] Trong khi đó, hấp khử trùng không phải là một biện pháp tốt để xử lýtinh bột do vật liệu này dễ dàng bị vón cục và thay đổi đặc tính lý hóa khi tiếp xúcvới nhiệt độ cao Chính sự ưu việt của tinh bột biến tính và sự nhạy cảm nhiệt củatinh bột là lý do thúc đẩy chúng tôi sử dụng công nghệ chiếu xạ để xử lý tinh bột,tạo chất mang vô trùng trước khi sử dụng để tạo hạt phân bón

Nghiên cứu này cũng là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam khi sử dụng chấtmang gồm alginate tinh bột để tạo phân bón vi sinh dạng hạt thay vì phối trộn VSVvới các chất mang truyền thống như rơm, than bùn, phân chuồng, bã bùn mía, vỏ càphê… Các chất mang trên thị trường có ưu điểm là rẻ, nhưng nhược điểm là khó xử

lý khử trùng dẫn tới tạp nhiễm hại khuẩn trong sản phẩm phân bón (VD tạp nhiễm

E.coli, Salmonella,…) Bên cạnh đó, khi tồn tại trong một quần xã gồm VSV vốn có

trong chất mang hữu cơ thì lợi khuẩn trộn vào chưa hẳn đã thích nghi và cạnh tranhđược với nhóm VSV này dẫn tới số lượng lợi khuẩn suy giảm nhanh chóng trongquá trình bảo quản, vận chuyển làm giảm nhanh chóng chất lượng phân bón sau khixuất xưởng Khắc phục các vấn đề nêu trên của phân bón vi sinh hiện có, phân bón

vi sinh dạng hạt tạo ra từ hỗn hợp chất mang alginate và tinh bột biến tính đã đượckhử trùng có thể tránh được tạp nhiễm trong quá trình phối trộn, đồng thời giữ vàduy trì hoạt tính sinh học của các lợi khuẩn trong mạng lưới polymer của nó, giúpkéo dài thời gian bảo quản Hơn nữa, lượng carbon dù nhỏ từ tinh bột sẵn có trongcấu trúc hạt sẽ là nguồn cung cấp năng lượng ban đầu lý tưởng, hỗ trợ cho sự nảy mầm của bào tử VSV khi gặp độ ẩm phù hợp

1.9 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào hai mục đích chính: