Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ trong mật ong góp phần đánh giá ô nhiễm môi trường

Ứng dụng quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong để xác định chất trong các mẫu thực tế...46 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ...52 1... Sự phân hủy chậm của t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Vũ Thị Thu Thủy

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM CLO HỮU CƠ TRONG MẬT ONG

GÓP PHẦN ĐÁNH GIÁ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Vũ Thị Thu Thủy

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM CLO HỮU CƠ TRONG MẬT ONG

GÓP PHẦN ĐÁNH GIÁ Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành: Khoa học môi trường

Mã số: 60440301

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Đỗ Quang Huy

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS.

Đỗ Quang Huy, giảng viên Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Em cũng tỏ lòng biết ơn đến tập thể các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ môi trường, Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt hướng dẫn cách tổng hợp các kiến thức quý báu trong suốt những năm học vừa qua và nhiệt tình giúp đỡ em về mọi mặt, cũng như luôn tạo điều kiện thuận lợi để

em có thể hoàn thành tốt đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các cán bộ, viên chức Ban 10-80, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin cảm ơn các cử nhân Nguyễn Thị Lan Anh đã cộng tác với tôi triển khai nghiên cứu trong lĩnh vực chuyên môn môi trường.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên

Vũ Thị Thu Thủy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦUU 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 3

1.2 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ 4

1.2.1 Hợp chất nhóm DDT 5

1.2.2 Hợp chất nhóm BHC 7

1.2.3 Hợp chất nhóm Chlordane 8

1.3 Giới thiệu chung về ong mật và sản phẩm mật ong 9

1.3.1 Tổ chức xã hội đàn ong 10

1.3.2 Mật ong 11

1.3.3 Vai trò của cây nguồn mật phấn đối với ong 14

1.3.4 Cách thức nuôi ong ở Việt Nam 15

1.4 Nguồn gốc xuất hiện các hóa chất BVTV trong mật ong 16

1.5 Một số nghiên cứu xác định dư lượng thuốc BVTV trong mật ong 18

1.5.1 Phương pháp chiết lỏng-lỏng kết hợp với sắc ký khí khối phổ 18

1.5.2 Phương pháp chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí khối phổ 18

Chương 2 20

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp thu thập và tổng hợp tài liệu 20

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và chuẩn bị mẫu 21

2.2.3 Phương pháp thực nghiệm 21

Chương 3 34

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Đường ngoại chuẩn của các thuốc BVTV cơ clo nghiên cứu 34

3.1.1 Nhận diện chất phân tích trên sắc ký đồ của chất chuẩn 34

3.1.2 Xây dựng đường ngoại chuẩn định lượng các chất nghiên cứu 35

3.2 Xây dựng quy trình phân tích 39

3.2.1 Kết quả khảo sát thể tích dung môi rửa giải 39

3.2.2 Khảo sát khả năng loại bỏ tạp chất trong dịch chiết của cột sắc ký 41

3.3 Độ thu hồi của các thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ 42

3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 43

3.5 Quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong 44

3.5.1 Chiết mẫu 44

3.5.2 Làm sạch dịch chiết 44

3.5.3 Làm giàu mẫu 44

3.6 Ứng dụng quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong để xác định chất trong các mẫu thực tế 46

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Khuyến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của DDT và các chất chuyển hóa của nó 6

Bảng 1.2 Tính chất của BHC và các đồng phân của BHC 7

Bảng 1.3 Một số tính chất vật lý của các nhóm thuốc BVTV tiêu biểu thuộc họ clo hữu cơ 9

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của mật ong 13

Bảng 2.1 Nồng độ các dung dịch hỗn hợp chất chuẩn 30

Bảng 3.1 Thời gian lưu của một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ chuẩn 34

Bảng 3.2 Mối quan hệ giữa nồng độ chất chuẩn và số đếm diện tích píc 35

Bảng 3.3 Phương trình đường ngoại chuẩn và hệ số tương quan của 19 loại thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ 38

Bảng 3.4 Độ thu hồi của các chất khi thực hiện bước chuẩn bị và phân tích mẫu 42

Bảng 3.5 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp phân tích thuốc BVTV nhóm cơ clo trong mật ong 43

Bảng 3.6: Kết quả phân tích một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong các mẫu mật ong tại xã Hồng Nam - tỉnh Hưng Yên (từ mẫu HY1 đễn mẫu HY11) 47

Bảng 3.7: Kết quả dư lượng một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong các mẫu mật ong tại xã Hồng Nam - tỉnh Hưng Yên (từ mẫu HY12 đến mẫu HY22) 48

Bảng 3.8: Kết quả phân tích dư lượng một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong các mẫu mật ong tại xã Giáp Sơn - tỉnh Bắc Giang; xã Bằng Khánh - tỉnh Lạng Sơn 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự chuyển hóa của DDT thành DDE và DDD 5

Hình 2.1 Sơ đồ khối của máy sắc ký khí 25

Hình 3.1 Sắc đồ của các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 34

Hình 3.2 Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 ứng với dịch rửa giải là 5 mL etyl axetat 39

Hình 3.3.Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 ứng với dịch rửa giải là 15 mL etyl axetat.40 Hình 3.4.Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 ứng với dịch rửa giải là 10 mL etyl axetat.40 Hình 3.5 Sắc đồ phân tích phân đoạn 1 rửa giải bằng 10 mL etyl axetat 41

cho qua cột Al2O3 41

Hình 3.6 Quy trình chuẩn bị mẫu và phân tích một số thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trong mật ong 45

Hình 1P Đường ngoại chuẩn của α-BHC 57

Hình 2P Đường ngoại chuẩn của Hexachlorbenzen 57

Hình 3P Đường ngoại chuẩn của β-BHC 58

Hình 4P Đường ngoại chuẩn của γ-BHC 58

Hình 5P Đường ngoại chuẩn của δ-BHC 59

Hình 6P Đường ngoại chuẩn của Heptachlor 59

Hình 7P Đường ngoại chuẩn của α-Chlordene 60

Hình 8P Đường ngoại chuẩn của β-Chlordene 60

Hình 9P Đường ngoại chuẩn của Oxychlordane 61

Hình 10P Đường ngoại chuẩn của trans-Chlordane 61

Hình 11P Đường ngoại chuẩn của o,p’-DDE 62

Hình 12P Đường ngoại chuẩn của cis-Chlordane 62

Hình 13P Đường ngoại chuẩn của trans-Nonachlor 63

Hình 14P Đường ngoại chuẩn của p,p’-DDE 63

Hình 15P Đường ngoại chuẩn của o,p’-DDD 64

Hình 16P Đường ngoại chuẩn của cis-Nonachlor 64

Hình 17P Đường ngoại chuẩn của o,p’-DDT và p,p’-DDD 65

Hình 18P Đường ngoại chuẩn của p,p’-DDT 65

Hình 19P Sắc đồ phân tích mẫu HY6 bằng GC/ECD 66

Hình 20P Sắc đồ phân tích mẫu HY8 bằng GC/ECD 66

Hình 21P Sắc đồ phân tích mẫu LS1 bằng GC/ECD 67

Hình 22P Sắc đồ phân tích mẫu LS3 bằng GC/ECD 67

Hình 23P Sắc đồ phân tích mẫu BG1 bằng GC/ECD 68

Hình 24P Sắc đồ phân tích mẫu BG2 bằng GC/ECD 68

: Dichlorodiphenytrichloroethane: Liên minh Châu Âu

: Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc: Sắc ký khí với detectơ cộng kết điện tử: Sắc ký khí detectơ quang hóa ngọn lửa: Sắc ký khí khối phổ

: Sắc ký lỏng khối phổ đề ion ở áp suất khí quyển: Giới hạn phát hiện

: Giới hạn định lượng: Khối lượng phân tử: Chiết pha rắn: Alpha – Benzenhexachloride: Beta – Benzenhexachloride: Delta – Benzenhexachloride: Gamma – Benzenhexachloride: Nhiệt độ sôi

: Nhiệt độ nóng chảy

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khoảng bảy mươi phần trăm dân sốsống bằng nghề nông, vì vậy việc nâng cao năng suất, sản lượng cây trồng luônđược quan tâm hàng đầu Trên con đường tìm kiếm các biện pháp để tăng năng suấtcây trồng, đảm bảo đời sống của người sản xuất, việc đưa hoá chất bảo vệ thực vậtvào sản xuất nông nghiệp ở nước ta được coi là một thành tựu khoa học to lớn, từ đó

mà năng suất nông sản thu hoạch tăng lên rõ rệt, cuộc sống vật chất của người nôngdân no đủ hơn Tuy nhiên cũng chính từ những lợi ích đó mà người nông dân đã lạmdụng hoá chất trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là hóa chất bảo vệ thực vật mộtcách quá mức, không chỉ cho các loại cây lương thực mà còn được dùng cho tất cảcác loại cây trồng khác trong đó có cây ăn quả, và hoa màu Theo số liệu của CụcBảo vệ Thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, ở Việt Nam, số lượng

và chủng loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng ngày càng tăng lên Nếu như trước năm

1985 khối lượng thuốc bảo vệ thực vật dùng hàng năm khoảng 6.500 đến 9.000 tấnthành phẩm quy đổi và lượng thuốc sử dụng bình quân khoảng 0,3 kg hoạt chất/hathì hiện nay theo Cục BVTV (Bộ NN&PTNT), trung bình mỗi năm cả nước nhậpkhẩu khoảng trên 70.000 tấn thuốc bảo vệ thực vật thành phẩm các loại, trong đó90% được nhập khẩu từ Trung Quốc Như trong năm 2012 số lượng và giá trị nhậpkhẩu đã tăng lên 103.500 tấn với khoảng 700 triệu USD

Sự phân hủy chậm của thuốc bảo vệ thực vật đặc biệt là nhóm thuốc bảo vệthực vật gốc clo hữu cơ và việc sử dụng không đúng cách thuốc bảo vệ thực vật đãlàm xuất hiện chúng ở trong môi trường và trong các sản phẩm nông nghiệp, dẫn

ngành y tế, trong năm 2012 cả nước đã xảy ra 168 vụ ngộ độc thực phẩm với 5541nạn nhân và làm chết 34 người, trong khi đó trong năm 2013 cả nước xảy ra 163 vụngộ độc thực phẩm với hơn 5000 nạn nhân, trong đó 28 người tử vong

Việc phun trực tiếp hóa chất bảo vệ thực vật lên hoa và sự có mặt của hóachất bảo vệ thực vật trong không khí là nguyên nhân chính dẫn đến mật hoa có thểchứa các loại hóa chất bảo vệ thực vật Vì vậy, trong quá trình lấy mật hoa, ong mật

(Apis mellifera) đã mang theo cả mật hoa và các hóa chất bảo vệ thực vật về tổ Đó

là nguyên nhân có thể làm xuất hiện hóa chất bảo vệ thực vật trong mật ong [23]

vùng miền Mật ong được sử dụng làm thức ăn, sản xuất hóa mỹ phẩm, dược phẩm vàđược xuất khẩu tới nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ Việc giám sát dư lượng hóa chất bảo

vệ thực vật trong mật ong giúp đánh giá rủi ro tiềm tàng của sản phẩm này đến sức khỏengười tiêu dùng, đồng thời cung cấp thông tin về loại thuốc bảo vệ thực vật đã được sử

dụng cho các loại cây trồng xung quanh khu vực nuôi ong Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu

quy trình xác định hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ trong mật ong góp phần đánh giá ô nhiễm môi trường”, được lựa chọn với mục tiêu:

nhóm clo hữu cơ trong mật ong;

trong mật ong và bước đầu đánh giá có hay không sự ô nhiễm môi trường do thuốc bảo

vệ thực vật tại khu vực lấy mẫu nghiên cứu

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật

1.1.1 Định nghĩa

Hóa chất bảo vệ thực vật hay còn gọi là thuốc bảo vệ thực vật (BVTV): lànhững chế phẩm có nguồn gốc hoá chất, thực vật, động vật, vi sinh vật và các chếphẩm khác dùng để phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật Bao gồm: cácchế phẩm dùng để phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật; các chế phẩmđiều hoà sinh trưởng thực vật, chất làm rụng hay khô lá; các chế phẩm có tác dụngxua đuổi hoặc thu hút các loài sinh vật gây hại tài nguyên thực vật đến để tiêu diệt

[3]

1.1.2 Phân loại

Có rất nhiều cách để phân loại thuốc BVTV, theo đó thuốc BVTV gồmnhiều loại, chủ yếu gồm 4 nhóm chính [4]:

hữu cơ như diphenyletan, cyclodien, benzen, hexan Nhóm này bao gồm những hợp chấthữu cơ rất bền vững trong môi trường tự nhiên và thời gian bán phân huỷ dài (ví dụ nhưDDT có thời gian bán phân huỷ là 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích luỹ vào cơ thể sinhvật qua chuỗi thức ăn) Đại diện của nhóm này là Aldrin, Dieldrin, DDT, Heptachlor,Lindan, Methoxychlor

cơ của acid photphoric Nhóm này có thời gian bán phân huỷ ngắn hơn so với nhóm Clohữu cơ và được sử dụng rộng rãi hơn Nhóm này tác động vào thần kinh của côn trùngbằng cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém,làm yếu cơ, gây choáng váng và chết Nhóm này bao gồm một số hợp chất như parathion,malathion, diclovos, clopyrifos…

chất ít bền vững hơn trong môi trường tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối với

người và động vật Khi sử dụng, chúng tác động trực tiếp vào men Cholinestraza

của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc giống như nhóm lân hữu cơ Đại diện cho nhóm này như: carbofuran, carbaryl, carbosulfan, isoprocarb, methomyl…

của các este khác nhau với cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống cúcnào đó Đại diện của nhóm này gồm cypermethrin, permethrin, fenvalarate, deltamethrin,

…

Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen),nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm,trừ vi khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp chất của đồng, thủy ngân…)

1.2 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ

Thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ chủ yếu là dẫn xuất clo của hydrocacbon đanhân, xicloparafin, tecpen… Đặc tính của thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ rất bềntrong môi trường được sử dụng phổ biến trong canh tác nông nghiệp để chống kiến,mối tha hạt Đặc điểm bền trong môi trường của chúng lúc đầu được coi là ưu điểm

vì độc tính có thể giữ được lâu, phun một lần có thể đảm bảo phòng trừ sâu bệnhtrong khoảng thời gian dài Tuy nhiên, cho đến nay thuốc BVTV có chu kỳ bánphân huỷ dài hơn 1 tuần được coi là phải kiểm soát sử dụng một cách nghiêm ngặt

Thị trường thuốc BVTV của Việt Nam rất phức tạp do nạn buôn lậu qua biêngiới, chủ yếu là từ Trung Quốc, không kiểm soát được Theo những công bố mớinhất, Trung Quốc vẫn tiếp tục sản xuất BHC, DDT để dùng nội địa và thậm chí suất

mới đáp ứng được yêu cầu của nông dân nghèo ít tiền mà vẫn cần phải có năng suất.Ngoài mục đích sử dụng trong nông nghiệp, các loại nông hoá còn được sử dụngnhiều trong y tế Trong đó, thuốc BVTV được dùng để chống muỗi, chống gián, tẩy

uế những nơi công cộng như bệnh viện, nhà ga.v.v

Tuy nhiên, do độ bền hóa học của thuốc BVTV nhóm cơ clo cao nên thuốctồn lưu lâu dài trong đất, cây trồng, nông sản, thực phẩm và làm cho môi trường bị

tiếp xúc hoặc qua chuỗi thức ăn có thể gây ngộ độc hoặc gây ra các bệnh hiểm

4

nghèo như ung thư, quái thai… Do những nhược điểm trên, ngày nay nhiều thuốcBVTV thuộc nhóm cơ clo đã bị cấm hoặc hạn chế sử dụng ở nhiều nước.

Một số thuốc BVTV nhóm cơ clo được nghiên cứu trong luận văn bao gồm:hợp chất nhóm DDT, hợp chất nhóm BHC, hợp chất nhóm Chlordane

1.2.1 Hợp chất nhóm DDT

DDT được điều chế từ phản ứng trùng ngưng giữa chlorobenzene vớitrichloroacetaldehyde và sản phẩm DDT công nghiệp thường có 30% đồng phâno,p- cũng có tính diệt côn trùng nhưng sản phẩm chính là p,p’-DDT Do vậy, khi đềcập đến DDT người ta thường quan tâm đến p,p’-DDT Các thành phần khác trong

DDT bị khử clo trong điều kiện yếm khí tạo thành DDD (hình 1.1), đây cũng

là một chất diệt côn trùng DDT bị khử clo và hydro trong điều kiện hiếu khí lạichuyển thành DDE (hình 1.1) (tính độc DDT > DDE > DDD) Độ bền DDE > DDD

Cả ba loại hợp chất này có nhiều đồng phân nhưng quan trọng hơn cả là các đồng phânp,p’- [1]

Hình 1.1 Sự chuyển hóa của DDT thành DDE và DDD

Tính chất hóa lý của nhóm thuốc DDT, DDD và DDE được nêu trong bảng 1.1: [8], [21]

Bảng 1.1 Tính chất của DDT và các chất chuyển hóa của nó

6

CTPT: C14H9Cl5M= 354.49 đvC

Tnc= 76-780C

1.2.2 Hợp chất nhóm BHC

BHC gồm tám đồng phân nhưng chỉ có α-BHC, β-BHC, γ-BHC, δ-BHC làquan trọng về mặt thương mại và được quan tâm nhiều Đây là những đồng phân có

sự sắp xếp không gian của các nguyên tử chlor trong phân tử BHC đối xứng quavòng cyclohexane Thuốc BVTV Lindan được sản xuất có chứa trên 98% γ-BHC,

của nhiều đồng phân gồm 60 – 70% α-BHC, 5 – 12% β-BHC, 10 – 15% γ-BHC và

δ-BHC > α-δ-BHC > δ-BHC Trong số các đồng phân của δ-BHC chỉ có đồng phân BHC là có tính diệt côn trùng và nó được biết đến ở Việt Nam từ những năm 60 củathế kỷ trước như một thần dược với tên gọi 666 dùng để chống muỗi, kiểm soátbệnh sốt rét cùng với DDT

γ-Tính chất hóa lý của các đồng phân phổ biến nhóm BHC được nêu trongbảng 1.2: [15], [21]

Bảng 1.2 Tính chất của BHC và các đồng phân của BHC

STT Công thức cấu tạo Tên gọi Thông số cơ bản

CTPT: C6H6Cl6α-BHC

CTPT: C6H6Cl6M= 209.83 đvC

Tỷ trọng: 1.89 ở 190Cg/cm3

Dearth và Hites (1991) [13] đã nhận dạng được với 147 hợp chất khác trongchlordane kỹ thuật và phần trăm tổng cộng của 12 hợp chất phổ biến nhất là: cis-Chlordane, 15%; trans-Chlordane, 15%; trans-Nonachlor, 9,7%; octachlordane,

8

3,9%; heptachlor, 3,8%; cis-Nonachlor, 2,7%; hợp chất K, 2,6%; dihydrochlordene,2,2%; nonachlor III, 2%; và 3 stereoisomeric dihydroheptachlors với thành phần10,2% 12 hợp chất gồm 67% của hỗn hợp này, và 33% còn lại gồm hỗn hợp của

135 hợp chất khác

Infante và cộng sự (1978) đã báo cáo một mẫu khác của chlordane kỹ thuật

có thành phần gồm 38 - 48% cis- và trans-Chlordane, 3 - 7 hoăc 7 - 13% heptachlor,

5 - 11% nonachlor, 17 - 25% đồng phân chlordane khác và một lượng nhỏ nhữnghợp chất khác

Tóm lại, nhóm Chlordane có 5 đồng phân chính đó là cis-Chlordane, Chlordane, cis-Nonachlor, trans-Nonachlor và heptachlor

trans-Một số tính chất vật lý và mục đích sử dụng của các chất tiêu biểu trongnhóm thuốc BVTV cơ clo được thể hiện trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số tính chất vật lý của các nhóm thuốc BVTV

tiêu biểu thuộc họ clo hữu cơ

STT Tên hợp Mục đích sử dụng Trạng thái Độ hoà tan Áp suất

điều kiện ở điều kiện hoà,

mg/l

-BHC

(20oC)

1.3 Giới thiệu chung về ong mật và sản phẩm mật ong

Ong mật là một loại động vật được yêu chuộng nhất trên thế giới Trên thế

giới có hơn 80.000 loại côn trùng, chỉ riêng có ong mật mới là loại có thể cung cấp

thức ăn cho con người, nên con người luôn luôn đi tìm tòi và nghiên cứu về loạiđộng vật nhỏ bé này Chân của ong mật có một bộ bàn chải rất thích hợp cho việclấy phấn hoa, chân nó như một bàn chải, như một cái lược, cái bừa, cái làn để đựngphấn Số hạt phấn hoa có thể mang trên mình ong tới 5 triệu hạt, vượt xa các loạicôn trùng khác Ong mật có thị giác và khứu giác đặc biệt, đôi mắt có nhìn rất xa, cóthể phân biệt các màu sắc: trắng, vàng, lam, tím nhạt và nhìn thấy cả tia tử ngoại màmắt người không thể nhìn thấy được Cơ quan khứu giác của ong là một cặp góctương xứng di động, không ngừng xoay bốn phía, có thể ngửi thấy mùi hoa với độthơm cực ít, nên nó có thể tìm ngay tới mục tiêu, tiết kiệm thời gian đi tìm Mặtkhác với đôi cánh khỏe, tốc độ bay mỗi giây đạt 400 lần đập cánh, đạt 60km/giờ,một con ong mỗi lần bay đi có thể thu hút hoa phấn tới mấy trăm bông nên hiệu quảrất cao Ngoài ra trong cơ thể ong còn có các túi mật hoa, có thể chứa một trọnglượng bằng 1/2 trọng lượng cơ thể ong, tại tổ ong có kho chứa phấn hoa và mật hoa.

1.3.1 Tổ chức xã hội đàn ong [2]

Ong mật có đặc tính sống thành xã hội, đàn ong là một đơn vị sinh học hoànchỉnh gồm 3 loại: Ong chúa, ong đực, ong thợ Mỗi loại có một chức năng sinh họcnhất định trong đàn, có mối quan hệ chặt chẽ với nhau

khối lượng của nó lớn nhất đàn Ong chúa lớn nhất đàn, dáng cân đối, bụng thon dài lộsau đỉnh cánh, chúa mới đẻ có lớp lông tơ nhiều, mịn, bò nhanh nhẹn Ong chúa là ongcái duy nhất có cơ quan sinh dục phát triển hoàn chỉnh để giao phối với ong đực Nhiệm

vụ chủ yếu của ong chúa là đẻ trứng và tiết chất chúa (Feromon) để điều tiết hoạt độngcủa đàn ong Tuổi thọ trung bình của ong chúa là 3 năm nhưng sức đẻ trứng của ong chúachỉ cao nhất trong năm đầu tiên Khi già, khả năng đẻ trứng của ong chúa giảm dần,lượng Feromon sản sinh ít và đẻ nhiều trứng không thụ tinh Khi đó, đàn ong có thể sẽtạo chúa để thay thế chúa già hoặc thay thế đàn

con ong đực, chúng có màu đen, to hơn ong thợ, ngắn hơn ong chúa, đôi cánh dài

hơn mình nó Ong đực chậm chạm, ăn cũng nhờ ong thợ bón Ong đực được sinh ra

10

từ trứng không thụ tinh có nhiệm vụ giao phối với ong chúa, chỉ có một con ong đựckhỏe mạnh nhất đàn mới thụ tinh cho ong chúa Ong đực sau khi thụ tinh cho ongchúa thì chết hoặc khi thiếu ăn chúng sẽ bị ong thợ đuổi ra ngoài và bị chết đói Tuynhiên, ong đực là một bộ phận không thể thiếu được của đàn ong, chỉ sau khi giaophối với ong đực, ong chúa mới có khả năng đẻ ra các trứng đã thụ tinh Từ nhữngtrứng này sẽ nở ra ong thợ và ong chúa thế hệ sau Tuổi thọ trung bình của ong đực

là 50 – 60 ngày Tuy ong đực không đóng góp gì vào các hoạt động xã hội của đànong như nuôi ấu trùng, sản xuất mật mà chúng còn tiêu thụ một số thức ăn và sự cómặt của chúng làm nâng cao nhiệt độ trong tổ Song bằng Feromon của chúng hoặcbằng cách nào đó, sự có mặt của chúng cũng có tác dụng làm cho đàn ong ổn định

các cơ quan phù hợp với chức năng của ong thợ Các nhiệm vụ chính của ong thợ là vệsinh tổ, vít lắp lỗ tổ; nuôi ấu trùng, chăm sóc, nuôi dưỡng ong chúa; tiết sáp, xây cầu vàkiếm mật Tuy nhiên, nhiệm vụ chủ yếu của ong thợ là hút mật hoa và chế biến mật hoathành mật ong Các nhà nghiên cứu cho rằng, sau khi ong thợ hút mật hoa về, tuyến hạhầu của chúng tiết ra enzym Invectaza và Gluco-oxydaza để chuyển hóa đường saccarozathành đường glucoza, chế biến thành mật ong, dự trữ lại trong các tổ và dự trữ tới mức dưthừa nhu cầu trong tương lai của đàn ong

1.3.2 Mật ong [2]

1.3.2.1 Quy trình tạo thành mật ong

Mật ong là sản phẩm do ong mật làm ra từ mật hoa, mật của dịch lá Bướcđầu tiên trong quá trình làm mật được bắt đầu khi những con ong bay từ cây hoanày sang cây hoa khác để “thu thập” mật hoa Chúng sử dụng những chiếc vòi củamình để hút mật từ hoa và cất giữ trong một cái túi dạ dày đặc biệt của mình Loàiong có hai cái dạ dày – một chiếc dạ dày dùng để đựng mật hoa gọi là dạ dày mậtong và một chiếc dạ dày thông thường dùng để tiêu hoá thức ăn Dạ dày mật ong cóthể chứa tới gần 70mg mật hoa và khi đầy, nó sẽ nặng gần bằng trọng lượng củamột chú ong

11

Những con ong phải cần đến khoảng từ 100 đến 1500 bông hoa mới làm đầyđược chiếc dạ dày của mình Sau đó, chúng sẽ trở về tổ và sẽ chuyển lượng mật hoa

dự trữ ấy cho những con ong thợ khác ở nhà Những con ong thợ này sẽ hút mật hoa

từ những con ong nói trên vào miệng của mình, sau đó sẽ “nhai” mật hoa trong vòngkhoảng nửa tiếng, trong thời gian đó, enzim trong miệng sẽ chuyển hóa các loạiđường phức tạp trong mật hoa thành những loại đường đơn giản vì thế nó sẽ vừa dễtiêu hoá hơn vừa giảm khả năng xâm nhập của các loại vi khuẩn trong quá trình cấtgiữ Những con ong sau đó sẽ phân phối mật hoa vào những cái ngăn ở bên trong tổ

mà tại đó nước trong mật hoa sẽ bị cô cạn và mật hoa sẽ biến thành một chất xi-rôđậm đặc hơn Những con ong dùng những chiếc cánh của mình để làm khô mật hoa.Ngay khi mật đủ đặc, ong sẽ đóng nắp những cái ngăn đó lại bằng một cái nút sápong

Mật ong là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, được sử dụng làm thức ăn bổsung cho con người trong nhiều loại thực phẩm và là vị thuốc tự nhiên chữa đượcnhiều bệnh như viêm họng, bệnh đường ruột, viêm gan

1.3.2.2 Phân loại mật ong

Mật ong được chia thành nhiều loại khác nhau, nhưng chủ yếu được phânlàm 3 loại là: mật ong hoa, mật ong dịch lá, mật ong hỗn hợp

nhiều hoa mà mật ong được chia làm 2 loại là mật ong đơn hoa và mật ong đa hoa Mậtong đơn hoa như: mật ong hoa nhãn, mật ong hoa vải, mật ong hoa bạch đàn,…Mật ong

đa hoa gồm một số loại như mật ong vải nhãn, mật ong hoa rừng,…

của cây, ví dụ mật ong đay, mật ong cao su,…

ví dụ mật ong cao su - vải, mật ong cà phê – bạch đàn - táo – đay

Sự đa dạng và phong phú của các cây nguồn mật tạo nên các loại mật ongkhác nhau như mật ong hoa vải, mật ong hoa nhãn, mật ong hoa bạch đàn, mật ongrừng… Các loại mật ong khác nhau có màu sắc, hương vị đặc trưng riêng như mật

12

ong hoa nhãn có màu hổ phách, mật ong hoa bạc hà có màu hơi xanh xanh, mật ongvùng Mộc Châu có màu vàng trong,…

1.3.2.3 Tính chất và thành phần hóa học của mật ong

Mật ong có màu sắc và mùi vị đặc trưng cho từng loại hoa mà ong lấy mật.Dựa vào tính chất này, người ta có thể nhận biết được nguồn gốc địa lý của mật ongthông qua phương pháp phân tích phấn hoa

Mật ong rất nhạy cảm với nhiệt độ và ánh sáng trực tiếp, do vậy nên đựngmật ong trong những lọ, chai thủy tinh mờ và bảo quản ở những nơi thoáng mát(nhiệt độ không quá 36oC)

Mật ong có tính chất lên men, khi tỷ lệ nước trong mật ong cao, vượt quá21%, mật dễ bị lên men sinh ra khí CO2 làm cho mật bị chua, chất lượng mật giảm.Đặc biệt, nếu sử dụng các đồ đựng mật bằng kim loại, mật có thể bị biến chất, gâyngộ độc cho người sử dụng vì trong mật ong có chứa axit hữu cơ và đường, dưới tácdụng của men, sẽ sinh ra axit etylenic ăn mòn lớp kim loại và làm tăng thêm hàmlượng kim loại trong mật ong

b Thành phần hóa học của mật ong

Thành phần hóa học của mật ong khá phức tạp vì chứa đến 80 các loại chấtkhác nhau có liên quan đến dinh dưỡng Thành phần chính và tỷ lệ các chất hóa họcquan trọng của mật ong thể hiện ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của mật ong [11]

STT Thành phần hóa học Tỷ lệ trung bình (%) Biên độ giao động (%)

số emzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa và điều hòa các hoạtđộng của cơ thể.

1.3.3 Vai trò của cây nguồn mật phấn đối với ong [2]

Cây nguồn mật có vai trò quan trọng đối với ong bởi thức ăn chủ yếu của ong

là mật hoa, phấn hoa Mật hoa và phấn hoa có thể cung cấp tất cả các năng lượngcần thiết cho ong Trong mật hoa có nhiều loại đường, chủ yếu là saccaroza,glucoza, fructoza,… là nguồn năng lượng cơ bản cho sự sinh tồn và sản xuất củađàn ong, trong đó, một phần mật hoa mà ong lấy được để sinh trưởng và phát triểnđàn, phần mật hoa dư thừa ong luyện thành mật ong dự trữ trong các lỗ tổ Lợi dụngđặc điểm này, con người đã trồng các loại cây nguồn mật cho ong và khai thác mậtong, đem lại hiệu quả kinh tế cho nghề nuôi ong

Cơ sở để phân loại cây nguồn mật là dựa vào lượng mật có trong hoa, cácvùng địa lý, phân loại thực vật, cơ quan tiết mật của cây,… Cây nguồn mật đượcchia làm 2 loại, đó là cây nguồn mật chính (cây nguồn mật chủ yếu) và cây nguồn

14

mật hỗ trợ Cây nguồn mật chính là cây tiết nhiều mật, số cây nhiều và tập trung.Cây nguồn mật hỗ trợ là những cây có mật, phấn cho ong ăn nhưng không đủ khaithác.

nở hoa của cây nguồn mật đã tạo nên các vụ mật chính trong năm

Các loại cây nguồn mật chủ yếu ở nước ta bao gồm:

đồng bằng và trung du Bắc Bộ Thời gian nở hoa từ 20/2 – 3/4 hàng năm Một ha cây vải

có thể khai thác được 120 – 140 kg mật ong

Bắc Bộ, có nhiều ở Hải Dương và Hưng Yên, đồng bằng sông Cửu Long (Tiền Giang,Bến Tre) Thời gian nở hoa từ 10/3 – 15/4 Trung bình một ha có thể khai thác được 100– 125kg mật ong

Tum), Khu IV cũ (Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh) Ong khai thác dịch ngọt tiết ra từ lá cây Thờigian tiết mật từ 15/2 – 30/4 Một ha cao su có thể khai thác được 70 – 75 kg mật ong.Đây là nguồn mật xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam do diện tích cây cao su khá lớn

nhiều ở vùng Thái Bình, Hưng Yên, Hà Nam, nhưng nay diện tích bị thu hẹp nhiều Ongkhai thác mật từ lá cây, thời gian tiết mật từ 15/4 – 3/6 Một ha có thể khai thác được50kg mật

Phúc, Bắc Giang Một ha bạch đàn có thể khai thác được 100 – 150 kg mật ong

cho năng suất và chất lượng mật khá tốt Đặc biệt là mật ong khai thác từ hoa táo và hoabạc hà dại có hương vị rất đặc trưng

1.3.4 Cách thức nuôi ong ở Việt Nam

15

Ở Việt Nam, nhân dân ta đã biết nuôi ong từ lâu, việc nuôi ong Apis cerana

đõ nằm sang đõ đứng có cầu di động Trong khai thác sản phẩm đã biết chỉ cắt một phầnmật, còn phần trứng và ấu trùng thì buộc lại xà cầu cho ong tiếp tục sinh sản và làm mật

Ở các tỉnh trung du miền núi, nhân dân có kinh nghiệm bắt ong rừng về nuôi nhưng việcnuôi ong của nước ta trước năm 1960, chủ yếu là nuôi theo kiểu dã sinh, đàn ong tự sinh,

tự diệt, lấy mật theo kiểu cắt bánh tổ vắt lấy mật nên năng suất thấp, chỉ khoảng 2-3kg/đàn/năm Sau vụ mật, đàn ong bốc bay có nơi tới 90%

Từ sau những năm 60 đến nay, kỹ thuật nuôi ong ở nước ta có nhiều tiến bộ.Đàn ong được nuôi trong kiểu thùng cải tiến của Trung Quốc, sử dụng thùng quay litâm để quay mật, sản xuất ra chân tầng nhân tạo nên năng suất mật cao, bình quângấp 5 - 7 lần so với trước [2]

Vào mùa hoa nở (tháng 2 đến tháng 4 của năm) là lúc nguồn mật cho ong rấtphong phú, chủ nuôi ong sẽ mang các thùng ong đến đặt ở những nơi có đủ nguồnmật cho ong như tại các vườn hoa nhãn, hoa vải, hoa mận, hoa rừng… và thực hiệnquay mật ngay tại nơi đặt thùng ong Mật ong thu được có mùi thơm đặc trưng củatừng loại cây nguồn mật Vào những thời điểm nguồn mật tự nhiên giành cho ongkhan hiếm (mùa đông), để duy trì sự sống cho đàn ong, người ta thường cho ong ănmật, ăn đường… Lúc này, lượng mật ong thu được ít và có chất lượng thấp

1.4 Nguồn gốc xuất hiện các hóa chất BVTV trong mật ong

Từ lâu nước Việt Nam ta đã hình thành những loài cây ăn quả nổi tiếng, ởmiền Bắc có nhãn lồng Hưng Yên, vải Thanh Hà Ngày nay, trong quá trình chuyểnđổi cơ cấu cây trồng, những loài cây ăn quả đó đã vượt qua vùng sản xuất truyềnthống đến những vùng trồng mới như vải thiều Lục Ngạn, nhãn Sông Mã, VănChấn,… Sự phát triển về cây nguồn mật tạo điều kiện cho kinh tế phát triển, cuộcsống người dân được cải thiện Song bên cạnh đó đã hình thành một hệ sâu bệnhgây hại Để phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng, con người đã sử dụng một lượngthuốc hóa học khổng lồ 210.000 tấn/năm (FAO 1981)

Theo Cục BVTV (2012) cho biết: qua thanh kiểm tra, các cơ quan ước tínhkhông dưới 25% số hộ nông dân thường xuyên vi phạm trong việc sử dụng thuốcBVTV, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sản xuất, cộng đồng và môi trường.Thiếu hiểu biết về tác hại của thuốc và vì lợi nhuận trước mắt, họ sử dụng bừa bãithuốc không rõ nguồn gốc, không đúng đối tượng sâu bệnh nên gây ra hiện tượngkháng thuốc và không phát huy tác dụng của thuốc BVTV, ô nhiễm môi trườngsống, …

Việc phun thuốc thường thực hiện trước khi hoa nở, nhưng nhiều trường hợp

do điều kiện mùa hoa nở vào cuối tháng 3 đầu tháng 4, thời tiết mưa phùn tạo điềukiện cho nấm bệnh hại hoa phát triển nên ngay cả khi hoa nở vẫn còn phun thuốc

Việc phun thuốc BVTV trên các cây nguồn mật như nhãn, vải, xoài, cam,chanh, mận, gioi, lúa,… khi hoa nở, hay có những loài phun thuốc khi không có hoa

nở nhưng thuốc rơi xuống cỏ hoa cũng sẽ gây ngộ độc cho ong mật Khi phun thuốctheo chiều gió thuốc có thể bay vào cửa tổ ong Có thể thuốc BVTV nhiễm vàonước, dính vào dụng cụ nuôi ong, vào chân tay, quần áo người nuôi gây tác hại choong Thuốc xâm nhập vào cơ thể ong qua đường hô hấp Bị ngộ độc thuốc BVTVnặng ong sẽ chết Ong thu được mật và phấn nhiễm thuốc BVTV sẽ mang về tổ khi

đó mật ong sẽ có thuốc BVTV Mật này làm thức ăn nuôi ấu trùng làm ấu trùng chếthoặc ra đời yếu ớt, bay khó khăn, tuổi thọ giảm, đàn ong sa sút

Mỗi ngày, 10.000-25.000 con ong làm việc trung bình 10 chuyến đi để khámphá khoảng 7 km2 trong khu vực gần tổ của chúng, thu thập mật hoa, nước, và phấn

từ hoa Trong quá trình này, các vi sinh vật khác nhau, các loại hóa chất, và các hạt

lơ lửng trong không khí, được chặn bởi các con ong này và giữ lại trên lớp lông bềmặt cơ thể của chúng, hoặc hít vào và giữ lại trên khí quản của chúng [14] Vì vậy,bằng cách dễ dàng đó, hầu hết các sinh vật ở khắp mọi nơi, với yêu cầu thực phẩmkhiêm tốn, rất nhạy cảm với các yếu tố sinh học, hóa học, và vật lý, chẳng hạn như

ký sinh trùng, chất gây ô nhiễm công nghiệp, thuốc trừ sâu và có thể được sử dụngnhư một chỉ thị sinh học để theo dõi tình trạng môi trường [10], [16] Hơn thế nữa,

sự liên hệ của ong mật với hầu hết các yếu tố môi trường (đất, thảm thực vật, nước,

17

không khí) nên ong giúp cung cấp nhiều thông tin chỉ thị môi trường (thông qua tìmkiếm thức ăn) cho mỗi mùa Cuối cùng, nhiều loại vật chất được đưa vào tổ ong(mật hoa, phấn hoa, dịch ngọt, sáp ong và nước) và được lưu trữ trong mật ong [24].

Do đó sản phẩm mật do ong tạo ra bị nhiễm thuốc BVTV

1.5 Một số nghiên cứu xác định dư lượng thuốc BVTV trong mật ong

1.5.1 Phương pháp chiết lỏng-lỏng kết hợp với sắc ký khí khối phổ

Dư lượng 48 loại thuốc trừ sâu họ halogen hữu cơ, photpho hữu cơ,pyrethroid và nito hữu cơ trong các mẫu mật ong được sản xuất tại Brazil được xác

tan trong nước, lắc đều Tiếp theo mẫu được chiết bằng 50 mL dung môi etyl axetat

để chiết bằng cách khuấy trong 20 phút Pha hữu cơ được tách ra khỏi mẫu bằngcách ly tâm hỗn hợp chiết đã nêu trên Thu lấy dung mỗi hữu cơ ở lớp phía trên,chiết mẫu thêm một lần nữa bằng etyl axetat Gộp hai phần lại và làm cô cạn trongmột thiết bị quay cất chân không ở áp suất thấp ở 65oC, làm khô phần mẫu còn lạinhờ dòng khí N2 tinh khiết Cuối cùng, phần mẫu khô được hòa tan trong 5 mL etylaxetat và lọc mẫu còn lại qua giấy lọc có kích thước lỗ 0,5 µm Dịch chiết được làmsạch bằng cách cho qua cột Florisil đã được hoạt hóa bằng 5 mL axeton, dung môirửa giải chất phân tích ra khỏi cột Florisil là 10 mL hỗn hợp hexan:etyl axetat tỉ lệ50:50 Sau khi hoàn thành bước rửa giải, dung dịch thu được được cô cạn nhờ dòngkhí N2 và được hòa tan trở lại trong 1 mL etyl axetat, sau đó đem phân tích trênGC/MS

Trong số 48 loại thuốc trừ sâu nghiên cứu, có 45 loại có giới hạn phát hiện(LOD) thấp hơn 0,005mg/L, trong đó 28 loại có LOD bằng hoặc thấp hơn 0,001mg/L Giới hạn định lượng (LOQ) của các chất nghiên cứu biến thiên trong khoảng

từ 0,0010 mg/L đến 0,0200 mg/L

1.5.2 Phương pháp chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí khối phổ

cơ, photpho hữu cơ và thuốc diệt ve trong các mẫu mật ong được xác định đồng

thời bằng phương pháp chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí khối phổ [9] Theo đó,

mật ong được hòa tan trong hỗn hợp nước:metanol (70:30), sau đó chuyển vào cộtC18 (1 g) đã được hoạt hóa bởi axetonitril và nước Các chất phân tích được rửa giảibằng hỗn hợp hexan:etyl axetat Dung dịch sau rửa giải được thổi khô và đem xácđịnh bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Khối phổ làm việc theo chế độ chọnlọc ion.

Giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích đối với từng loại thuốc trừ sâu

có giá trị trong khoảng 0,1-6,1μg/kg Khoảng tuyến tính thu được từ 25-200 µg/Kgvới hệ số xác định > 0,996

Bên cạnh đó, một số tác giả đã cải tiến phương pháp chiết pha rắn để phântích đồng thời 42 loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm clo hữu cơ, carbamate, và phốt phohữu cơ trong các mẫu mật ong Trong đó nhóm photpho hữu cơ và cacbamat đượcphân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đề ion ở áp suất khí quyển(LC/APCI/MS) [12]

Với phương pháp này, giới hạn định lượng của phương pháp LC/APCI/MSđối với từng loại thuốc trừ sâu nhóm phốt pho hữu cơ và cacbamat từ 0,005-0,1mg/kg LOQ của phương pháp GC/MS đối với từng loại thuốc trừ sâu nhóm clo hữu

cơ trong khoảng 0,003-0,2 mg/kg Độ thu hồi của phương pháp LC/APCI/MS là 95%, độ thu hồi của phương pháp GC/MS là 79-98%

73-Detectơ quang hóa ngọn lửa (FPD) sử dụng trong sắc ký khí và detectơhuỳnh quang (FL) sử dụng trong sắc ký lỏng cũng được sử dụng để thực hiện xácđịnh đồng thời dư lượng 15 loại thuốc trừ sâu nhóm phốt pho hữu cơ (OP), 17 loạinhóm clo hữu cơ (OC), 8 loại nhóm Pyrethoid (PYR), 12 loại nhóm N-metyl-

Theo đó, khoảng tuyến tính trong xác định các chất được tìm thấy là từ

nghiên cứu Hầu hết các thuốc trừ sâu có độ thu hồi trong khoảng 70-103% Các giátrị LOQ cho tất cả các loại thuốc trừ sâu nghiên cứu dao động từ 0,0005-0,025mg/kg, giá trị LOD từ 0,0002-0,008 mg/kg

19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là sản phẩm mật ong nuôi tại các tỉnh Hưng Yên, BắcGiang, Lạng Sơn Mật ong được lấy trực tiếp vào các tháng 2, 3 và 4 năm 2014 từ

cơ sở nuôi ong tại xã Hồng Nam huyện Tiên Lữ tỉnh Hưng Yên; xã Giáp Sơn huyện Lục Ngạn - tỉnh Bắc Giang; xã Bằng Khánh - huyện Lộc Bình - tỉnh LạngSơn Ở những nơi lấy mẫu, các thùng ong được đặt trong những vườn cây ăn quảnhư nhãn, vải, mận… Vào thời điểm tháng 2 đến tháng 4 là mùa hoa nở, hàng ngàychủ nuôi ong sẽ thả đàn ong ra để chúng đi hút mật tại các vườn cây ăn quả này

-Các chất lựa chọn nghiên cứu xác định trong mật ong là nhóm chất clo hữu

cơ, bao gồm: α-BHC; Hexachlorbenzen (HCB); β-BHC; γ-BHC; δ-BHC;Heptachlor; α-Chlordene; β-Chlordene; Oxychlordane; trans-Chlordane; o,p’-DDE;cis-Chlordane; trans-Nonachlor; p,p’-DDE; o,p’-DDD; cis-Nonachlor; o,p’-DDT;p,p’-DDD; p,p’-DDT Trong đó, các hợp chất của BHC, DDT, Chlordane,Hexachlorbenzen và Heptachlor đều nằm trong danh mục thuốc BVTV cấm sửdụng ở Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập và tổng hợp tài liệu

Luận văn có sử dụng các tài liệu thuộc nhiều nguồn khác nhau, trong đó cócác bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học trong nước và quốc tế; các sáchchuyên đề về nông nghiệp, hóa chất bảo vệ thực vật trong và ngoài nước; các báocáo tại các hội nghị khoa học;… Mục đích của phương pháp là thu thập, tiếp thu cóchọn lọc các công trình nghiên cứu, các thông tin, tài liệu có liên quan

Từ các tài liệu thu thập và tổng hợp được, chúng tôi nhận thấy quy trình phântích dư lượng thuốc BVTV thường có các bước sau: lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, táchchiết, làm sạch, phân tích trên máy, xử lý kết quả Kết quả phân tích có độ chính xáccao là cơ sở cho các quyết định và hành động sau đó Để đạt được điều đó,

phòng thí nghiệm phải chuẩn hóa thiết bị, dụng cụ, lưu mẫu và chất chuẩn tại điềukiện tiêu chuẩn.

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và chuẩn bị mẫu

2.2.2.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản

Mẫu mật ong được lấy trực tiếp ở những vùng chuyên sản xuất mật ong Mẫuđược đựng trong các lọ thủy tinh màu nâu và sạch, vận chuyển về phòng thí nghiệm

nhãn mác, ghi đầy đủ các thông tin cần thiết tránh nhầm lẫn

2.2.2.2 Phương pháp tạo mẫu phân tích

Chọn một số mẫu ở cùng cơ sở sản xuất, trộn đều, sau đó lấy 1 phần làm mẫuphân tích (mẫu đại diện trong phân tích) Phần còn lại được bảo quản để dùng chonhững mục đích khác

2.2.2.3 Phương pháp tạo mẫu so sánh

Từ mẫu thực đã trộn đồng nhất lấy ra hai mẫu: một mẫu cho thêm chất chuẩn(mẫu tự tạo), mẫu còn lại giữ nguyên (mẫu trắng) Tiến hành phân tích hai mẫu này

Ưu điểm của phương pháp SPE là khả năng làm giàu mẫu cao, giúp loại bỏảnh hưởng của các chất gây nhiễu, quy trình thực hiện dễ tự động hoá, phù hợp vớiphân tích sắc ký và giảm lượng dung môi sử dụng so với phương pháp chiết lỏng -lỏng thông thường

b Cấu tạo cột SPE

21

Cột SPE có nhiều dạng nhưng loại thường sử dụng là những cột nhỏ có dạngthân ống tiêm, bên trong nhồi các pha tĩnh Pha tĩnh nhồi vào cột chiếm bề dày cộtkhoảng 0,5 - 2cm, lượng sử dụng từ 100mg đến 1g, trong một số trường hợp có thểlên đến vài gram Trong cột có 2 đĩa thuỷ tinh xốp giúp giữ pha tĩnh để không chochúng đi ra khỏi cột theo dung môi và giữ cho cột ổn định.

Cột SPE có 3 loại:

hạt silic oxit tạo thành các mạch không phân cực Các mạch gắn trên SiO2 thực hiện chứcnăng tách các chất không phân cực hay ít phân cực

nhóm chức như -OH, -NH2, -CN dùng chủ yếu để tách các chất tương đối phân cực.Phần lớn được sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thường (cột ghép –CN có thể sửdụng trong pha đảo)

cột SCX tách cation)

c Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Bước 1: Hoạt hoá pha tĩnh

Cho dung môi thích hợp chảy qua pha tĩnh để thấm ướt vật liệu nhồi và đểsolvat hoá các nhóm chức của chất hấp phụ, đồng thời loại bỏ không khí và các chấtbẩn trong cột

Để hoạt hoá cột có thể sử dụng hai dung môi có khả năng chiết tách mạnh:

tách của dung môi sẽ được sử dụng cuối cùng để rửa giải hết các chất phân tích ra khỏicột

môi 1 Dung môi 2 này có khả năng chiết tách chất gần bằng dung môi 3 (dung môi đểhoà tan hỗn hợp chất cần phân tích)

Trong quá trình hoạt hoá cột không được để cột bị khô dung môi

Bước 2: Cho mẫu chảy qua cột

Hoà tan mẫu phân tích vào dung môi 3 (dung môi 3 phải có khả năng chiếttách yếu đối với chất phân tích được giữ lại trên cột SPE) rồi dội mẫu qua cột.Trong quá trình này chất phân tích được giữ lại trên cột Dung môi và phần lớn tạpchất được rút từ từ ra khỏi cột dưới tác dụng của áp suất thấp tạo bởi bơm chânkhông.

Bước 3: Rửa các tạp chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

Quá trình này sẽ loại bỏ tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại chất phân tích.Nếu mẫu hoà tan trong nước thì nên sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ Nếu mẫu hoà tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa các tạp chất

ra khỏi cột cần sử dụng chính dung môi hữu cơ này

Bước 4: Giải hấp chất phân tích khỏi cột

Tách từ từ cấu tử các chất phân tích ra khỏi cột bằng dung môi 1 hoặc nhữngdung môi thích hợp có khả năng chiết tách chất theo hướng tăng dần Trường hợpdung môi dùng để giải hấp không tan trong dung môi đã sử dụng để rửa tạp thì phảirút chân không nhẹ để làm khô cột trước khi cho dung môi giải hấp vào

Về nguyên tắc không nên sử dụng dung môi có khả năng chiết tách quámạnh vì có thể lôi kéo theo cả những tạp chất không mong muốn trong quá trìnhgiải hấp Ngược lại nếu khả năng chiết tách của dung môi quá yếu thì sẽ phải sửdụng một lượng dung môi lớn thì mới có thể giải hấp hết các chất phân tích trên cột

Do thuốc bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ là những chất không phân cựchoặc ít phân cực nên trong đề tài này sẽ sử dụng cột chiết pha rắn là cột C18

2.2.3.2 Phương pháp sắc ký cột

Để phân tích thuốc BVTV bằng phương pháp sắc ký khí trong các đối tượngmẫu mật ong khác nhau (có thành phần cấu tử trong mẫu phân tích rất phức tạp) thìcần phải được tiến hành bước làm sạch nhằm loại bỏ các cấu tử gây cản trở phântích (phần lớn lượng tạp chất đi kèm theo thuốc BVTV cần phân tích) Tạp chấttrong mẫu có thể gồm các amin, phenol, axit hữu cơ, đường, dầu thực vật, chất màu,diệp lục… các chất này gây ảnh hưởng đến khả năng phát hiện của detectơ ECD Vìvậy quá trình làm sạch các cấu tử gây cản trở có trong dịch chiết mẫu là giai đoạn

23

bắt buộc khi phân tích hóa chất BVTV bằng phương pháp GC sử dụng detectơECD Quá trình làm sạch dịch chiết được thực hiện trên sắc ký cột.

Để loại bỏ tiếp tục các tạp chất trong dịch chiết mẫu đã tách trên cột chiếtpha rắn cần sử dụng cột sắc ký hấp phụ Những cột này chứa chất hấp phụ ổn định

về tính chất, kích thước hạt đồng nhất, hoạt độ phù hợp với tách chất

Các chất hấp phụ dùng cho giai đoạn làm sạch thường là nhôm oxit, magiesilicat biến tính (florisil), silicagel không biến tính (silicagel thường), các polime,…Các vật liệu hấp phụ này có khả năng loại trừ các chất gây ảnh hưởng tới quá trìnhphân tích, đó là hợp chất béo, các hydrocacbon thơm, các hợp chất hữu cơ chứaNitơ Các chất hấp phụ được nhồi vào cột sắc ký có khóa điều chỉnh tốc độ dòngdung môi rửa giải Các chất sau khi hấp phụ trên cột sắc ký sẽ được rửa giải bằngdung môi thích hợp

Trong nghiên cứu này sử dụng cả 2 phương pháp để làm sạch trên để làmsạch mẫu: phương pháp chiết pha rắn và phương pháp sắc ký cột

2.2.3.3 Làm giàu mẫu

Trong quá trình phân tích lượng vết các loại thuốc BVTV, do lượng chất quánhỏ nên cần làm giàu chất cần xác định để tăng nồng độ chất bằng cách làm bay hơidung môi tới thể tích phù hợp nhờ dòng khí N2 hoặc bằng cách chưng cất quay chânkhông

2.2.3.4 Phương pháp phân tích sắc ký khí

a Nguyên lý

Đây là kĩ thuật tách chất từ hỗn hợp các cấu tử ở dạng hơi nhờ vào sự dichuyển khác nhau của chúng thông qua cột chứa pha tĩnh là chất lỏng hoặc rắn Cácchất cần tách di chuyển qua cột nhờ pha động ở dạng khí và chúng sẽ được pháthiện từ pha khí sau khi được rửa giải ra ở cuối cột Bộ phận phát hiện tín hiệu sẽsinh ra một tín hiệu điện, được khuếch đại và được ghi lại dưới dạng sắc đồ biểudiễn nồng độ các cấu tử cần tách theo thời gian [17]

b Sơ đồ khối thiết bị sắc ký khí (hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ khối của máy sắc ký khí [7]

Khối I: khối này gồm các thiết bị dùng để tách các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích ra khỏi nhau, gồm hệ sắc ký và các bộ phận vận hành sắc ký

Hệ sắc ký gồm:

1- Cột sắc ký2- Bom chứa pha động (khí mang)Các bộ phận vận hành sắc ký:

3- Bộ phận điều chỉnh tốc độ pha động4- Bộ phận bơm mẫu và buồng bơm mẫu5- Bộ phận điều nhiệt

Khối II: bao gồm các thiết bị và bộ phận nhận biết cấu tử ra khỏi cột và nhận biết kết quả Trong đó:

biết từng chất hoặc nhóm chất ra khỏi cột với tín hiệu tỉ lệ với hàm lượng tương ứng

đó chúng chuyển thành tín hiệu điện, các tín hiệu điện được khuếch đại tại bộ phận

25

khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi hoặc chuyển sang phân tích kế có máy tính,tín hiệu được xử lý ở đó và chuyển sang bộ phận ghi kết quả Trên sắc đồ nhận được

từ bộ phận ghi, ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử cần tách ra gọi là píc [7]

Thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho các cấu tử cần tách, được dùng đểđịnh tính, còn diện tích píc là thước đo định lượng cho từng cấu tử trong hỗn hợpnghiên cứu Trong sắc ký khí, người ta cần dạng píc không bị biến dạng nhiều nhằmxác định chính xác đỉnh píc, đối với phân tích định lượng, yêu cầu đặt ra cao hơn:

độ lặp lại, độ so sánh tốt, độ chính xác cao [7]

Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký khí được sử dụng rộng rãi bởi vì khảnăng tách cao và tính sẵn có của detectơ chọn lọc như detectơ cộng kết điện tử(ECD), detectơ dẫn nhiệt (TCD), detectơ ion hóa ngọn lửa (FID), detectơ nitơ phốt

clo, phương pháp phân tích phù hợp nhất và được lựa chọn trong nghiên cứu này làphương pháp sắc ký khí detectơ cộng kết điện tử

Detectơ cộng kết điện tử (ECD) hoạt động dựa trên đặc tính các chất có khảnăng cộng kết điện tử trong pha khí ECD là một dạng của detectơ ion hoá, các ionđược tạo ra bởi một nguồn phóng xạ như 3H hoặc 63Ni, chúng phá ra các hạt β, cáchạt này ion hoá các chất (chẳng hạn như khí mang N2 + β → N2+ + 2 e) và tạo ramột dòng điện nền Khi các chất có khả năng bắt điện tử đi qua, chúng sẽ bắt giữđiện tử làm giảm đường nền và gây ra các tín hiệu tương ứng ECD rất chọn lọc vớicác nguyên tố có độ âm điện cao như halogen, sulfua và những chất có cấu trúcchưa no [17]

d Định tính và định lượng

- Định tính: trên sắc đồ nhận được sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được

tách gọi là píc Người ta sử dụng yếu tố đặc trưng là thời gian lưu của các cấu tử để nhậndiện chúng, bằng cách so sánh thời gian lưu của cấu tử cần xác định với thời gian lưu củachất chuẩn Việc nhận diện một cấu tử chính xác hay không phụ thuộc vào sự giống nhaucủa mẫu phân tích so với mẫu chuẩn và chỉ được khẳng định khi

thời gian lưu của chất cần phân tích trùng với giá trị thời gian lưu của chất chuẩn

Trong nghiên cứu này, thời gian lưu của từng cấu tử trong chất chuẩn được xác địnhdựa vào tín hiệu ghi nhận bởi detectơ ECD.

- Định lượng: diện tích píc là thước đo định lượng các chất trong hỗn hợp

nghiên cứu Dựa vào mối tương quan giữa số đếm diện tích píc và nồng độ chất chuẩn sẽdựng được đường ngoại chuẩn thể hiện mối tương quan này Từ số đếm diện tích píc thuđược của các mẫu phân tích và đường ngoại chuẩn sẽ xác định được nồng độ chất cầnnghiên cứu trong mẫu

2.2.3.5 Tiến hành thực nghiệm

a Hóa chất

dùng cho sắc ký của các hãng Merck (Đức)

(Tomelloso, Tây Ban Nha), cột chiết pha rắn có dung tích 500 mg

mesh của hãng Merck (Đức), diện tích bề mặt 155 m2/g, Al2O3 được sấy khô và hoạt hoá

ở nhiệt độ 130oC trong 5 giờ

β-BHC (1,03 ppm); γ-β-BHC (1,033 ppm); δ-β-BHC (0,97 ppm); Hexachlorbenzen (1,053ppm); Heptachlor (0,505 ppm); α-Chlordene (1,005 ppm); β-Chlordene (1,005 ppm);Oxychlordane (1,055 ppm); trans-Chlordane (1,025 ppm); cis-Chlordane (1,005 ppm);trans-Nonachlor (1,000 ppm); cis-Nonachlor (1,015 ppm); o,p’-DDE (1,038 ppm); p,p’-DDE (1,02 ppm); o,p’-DDD (1,033 ppm), p,p’-DDD (1,053 ppm); o,p’-DDT (1,04 ppm);p,p’-DDT (1,063 ppm) Các chất chuẩn được cung cấp từ Nhật Bản

27

có gắn van điều chỉnh tốc độ dòng.

Tất cả các dụng cụ thủy tinh sử dụng trong các thí nghiệm đều được làm sạchbằng cách ngâm trong dung dịch rửa (H2SO4 đặc + Cr2O3) khoảng 24h Sau đótráng lại bằng nước cất hai lần và axeton, n-Hexan Dụng cụ đã rửa được sấy ở nhiệt

độ 2000C trong 2 giờ Trước khi sử dụng được tráng 2 lần bằng n-Hexan

sắc ký mao quản HP5_MS dài 60 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp phin pha tĩnh dầy0,25 µm

Điều kiện làm việc của máy sắc ký khí:

Trên cơ sở tham khảo tài liệu, quá trình thực nghiệm và điều kiện hiện có củaphòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn chế độ phân tích dư lượng thuốc BVTV nhómclo hữu cơ trên máy GC/ECD như sau:

+ Nhiệt độ ban đầu là 900C giữ trong 1 phút; tăng đến 2500C với tốc

phin pha tĩnh dầy 0,25 µm

c Xây dựng đường ngoại chuẩn

Đường ngoại chuẩn được sử dụng để xác định nồng độ thuốc BVTV trongcác mẫu mật ong Trong phương pháp này dùng chất chuẩn tinh khiết của chất cầnxác định pha thành nhiều nồng độ khác nhau, dựng đường chuẩn theo số đếm diệntích píc trên sắc ký đồ và nồng độ chất chuẩn phân tích Dựa vào đường ngoại chuẩn

và số đếm diện tích píc của chất cần phân tích có thể xác định được nồng độ chấtcần phân tích

• Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chất chuẩn:

đã biết nồng độ của từng chất (gọi là C0): α-BHC; β-BHC; γ-BHC; δ-BHC;Hexachlorbenzen (HCB); Heptachlor; α-Chlordene; β-Chlordene; Oxychlordane; trans-Chlordane; cis-Chlordane; trans-Nonachlor; cis-Nonachlor; o,p’-DDE; p,p’-DDE; o,p’-DDD, p,p’-DDD; o,p’-DDT; p,p’-DDT pha loãng thành 1 mL bằng n-Hexan nhận đượcdung dịch C1

được dung dịch C2

29

- Lấy chính xác 500 µL dung dịch C2 pha loãng thành 1 mL n-Hexan được dung dịch C3.

C6, C7 Nồng độ mỗi chất trong dung dịch hỗn hợp chất chuẩn được thể hiện trong bảng 2.1dưới đây:

• Xây dựng đường ngoại chuẩn:

Lấy các dung dịch hỗn hợp chuẩn C3, C4, C5, C6, C7 đã pha ở trên, tiếnhành phân tích các dung dịch này trên máy GC/ECD với điều kiện làm việc của máynhư đã trình bày ở trên Mỗi dung dịch chuẩn được phân tích 3 lần với thể tích