Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biến sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển việt nam

Khả năng sinh chất kháng sinh trên các môi trường lên men khác nhau của các chủng xạ khuẩn NA113 và NA115Bảng 3.13.. Cấu trúc của deoxynyboquinone 1 và pseudonocardian A-C 2-4Tỉ lệ các c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-HỒ VĂN HOÀN

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG

VEN BIỂN VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Phương Nhuệ

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài

Bảng 3.1 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn

Bảng 3.2 Mầu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trường ISP khác nhau

Bảng 3.3 Khả năng sử dụng nguồn nitơ của các chủng xạ khuẩn

Bảng 3.4 Khả năng sử dụng nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn

Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở nồng độ NaCl khác nhau

Bảng 3.6 Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ở các

điều kiện nhiệt độ khác nhauBảng 3.7 Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở điều kiện pH khác nhau

Bảng 3.8 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA113 với chủng xạ

khuẩn S scabies ISP 5058

Bảng 3.9 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA115 với chủng

chuẩn S tendae ISP 5101

Bảng 3.10 Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113 với

gene tương ứng của các chủng vi khuẩn được đăng ký trên GenBankBảng 3.11 Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115 với

gene tương ứng của các chủng vi khuẩn được đăng ký trên GenBankBảng 3.12 Khả năng sinh chất kháng sinh trên các môi trường lên men khác nhau

của các chủng xạ khuẩn NA113 và NA115Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn của

chủng NA113 và NA115Bảng 3.14 Ảnh hưởng của pH ban đầu và độ thoáng khí đến hoạt tính kháng sinh Bảng 3.15 Phổ hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn NA113 và NA115

Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4)

Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm địnhHoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn

Hình thái khuẩn lạc của chủng NA113 trên môi trường ISP2, ISP3Hình thái khuẩn lạc của chủng NA115 trên môi trường ISP2, ISP3Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA113Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA115Khả năng sinh trưởng của chủng NA113 trên môi trường có pHkhác nhau

Khả năng sinh trưởng của chủng NA115 trên môi trường có pHkhác nhau

Kết quả điện di DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn trên gelagarose 1%

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

Cây phân loại của chủng NA113 và một số chủng xạ khuẩnCây phân loại của chủng NA115 và một số chủng xạ khuẩn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iv

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH VẼ vii

MỤC LỤC viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn 3

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

3 1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

3 1.1.3 Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

6 1.2 Phân loại xạ khuẩn 7

1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

7 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)

8 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

8 1.2.4 Phân loại số (Numerical Taxonomy)

9 1.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rDNA

9 1.3 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 10

1.3.1 Nhóm chất kháng sinh polyketide 10

1.3.2 Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide 11

1.3.3 Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide 12

1.3.4 Nhóm kháng sinh isoprenoid 12

1.3.5 Các chất kháng sinh khác 13

1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15

1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ

1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 17

1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước 17

1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu 21

2.1.1 Vật liệu 21

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

viii

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22

2.2.2 Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu 22

2.2.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh 23

2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 24

2.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh 29

3.2 Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn 32

3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 32

3.2.2 Đặc điểm hình thái 34

3.3 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa 35

3.3.1 Khả năng sử dụng nguồn nitơ 35

3.3.2 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon 36

3.3.3 Khả năng chịu muối NaCl 38

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng 38

3.3.5 Ảnh hưởng của độ pH 39

3.4 Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 40

3.4.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa 40

3.4.2 Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 43

3.5.1 Lựa chọn môi trường lên men 48

3.5.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ 49

3.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thoáng khí 51

3.6 Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

KẾT LUẬN 53

ĐỀ NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN 58

PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI 59

PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH 61

PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA 62

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bốrất rộng rãi trong tự nhiên Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khảnăng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng Trong số hơn 8000 chất khángsinh hiện đã được biết trên thế giới thì có trên 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ

yếu là từ các chi Streptomyces và Micromonospora Giai đoạn những năm 1980 trở

về trước các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá các chủng xạ khuẩntrên mặt đất Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng

xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý như: khả năng sản xuất kháng sinh có phổkháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thư… có ý nghĩa ứng dụng trong y học[1]

Cùng với sự sinh trưởng của công nghệ sinh học hiện đại, các nghiên cứu vềứng dụng xạ khuẩn biển đã thu được rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinhkhối, dược phẩm… được sử dụng trong các ngành công nghiệp, y dược học, nôngnghiệp… Trong lĩnh vực y dược, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn trong đờisống, góp phần đẩy lùi bệnh tật và nâng cao sức khỏe cộng đồng Tuy nhiên, việclạm dụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc làm ảnh hưởng đếnkết quả điều trị bệnh Việc tìm ra các chất kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩncao từ các nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành nhu cầu cấp thiết hiện nay.Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh cũng rất

quan trọng, các nghiên cứu cơ bản này giúp định hướng sản xuất các sản phẩm hữuích từ các chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá sự đa dạng của các vi sinh vậtbiển.

Xuất phát từ những định hướng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam”.

Mục tiêu:

Tuyển chọn và phân loại các chủng xạ khuẩn biển có khả năng tổng hợpkháng sinh cao định hướng ứng dụng trong y dược

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nước, bùn ở các vùng biển Bắc, Trung, Nam

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn lựa chọn

- Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phương pháp giải trình tự gene16S-rRNA

- Nghiên cứu một số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố

rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chấthữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trưởngđược

Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộcvào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu dinh dưỡng vàlớp đất bề mặt thường có số lượng lớn xạ khuẩn Trong 1 gam đất canh tác có thể phânlập được 5 triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa chỉ có 10 – 100 nghìn mầm Số lượng

xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [7]

Xạ khuẩn cũng thường sống hoại sinh trên xác các sinh vật (cây chết, rơmrạ) nhưng cũng có thể kí sinh trên thân, củ hoặc rễ cây

Xạ khuẩn biển thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tíchbiển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật khác như san hô, rong biển.Trước đó, người ta tin rằng xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ trên cạn Tuy nhiên, sau

đó có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển

Xạ khuẩn biển thường có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những chủng

Streptomyces ssp có thể sinh trưởng được ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc

chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốt khi ở nồng độ NaCl 10%,

Micromonospora sp và Salinospora sp cũng có khả năng chịu mặn cao [24, 25].

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kíchthước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc xạ khuẩnkhông trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, có các nếp tỏa

ra theo hình phóng xạ Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes,

tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”) Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da,dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo [4] Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấutrúc tổ ong Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùythuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng.

Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thểđơn bào, không có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn Trên môi trường đặc,

hệ sợi của xạ khuẩn sinh trưởng thành 2 hướng tạo thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn

ti khí sinh Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chứcnăng chủ yếu là lấy nước và thức ăn Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng một thời gian thìdài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh Người ta gọi khuẩn ti khí sinh làkhuẩn ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp là loại khuẩn ti sinh trưởng từ cácloại bào tử nảy mầm [4] Nhiều loại chỉ có khuẩn ti cơ chất mà không có khuẩn ti

khí sinh, nhưng cũng có loại như chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ti khí sinh Khi

đó khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản

Khuẩn ti của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính thay đổitrong khoảng 0,2 – 1 µm đến 2 – 3 µm Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti không có váchngăn và không tự đứt đoạn Sau một thời gian sinh trưởng, ở đầu các khuẩn ti khísinh thường hình thành các sợi bào tử Khuẩn ti không mang bào tử gọi chung làkhuẩn ti dinh dưỡng

Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lưới dày khoảng 10 – 20 nm,

có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ti và bảo vệ tế bào Căn cứ vào kết cấu hóahọc người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin Thuộc nhóm này có

- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin Thuộc nhóm này có

- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP Gồm các chi Dermatophilus,

Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis, Microbispora,

Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora,

Streptosporangium, Actinosynnema.

- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose Gồm các chi

Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora [4].

Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu gồm 3 lớp: lớp ngoài dầy 60 – 120 Å, khi già

có thể dầy tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50 Å và lớp trong dầy 50 Å Thành tếbào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptid gồm các gốc N-acetylglucozamin liênkết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glicozit Khi xử lí bằng lysozym, các liênkết này bị phát vỡ, thành tế bào bị phá hủy và màng nguyên sinh chất bao bọc phầncòn lại của tế bào tạo thành tế bào trần Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lí bằng hỗnhợp ether và chloroform và các dung môi hòa tan lipit Điều đó chứng tỏ lớp ngoàithành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit Thành tế bào xạ khuẩn không chứacellulose hay chitin [7]

Đối với xạ khuẩn phân lập từ các vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dầy

và độ bền cơ học cao, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (nồng

độ muối từ 3 - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC) Thành tếbào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều axit polymenhư axit galacturonic, axit glutamic, axit aspartic và axit phosphoric Với điện tích

âm của các thành phần axit không thuộc peptidoglycan, bề mặt thành tế bào có thểhấp thụ các ion Na+, H+ trong khi đẩy các ion OH- Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớppeptidoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhưng lại khácnhau về thành phần hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ưa kiềm chứa nhiều hesoamin vàaxit amin [20]

Màng sinh chất của xạ khuẩn dầy khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủyếu là phospholipit và protein, chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như màngsinh chất của vi khuẩn Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trong quátrình vận chuyển các chất qua màng [4]

Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng sinh chất và cóhình phiến, hình bọng hay hình ống Tác dụng của thể trung gian là làm tăng diệntích tiếp xúc của màng tế bào và từ đó làm tăng cường hoạt tính của enzyme, tăngchuyển điện tử…[4].

Các thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt polyphosphat(hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III) và polysaccarit (bắt màu với dungdịch Lugol) [4]

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinhvật nhân sơ khác là tỉ lệ G – C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 – 45%

Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bềnvững về di truyền và thường xảy ra sự đột biến trong phân tử DNA Điều này tạo ratính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng Hơn nữa, sự

tự nhân lên của các đoạn DNA còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở

xạ khuẩn [7]

1.1.3 Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn là dựa vào hìnhthái và kích thước của cuống sinh bào tử Sợi bào tử có thể có nhiều hình dạng khácnhau tùy theo loài: thẳng-lượn sóng (Retiflexibilis), xoắn (Spirales) hoặc có móc,vòng (Retinaculiaperti)… có loại mọc vòng đơn cấp, có loại mọc vòng hai cấp Một

số xạ khuẩn có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bào tử nang Bề mặt của bào

tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)…tùy thuộc vào loài xạ khuẩn [4, 5, 13]

Bào tử xạ khuẩn được hình thành theo 3 phương thức sau đây:

- Phương thức sinh trưởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ti hình thành ra thành bào tử

- Phương thức sinh trưởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa

màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ti Trường hợp này gặp ở Planomonospora.

- Phương thức sinh trưởng bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ti không tham

gia vào quá trình hình thành bào tử Trường hợp này gặp ở Thermoactinomycetes

độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử [7]

1.2 Phân loại xạ khuẩn

1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Trong phân loại người ta thường chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính dựa trêncác dấu hiệu hình thái:

- Các nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt Đặc trưng của nhóm này là sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành KTKS và KTCC

- Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang Đặc trưng của nhóm này là khuẩn ti phân chia theo hướng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tương tự nang bào tử

- Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia: sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ti.

- Nhóm xạ khuẩn dạng tương tự Corynebacter và dạng cầu: tế bào có hình

chữ V, T hoặc dạng cầu, thông thường không có khuẩn ti

Trước kia, nhiều loại xạ khuẩn được phân chia tùy theo sự khác nhau về đặcđiểm hình thái và tính chất nuôi cấy như màu của KTCC, KTKS, sắc tố tan; sự cómặt của KTCC, hình dạng và kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử và sựphân đốt của khuẩn ti Tuy nhiên, ngày nay chỉ tiêu này chỉ là bổ sung cho việcnghiên cứu phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [7,36]

1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong một vàithập kỉ trước và ngày nay vẫn còn là cơ sở quan trọng trong phân loại xạ khuẩn.Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượngthành phần hóa học của tế bào vi sinh vật Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặcđiểm sau:

- Typ thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào

- Typ peptidoglycan (PG): dựa trên các thông tin về thành phần và cấu trúccủa mạch tetrapeptid của PG, của cầu nối peptid và cách liên kết giữa các mắt xíchcủa PG

- Axit mycolic: là các phần tử có mạch dài hay phân nhánh thuộc chi

Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium và Corynebacter Đây là đặc điểm phân

loại cơ bản của các chi đó

- Axit béo: thường được sử dụng trong phân loại là các axit béo bão hòamạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso- và enteiso- đượcmethyl hóa ở phân tử cacbon thứ 10 Sự có mặt của axit 10-methyloctadecanoid làđặc điểm phân loại đến chi

- Menaquinon: Xạ khuẩn giống vi khuẩn Gram dương và khác vi khuẩnGram âm ở chỗ tổng hợp menaquinon và dimethylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon Phần lớn các chi xạ khuẩn có thành phần menaquinon xác định

- Photpholipid: có 5 typ photpholipid (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặctrưng và có ý nghĩa trong phân loại xạ khuẩn [7]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Khi phân loại xạ khuẩn người ta thường sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinhhóa cũng như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chấtkích thích sinh trưởng Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng được xác định như pH,nhiệt độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với chất kháng sinh,

khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trưngcủa xạ khuẩn.

Tuy nhiên, do xạ khuẩn thường xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểmsinh lý, sinh hóa thường có giá trị thấp về mặt phân loại Nhưng để phát hiện loàimới người ta thường sử dụng các đặc điểm này dựa trên phân loại số [7, 34]

1.2.4 Phân loại số (Numerical Taxonomy)

Phân loại số được Williams và cs, (1983) sử dụng để phân loại chi

Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi Phương pháp này dựa trên sự đánh giá

về số lượng, mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm,chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh các chủng với nhautừng đôi một, Sneath (1973) đề nghị tính hệ số giống nhau S (Similarity) theophương trình sau:

Kết quả phân tích được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủngtùy theo mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster) Bằng phân loại

số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13

cụm với những đại diện nhất định [7, 27, 31]

1.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rDNA

Từ cuối thế kỷ XX, đặc biệt là những năm 80 trở lại đây, với sự sinh trưởngmạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phânloại sinh vật đó là phân loại học phân tử Phương pháp này có ưu điểm là thời gianngắn và có độ chính xác cao Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gene, hoặccác sản phẩm của gene Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử

9

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất đểxác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rRNA có mặt trong tất cả cácsinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao Chúng chỉ khác nhau rất ítgiữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánhgiá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật.

Trong tế bào vi sinh vật nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất.Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rRNA và proteinriêng rẽ Ribosome vi sinh vật nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S(gồm rRNA 5S, rRNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rRNA 16S và 21phân tử protein) [6]

Các gene mã hóa 5S-rRNA, 16S-rRNA và 23S-rRNA nằm cạnh nhau, cócùng một operon và có cơ chế điều hòa chung Trong các loại rRNA, thì 16S-rRNA

là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn, vì gene mã hóa 16S-rRNA cókích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho các nghiên cứu phân loại; còn gene mãhóa 5S-rRNA có kích thước khoảng 120 bp, dễ xác định trình tự nhưng lại khôngđặc hiệu cho phân loại; còn gene mã hóa 23S-rRNA cũng là một gene tiềm năng chophân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gene nàytương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ítđược sử dụng hơn [16]

Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự16S-rRNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S-rRNA được coi làngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấygiá trị này là 98% [21]

1.3 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển

ketoreductase, dehydratase và enoylreductase Có 3 loại PKSs khác nhau đã đượcbiết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức năng PKSs loại II làphức hợp của nhiều enzyme, cùng tạo nên cấu trúc của chuỗi polyketide và PKSsloại III [14, 24].

Hình 1.1 Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin [14, 24]

Abyssomicin C là kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển Verrucosispora

sp Abyssomicin C có khả năng kháng lại các vi khuẩn G+, bao gồm cả những vi

khuẩn gây bệnh đã kháng vancomycin như Staphylococcus aureus [14, 22].

Daryamide là polyketide gây độc cho tế bào được phân lập từ dịch nuôi cấy

của xạ khuẩn Streptomyces sp chủng CNQ-085 Chất này có khả năng gây độc cho

tế bào ung thư biểu mô ở người, dòng HCT-116 và có khả năng kháng nấm C.

albicans [14, 17].

Trioxacarcin lần đầu tiên được phân lập vào năm 1981 từ S bottropensis

DO-45 Chúng có khả năng chống lại các tế bào ung thư khác nhau, có hoạt tínhkháng vi khuẩn G- và G+ và kháng trùng sốt rét Trioxacarcin A có khả năng tạo liênkết cộng hóa trị với đoạn DNA sợi kép d(AACCGGTT) [14]

1.3.2 Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide

Proximicin là kháng sinh được tạo ra bởi xạ khuẩn Verrucosispora sp MG37 và

V maris AB-18-032 chúng được phân lập từ các mẫu trầm tích dưới độ sâu

250m ở Raune Fjord, Na-uy và ở biển Nhật Bản ở độ sâu 289 m Proximicin (A, B,

C) có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào ung thư biểu mô dạ dày và ung thư biểu mô gan [14]

Mechercharmycin được sản xuất bởi xạ khuẩn Thermoactinomyces sp

YM3-251; được phân lập từ bùn ở Macherchar nước cộng hòa Palau (bắc Thái bìnhdương) Mechercharmycin A có khả năng gây độc cho tế bào ung thư tuyến biểu

mô phổi dòng A549 và tế bào ung thư bạch cầu [14]

1.3.3 Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide

Salinosporamide A (NPI-0052) là kháng sinh mới có cấu trúc

β-lactone-γ-lactam (C15H20O4NCl) tách từ dịch lên men của xạ khuẩn biển Salinispora tropicađược phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở độ sâu 1m tại biển Chab Cay, Bahamas.NPI-0025 là chất ức chế proteasome 20S gây ra hiện tượng appoptosis trong tế bào

u tủy và kháng lại tế bào ung thư ruột kết NPI-0025 đã được thử nghiệm lâm sàngbởi hãng dược phẩm Nereus Pharmaceuticals vào năm 2006 và có tiềm năng là mộtchất kháng ung thư có giá trị trong tương lai [14, 22, 26]

Lajollamycin là kháng sinh được tạo thành từ xạ khuẩn S nodosus chủng

NPS007994 phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở Scripps Canyon, La Jolla,California Lajollamycin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào u melanindòng B16-F10 ở chuột; ngoài ra chất này còn được Manam và cộng sự (2005) xácđịnh là có khả năng tiêu diệt nhiều tế bào vi khuẩn [14]

1.3.4 Nhóm kháng sinh isoprenoid

Altemicidin là kháng sinh có bộ khung vòng đơn terpen-alkaloid, được hình

thành từ xạ khuẩn biển S sioyaensis chủng SA1758 được phân lập từ mẫu bùn ở

Gamo, Miyagi Prefecture, Nhật Bản Chất này có khả năng kìm hãm sự sinh trưởngcủa tế bào ung thư bạch cầu Lympho L1210 và ung thư biểu mô dòng IMC [14]

Marinone có cấu trúc một vòng rưỡi terpen Marinone và nhiều chất có hoạttính khác được tạo ra từ xạ khuẩn chủng CNH099 phân lập từ độ sâu 1 m ở

Batiquitos Lagoon, Bắc San Diego, Califorlia Những chất này có khả năng gây độc

tế bào ung thư ruột kết ở người dòng HCT116 trong điều kiện in vitro [14].

Glaciapyrrole (A, B, C) là kháng sinh được hình thành từ xạ khuẩn

Streptomyces sp chủng NPS008187 Nhóm kháng sinh này đã được Macherla

(2005) tìm ra có khả năng kháng khuẩn [17]

1.3.5 Các chất kháng sinh khác

Diazepinomicin (ECO-4601) được phát hiện vào năm 2004 bởi Charan và

cộng sự ECO-4601 có nguồn gốc từ Micromonospora sp., có hoạt tính kháng

khuẩn, kháng viêm và kháng tế bào ung thư ECO-4601 có phổ kháng rộng chốnglại tế bào u vú, u thần kinh đệm và u tiền liệt tuyến Đã được thử nghiệm lâm sàngtại Canada vào năm 2006 [18, 22]

Hình 1.2 Cấu trúc của Diazepinomicin [22]

Chandrananimycin được hình thành từ xạ khuẩn Actinomadura sp chủng

M048 được phân lập từ vịnh Giao Châu, Trung Quốc Chandrananimycin có khảnăng chống lại tế bào khối u ruột kết, u melanin, u phổi, u vú, u tuyến tiền liệt và utuyến thận Ngoài ra chất kháng sinh này còn có khả năng kháng khuẩn và nấm[14]

Helquinoline (C12H15O3N) là kháng sinh hình thành từ Janibacter limosus

Chất kháng sinh này có khả năng kháng Bacillus subtilis, S virdochromogenes Tu57 và Staphylococcus aureus [17, 22].

Bảng 1.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển [14, 18, 22, 24]

1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus

anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi

khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính khángkhuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tínhkìm hãm các chủng đối kháng

Trong quá trình tiến hóa, tính đối kháng là cơ chế bảo vệ trong đấu tranh sinhtồn của loài Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt Xạ khuẩnthường tạo ra các sản phẩm trao đổi chất của mình để ức chế hoặc tạo điều kiệnkhông thuận lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật khác Thông thường các chấtkháng sinh có thể hình thành theo các cơ chế sau:

- Đối với các CKS tương tự như các sản phẩm chuyển hóa bậc một (axitamin, nucleotid…) thì sự sinh tổng hợp các CKS này tương tự như sinh tổng hợp các chất chuyển hóa bậc một

- Đối với kháng sinh được tạo ra bằng con đường polime hóa bao gồm:

+ Các chất là dẫn xuất của polipeptid, được tạo thành bằng cách trùng hợpcác axit amin Mạch polipeptid được tạo thành có thể được biến đổi trong các phảnứng tiếp theo

+ Các chất được tạo thành từ đơn vị acetat và propionat thì theo con đường tổng hợp axit béo

+ Các chất terpen được tạo thành từ các đơn vị isopren

+ Đối với các chất aminoglucozid thì tạo thành bằng con đường trùng hợp các phân tử đường, axit amin và các rượu amin mạch vòng

Chức năng của các sản phẩm trao đổi bậc hai đối với cơ thể sản sinh ra vẫnchưa được xác định chính xác và còn nhiều điều chưa thể lí giải Có thể nói, chúngkhông có một chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tế bào vì tế bào vẫn có khả

năng sinh trưởng và sinh trưởng bình thường khi không có các hợp chất này Do đó,vai trò đối với tế bào của các sản phẩm này cần được nghiên cứu kỹ lưỡng hơn [11].

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tốnhư pH, nhiệt độ, thành phần môi trường lên men… Để xạ khuẩn sinh trưởng tốt

và hình thành các sản phẩm tối ưu, cần đảm bảo trong môi trường lên men có đầy

đủ các nguồn cacbon, nitơ, các nguyên tố vi lượng và các thông số về điều kiệnnuôi cấy thích hợp

1.4.2.1 Điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ: Phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở 28 – 30oC Nhiệt độ tối ưu cho tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng 18 – 28oC [7]

- pH môi trường: Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường

pH thích hợp cho tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit thường ứcchế quá trình sinh tổng hợp CKS Tuy nhiên dải pH cho chủng vi sinh vật sinh

trưởng thường dài hơn pH tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh Ví dụ ở S.

aureofaciens, pH thích hợp cho sinh trưởng là 4,2 – 8,0 và cho sinh kháng sinh là

5,5 – 6,5 [7]

- Độ thông khí: Xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh vậtkhác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ 6 – 12 giờ nuôi) Do vậy, để đảmbảo thông khí tốt, người ta thường thêm vào môi trường lên men benzylthioxyanatlàm tăng khả năng hòa tan của oxi Nồng độ thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2-8% O2 trong dịch lên men [2]

- Lượng giống và tuổi giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp CKSkhông chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng củabào tử và giống sinh dưỡng Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môitrường lên men để hiệu quả nhất là từ 2 – 10%, tuổi giống thường là 24 giờ [15]

1.4.2.2 Thành phần môi trường lên men

- Nguồn cacbon: Các hợp chất cacbon có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinhtrưởng và sinh tổng hợp CKS Đối với nhiều chủng xạ khuẩn có hoạt tính amylase,

nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng chủng mà chọnnguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn glucose, fructose, galactose haycác loại đường đôi như maltose, saccarose, lactose…; các loại đường đa như tinhbột, destrose…; các loại thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch…;cũng có thể là các axit hữu cơ và chất béo làm nguồn cacbon [7].

- Nguồn nitơ: Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả 2 nguồnnitơ hữu cơ và vô cơ Trong đó, nguồn nitơ vô cơ thường cho khả năng sinh CKSkhông cao Nguồn nitơ hữu hiệu nhất thường là các sản phẩm từ thực vật như bộtđậu tương, bột đậu xanh, cao ngô… Trong đó, cao ngô là nguồn cung cấp cả nitơ vô

cơ và hữu cơ; tuy nhiên cao ngô có hạn chế về chất lượng do có lượng photphat vô

cơ cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS [33]

- Nguồn photphat vô cơ: Vai trò của photphat vô cơ như yếu tố điều chỉnhsinh tổng hợp CKS được nhiều tác giả đề cập Nồng độ photphat thích hợp cho sinhtổng hợp phần lớn CKS không quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làmtăng lượng axit nucleic trong khuẩn ti, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn phatổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng quá trình sinhtổng hợp CKS Sự thừa photphat cũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vàoquá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp làm giảm khả năng tổng hợp CKS [7]

1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh

1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi sinh vật biển có khả năng sinh các chất cóhoạt tính đối kháng còn hạn chế, hầu như chưa có công trình khoa học có quy môlớn nghiên cứu các vi sinh vật và tách chiết các chất kháng sinh từ vi sinh vật biển

Tác giả Lê Gia Hy và cs, Viện Công nghệ sinh học đã phân lập và nghiêncứu được đặc điểm của chủng vi khuẩn biển HT0523 có nhiều đặc điểm quý có thểkhai thác trong nuôi trồng thủy sản Chủng vi khuẩn biển HT0523 chính là vi khuẩn

Gram dương, sinh bào tử có khả năng ức chế mạnh cả 2 chủng vi sinh vật Vibrio gây bệnh cho tôm là V parahaemolyticus và V furnisii Chủng HT0523 có sức sống

cao, có khả năng thích ứng rất tốt với điều kiện môi trường dao động nhiều, sinh

trưởng tốt ở nồng độ NaCl 1-3%, pH thích hợp từ 7 - 9, nhiệt độ từ 25 - 37oC.Chủng này sinh trưởng tốt trên nguồn cacbon lactose và nguồn nitơ vô cơ là KNO3đặc biệt là khi kết hợp với nguồn nitơ hữu cơ (pepton) thì mật độ tế bào cao xấp xỉhai lần [8].

Các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

đã tách được chất Fucoidan từ một số loài rong ở vùng biển Nha Trang-Khánh Hòa

như Sargassum polysystum, S Oligosystum, S mcclurei, S swartzii, S.

denticarpum Bằng các phương pháp phân tích hóa học và phổ cho thấy những

phân đoạn Fucoidan tách được là Fucogalactam có chứa nhóm este sulfat, uronic

axit và các gốc đường fructose, galactose… Các phân đoạn đều đem thử hoạt tính

và kết quả là tất cả các phân đoạn đều có hoạt tính chống ung thư Kết quả thựcnghiệm chỉ ra rằng sự có mặt của nhóm sulfat và uronic làm tăng hoạt tính củaFucoidan [9, 12]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới

Trong những năm gần đây, vi sinh vật biển là đề tài quan trọng trong nhiềunghiên cứu mới về vi sinh vật ở nhiều nước trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìmkiếm các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển như các chất kháng khuẩn,kháng virus, kháng tế bào ung thư, kháng nấm, chống đông máu hoặc là khángtrùng sốt rét… Những hợp chất này sẽ trở thành nguồn dược phẩm quan trọng đểchữa bệnh trong tương lai

G Vijaya Baskara Sethubathi và V Ashok Prabu (Đại học Annamalai) đãphân lập được 12 chủng tảo biển ở bờ biển Adirampattinam, tây nam vịnh Palk

Dựa trên đặc điểm sinh trưởng có 3 chủng được phân loại đó là Oscillatoria sp.,

Phirmidium sp và Lyngbya majuscule Ba loài này đều có khả năng kháng một số

loài vi khuẩn gây bệnh ở người như S mutants, S aureus, Pseudomonas

aeruginosa, B subtilis và Klebsiella pneumoniae Trong đó Oscillatoria sp có hoạt

tính kháng khuẩn mạnh nhất và Lyngbya majuscule có hoạt tính yếu nhất [35].

M Krishnaraj và N Mathivanan (Ấn Độ - 2009) đã phân lập được 137chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ 40 địa điểm khác nhau ở vịnh

Bengal Trong tất cả 137 chủng xạ khuẩn đều có khả năng kháng các vi khuẩn gây

bệnh ở người như S aureus, P aeruginosa, Bacillus spp và 10 chủng có khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani và Fuzarium oxysporum gây bệnh ở thực vật [23].

Năm 2010, Rofiq Sunaryanto và Bambang Marwoto đã phân lập ở Anyer,Banten (Indonesia) được 29 chủng vi khuẩn trong đó có một chủng A11 có đặc tínhkháng được các chủng vi khuẩn G- và G+ (E coli, S aureus, P aeruginosa, B.

subtilis) Bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh trình tự với dữ

liệu của Genbank đã xác định được chủng A11 chính là xạ khuẩn Streptomyces sp.

Bằng phương pháp sắc ký đã tách được một hợp chất kháng sinh có khả năngkháng khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu thấp hơn nhiều so với chất kháng sinhtetracyline (đối chứng) [28]

Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P và Reena

A (trường ĐH Khoa học công nghệ Mohamed Sathak-Ấn Độ) phân lập được 20chủng xạ khuẩn từ bờ biển Royapuram, Muttukadu, Mahabalipuram và ở cửa biểnAdyar vào năm 2011 Trong đó có 2 chủng xạ khuẩn (ký hiệu C11 và C12) có khảnăng kháng khuẩn Chủng C11 có chuỗi bào tử dài, bề mặt khuẩn lạc trắng và là vikhuẩn G+, chúng kháng được Staphylococcus, Pseudomonas, V harveyi Chủng

C12 cũng là vi khuẩn G+, có chuỗi bào tử hình cầu, bề khuẩn lạc mầu kem và C12

ngoài kháng được 3 loài vi khuẩn gây bệnh trên còn kháng cả B subtilis Bằng

phương pháp phân loại phân tử giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh với cơ sở

dữ liệu ở Genbank đã phân loại được 2 chủng C11 và C12 đều là xạ khuẩn

Streptomyces [34].

Năm 2011, Sumei Li và cộng sự đã phân lập được một chủng xạ khuẩn(SCSIO-01299) từ biển Đông (Việt Nam) ở độ sâu 3258 m Bằng phương phápquan sát hình thái học và giải trình tự gene 16S-rRNA, chủng SCSIO-01299 được

phân loại là Pseudonocardia sp SCSIO-01299 Các nhà khoa học này đã tách được

4 hợp chất có hoạt tính sinh học cao đó là deoxynyboquinone và Pseudonocardian

A-C Deoxynyboquinone và Pseudonocardian A và B có khả năng kháng khuẩn (S.

aureus, E faecalis, B thuringensis) và kháng tế bào ung thư phổi, ung thư vú và

ung thư não Bằng phương pháp khối phổ đã phân tích được deoxynyboquinone cócông thức phân tử C15H12O4N2; pseudonocardian A có thành phần C18H18O5N2;pseudonocardian B công thức là C19H20O5N2; pseudonocardian C công thức làC21H24O8N2 [32].

Hình 1.3 Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4) [32]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Các mẫu nước và bùn lấy ở ven bờ tại các vị trí khác nhau ở các vùng biểnViệt Nam, các mẫu được ký hiệu theo tên từng địa phương lấy mẫu

Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm: Bacillus subtilis ATCC 6633; Bacilus

cereus ATCC 11778; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Enterobacter aerogenes ATCC 23048; Salmonella typhi IFO 14193; Candida albicans ATCC10,

E coli ATCC 11105, Alcaligenes faecallis, Pseudomonas auroginosa nhận từ bộ

sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, viện Công nghệ sinh học

Các hóa chất khác dùng trong nuôi cấy và lên men: CaCO3; K2HPO4.3H2O;

KH2PO4; FeSO4.7H2O; (NH4)2SO4; NH4Cl; NaCl; bột đậu tương; trypton; pepton; caongô; casein thủy phân; agar và một số hóa chất cần thiết khác… là sản phẩm của ViệtNam hoặc nước ngoài có độ tinh khiết cao, đáp ứng yêu cầu nghiên cứu

Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử gồm: Tris-base, EDTA, axit acetic,CTAB, NaCl, propanol, chloroform, phenol, isoamin alcohol, etanol, bromophenolblue, Ethidium bromide, glycerol, dNTP các loại, MgCl2, cặp mồi FC27/RC1492,kít PureLinkTM - DNA Purification (Invitrogen), DNA Marker (Fermentas),agarose…

2.1.2.2 Thiết bị

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài Tên thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu phụ thuộc vào tính chất của mẫu (đất mùn, bùn,nước ) mà có phương pháp thu thập mẫu thích hợp Dụng cụ dùng lấy mẫu phải

vô trùng để tránh nhiễm chéo Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi

xử lí và phân tích

Mẫu nước

Dụng cụ lấy mẫu như gáo có tay cầm hoặc các ống nghiệm, chai nhựa đãđược khử trùng bằng cồn Lấy nước cách bề mặt 0,2 – 5,0 m mẫu nước được đựngtrong các ống nghiệm nút cao su, chai nhựa có ghi rõ đặc điểm và địa điểm lấy mẫu

Mẫu đất, bùn

Dùng dao hay xẻng sạch đã lau cồn để lấy mẫu đất Đầu tiên loại bỏ lớp đấtdày 2-5 cm trên bề mặt, sau đó lấy phần đất tiếp theo cho vào túi đã được khửtrùng, gài cẩn thận Túi được dán nhãn ghi rõ đặc điểm, địa điểm lấy mẫu

2.2.2 Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu

Để xác định thành phần và số lượng nhóm vi sinh vật có trong các mẫu, sửdụng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi trên các môi trường đặc trưng chotừng nhóm vi sinh vật

Các mẫu được pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,85% trong điều kiện vôtrùng, nồng độ pha loãng theo cơ số 10 Quá trình thực hiện như sau:

Đối với mẫu bùn: Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muốisinh lý 0,85% Cân chính xác 1 gam mẫu bùn hoặc đất chuyển vào bình thủy tinh đãchứa 100 ml nước cất khử trùng, lắc trên máy lắc khoảng 1 giờ với tốc độ 150-200vòng/phút, sau đó để lắng trong 30 phút Dịch thu được đã có độ pha loãng 10-2(1:100) Hút 1 ml dịch này chuyển vào ống nghiệm sạch, được độ pha loãng 10-3

Từ ống pha 10-3 hút 1ml chuyển sang ống tiếp theo, lặp lại các bước để thu được

độ pha loãng tiếp theo cơ số 10

Đối với mẫu nước: hút 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cấtkhử trùng, lắc đều Dịch trong ống tương đương với độ pha loãng 10-1 Hút 1 ml từống nghiệm có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 2, lắc đều Dịch trong ống tươngđương với độ pha loãng 10-2 Làm tương tự với các ống nghiệm khác tới 10-6

Dịch đã pha loãng được cấy trên đĩa petri có chứa các môi trường tươngứng Hút 0,2 ml dịch trong ống nhỏ lên các hộp petri có chứa môi trường đặc trưngcho mỗi loại vi sinh vật điển hình để xác định số lượng vi sinh vật Dùng que gạtđều lên trên mặt thạch

Các đĩa thạch sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 24-96 giờtùy theo từng nhóm vi sinh vật

Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch và tính toán sốlượng vi sinh vật có trong 1ml mẫu theo công thức:

CFU/ml (g) = a x 1/K x 1/V

a: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên đĩa petri có cùng độ pha loãng.V: Thể tích dịch pha loãng trang trên mỗi đĩa (ml)

K: Độ pha loãng của dịch được cấy

2.2.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh

Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập được kiểm tra khả năng sinh kháng sinh bằng các phương pháp sau:

2.2.3.1 Phương pháp thỏi thạch

Vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp trong đĩa petri Sau 7-14 ngày, khi mọc tốt, dùng ống đục lỗ thạch, lấy các thỏi thạch đặt lên đĩa petri đã cấy

vi sinh vật kiểm định Để các đĩa cấy ở nhiệt độ 4-8oC trong khoảng 4-8 giờ để chấtkháng sinh khuếch tán vào môi trường thạch, sau đó nuôi cấy ở 37oC với vi sinhvật kiểm định và đọc kết quả sau 24 giờ [3]

Khả năng đối kháng được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn

Môi trường thạch dinh dưỡng sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt dộ

40 - 45oC Hút dịch vi khuẩn kiểm định cho vào bình môi trường, trộn đều và đổvào các khay hoặc đĩa petri Sau khi thạch nguội dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùngđục lỗ và lấy các thỏi thạch ra Vi sinh vật sau khi nuôi lắc đem ly tâm ở 6000

- 8000 vòng/phút, lấy dịch nhỏ vào lỗ thạch Sau đó cho vào tủ lạnh 6-8 giờ để dịch

tế bào khuếch tán vào môi trường rồi chuyển ra nuôi ở 28 - 30oC sau 14 - 18 giờ,quan sát vòng kháng khuẩn [3]

Chọn và giữ các chủng có vòng kháng khuẩn để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại

2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn

Nghiên cứu định tên các chủng xạ khuẩn đã chọn theo đặc điểm phân loạicủa Waskman, 1961; Krasilnikov, 1970; Gause, 1983; Sổ tay phân loại vi sinh vậtcủa Bergey, 1989 và tham khảo các bản mô tả xạ khuẩn của chương trình xạ khuẩnquốc tế (ISP), 1966 và 1970 [27, 30, 31]

Để quan sát các đặc điểm hình thái như hình dáng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn tikhí sinh, khuẩn ti cơ chất, sắc tố tan, sự hình thành melanin, cuống sinh bào tử, bề mặtbảo tử các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gause 1, ISP 1, ISP 2,ISP 3, ISP 4, ISP 5, ISP 6, ISP 7, môi trường Bennet và khoai tây ở nhiệt độ

28-30oC Sau 7, 14 và 21 ngày quan sát màu sắc khuẩn ti khí sinh, khuẩn ti cơ chất

và sắc tố tan trên môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb và sử dụngbảng màu của Tresner và Barkus (1963)

Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của chủng được mô tả dựa vào khả năng đồng hóacác nguồn cacbon, nitơ, khả năng ức chế các vi sinh vật, khả năng mẫn cảm với cácchất kháng sinh và sự sinh trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện nuôi cấy khácnhau (pH, nhiệt độ, sự có mặt các chất ức chế)

2.2.4.1 Đặc điểm hình thái

2.2.4.1.1 Các đặc điểm nuôi cấy

Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ti khí sinh): Màu sắc của khuẩn ti khí sinh được

so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus (1963): xanh da trời, sẫm, xám, xanh lá,

đỏ, tím, trắng, vàng

Màu sắc của khuẩn ti cơ chất: chia vào 5 nhóm vàng- nâu (gồm cả các loại

không tiết sắc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi

trường ISP2-5 Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ti khí sinh vàkhuẩn ti cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin, nuôi

cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp Quan sáttrong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ vàngnhạt sang nâu, đen [30]

2.2.4.1.2 Các đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP3 và ISP 4 có đặt lamen trênmặt đĩa Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28 - 30oC xạ khuẩn sinh trưởng tốtlấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học vàkính hiển vi quét

Hình dạng chuỗi bào tử được kí hiệu: RF: thẳng hay hơi lượn sóng; RA:

hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn; S: dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn; SRF: dạng xoắn lượn sóng; SRA: dạng xoắn có móc câu.

Bề mặt bào tử: Bề mặt của khuẩn ti khí sinh có bào tử được phủ platin trong

30 giây sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quét (Viện 69-Bộ tư lệnhBảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh) để xác định đặc điểm bề mặt bào tử:

+ Bào tử hình tròn, ovan, hình que

+ Bề mặt bào tử được ký hiệu: sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ha (tóc)

2.2.4.2 Các đặc điểm sinh lí, sinh hoá

2.2.4.2.1 Khả năng sử dụng nguồn đường

Quan sát khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn trên môitrường ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đường glucose, fructose, sacarose,arabinose, xenlobiose, myo-inositol, manitol, xylose, raffinose, rhamnose, tinh bột,dextrose Các ống thạch đã cấy được ủ 5 - 7 ngày ở nhiệt độ thích hợp, so sánh vớiđối chứng dương là môi trường ISP9 bổ sung glucose, đối chứng âm là môi trườngISP9 cơ sở (môi trường khoáng) [30]

2.2.4.2.2 Khả năng sử dụng nguồn nitơ

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP8 bổ sung nguồn nitơ (0,1% w/v).Kết quả sinh trưởng được xác định sau 15 ngày, so sánh với ống đối chứng âm vàđối chứng dương (môi trường có L-Asparagine monohydrate) [30]

2.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử

2.2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ xạ khuẩn bằng đệm CTAB

Nguyên tắc:

Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn bằng lysozym sau đó loại bỏ protein khỏiDNA nhờ protease K Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ bằngphức hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Sau đó dịch có chứaDNA được tủa bằng Isopropanol và rửa bằng etanol Cặn DNA được hòa tan trongđệm TE Bảo quản ở -20oC [29]

Quy trình:

Lấy 2 ml dịch nuôi cấy đem li tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút

để thu cặn tế bào Hòa tan cặn trong 510 µl TE, pH = 8 Đảo đều bằng voltex Bổsung thêm 60 µl EDTA (nồng độ cuối 45mM) Sau đó thêm 60 µl lysozym (50

mg/ml), ủ trong 2 giờ ở 65OC Bổ sung thêm 5 µl protease K, 30 µl SDS 10% Đảonhẹ, ủ 1 giờ ở 37OC Thêm 110 µl NaCl 5M, 90 µl CTAB, đảo nhẹ Bổ sung thêm

700 µl Chloroform : Isoamin alcohol (24:1), đảo đều sau đó li tâm 10.000 vòng/phúttrong 10 phút

Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới Bổ sung thêm 700 µl hỗn hợpphenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), đảo nhẹ sau đó li tâm 10.000vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới (lặp lại 3lần)

Kết tủa DNA với propanol, để qua đêm ở -20oC

Li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch

Rửa tủa 2 lần với 500 µl cồn tuyệt đối

Làm khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Thêm 1 µl TE/RNase, sau đó ủ ở 37oC trong 2 giờ

Hòa tan lại tủa với 40 µl TE, pH 8

Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Bảo quản ở 4oC

* Tinh sạch DNA bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260 và 280 nm

Tính hệ số A = λ260/λ280 Nếu hệ số chỉ từ 1,8 – 2,0 là đạt yêu cầu.

Hỗn hợp phản ứng được chạy PCR với chương trình như sau:

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% Kích thướccủa các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn(Fermentas) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNAPurification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABIPRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam

Sản phẩm sau khi giải trình tự được so sánh với các trình tự tương ứng trênGenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI Cây phát sinh chủng loại được thiết lậptrên cơ sở khoảng cách di truyền theo Kimura, bằng việc sử dụng phương phápNeighbor-joining Phân tích Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với

1000 mẫu thử [10, 19]

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh

Từ 39 mẫu nước, bùn, đất thu thập được ở các vùng biển Quảng Ninh, HảiPhòng, Nghệ An, chúng tôi đã tiến hành phân lập và thu được 23 mẫu có xạ khuẩnvới tổng cộng 40 chủng Các chủng xạ khuẩn xuất hiện chủ yếu ở các mẫu đất vàbùn với màu sắc và hình dạng phong phú Trong các mẫu nước hầu như không tìmthấy xạ khuẩn hoặc có thì cũng rất ít và mức độ khác nhau của chúng không nhiều

do các mẫu đều lấy ở ven bờ trong độ sâu từ 0,2 – 5 m

Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường Gause

1 và một số môi trường đặc trưng cho sinh kháng sinh khác, có bổ sung nước biển.Các chủng sau khi nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC được thử hoạt tính đối kháng vi sinhvật bằng phương pháp thỏi thạch trên các môi trường có bổ sung các vi sinh vật

kiểm định S epidermidis ATCC 12228, B cereus ATCC 11778, B subtilis ATCC

6633, C albicans ATCC 10231 Sau 14 – 18 giờ, đo vòng đối kháng (D-d, mm) Kết

quả được thể hiện trên bảng 3.1

Bảng 3.1 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn

Chủng xạ TT