Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa (oryza sativa)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---Nguyễn Thị Thu Tươi NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA Oryza sativa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thị Thu Tươi

NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN

SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thị Thu Tươi

NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN

SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số : 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.Đỗ Thị Phúc

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quảnêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác Nếukhông đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình

Người cam đoan

Nguyễn Thị Thu Tươi

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, ủng hộ vàđộng viên tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2018

Nguyễn Thị Thu Tươi

iv

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA 3

1.1.1 Khái quát về đất nhiễm mặn 3

1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam 4

1.1.3 Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa 6

1.2 GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE ( SOS) Ở THỰC VẬT 10 1.2.1 Giới thiệu chung về họ gen SOS 10

1.2.2 Vai trò của SOS trong khả năng chống chịu mặn của cây trồng 12

1.2.3 Giới thiệu về gen SOS1 ở cây lúa 14

1.3 HIỆN TƯỢNG METHYL HÓA ADN VÀ VAI TRÒ CỦA METHYL HÓA ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG 15

1.3.1 Khái quát về hiện tượng methyl hóa ADN 15

1.3.2 Mối liên quan giữa sự methyl hóa ADN và khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở thực vật 16

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN SOS1 Ở THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 18

1.4.1 Tình hình nghiên cứu Methyl hóa gen SOS1 18

1.4.2 Tình hình nghiên cứu biểu hiện gen SOS1 ở điều kiện mặn 18

1.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHYL HÓA 19

1.5.1 MSP (Methyl Specific PCR) 19

1.5.2 Giải trình tự bisulfite 21

1.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ 22 1.6.1 Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR) 22

1.6.2 RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang 23

1.6.3 RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 25

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.1.2 Mồi phản ứng PCR 25

2.1.3 Hóa chất 26

2.1.4 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Trồng cây, xử lý mặn, thu mẫu và phương pháp đánh giá kiểu hình 27

2.2.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng MSP 28

2.2.3 Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu sự methyl hóa gen SOS1 29

2.2.4 Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen SOS1 32 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KIỂU HÌNH 35

3.1.1 Đánh giá đặc điểm hình thái lá 35

3.1.2 Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các giống lúa 36

3.2 ĐÁNH GIÁ SỰ METHYL HÓA CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 38

3.2.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP 38

3.2.2 Đánh giá sự methyl hóa của gen SOS1 40

3.2.3 Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn 41 3.3 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN 44

3.3.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR 44

3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn đến mức độ biểu hiện gen SOS1 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi

trùng hợp đặc hiệu methyl)Polymerase Chain Reactionreal-time reverse transcription polymerase chain reactionSingle nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn)Tris borate EDTA

Tris – EDTACalcium Binding Protein 8Salt Overly Sensitive

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tình trạng xâm nhập mặn tại đồng bằng sông Cửu Long 5

Hình 1.2 Ảnh hưởng của mặn đến hình thái cây lúa 8

Hình 1.3 Các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu mặn ở mức độ rễ, thân và lá 9

Hình 1.4 Con đường SOS tham gia duy trì cân bằng ion ở rễ cây 11

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 ở cây lúa 14

Hình 1.6 Sơ đồ đại diện của các con đường methyl hóa cytosine, demethylation, và mutagenesis của cytosine và 5-mC 16

Hình 1.7 Methylate-specific PCR 20

Hình 1.8 Xác định methyl hóa bằng cách sử dụng methylSEQr™ của AB Bisulfite Conversion Kit và thiết bị CE để phân tích DNA 22

Hình 1.9 Sơ đồ real-time PCR TaqMan 24

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31

Hình 3.1 Biểu đồ điểm xếp hạng trung bình của 4 giống lúa sau 14 ngày xử lý mặn 35 Hình 3.2 Biểu đồ về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 4 giống lúa trong điều kiện thường và sau 14 ngày xử lý mặn ở 100 mM NaCl 37

Hình 3.3 Cấu trúc gen SOS1 với 2 vùng methyl hóa cao b và c 38

Hình 3.4 Kết quả khảo sát methyl hóa vùng promoter của gen SOS1 39

Hình 3.5 Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi methyl trên gen SOS1 40

Hình 3.6 Đánh giá sự methyl hóa gen SOS1 bằng PCR (MSP) đối với 4 giống lúa tương ứng được xử lý mặn (100 mM NaCl) và giống đối chứng tại các thời điểm 1, 3, 24 giờ sau xử lý mặn 41

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự gen SOS1 giống Nipponbare 43

Hình 3.8 Kết quả đo đường cong nóng chảy 45

Hình 3.9 Biểu hiện của gen SOS1 ở 4 giống lúa được phân tích bằng phương pháp realtime PCR định lượng 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng 3

Bảng 1.2 Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng 4

Bảng 1.3 Quan hệ giữa EC và năng suất lúa 7

Bảng 2.1 Danh sách các mồi sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 2.2 Chỉ số scoring để đánh giá đặc điểm hình thái lá của IRRI 28

Bảng 2.3 Các thành phần của phản ứng PCR 30

Bảng 3.1 Các vị trí nucleotit bị methyl hóa 43

MỞ ĐẦU

Biến đổi khí hậu làm gia tăng tần suất lũ lụt, hạn hán, nước biển dâng và thayđổi quy luật mùa vụ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống nhân sinh và tác độngtrực tiếp đến sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa nước Đất nhiễm mặn gâyảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây trồng và vấn đề đất nhiễm mặn ngày càng làthách thức lớn đối với nền sản xuất lúa [26]

Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng trên thế giới, là nguồn lươngthực chính nuôi sống hơn 1/3 dân số thế giới Việt Nam với trên 75% dân số phụthuộc chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp và 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạolàm lương thực chính Tuy nhiên, hiện nay tình trạng đất nhiễm mặn ngày một giatăng, năng suất lúa trồng trên các vùng đất nhiễm mặn bị giảm, thậm chí nhiều nơi bịmất trắng Do đó, đất trồng lúa bị xâm nhiễm mặn đang là trở ngại và khó khăn lớnđối với nông dân và cũng là vấn đề gây tác động đến an ninh lương thực Quốc gia.Như vậy, giải pháp chiến lược có tính bền vững để hạn chế ảnh hưởng của nhiễmmặn đến sản xuất lúa là gieo cấy các giống lúa có khả năng chịu mặn [26]

Methyl hóa ADN có vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen, làmtắt hoạt động của transposon đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường Sự hiểu biết

về methyl hóa ADN của các gen giúp hiểu rõ hơn về vai trò của gen trong khả năng

chống chịu của cây trồng Gen Salt Overly Sensitive 1 (SOS1) được chứng minh là có

vai trò quan trọng trong việc đào thải Na+ khỏi tế bào, do đó góp phần vào khả năng

chống chịu mặn của cây trồng Tuy nhiên, điều hòa biểu hiện gen SOS1 thông qua cơ

chế methyl hóa ADN trong điều kiện mặn chưa được nghiên cứu ở cây lúa Chính vìvậy, chúng tôi lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều

kiện mặn ở cây lúa (Oryza sativa)”

nhằm đánh giá được sự methyl hóa ADN và mức độ biểu hiện gen SOS1 đáp ứng với

điều kiện mặn ở cây lúa, đồng thời đặt cơ sở khoa học bước đầu về nghiên cứu cơ chế

điều hòa biểu hiện gen SOS1 thông qua cơ chế methyl hóa ADN trong điều kiện mặn.

Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với các nội dung sau:

➢ Đánh giá đặc điểm kiểu hình lúa dưới điều kiện mặn

➢ Đánh giá sự methyl hóa của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn

➢ Đánh giá mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA

1.1.1 Khái quát về đất nhiễm mặn

Đất nhiễm mặn là đất có chứa một lượng muối hòa tan cao đủ gây ảnh hưởngđến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [4]

Đất mặn được hình thành do hai nguyên nhân: thứ nhất là sự tích tụ muối tựnhiên và thứ hai là do xâm thực mặn từ nước biển Đất mặn do nguyên nhân thứ nhấtthường hình thành trên các vùng khô hạn hoặc bán khô hạn, nơi lượng nước bốc thoáthơi cao hơn lượng mưa và hiện tượng tích tụ muối tự nhiên thường xuyên xảy ra Cácmuối này chủ yếu là dạng anion Cl-, SO4 2- cùng với các cation Na+, Ca2+, Mg2+, K+.Chúng có thể hình thành từ quá trình phong hóa đất và khoáng, hay được di chuyểnvào đất do mưa và nước tưới Với nguyên nhân thứ hai đất mặn được hình thành từcác vùng biển cũ trong lục địa, do các mạch nước ngầm nhiễm mặn nên muối đượcbốc lên theo các mao dẫn lên tầng đất mặt [4]

Dựa theo nồng độ muối hòa tan trong đất, người ta phân loại đất mặn

thành nhiều loại khác nhau:

Bảng 1.1.

Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng [28]

Phân loại đất mặn

Không mặnMặn ít

Mặn trungbìnhMặn

Mỗi loại cây trồng có khả năng chịu mặn khác nhau, được đánh giá qua chỉ sốngưỡng chịu mặn Ngưỡng chịu mặn là giá trị mà tại đó, cây trồng bắt đầu bị thiệt hạinăng suất được thể hiện qua bảng 1.2:

Bảng 1.2 Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng [30]

STT

1 2 3 4

5

6 7 8 9 14

15

1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, tình trạng đáng báo động về sự xâm nhập mặn diễn biến ngày càngtăng Theo báo cáo của Bộ Khoa học và Công nghệ (2016) [1], cuối năm 2015 vànhững tháng đầu năm 2016, diễn biến xâm nhập mặn tại đồng bằng sông Cửu Long

được đánh giá nặng nề nhất trong 100 năm qua Ngay từ tháng 2, độ mặn đã duy trì ở

4

sâu tới 70 km tính từ cửa sông, thậm chí có nơi lên đến 85 km (trong khi theo Trungtâm phòng tránh và giảm nhẹ thiên tai thì độ mặn bằng 4‰ đã được coi là bị xâmnhập mặn) [1].

Tại Hội nghị biến đổi khí hậu tác động đến nông nghiệp, Rạch Giá, Kiên Giangnăm 2013, nhiều tác giả đã nhấn mạnh, nếu mực nước biển dâng 12 cm (năm 2020); 30

cm (năm 2050) thì diện tích đất trồng lúa bị ngập vĩnh viễn tại khu vực đồng bằng sôngCửu Long sẽ là 1,4% và 6,0% tương ứng 1.317 và 1.345,44 km2 [8] Đặc biệt, việc nuôitrồng thủy sản không có quy hoạch cùng việc dự trữ nước của các đập thủy lợi, thủy điệncủa các quốc gia vùng thượng nguồn hay hiện tượng nước biển dâng làm cho nhiễm mặnngày càng nghiêm trọng chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long [2]

Hình 1.1 Tình trạng xâm nhập mặn tại đồng bằng sông Cửu Long [3]

Các dòng sông ở Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long đang bịxâm nhập mặn sâu vào nội địa trên 70 km và có chiều hướng gia tăng nhanh Độ mặn

đo được ở các điểm quan trắc cũng tăng Tại Sóc Trăng, độ mặn đo được từ tháng01/2015 tại trạm Đại Ngãi là 8‰ trong và cuối tháng 3 là 6,5‰ trong khi cùng kỳnăm 2014 độ mặn chỉ tới 4‰ Tại Hậu Giang, tình hình xâm nhập mặn diễn biến rấtphức tạp và cũng có chiều hướng gia tăng, độ mặn đo được ở thành phố Vị Thanh là12‰, có thời điểm (cuối tháng 3/2015) mỗi ngày độ mặn tăng 0,5 - 1‰ và di chuyểnsâu vào đất liền 2 - 3 km/ngày [7].

Các vùng lúa nhiễm mặn ở đồng bằng sông Hồng thuộc các tỉnh như Thái Bình,Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Vùng ven biển thuộc Hải Phòng bịnhiễm mặn khoảng 20.000 ha ở cả 2 dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâmnhiễm từ 0,3 - 0,5% Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn Tỉnh NamĐịnh có khoảng 10.000 ha Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 ha đất nhiễm mặn.Quan trọng hơn, dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu như hiện nay, dự báokhi mức nước biển dâng cao, diện tích đất nhiễm mặn ở Việt Nam có thể sẽ tăng lênnhanh và đây sẽ là khó khăn rất lớn cho sản xuất lúa trong tương lai

1.1.3 Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa

1.1.3.1 Ảnh hưởng của mặn đến các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây lúa

Ảnh hưởng của mặn đến sinh trưởng, phát triển của cây lúa được đánh giá bằngmức độ thiệt hại ở từng giai đoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau Ở mức nhiễmmặn trung bình và thấp có thể ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây,gây nên những thay đổi về hình thái, sinh lý, sinh hóa và làm giảm năng suất, trongkhi mức độ nhiễm mặn cao sẽ làm cây chết [30] Mối quan hệ giữa EC (ElectroConductivity - chỉ số diễn tả tổng nồng độ ion hòa tan trong dung dịch) và năng suấtlúa được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Quan hệ giữa EC và năng suất lúa

Theo Akita [8], mặn làm giảm diện tích lá ở cây lúa Trong điều kiện thiệt hạinhẹ, khối lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêmtrọng vì diện tích lá giảm Nếu ảnh hưởng mặn lớn hơn, khối lượng khô của chồi và

rễ sẽ giảm tương ứng Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ bị ảnh hưởng nhiều hơn lá non.Ảnh hưởng của độ mặn thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng, phát triển của lúa.Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây lúa chịu được mặn trong quá trình nảy mầm,nhưng trở nên rất nhạy cảm trong thời kỳ mạ non Mặc dù chịu được mặn trong suốtthời gian sinh trưởngvà phát triển, cây lúa lại rất nhạy cảm với độ mặn trong thời gianthụ phấn và thụ tinh [33]

1.1.3.2 Ảnh hưởng của mặn đến đặc điểm hình thái của cây lúa

Năm 1980, Ponnamperuma và Bandyopadhya [7], đã chỉ ra những biểu hiện đặctrưng nhất về mặt hình thái do tác động của mặn là cây lúa sinh trưởng, phát triểnkém, lá cuốn lại, khô đầu lá, phiến lá xuất hiện nhiều chấm lốm đốm màu trắng và lábên dưới bị khô cháy Theo Singh (2006) [48], hầu hết các thông số như số nhánh ít,bông lép, số hoa trên bông ít, khối lượng 1000 hạt thấp và cháy lá đều là biểu hiệncủa sự ảnh hưởng mặn

Hình 1.2 Ảnh hưởng của mặn đến hình thái cây lúa [49]

Các triệu chứng chính về mặt hình thái theo Singh (2006) [48] là lá chuyển màunâu và chết (trong trường hợp mặn kiềm), cây thấp, đẻ nhánh kém, tăng số bông bấtthụ, chỉ số thu hoạch thấp, giảm số hạt trên bông, giảm khối lượng 1000 hạt, năngsuất thấp và thay đổi thời gian sinh trưởng, lá cuốn lại, lá khô trắng, rễ sinh trưởngkém và ruộng lúa sinh trưởng, phát triển không đồng đều

1.1.3.3 Ảnh hưởng của mặn đến đặc tính sinh lý, sinh hóa và điều hòa biểu hiện gen của cây lúa

Theo Singh (2006) [48], dưới điều kiện mặn cao, hầu hết các cây trồng có nhữngthay đổi về mặt sinh lý và sinh hoá như tăng vận chuyển Na+ tới chồi, tích lũy Natrinhiều hơn trong các lá già, tăng hấp thu ion Cl-, giảm hấp thu ion K+, giảm khối lượngtươi và khô của chồi và rễ, giảm hấp thu photpho và kẽm, thay đổi enzyme, tăng cường

sự hoà tan các hợp chất hữu cơ không độc hại và tăng mức polyamine Theo Amirjani vàMonhammad (2010) [9], mặn ảnh hưởng đến cả sự phát triển lá và tình trạng nước củacây lúa Tác dụng thẩm thấu do độ mặn của đất có thể gây ra rối loạn cân bằng nướctrong quá trình sinh trưởng, đồng thời hạn chế sự sinh trưởng, kích thích sự đóng khíkhổng và làm giảm quá trình quang hợp Cây phản ứng bằng cách điều chỉnh thẩm thấu,thường bằng cách tăng nồng độ Na+ và Cl- trong các mô của chúng, mặc dù sự tích lũycác ion vô cơ như vậy có thể gây độc, làm tổn thương tế bào cũng như làm ảnh hưởng cảquá trình quang hợp và hô hấp Sự điều chỉnh phần

nào áp suất thẩm thấu này không đủ để tránh tình trạng thiếu nước trong cây, do đólàm sụt giảm hàm lượng nước trong rễ.

Khả năng chịu mặn của lúa chủ yếu theo hai cơ chế: loại trừ ion và khả năngthẩm thấu [36] Loại trừ ion chủ yếu liên quan đến quá trình vận chuyển Na+ và Cl-trong rễ và ngăn ngừa sự tích tụ dư thừa của Na+ và Cl- trong lá Loại trừ ion baogồm việc tìm kiếm Na+ từ xylem, và thải loại Na+ ra khỏi tế bào Khả năng chịu mặncủa lúa được điều chỉnh bởi các tín hiệu đường dài làm giảm sự phát triển của chồi vàđược kích hoạt trước khi tích lũy Na+ Khả năng chịu mặn của mô liên quan đến việc

cô lập Na+ trong không bào, tổng hợp các chất tan tương thích và sản xuất cácenzyme xúc tác phân giải hoạt tính độc của oxi Hình 1.3 cho thấy phác hoạ các cơchế và gen có liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa

Hình 1.3 Các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu mặn ở mức độ rễ, thân và lá

Một số loại gen quan trọng trong cơ chế chịu mặn của lúa là OsSOS1, OsNHX1

(Na+ / H+ antiporters), OsHKT2, 1 (Na+ / K+ symporter), OsCAX1, OsAKT1 (K+ kênh

chẩn đoán chính xác), OsKCO1 (Kênh chỉnh K+ ra bên ngoài), OsTPC1 (kênh thẩm

thấu Ca2+), OsCLC1 (kênh Cl) và OsNRT1; 2 (vận chuyển nitrat) [27].

1.2 GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Ở THỰC

VẬT

1.2.1 Giới thiệu chung về họ gen SOS

Mặn ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen, trong đó có một số gen quan

trọng như : NHXs, SOS, HKTs Trong đó, hai yếu tố chính giúp duy trì lượng Na+

thấp trong tế bào chất của thực vật là các kênh trao đổi (exchanger) Na+/H+ hiện diệntrên màng không bào (tonoplast) NHX1 và kênh đối chuyển (antiporter) Na+ /H+ -SOS1 trên màng sinh chất (plasma membrane) Hầu hết các kênh NHXs cần thiết choquá trình khử độc Na+ thông qua sự cô lập Na+ trong không bào thực vật, trong khicon đường tín hiệu Salt Overly Sensitive (SOS) được ghi nhận là xuất Na+ ra khỏi tếbào [25]

Ở cấp độ phân tử, con đường Salt Overly Sensitive (SOS) bao gồm các proteinSOS3, SOS2 và SOS1 đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng nồng độ

của các ion trong tế bào Trong đó, SOS1 là protein vận chuyển ion Na+/ H+ nằm trênmàng tế bào và được điều chỉnh bởi phức hợp protein kinase SOS2-SOS3 [37] Gen

mã hóa cho SOS1 chủ yếu biểu hiện ở lớp tế bào biểu bì rễ và trong xylem ở ranh

giới xylem-symplast trong cơ thể thực vật, trong khi SOS3 mã hóa cho một protein

gắn Canxi có chức năng cảm biến sự gia tăng nồng độ Canxi gây ra do dư thừa Na+

trong tế bào chất SOS2 mã hóa cho protein kinase serine/ threonine với 446 amino

axit và khối lượng phân tử ước tính là 51 kD [29] SOS2 có một đầu N-terminalkhoảng 270 axit amin và đuôi C-terminal quy định các chức năng kinase Khi gắn kếtvới Ca2+, SOS3 có thể tương tác và kích hoạt protein kinase serine/ threonine SOS2.Các tương tác SOS3-SOS2 hoặc SCaBP8-SOS2 kích hoạt hoạt động của proteinSOS1 giúp ngăn cản sự tăng quá mức nồng độ Na+/H+ trong tế bào [25]

Hình 1.4 Con đường SOS tham gia duy trì cân bằng ion ở rễ cây [25]

Chú thích: Các mũi tên nét liền biểu thị các tương tác đã được thiết lập, các đường

nét đứt chỉ ra mối liên kết được đề xuất giữa các thành phần được trình bày.)

Gần đây, một số lượng lớn các bằng chứng nghiên cứu cho thấy sự đa dạng chứcnăng của các protein trong con đường SOS cũng rất quan trọng đối với khả năng chịumặn Một số báo cáo đã chỉ ra rằng, trong rễ, các protein SOS có những chức năng mớingoài cân bằng nồng độ ion natri đó là duy trì khung xương tế bào dưới điều kiện bất lợi

và phát triển rễ bên thông qua điều chỉnh gradient auxin dưới điều kiện mặn Nghiên cứucác đột biến đơn hình của các gen trong con đường SOS biểu hiện các kiểu hình khiếm

khuyết đối với rễ, củ, gốc, cho thấy hoạt động của các gen SOS là rất cần thiết cho việc

thiết lập sự phát triển của tế bào thượng bì phần gốc nhằm đáp ứng với điều kiện mặn vàduy trì sự cân bằng nồng độ ion trong các tế bào [25] Trong năm 2007, Verslues và cácđồng nghiệp đã chứng minh rằng SOS2 tương tác với Nucleoside Diphosphate Kinase 2,Catalase 2 và 3, cho thấy SOS2 là một phần của nút tín hiệu kết

nối phản ứng đáp ứng với điều kiện mặn và tín hiệu ROS [53] Ngoài ra, các bằngchứng khác cũng cho thấy SOS2 tương tác và điều chỉnh hoạt động của các proteinnằm trên màng không bào như CAX1 và Vaccin ATPaa Vacuolar (V-ATPase) điềunày chứng tỏ rằng SOS2 đóng vai trò trung tâm của các quá trình vận chuyển [53].SOS2 cũng được chứng minh tương tác với ABI2, cho thấy một sự liên hệ giữa conđường ABA và con đường SOS [42] Những kết quả này cho thấy một mạng lướiphức tạp liên quan đến phản ứng của thực vật trong điều kiện mặn có liên quan đến

con đường SOS.

1.2.2 Vai trò của SOS trong khả năng chống chịu mặn của cây trồng

Ở thực vật, sự cân bằng nồng độ ion chủ yếu có liên quan đến con đường tínhiệu SOS, trong đó SOS1 đóng vai trò quan trọng trọng việc thải loại trực tiếp Na+ ramôi trường đất giúp kiểm soát quá trình vận chuyển Na+ trong tế bào Bên cạnh đó,các báo cáo trước đây cũng cho thấy SOS1 đóng vai trò quan trọng trong việc kiểmsoát sự cô lập Na+ trong không bào và điều chỉnh lượng Na+ vào xylem [37] Điềunày cho thấy SOS1 có liên quan đến nhiều quá trình trung gian trong đáp ứng vớiđiều kiện mặn ở thực vật

Ở Arabidopsis, SOS1 mã hóa cho một protein vận chuyển Na+/ H+ với một khối

lượng phân tử được dự đoán là 127 kD [25] Vùng N-terminal của SOS1 là kỵ nước

và có thể chứa từ 10 đến 12 domain xuyên màng, tùy thuộc vào chương trình dự đoán

được sử dụng để phân tích SOS1 đại diện cho một lớp các protein mới vận chuyển

Na+/ H+ có thể hoạt động trên màng tế bào [25] Đặc biệt, đuôi dài kỵ nước của SOS1được dự đoán là nằm trong bào tương Chiều dài đuôi của SOS1 sẽ tạo ra nhiều cơhội để tương tác với vô số các protein dự kiến sẽ điều chỉnh hoạt động của nó Mức

độ biểu hiện của gen SOS1 được điều chỉnh bởi điều kiện bất lợi mặn [25] Không

giống nhiều loại gen đáp ứng điều kiện mặn khác, quy định này rất cụ thể đối vớiNaCl và không xảy ra trong con đường ABA hoặc đáp ứng với điều kiện lạnh [25]

Như vậy, mô hình này cho thấy rằng SOS1 có chức năng trong việc thu nhận Na+ từxylem hoặc thải loại Na+ qua xylem

Vai trò của SOS1 trong việc kiểm soát sự cân bằng ion đã được thể hiện thông qua

sự kết hợp các phân tích sinh lý, sinh hóa và di truyền học Sử dụng các chủng nấm

men đột biến để nghiên cứu, SOS1 lần đầu tiên được chứng minh có thể vận chuyển

Na+ ra khỏi tế bào dưới điều kiện mặn [21] Phân tích sinh lý của cây đột biến SOS1 cùng với các nghiên cứu biểu hiện gen ở Arabidopsis cho thấy SOS1 có liên quan đến

quá trình thải loại ion từ tế bào chất ra môi trường xung quanh, trong các tế bào biểu

bì và các mô mạch, do đó duy trì nồng độ Na+ trong các tế bào rễ [45] Một vài

nghiên cứu khác đã cho thấy sự biểu hiện của tất cả ba gen SOS được tạo ra bởi stress mặn trong rễ, và đặc biệt, mức độ biểu hiện SOS1 cao đã được phát hiện trong các tế bào biểu bì phần gốc của A thaliana [45] Có thể hiểu rằng trong trường hợp nồng độ

NaCl thấp, Na+ trung gian do SOS1 gây ra cho môi trường tăng trưởng bởi các tế bào

biểu bì có thể là đủ để duy trì trạng thái cân bằng ion và các chức năng tế bào thíchhợp Quá trình loại trừ ion đặc biệt này trong các tế bào biểu bì gốc có thể được điềuchỉnh bởi cả con đường tín hiệu phụ thuộc vào con đường SOS Một nghiên cứu gầnđây đã chỉ ra rằng, phần lớn các quá trình sinh lý và sinh hóa của các loại tế bào đặcbiệt rất nhạy cảm với stress mặn trong rễ [19] Phân tích Microarray cho thấy rằng

biểu hiện gen SOS3 thể hiện cảm ứng khác biệt trong các loại tế bào nằm ở các vùng

rễ phát triển khác nhau để đáp ứng với stress mặn

Các nghiên cứu ở một số loài đã chỉ ra rằng SOS1 được bảo tồn ở các thực vật bậc cao bao gồm cả lá đơn và lá kép [45] Đặc biệt là, hoạt động của SOS1 đã được chứng minh là cần thiết cho các đặc tính chịu mặn của Thellungiella salsuginea (còn gọi là T halophila), một loài thực vật chịu mặn tự nhiên liên quan chặt chẽ đến Arabidopsis [25] Việc giảm 50% hoặc tăng cao hơn mức biểu hiện SOS1 bằng cách

sử dụng RNAi dẫn đến sự tích tụ ion cao gây độc cho T salsuginea [25] Do đó, tín

hiệu SOS3 / SCaBP8-SOS2-SOS1 là một cơ chế điều tiết tối ưu trong việc loại trừion Na+ và cân bằng nồng độ ion trong tế bào

Các nghiên cứu trong A.thaliana, những cây đột biến thiếu gen SOS1 cho thấy cực

kỳ nhạy cảm với điều kiện mặn và có khiếm khuyết khác nhau trong việc thải loại Na+

và vận chuyển ion [25] Khi biểu hiện trên màng tế bào S.cerevisia, SOS1 hoạt động như

một chất vận chuyển Na+ / H+ làm giảm nồng độ Na+ trong tế bào chất [25]

ỞArabidopsis, việc đưa các gen SOS1 vào các cây bị đột biến sos1 đã giúp khôi phục

khả năng chịu mặn của dòng đột biến này Sau 3 giờ xử lý mặn, mức độ biểu hiện của

gen SOS1 trong rễ cây Arabidopsis đã tăng lên khoảng 2 lần và đạt đến cực đại 6 lần sau 15 giờ trong khi nó giảm trong mô lá [9] Ở vùng tiếp xúc gốc-đất, SOS1 sẽ thải

loại một lượng các ion Na+ dư thừa từ các tế bào biểu bì gốc ra ngoài môi trường đất.Ngoài ra, phân tích khả năng vận chuyển Na+ trong cây bị đột biến sos1 theo các mức

độ mặn khác nhau đã chỉ ra rằng SOS1 cũng tham gia phân phối lại Na+ giữa các mô,

tế bào và các cơ quan trong cơ thể thực vật [42] Ở độ mặn trung bình (25 mM NaCl),

các cây đột biến gen sos1 tích tụ ít Na+ trong các cơ quan hơn các cây bình thường,

không đột biến gen Điều này cho thấy SOS1 có chức năng vận chuyển Na+ vàoxylem để phân phối đến chồi, lá Ngược lại, ở độ mặn cao (100 mM NaCl), rễ và các

cơ quan khác của cây đột biến sos1 tích tụ nhiều Na+ hơn các cây bình thường, có thể

là do sự loại bỏ Na+ ở lớp tế bào biểu bì gốc và gradient điện hóa lớn của Na+ ở câybình thường tốt hơn cây đột biến [42]

Vậy từ những nghiên cứu ở trên có thể kết luận được SOS1 đóng vai trò vô cùng quan trọng trong khả năng đáp ứng với điều kiện mặn ở cây trồng SOS1 vừa có vai

trò thải loại các ion Na+ dư thừa ra ngoài môi trường, vừa tham gia phân phối lại ion

Na+ giữa các cơ quan trong cơ thể, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn trongđiều kiện mặn

1.2.3 Giới thiệu về gen SOS1 ở cây lúa

Lúa (Oryza sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng ở các vùng

nhiệt đới và ôn đới trên thế giới Trong số những bất lợi về môi trường, độ mặn là yếu

tố chính làm giảm chất lượng và năng suất của cây Ở lúa, gen SOS1 (LOC_Os12g44360) mã hóa cho một protein vận chuyển Na+/H+ nằm trên màng tế bào có độ dài 14451 bp, gồm 23 exon và 22 intron với độ dài trình tự cds là 3447 bp

tương ứng 1148 acid amin (Hình 1.5)

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 ở cây lúa

Tương tự như ở Arabidopsis, gen SOS1 ở lúa có vai trò quan trọng trọng việc

thải loại trực tiếp NaCl ra môi trường giúp kiểm soát quá trình vận chuyển Na+ trong

tế bào Đồng thời, SOS1 cũng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự phânphối Na+ trong không bào và xylem [41]

1.3 HIỆN TƯỢNG METHYL HÓA ADN VÀ VAI TRÒ CỦA METHYL HÓA ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG

1.3.1 Khái quát về hiện tượng methyl hóa ADN

Methyl hóa ADN là một trong những cơ chế sửa đổi gen có vai trò quan trọngtrong việc điều hòa hoạt động của gen Không giống như trong tế bào động vật, sựmethyl hóa ADN trong tế bào thực vật không chỉ xảy ra ở vùng trình tự CG đối xứng

mà còn ở các vùng trình tự CHH và CHG (với H = A, T hoặc C) có tỷ lệ phần trămthấp hơn, tương ứng là 1,7% và 6,7% Methyl hóa ADN với tỷ lệ phần trăm cao chủyếu được tìm thấy trong heterochromatin nơi chứa các transposons và các trình tự lặp

đi lặp lại [10] Methyl hóa ở thực vật thường xảy ra trong hệ gen và chỉ có 5% genđược methyl hóa trong promoter của chúng, cơ chế này thường liên quan đến sự ứcchế biểu hiện gen

Hình 1.6 Sơ đồ đại diện của các con đường methyl hóa cytosine, demethylation,

và mutagenesis của cytosine và 5-mC [40]

Methyl hóa ADN rất quan trọng đối với sự tăng trưởng và phát triển của câytrồng để đáp ứng các điều kiện bất lợi từ môi trường [40] Là một trong những sửađổi cấu trúc ADN đầu tiên được phát hiện, methyl hóa ADN đã được quan sát thấy ởnhiều sinh vật Việc methyl hoá ADN nhân tạo thường xảy ra ở vị trí 5 của cytosine,tạo ra 5-methylcytosine Trong các điều kiện tăng trưởng bình thường, tỷ lệ cytosinesđược methyl hóa trong thực vật là 20-30% [40] Có rất nhiều bằng chứng chỉ ra rằngnhững thay đổi của gen khi bị methyl hóa ảnh hưởng đáng kể đến khả năng đáp ứngcủa thực vật đối với các điều kiện bất lợi từ môi trường [40]

1.3.2 Mối liên quan giữa sự methyl hóa ADN và khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở thực vật.

Methyl hóa ADN để đáp ứng với các điều kiện bất lợi từ môi trường được chứngminh là đặc tính của cơ quan và gen [62] Trong nghiên cứu của Zhikang Li và cộng

sự [60], phương pháp methyl hóa kết hợp với sự biểu hiện gen ở các giống khác nhaunhằm đánh giá ảnh hưởng của sự methyl hóa ADN đối với sự biểu hiện của các gentrong cùng một loài Kết quả cho thấy tổng cộng khoảng 39% (2010) và 30% (966) cácgen trong giống lúa N22 / IR64 và PK / IR64, đã được tìm thấy có liên quan đến cácvùng methyl hóa khác nhau Điều này cho thấy rằng biểu hiện của các gen liên quan đếncác vùng methyl hóa khác nhau phụ thuộc vào hướng thay đổi trạng thái methyl hóa.Nhìn chung, các gen gần với các vùng methyl hóa thể hiện mức độ sao chép thấp hơn(giảm xuống) so với toàn bộ hệ gen Sự methyl hóa ADN dường như tương quan với tìnhtrạng bật / tắt biểu hiện gen đối với các vùng methyl hóa (14,5% đối với N22

/IR64 và 7,2% đối với PK / IR64) [62] Đối với các trường hợp khác, trạng thái methyl hóa ADN tương quan với sự khác biệt về số lượng trong biểu hiện gen

Hơn nữa, phân tích mức độ biểu hiện gen DEGs của các vùng methyl hóa khácnhau cho thấy mối tương quan giữa tình trạng methyl hóa và mức độ biểu hiện gen.Các kết quả trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng sự methyl hoá gen đóng một vai tròquan trọng trong việc điều hòa sự biểu hiện gen của các giống lúa [62]

Methyl hóa của các gen liên quan đến đáp ứng điều kiện bất lợi và điều chỉnhmức độ biểu hiện gen Sự biểu hiện của các gen liên quan đến sự khác nhau giữa cácgiống lúa Việc tăng cường kích hoạt hoặc kìm hãm nhiều gen phụ thuộc vào cấu trúcchromatin và sự methyl hóa ADN [62]

Một vài ví dụ điển hình về sự methyl hóa của các gen liên quan đến các phảnứng stress phi sinh học và sự điều hòa biểu hiện gen đã được thể hiện trong nghiêncứu của Zhikang Li và cộng sự [60], Sự biểu hiện quá mức các gen mã hóa proteinnày đã được chứng minh có liên quan đến tình trạng methyl hóa ADN Ví dụ, các

nhân tố sao chép, chẳng hạn như A20 / AN1 (Os05g23470), homeobox (Os02g43330

và Os03g43930) và AGL19 (Os10g39130) biểu hiện methyl hóa không đồng đều

trong N22 / IR64 và / hoặc PK / IR64 Tình trạng methyl hóa của các nhân tố phiên

mã này có thể điều chỉnh sự biểu hiện của hàng loạt các gen đích khác

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN

GEN SOS1 Ở THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM

1.4.1 Tình hình nghiên cứu Methyl hóa gen SOS1

Methyl hóa ADN có vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen và sự phát triểncủa cây trồng trong điều kiện môi trường bất lợi [11] Nếu trước đó, sự methyl hóaADN trong vùng promoter đã được chứng minh có ảnh hưởng đến biểu hiện gen, thìphân tích methyl hóa trong vùng mã hóa của gen cho thấy có ảnh hưởng tích cực đến

sự biểu hiện gen [44] Ở lúa, bản đồ toàn bộ gen methyl hóa cytosine cho thấy có13,1% gen được methyl hóa trong vùng promoter và 5,4% gel được methyl trongvùng mã hóa của gen [57] Trong một điều kiện nhất định, methyl hóa ADN kiểm

soát sự biểu hiện của gen để đáp ứng lại stress Ở cây ngô, sự biểu hiện ZmMI1 tương

quan với sự giảm methyl hóa ADN của lõi nucleosome dưới điều kiện lạnh [46]

Trong đột biến Arabidopsis Met1-3, sự giảm methyl hóa cytosine gây ra biểu hiện gen AtHKT1 thấp, khiến đột biến này trở nên quá nhạy cảm với mặn [10].

Ở Việt Nam, trong nghiên cứu của Hoa và cs (2016) [40] đã phân tích tình trạng

methyl hóa của gen SOS1 trong 2 giống lúa Nipponbare (nhạy cảm) và giống Pokkali

(chịu mặn) dưới điều kiện mặn trong cả mô chồi và rễ Nghiên cứu đã giúp xác địnhđược chính xác các vị trí methyl hóa ở cặp base đơn trong giải trình tự bisulfite vàđưa đến kết luận sự methyl hóa chỉ xảy ra ở các vị trí CpG mà không mở rộng ở các

vị trí CHG và CHH [36]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu biểu hiện gen SOS1 ở điều kiện mặn

Trong nghiên cứu của Praveen Soni và cs (2013)[49], gen SOS1 đã được xác định

là không chịu ảnh hưởng ở mức độ phiên mã của yếu tố nhịp điệu ngày đêm Theo đó,

trong nghiên cứu của mình, Praveen Soni và cs đã đánh giá hoạt động tuần hoàn của các

gen SOS ở lúa trong giai đoạn cây con nhằm đáp ứng với những thay đổi của nhịp điệu

ngày đêm Để loại trừ sự thay đổi nhiệt độ của các mô hình biểu hiện của các gen này,

cây con được nuôi trong điều kiện nhiệt độ không đổi Kết quả cho thấy gen SOS3 và

SOS2 biểu hiện cùng một nhịp điệu, trong khi SOS1 không đánh giá được trong bất kỳ

mô hình biểu hiện cụ thể nào Phân tích này thiết lập một liên kết chéo

giữa nhịp điệu ngày đêm và con đường SOS cho thấy con đường SOS bị ảnh hưởng

bởi nhịp điệu ngày đêm ở lúa

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện mặn đến sự cân bằng ion và chuyển hóa

nitơ của lá già và lá non trong lúa đã chứng minh khi các gen HKT1; 5 và SOS1 biểu

hiện thấp ở lá già có thể làm giảm tần suất thu nhận Na+ từ các tế bào lá già [49].Ngoài ra, còn một số nghiên cứu khác đã chứng minh được vai trò quan trọng của

gen SOS1 trong việc kiểm soát và duy trì ổn định nồng độ Na+ trong tế bào thực vật

Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen SOS1 ở thực vật, cũng chưa có nghiên cứu nào kết hợp cả hai phương pháp methyl hóa và biểu hiện gen SOS1 trong

Nguyên lý: Đầu tiên, ADN được biến đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất

cả các cytosine không bị methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này được khuếch đại lên qua phản ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl hóa

và không bị methyl hóa Kỹ thuật MSP đòi hỏi lượng ADN rất ít, phát hiện nhạy tới 0,1% các alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm và cũng có thể thực hiện được với ADN tách chiết từ các mẫu đúc paraffin Sơ đồ mô tả kỹ thuật MSP:

Hình 1.7 Methylate-specific PCR [23]

Chú thích: Methylate-specific PCR bao gồm việc sử dụng hai cặp mồi: cặp 1

được thiết kế để khuếch đại trình tự gen đã xử lý bisulfite (các chấm đen) và cặp 2 là cặp mồi khuếch đại trình tự gen chưa xử lý bisulfite (các chấm trắng) Các cặp mồi được thiết kế sao cho có sự khác biệt về kích thước Sau khi nhân bản ADN bằng phản ứng PCR sử dụng hai cặp mồi trên, sản phẩm được đem đi điện di trên gel agarose Kết quả giả thuyết được trình bày như sau: Mẫu 1 cho thấy sản phẩm của

cả mồi methyl hoá (M) và không methyl hóa (U) đều hiển thị; mẫu 2 chỉ chứa ADN không methyl; mẫu 3 chỉ chứa ADN đã bị methyl hóa; và mẫu 4 không cho sản phẩm nào Điện di sử dụng marker L.DNA ladder.

Ưu điểm: Kỹ thuật MSP hạn chế được các kết quả dương tính giả từ các nghiên

cứu trước đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme giới hạn để phân biệt giữaADN bị methyl hóa và không bị methyl hóa

Hiện nay, kỹ thuật MSP được sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản, nhạy vàchi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện sự tăng cường methyl hóa tại một vùngpromoter quan tâm của một số gen có chức năng quan trọng, liên quan tới sự bất hoạtgen đó trong các bệnh ung thư ở Đây là kỹ thuật nhanh chóng phát hiện được sựmethyl hóa của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG [23]

1.5.2 Giải trình tự bisulfite

Giải trình tự toàn bộ hệ gen bisulfite (Whole genome bisulfite sequencing), còn

được gọi là BS-Seq, là kỹ thuật phân tích hệ gen đầu vào cao cho sự methyl hóa ADN

Nó dựa trên sự chuyển đổi sodium bisulfite ADN hệ gen, sau đó được giải trình tự bằngNext-generation sequencing platform Các trình tự thu được sau đó được sắp xếp lại với

hệ gen tham chiếu để xác định trạng thái methyl hóa của dinucleotide CpG dựa trên sựbắt cặp sai là do việc chuyển các Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil Dữ liệutrình tự bisulfit được phân tích bằng công cụ trực tuyến Kismeth2 [10]

Hình 1.8 Xác định methyl hóa bằng cách sử dụng methylSEQr™ của AB Bisulfite Conversion Kit và thiết bị CE để phân tích DNA [10].

1.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ 1.6.1 Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR)

Real time PCR là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN được hiển thị ngaysau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Kĩ thuật này cho phép phát hiện và định lượngtuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của một mẫu ADN [32].Phản ứng qRT-PCR (Real-time reverse transcription PCR) được sử dụng để pháthiện sự biểu hiện của gen thông qua quá trình tổng hợp cADN từ ARN bằng enzymephiên mã ngược cADN sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Sảnphẩm của RT-PCR có thể được định lượng nhờ điện di trên gel agarose sau khi chạyphản ứng PCR hoặc sử dụng phản ứng Real-time PCR Real-time PCR cho phép pháthiện và định lượng sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ

sở đánh dấu huỳnh quang, nồng độ sản phẩm được phân tích, dựa trên cường độ tínhiệu huỳnh quang, từ đó tính toán được nồng độ khuôn ban đầu [32]

Ứng dụng: qRT – PCR được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gene, để xác định

sự biểu hiện của một gen hoặc để xác định trình tự của một bản sao mã ARN, baogồm cả vùng khởi đầu và kết thúc phiên mã

1.6.2 RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang

Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng thuốc nhuộm ADN, thường là SYBRGreen, thuốc nhuộm gắn không đặc hiệu vào tất cả các chuỗi ADN kép và phát huỳnhquang, sau mỗi chu kỳ phản ứng, lượng ADN sản phẩm tăng làm tăng cường độ tínhiệu huỳnh quang tương ứng Nhược điểm của chất huỳnh quang là có thể gắn vàocác sản phẩm tự mồi gây nên hiện tượng nhiễu, làm giảm độ chính xác trong phântích định lượng kết quả trình tự đích cần khuếch đại [32]

Phản ứng được thực hiện trong một máy chu kỳ nhiệt như bình thường, trừ việcthêm thuốc nhuộm chuỗi ADN kép, thuốc nhuộm chỉ phát quang khi gắn với chuỗiADN kép, và đầu dò sẽ đo mức huỳnh quang sau mỗi chu kỳ Nếu kèm gam chuẩnngoài thì phản ứng có thể định lượng được [32]

1.6.3 RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan)

Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đángtin cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dòchuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát hiện(hiện tượng FRET) Đầu dò ADN hay ARN gắn đặc hiệu vào khu vực giữa hai đoạnmồi để định lượng chỉ những ADN chứa trình tự đầu dò, do vậy làm tăng đáng kể độđặc hiệu, và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cả một số sản phẩmkhuếch đại không đặc hiệu Khả năng này còn cho phép làm thử nghiệm đa mồi khi

sử dụng các đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau

Hình 1.9 Sơ đồ real-time PCR TaqMan [32].

Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một chất chặn ở đầu kia (Quencher – 3’), vị trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làm thuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ không phát quang Khi taq polymerase hoạt động, do enzyme này có hoạt tính 5’ – 3’

exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần nhau giữa chất mang và chất chặn bị phá vỡ nên hiện tượng FRET không xảy ra nữa, chất huỳnh quang không còn bị chặn, ở trạng thái tự do nên phát quang và tín hiệu phát quang này sẽ được máy đo lại. Sản phẩm đích tăng lên sau mỗi chu kỳ phản ứng thì lượng chất huỳnh quang tự do được giải phóng ra cũng tích tụ lại ngày càng nhiều

PCR được tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnh quang;Khi phản ứng bắt đầu, ở giai đoạn gắn mồi của PCR, cả mồi và đầu dò đều gắn đặc hiệuvào ADN đích; Quá trình tổng hợp chuỗi được thực hiện từ vị trí các mồi, và khi taqpolymerase chạm vào đầu dò thì hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của enzyme này phá hủyđầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi chất chặn và do đó làm tăng lượng chất huỳnhquang ở dạng tự do Chất huỳnh quang được đo bằng máy real-time PCR, lượng tăngtrung bình nhân chất huỳnh quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ của sản phẩm vàđược sử dụng để xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) của mỗi phản ứng