Nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây (solanum tuberosum l )

Nghiên cứu được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia NAFOSTED tài trợ kinh phí trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu các mối liên quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Vũ Thị Hoa Phượng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẬP CHỐNG CHỊU

HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY (Solanum tuberosum

L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Vũ Thị Hoa Phượng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẬP CHỐNG CHỊU

HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY (Solanum tuberosum

L.)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUỲNH MAI

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới cán

bộ hướng dẫn của tôi, TS Lê Quỳnh Mai, người đã tận tình dạy bảo, dẫn dắt, tạo điềukiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ Phòng thí nghiệm Công nghệ nuôi cấyThực vật và Vi tảo, Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Thínghiệm Trọng điểm Quốc gia về Enzyme và Protein, Đại học Khoa Học Tự Nhiên –Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tạo điều kiện cho tôi thực hiện thí nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn các thày giáo, cô giáo và các cán bộ Khoa Sinh họcđặc biệt là các thày, cô giáo và các cán bộ Bộ môn Sinh Lý Thực Vật và Hóa Sinh,trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình giảng dạycho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với gia đình, bè bạn nhữngngười đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong cuộc sống

Nghiên cứu được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) tài trợ kinh phí trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu các mối liên

quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn hán, độ mặn cao” với mã số 106.06-2012.14 Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Vũ Thị Hoa Phƣợng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Giới thiệu chung về khoai tây 5

1.1.1 Nguồn gốc lịch sử 5

1.1.2 Phân loại học 5

1.1.3 Đặc điểm của cây khoai tây 5

1.1.4 Vai trò của khoai tây 7

1.2 Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trước điều kiện hạn 8

1.2.1 Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn 8

1.2.2 Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật 9

1.2.3 Đáp ứng hạn của thực vật 12

1.3 Ảnh hưởng của môi trường hạn đến khoai tây 15

1.4 Tính tập chống chịu của thực vật 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị 21

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu 22

2.2.2 Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý 23

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll 24

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu 25

2.2.5 Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây (Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập chống chịu ở Arabidopsis thaliana 27

2.2.5.1 Thu mẫu 28

2.2.5.2 Tách RNA tổng số 28

2.2.5.3 Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số 29

2.2.5.4 Xử lý DNA 30

2.2.5.5 Tổng hợp cDNA 30

2.2.5.6 Kiểm tra chất lượng cDNA 31

2.2.5.7 Chọn gen đích 32

2.2.5.8 Thiết kế mồi 33

2.2.5.9 Xác định tương quan mức độ biểu hiện 34

2.2.5.10 Xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Ảnh hưởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà 7 35

3.2 Đánh giá các chỉ số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu 37

3.2.1 Hệ số nhân chồi 37

3.2.2 Chiều cao chồi 38

3.2.3 Số lá 39

3.2.4 Số rễ 41

3.2.5 Trọng lượng tươi và trọng lượng khô 42

3.3 Hàm lượng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống chịu 44

3.4 Hàm lượng proline 45

3.5 Mức độ biểu hiện của một số gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của khoai tây 47

3.5.1 Hàm lượng và độ tinh sạch của RNA tổng số 47

3.5.2 Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA 48

3.5.3 Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMG400014309 (P1) 50

3.5.4 Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMP400026903 (P2) 51

3.5.5 Sự biểu hiện của gen PGSC0003DMT400045091 (P3) 53

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu 20Bảng 2.2 Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu 21Bảng 2.3 Nồng độ proline và giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm 26Bảng 2.4 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra chất lượng cDNA.31Bảng 2.5 Thành phần phản ứng qPCR với thể tích phản ứng 20 µl 32Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng qPCR 32Bảng 2.7 Thông tin các gen đích được chọn trong nghiên cứu 33

Bảng 2.8 Các mồi sử dụng trong phản ứng qPCR kiểm tra sự biểu hiện của gen đích33Bảng 3.1 Hàm lượng RNA tổng số và các giá trị đánh giá mức độ tinh sạch 48Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra chất lượng cDNA 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) 6

Hình 1.2 Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn 13Hình 1.3 Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp ứng tậpchống chịu 18Hình 2.1 Các nội dung nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây

(Solanum tuberosum L.) giống HH7 22Hình 2.2 Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu 23Hình 2.3 Đường chuẩn proline 26Hình 2.4 Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã 28Hình 3.1 Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo trên môi trường có

bổ sung sorbitol 36Hình 3.2 Cây khoai tây trên đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt 36Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 38Hình 3.4 Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitolkhác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 38

Hình 3.5 Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol

khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 40Hình 3.6 Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ

sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 41Hình 3.7 Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7 trên môitrường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn 42

ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy) 42Hình 3.8 Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có cácnồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm(đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy) 44

Hình 3.9 Hàm lượng proline trong thân và lá khoai tây HH7 trên môi trường có cácnồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm(đánh giá sau 4 tuần) 46Hình 3.10 Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý hạn

và mẫu đối chứng của gen PGSC0003DMG400014309 (P1), tương đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã DREB1A ở Arabidopsis thaliana 51Hình 3.11 Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu khoai tây được xử lý hạn

và mẫu đối chứng của của gen PGSC0003DMP400026903 (P2), tương đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã RD26 ở Arabidopsis thaliana 52

Hình 3.12 Biểu đồ tương quan mức độ biểu hiện của gen GSC0003DMT400045091 (Gen P3), tương đồng với gen yếu tố phiên mã At4g13040 ở Arabidopsis

thaliana 53

Chữ viết tắt/

Kí hiệu

ABAcDNAChl.Chla

Chlb

cs.DNAĐCef1αHH7HK

MS

qPCRRefRNA

ROSTFTN

MỞ ĐẦUTÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tổ chức Nông Lương Thế Giới (FAO) khuyến cáo: Trong tương lai sản xuấtlương thực sẽ cần phải tăng 75% mới có thể cung cấp đủ lương thực cho 9 tỷ ngườivào năm 2050 Theo số liệu do Liên hợp quốc công bố ngày 16-10-2010, trên thế giới

có khoảng 1 tỉ người thiếu ăn Vấn đề an ninh lương thực là một vấn đề thế giới đãđang và sẽ phải đối mặt Hơn nữa, biến đổi khí hậu đang diễn biến ngày càng phứctạp, nắng nóng kéo dài, hạn hán, xâm nhập mặn và nhiều dạng thời tiết khắc nghiệtđang ảnh hưởng đến trái đất, đặc biệt ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển, năngsuất và chất lượng của cây trồng

Trước điều kiện tự nhiên bất lợi, thực vật có nhiều cơ chế giúp chúng tồn tại.Chúng có thể thích nghi (adapted) hoặc tập chống chịu (acclimated) với điều kiệnmôi trường Hai cơ chế này khác nhau cơ bản nhất ở khả năng di truyền và được quyđịnh ở việc biểu hiện gen thường trực hay có điều kiện Khả năng thích nghi với điềukiện sống liên quan đến những thay đổi trong cả một quần thể, trở thành đặc điểmcủa loài và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Ngược lại, khả năng tậpchống chịu mặc dù vẫn liên quan đến biểu hiện gen nhưng chỉ thể hiện dưới các điềukiện nhất định và những thay đổi này lại không di truyền Các cây qua giai đoạn tậpchống chịu sẽ thay đổi trực tiếp hình thái và sinh lý để có thể tồn tại trong nhiều loạiđiều kiện môi trường khác nhau và những biến đổi trong quá trình tập chống chịu cóthể mất đi khi điều kiện trở lại bình thường Và trong hoàn cảnh biến đổi khí hậuđang diễn ra phức tạp như hiện nay, thì việc nghiên cứu tính tập chống chịu của câytrồng cho chúng ta hi vọng sẽ thu được cây, đặc biệt là cây lương thực, có khả năngchống chịu với các điều kiện bất lợi biến đổi bất thường

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là loại cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế

giới và là cây lương thực đứng thứ tư trên thế giới về mặt sản lượng tươi (xếp sau lúa

mì, gạo và ngô) Khoai tây được coi là ―nguồn lương thực thực phẩm của tương lai‖

đã được trồng trên 100 nước trên toàn thế giới và là thành phần quan trọng trong hệthống lương thực thế giới (FAO) Đã có nghiên cứu cho thấy khoai tây là loại cây có

khả năng tập chống chịu với một số điều kiện bất lợi [18, 19, 50] Ở Việt Nam, cácnghiên cứu về khoai tây tập trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củnhỏ và một số bệnh cây, chủ yếu là bệnh virus, nhằm cải tạo giống và nâng cao chấtlượng cây Hầu như chưa có nghiên cứu nào về cơ chế tập chống chịu của loại câynày trước các điều kiện phi sinh học.

Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng tập chống

chịu hạn hán của khoai tây (Solanum tuberosum L.)” Qua đề tài những kiến thức

cơ bản xung quanh khả năng và cơ chế tập chống chịu của khoai tây trước điều kiệnhạn sẽ phần nào được làm sáng tỏ Cũng trong đề tài này, sự biểu hiện của một số genliên quan đến chịu hạn sẽ được đánh giá để thấy được vai trò của các gen này trongquá trình tập chống chịu

Các nghiên cứu trong luận văn này nằm trong đề tài “Nghiên cứu các mối liên

quan giữa khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố nhiệt độ cao, hạn hán, độ mặn cao” được Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) tài trợ với mã số 106.06-2012.14

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây giống

- Xác định cường độ hạn trong giai đoạn tập chống chịu cho hiệu quả nâng caokhả năng chống chịu hạn của khoai tây

- Đánh giá sự thay đổi hàm lượng proline, một chất điều hòa thẩm thấu trong

tế bào được coi là chỉ thị cho quá trình đáp ứng bất lợi về áp suất thẩm thấu của thựcvật, ở cây khoai tây đã qua tập chống chịu hạn

- Xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã ở khoai tây tương đồng với

các gen liên quan đến khả năng đáp ứng với hạn ở A thaliana.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng thực vật: Khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống HH7.

- Thông số của đối tượng: Các chỉ số sinh lý, sinh hóa gồm hệ số nhân chồi, chiều

cao chồi, số lá, số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng chlorophyll và hàm lượng proline ở các cây thí nghiệm và cây đối chứng

- Đối tượng gen: 3 gen mã hóa cho các yếu tố phiên mã ở khoai tây

PGSC0003DMG400014309, PGSC0003DMP400026903 và PGSC0003DMT400045091 tương đồng với các gen At4g13040.1, At4g27410.2 và At1g63040 ở A thaliana, lần lượt Các gen được chọn là những gen của khoai tây có

mức độ tương đồng về trình tự nucleotide vùng chức năng >90% tương ứng với các

gen ở A thaliana nêu trên Trong đó, PGSC0003DMG400014309 và

PGSC0003DMP400026903 là hai gen lần lượt tương đồng với DREB1A và RD26 ở

A thaliana liên quan đến khả năng chịu hạn đã được nghiên cứu [53]; PGSC0003DMT400045091 là gen có mức độ tương đồng 100% với gen At1g63040 ở A.thaliana liên quan đến khả năng chống lại các bệnh liên quan đến nấm và khuẩn

[22]. Trong đề tài, các gen PGSC0003DMG400014309, PGSC0003DMP400026903

và PGSC0003DMT400045091 sẽ được nghiên cứu và xác định mức độ biểu hiện

trong quá trình tập chống chịu ở khoai tây

Thí nghiệm nghiên cứu đánh giá khả năng tập chống chịu hạn của khoai tâytrên môi trường hạn nhân tạo được bố trí và tiến hành tại Phòng thí nghiệm Côngnghệ Nuôi cấy Thực vật và Vi tảo và một số phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Sinh LýThực Vật và Hóa Sinh, khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đạihọc Quốc gia Hà Nội Một số máy móc thiết bị được sử dụng tại Phòng thí nghiệmtrọng điểm Quốc gia về Enzyme và Protein, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại họcQuốc Gia Hà Nội

Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu khả năng tập chống chịu hạn của khoai tây sẽ là một đónggóp kiến thức quan trọng về sinh lý chống chịu hạn của khoai tây Trong các nghiêncứu về khoai tây ở Việt Nam đây là nghiên cứu đầu tiên hướng tới các hiểu biết cơbản về sinh lý liên quan đến tính tập chống chịu trước các yếu tố phi sinh học và tậpchống chịu hạn nói riêng

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài sẽ là một gợi ý hữu ích về một gen đích có thể ứng dụng kỹthuật di truyền nhằm đưa lại cho cầy trồng một sức sống mới trong điều kiện biến đổikhí hậu diễn ra ngày càng bất thường

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc lịch sử

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây thân thảo, có củ thuộc họ cà, có

nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao 2000-5000m.Các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều di tích lịch sử chứng minh cây khoai tây có từkhoảng 500 năm trước Công nguyên Người Tây Ban Nha lần đầu tiên phát hiện racây khoai tây khi họ đặt chân lên thung lũng Magdalenna (Nam Mỹ) Lúc đó, người

ta gọi khoai tây là Truffles vì hoa của nó có màu sặc sỡ [70] Đến thời kỳ người TâyBan Nha chinh phục châu Mỹ trong thế kỷ XVI, hàng trăm giống khoai tây đã đượcbiết đến và được trồng, chủ yếu dọc miền núi, bây giờ là Bolivia, Chile, Colombia,Ecuador và Peru [31] Từ đó đến nay, cây khoai tây đã dần phổ biến hơn và đóng vaitrò quan trọng trong đời sống con người

1.1.2 Phân loại học

Phân loại học của khoai tây trong hệ thống học thực vật (USDA, NRCS, 2010):

Giới: Plantae (plants)

Ngành: Magnoliophyta (flowering plants)

Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons)

Bộ: Solanales

Họ: Solanaceae

Chi: Solanum L

Loài: Solanum tuberosum L.

1.1.3 Đặc điểm của cây khoai tây

Khoai tây có thân chính mọc từ hạt hoặc từ củ Chiều cao thân khoai tây từ 45đến 90 cm tùy thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác và độ phì của đất Thân và lá khoaitây có nhiều lông Thân cây khoai tây là một hệ thống gồm thân, tia củ và củ Tia củphát triển từ thân ngầm Trong điều kiện thuận lợi sẽ phát triển củ Trong điều kiệnkhông thuận lợi sẽ trồi lên mặt đất, phát triển thành thân

Hình 1.1 Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.)

(Nguồn: Atlas des plantes de France 1891)

Lá khoai tây là lá kép lông chim, không đối xứng Các lá chét có đặc điểm làluân phiên xen kẽ một lá to đến một lá nhỏ (Hình 1.1)

Khoai tây có hoa cân đối Màu sắc hoa là đặc điểm phân biệt các giống: Cánhhoa có màu: trắng, tím-đỏ, tím-xanh, xanh thẫm Hoa khoai tây mọc thành chùm, làhoa lưỡng tính Khoai tây là cây tự thụ phấn nhưng cũng có trường hợp giao phấn Sựthụ phấn chéo của khoai tây được thực hiện nhờ côn trùng Sau thời kỳ ra hoa, mộtvài loài kết quả

Quả chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ anh đào giống như màu càchua Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, có 2 ô, hạt rất nhỏ

Mầm ngủ trên thân khoai tây được tạo thành ở các nách lá và củ Mầm ngủ ởmỗi củ thường là một số, phần lớn là 3 mầm Các mắt ngủ trên củ khoai tây phân bốtheo hình xoắn ốc Chúng được phân bố không đều trên bề mặt củ Thường tập trungchủ yếu ở phần trên của củ, nơi có các tế bào tương đối trẻ [2].

Đời sống của cây khoai tây được chia làm 4 thời kỳ:

- Thời kỳ ngủ

- Thời kỳ nảy mầm

- Thời kỳ hình thành thân củ

- Thời kỳ phát triển củ

1.1.4 Vai trò của khoai tây

Khoai tây là thực phẩm cung cấp năng lượng và là nguồn dinh dưỡng có giátrị Khoai tây giàu tinh bột, đường, chủ yếu là đường sacarose, có loại đường đơn nhưglucose và fructose nhưng hàm lượng thấp, nhiều loại vitamin: B1, B2, B3, đặc biệt

là vitamin C… Trong khoai tây chứa đạm, bên cạnh các loại protit (khoảng 2% trọnglượng tươi) là các axit amin tự do (trong củ thường có đến 20 axit amin tự do) Trongkhoai tây còn chứa nhiều khoáng chất, nhiều nhất là kali (lượng oxit kali chiếm gần60% trọng lượng chất khoáng) Ngoài ra còn có canxi, magie, sắt, Vỏ củ khoai tâycung cấp một lượng lớn chất sơ

Sử dụng 100g khoai tây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% nănglượng, 10% sắt, 10% vitamin B1và 20-50% nhu cầu vitamin C cho một người trongmột ngày đêm 31].[8,

Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực và thực phẩm, các nước phát triển

sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc Hàng năm, Pháp sử dụng từ 1 đến 1,4triệu tấn khoai tây cho chăn nuôi Bên cạnh đó, khoai tây còn được dùng nhiều trongcông nghiệp sản xuất axit hữu cơ như axit lactic, axit xitric; các dung môi hữu cơ nhưethanol, butanol, xeton, …

1.2 Hạn và đáp ứng của thực vật ở cạn trước điều kiện hạn

Thực vật ở cạn sống bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển trong suốtquá trình phát triển cá thể Vì vậy, chúng chịu ảnh hưởng sâu sắc bởi điều kiện ngoạicảnh Ngày nay, do biến đổi khí hậu toàn cầu, hiện tượng hạn, mặn, úng, nóng, lạnh,

… (các yếu tố cực đoan phi sinh học, abiotic stress) xảy ra ngày càng nhiều Trong

đó, hạn là một trong các yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng vànăng suất cây trồng Hạn làm thay đổi nhiều quá trình sinh lý và có thể làm biến đổihình thái của thực vật

Hạn hán là một thiên tai phổ biến trên thế giới với biểu hiện thiếu hụt nghiêmtrọng lượng mưa, giảm lượng ẩm trong không khí, suy kiệt dòng chảy sông suối, hạthấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới đất, … Xét trên mốiquan hệ giữa hạn với thực vật, hạn của môi trường được chia làm hai kiểu: Hạn đất

và hạn không khí

- Hạn đất: Hạn đất xuất hiện khi không có mưa trong thời gian dài, khi câykhông thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước mất đi qua con đường thoát hơi nước,dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và cây có dấu hiệu bị khô héo

- Hạn không khí: Hạn không khí xuất hiện khi độ ẩm tương đối của không khígiảm xuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên trong lá dướikhí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh, gây nên sựmất cân bằng nước trong mô cây và cây bị héo [3]

1.2.1 Đặc điểm thích nghi của thực vật chịu hạn

Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thểhiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý Một số giảm thiểu sự thoát hơi nướcnhờ có lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể tiêu giảm, sửdụng nước hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con đường CAM Một sốngừng sinh trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình thường Một số có chu kỳ sinhdưỡng ngắn, chỉ trong vài tuần Khi có mưa, đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm.Chúng sinh trưởng và phát triển thật nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khôhạn đến [3]

1.2.2 Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của thực vậttrước các điều kiện phi sinh học Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối cao là nhữngyếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật Nhiệt độ cao ảnhhưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm ngừng các quá trìnhquang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế bào hàng loạt Trong khi đó,hạn và mặn làm giảm thế nước của thực vật, làm tế bào không thể phát triển, phá vỡcác protein trong tế bào, gây mất cân bằng ion dẫn đến các hoạt động trao đổi chất bịđình trệ, quang hợp bị ức chế và có thể gây chết tế bào [13] Các nhà khoa học cũng

đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng cộng hưởng của các yếu tố bất lợi khác nhauđến cây trồng [52, 62]

Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước

Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là ngừngsinh trưởng Sự hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm nhu cầutrao đổi chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo

vệ, điều chỉnh thẩm thấu Sự ngưng sinh trưởng ở rễ cho phép mô phân sinh của rễvẫn thực hiện chức năng và phát triển nhanh chóng khi điều kiện bất lợi giảm

[32]. Hạn chế sự phát triển rễ bên cũng là một cách thức đáp ứng hạn, điều này thúcđẩy sự sinh trưởng của rễ chính, giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầngđất sâu hơn [88]

Nước sẵn có trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sựđóng khí khổng Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu dinhdưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể hình thànhmột đáp ứng thích nghi Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách đối phó với hạncủa thực vật Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline trong điều kiện bất lợigiúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này đóng vai trò quan trọng trongviệc duy trì sức trương của tế bào [12]

Sự thay đổi trong sinh trưởng cùng với việc giảm hoạt động của cơ quanquang hợp do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó dẫn đến sự biến đổi trong sự

phân chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và tế bào/mô tích trữ (sourceand sink tissue) [66] Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinhtrưởng trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc đểtổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu [45].

Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp

Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA khiến cho khí khổng đónglại Điều này làm giảm hàm lượng carbon dioxide trong mô lá và cản trở quá trìnhquang hợp Sự cản trở quá trình quang hợp sẽ mất đi và quang hợp sẽ phục hồi nếukhí khổng mở ra khi điều kiện trở lại bình thường [16] Một vài loài thực vật đã sửdụng sản phẩm của quang hợp để điều chỉnh thẩm thấu, điều này giúp ngăn cản sựmất sức trương của tế bào

Sự hạn chế carbon dioxide do kéo dài thời gian đóng khí khổng trong điềukiện bất lợi dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron,điều này có thể làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS (reactiveoxygen species) ROS là các phân tử hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏngoài cùng như superoxide, hydropeoxide, hydroxyl Việc tích lũy các hợp chất ROStrong tế bào gây tác động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA vàRNA), protein và lipid Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và

cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏnghoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [43]

Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào

Sinh trưởng của thực vật được xác định bởi hệ số hô hấp, là tỷ lệ giữa CO2

được đồng hóa trong quang hợp và CO2 thải ra trong quá trình hô hấp Hệ số hô hấpđược điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp – ATP,nước và các chất tan được hấp thu bởi rễ, sự vận chuyển của các sản phẩm đến các

mô dự trữ, NADH và chu kỳ TCA trung gian (quá trình sinh tổng hợp trong quá trìnhphát triển của thực vật) Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng và dẫnđến sự tăng cường hô hấp Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là do sự kíchhoạt các quá trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất điều chỉnh thẩmthấu và chống oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [9]

Ảnh hưởng của hạn đến hormone

Hormone thực vật điều chỉnh các quá trình khác nhau cho phép thực vật tậpchống chịu với các điều kiện bất lợi Khi thiếu nước, ABA được tổng hợp ở rễ và vậnchuyển lên lá Ở đây, ABA làm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởngcủa thực vật, vì vậy nó cho phép thực vật thích ứng với điều kiện hạn [86] Ở lúamạch, ABA nội sinh tăng lên gấp 5 lần để chống chịu với hạn, điều này cho thấy vaitrò của ABA giúp cải thiện khả năng chống chịu hạn [79] Kết quả theo dõi 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED3), một emzyme then chốt trong quá trình sinh

tổng hợp ABA ở A thaliana trong điều kiện hạn đã cho thấy sự tăng cường biểu hiện

[34] Bên cạnh sự tăng cường hàm lượng ABA, hàm lượng auxin cũng có sự biến đổikhi thực vật chống chịu với hạn Ở lúa mì, khả năng chống chịu hạn đã được hỗ trợbởi sự giảm hàm lượng indole-3-acetic acid (IAA) ở lá [87] Tuy nhiên, có một vàibằng chứng cho rằng sự tăng hàm lượng IAA tạm thời ở lá ngô trong suốt giai đoạnđầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chống chịu với hạn ở giai đoạn sau

[82] Sự giảm nhanh chóng hàm lượng zeatin và gibberellin nội sinh cũng đã xảy ra ở

lá ngô để đối phó với hạn Bên cạnh đó, hàm lượng và khả năng hoạt động củacytokinin cũng giảm trong điều kiện hạn [61] Ở cỏ linh lăng, hàm lượng cytokiningiảm trong suốt thời kỳ hạn làm thúc đẩy quá trình già hóa nhanh hơn [23] Cytokininđược biết đến giúp làm chậm quá trình già hóa và khi hàm lượng cytokinin nội bàotăng nhờ có sự tăng cường biểu hiện của gen ipt liên quan đến sinh tổng hợpcytokinin dẫn đến những đáp ứng hạn [59] Cytokinin cũng gây ảnh hưởng xấu đếnsinh trưởng của rễ, hạn chế sự sinh trưởng rễ chính và tăng cường phát triển rễ bên

Nhờ vậy mà khả năng chống chịu hạn của A.thaliana được tăng lên [85]

Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vậtchống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học [39] BR làm tăng cường khả năng hấp thunước và ổn định màng cũng như làm giảm sự rò rỉ ion khỏi màng ở lúa mì khi chốngchịu với hạn [67]

1.2.3 Đáp ứng hạn của thực vật

Thực vật có những cơ chế đáp ứng giúp chúng tăng cường tính chống chịu đối

với các điều kiện bất lợi trên Hệ thống mô hình xử lý hạn cho cây mô hình A.

thaliana đã được Amal Harb và cs (2010) thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của

cây khi bị hạn Kết quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua

ba giai đoạn: giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đápứng tập chống chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [27] Thực vật đápứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và khôngphụ thuộc ABA Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi trường được tếbào tiếp nhận và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường hoặc thông qua ABAhoặc không thông qua ABA [75] Các tín hiệu được dẫn truyền đến nhân gây ra sựtăng cường biểu hiện của các gen mã hóa yếu tố phiên mã Các yếu tố phiên mã gây

ra sự tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến tính chống chịu Các đáp ứngnày sẽ bị mất dần khi điều kiện bất lợi mất đi [9, 80]

Thực vật cảm nhận các yếu tố bất lợi, hay các tác nhân từ môi trường nóichung thông qua hàng loạt các thụ thể bề mặt tế bào như các serine/threonine-likereceptor kinase, được gọi chung là các receptor-like kinase (RLKs), các thụ thể liênkết với kênh ion (ion chanel-linked receptor), các G-protein-couple receptor (GPCRs)

và các thụ thể histidine kinase Các kênh Ca2+ cho phép Ca2+ được chuyển vào tế bàochất khi được kích hoạt bởi các yếu tố bất lợi [88] Vì vậy các kênh này hoạt độngnhư các các thụ thể liên kết với kênh ion của yếu tố bất lợi GPCRs là một nhóm thụthể màng khác Trong điều kiện bất lợi, chúng kích hoạt các enzyme phospholipase Choặc D và chuyển hóa thành các tín hiệu [81]

Các thụ thể nội bào ABA, PYR/RCAR, là các tín hiệu của yếu tố bất lợi gây rabởi hạn, thông qua kích hoạt serine/threonine kinase SnRK2 trong đáp ứng với ABA[73]. Do sự tổng hợp ABA dẫn đến tăng cường đáp ứng với điều kiện bất lợi, thụ thểABA có thể được coi là một thiết bị cảm biến yếu tố bất lợi

Hình 1.2 Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn

Trong quá trình tiếp nhận tín hiệu bất lợi từ môi trường không thông qua ABA,đường là một hợp chất quan trọng Các hexokinase là thiết bị cảm biến đường

ở thực vật, chúng đóng vai trò ngăn chặn sự biểu hiện các gen liên quan đến quá trìnhquang hợp khi hàm lượng hexose trong tế bào lá cao [41] Trehalose - 6 - phosphate(T6P) là một phân tử đường tín hiệu, có chức năng điều chỉnh quá trình sinh trưởng,phát triển và làm tăng hàm lượng sucrose trong thời kỳ ra hoa Sự tăng cường biểuhiện của trehalose - 6 - phosphate phosphatase ở ngô trong thời kỳ ra hoa giúp cảithiện năng suất trong điều kiện hạn [56] ROS là sản phẩm của các quá trình trao đổichất trong điều kiện bất lợi, cũng là những phân tử tín hiệu quan trọng [51] Các tínhiệu oxi hóa được chuyển qua tín hiệu trung gian thứ hai như Ca2+ hoặc phosphatidicacid (PA) - kích hoạt protein kinase serine/threonine và mitogen - activated protein

kinase (MAP) dẫn đến sự phiên mã của các gen đóng vai trò quan trọng trong tậpchống chịu [17].

Cơ chế truyền tín hiệu

Các tín hiệu được các thụ thể tiếp nhận sau đó truyền lại cho các phân tử tínhiệu thứ hai như các protein kinase, các phosphatase (serine/threonine phosphatases),các phospholipid như phosphoinositides [5] ROS, Ca2+, nitric oxide, cAMP và cácphân tử đường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu [81] Trongđiều kiện bất lợi gây ra bởi những yếu tố khác nhau có nhiều phân tử tín hiệu giốngnhau Điều này chỉ ra rằng các con đường đáp ứng các điều kiện bất lợi khác nhau cóthể xảy ra nhờ những chất truyền tín hiệu chung [9] Các phân tử protein kinase kíchhoạt phân chia tế bào thông qua quá trình phosphoryl hóa các protein và là một trongcác cơ chế chính của quá trình truyền tín hiệu

Hàm lượng canxi trong tế bào chất tăng trong điều kiện bất lợi Ca2+ trong tếbào chất tăng lên chủ yếu từ ngoài vào tế bào qua màng hoặc được huy động từnguồn dự trữ trong tế bào, cụ thể là từ không bào Một vài kênh cảm ứng Ca2+ nhưcalmodulin (CaM) hay CaM - binding protein đã được tìm thấy trong tế bào tham giatruyền tín hiệu đến nhân thông qua các tín hiệu như phospholipase hay Ca2+ -dependent kinase [81]

Điều khiển phiên mã trong biểu hiện gen

Một số lượng lớn các gen được tìm ra liên quan đến các đáp ứng với điều kiệnbất lợi [88] Microarray DNA cung cấp thông tin có ý nghĩa lớn trong việc phân tíchbiểu hiện của toàn bộ hệ gen và đã được sử dụng để nghiên cứu các mô hình biểuhiện gen ở các đáp ứng với hạn hoặc mặn ở một số loài thực vật [25, 72, 29, 44] Các

gen tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn bao gồm các gen liên quan đến tổnghợp các chất điều hòa thẩm thấu, các gen mã hóa cho các protein LEA, aquaporin,các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã Trong đó, các gen mã hóa cho các yếu tốphiên mã được quan tâm nhiều bởi các yếu tố phiên mã hoạt động như những côngtắc tác động đến hàng loạt các gen đáp ứng với điều kiện bất lợi [5] Có hơn 100 yếu

tố phiên mã mà sự biểu hiện của chúng được tăng cường khi tiếp xúc với điều kiện

hạn, chúng đã được tìm ra bằng phân tích toàn bộ hệ phiên mã ở cây A thaliana tiếp

xúc với hạn [65] Hạn làm tăng cường mức độ biểu hiện của các gen, được điều khiểnbởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF, HD-ZIP, MYB, Bhlh, NAC, NF-Y,EAR và ZPT2 [91] Những yếu tố phiên mã này được kích hoạt bởi các tín hiệu hạn

Do hạn xảy ra cùng với sự tăng lên về hàm lượng ABA, một vài yếu tố phiên mãđược kích hoạt bởi ABA Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA (ABFs) chủ yếuthuộc họ bZIP và kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong các promotercủa các gen đáp ứng hạn [37, 92] Trong khi đó, sự hoạt động của một số gen mã hóayếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc ABA Tuynhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gen mã hóa yếu tố phiên mãthuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ thuộc ABA và khôngphụ thuộc ABA [49, 89]

APETALA2/ethylene response element - binding protein (AP2/EREBP) là họ

yếu tố phiên mã chính trong các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana, gồm 147 gen,

chiếm 9% các yếu tố phiên mã [20] Ở thực vật bậc cao, có gần 200 gen yếu tố phiên

mã AP2 đã được báo cáo Các AP2/EREBP được đặc trưng bởi sự có mặt của binding domain, được gọi là AP2 domain, chứa khoảng 68 amino acid [26, 64] Dựavào sự có mặt của một hoặc hai AP2 – DNA - binding domain, họ gen này được chiathành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV [68] Phân họ AP2 mã hóa cho các protein

DNA-có hai AP2 domain và các protein này liên quan đến các quá trình sinh trưởng nhưphát triển các mô phân sinh, các bào quan và sự phát triển hoa Các phân họ DREB(dehydration - responsive element binding), ERF (ethylene - responsive factor) vàRAV (related to ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một AP2 domain và cácthành viên trong phân họ gen này liên quan đến hệ thống truyền tín hiệu [24, 76]

1.3 Ảnh hưởng của môi trường hạn đến khoai tây

Trong quá trình sinh trưởng, khoai tây cần rất nhiều nước Để tạo ra 100kg củkhoai tây cần 12-15 m3 nước, để đạt được năng suất củ từ 19-33 tấn/ha, mỗi hectakhoai tây cần 2800-2900 m3 nước Giai đoạn trước khi hình thành củ đòi hỏi ẩm độđất khoảng 60%, giai đoạn hình thành củ là 80% Nếu thiếu nước ở giai đoạn hình

thành củ thì năng suất giảm rõ rệt Cụ thể: ẩm độ đất là 60% thì năng suất giảm 4,3%;

ẩm độ đất còn 40%, năng suất giảm 33,9%; không tưới năng suất giảm 63% [1].Khoai tây được trồng bằng củ nên khi phát triển không hình thành rễ chính mà chỉ cócác rễ phụ thưa thớt Phần lớn rễ tập trung ở tầng đất mặt nên khả năng hút nước củacây không lớn Gặp điều kiện khô hạn, khoai tây rất dễ bị thiếu nước và phát triểnkém [2] Nghiên cứu của Deblonde và cộng sự năm 1999 chỉ rõ, năng suất và yếu tốcấu thành năng suất bị tác động mạnh mẽ bởi tổng lượng nước tưới Tuy nhiên, tácđộng của hạn đến cây trồng phụ thuộc vào thời gian, gian đoạn và mức độ nghiêmtrọng của khô hạn [28, 38] Hạn thường tác động mạnh ở 3 giai đoạn: sinh trưởngsinh dưỡng, phình to củ và chín (héo tán cây, vỏ củ cứng lại, đường chuyển hóa thànhtinh bột) Nhiều thí nghiệm đã chứng minh, thiếu nước ở giai đoạn sinh trưởng sinhdưỡng thì củ rất nhỏ nhưng số lượng củ/cây nhiều Khô hạn bắt đầu vào giai đoạnphình to củ làm cho giai đoạn hình thành củ kéo dài hơn nhưng lại giảm số lượng củ

và năng suất [30] Thiếu nước ở giai đoạn chín sinh lý, có thể tăng lượng chất khô màkhoai tây có thể tích lũy được trong củ [15]

Đã có những nghiên cứu chứng minh sự đáp ứng hạn của khoai tây có liênquan đến biểu hiện gen Năm 2011, cơ quan Phát triển Nông thôn Hàn quốc công bốviệc phát hiện một gen giúp tăng cường khả năng chịu hạn ở khoai tây Gen này mãhóa cho một yếu tố phiên mã trong nhóm MYB, putative R1-type MYB-liketranscription factor (StMYB1R-1) Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây khoai tâytăng cường biểu hiện gen StMYB1R-1 có khả năng chống chịu cao với hạn mà đồngthời lại không ảnh hưởng tới các tính trạng nông học khác [74] Nghiên cứu của AnilKumar Singh và cs (2013) đã chỉ ra sự tăng cường biểu hiện của một số gen mã hóayếu tố phiên mã họ NAC ở khoai tây trong điều hiện hạn [77]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khoai tây chủ yếu tập trung vào việc khảonghiệm, lai giống, kỹ thuật canh tác, các bệnh về cây nhằm nâng cao năng suất vàchất lượng cây [2, 3, 4] Gần đây, năm 2013, Sở Khoa học và Công nghệ Vĩnh Phúc

đã tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống khoai tây trồngtại Vĩnh Phúc Nghiên cứu được tiến hành trên 5 giống khoai tây KT3, Diamant,

Solara, Esprit và Atlantic Kết quả cho thấy, giống khoai KT3 và Diamant có khảnăng chịu hạn tốt hơn so với các giống còn lại Khả năng chịu hạn được đánh giáthông qua một số chỉ tiêu: hàm lượng proline của lá, sự biến đổi áp suất thẩm thấucủa tế bào, khả năng trao đổi nước, sự biến đổi huỳnh quang diệp lục của lá và chỉtiêu năng suất.

Hiện tại, trong nước chưa có nghiên cứu nào về khả năng tập chống chịu củakhoai tây trước các điều kiện phi sinh học Có thể thấy rằng, nghiên cứu của chúngtôi sẽ đóng góp kiến thức quan trọng về sinh lý chống chịu hạn của khoai tây, mở đầucho một hướng đi mới liên quan đến khả năng tập chống chịu của thực vật trước cácyếu tố bất lợi phi sinh học từ môi trường

1.4 Tính tập chống chịu của thực vật

Năng suất của cây trồng có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với đời sống conngười cũng như sự phát triển kinh tế của mỗi quốc gia Tuy nhiên, nó đang bị giảmmạnh bởi các yếu tố bất lợi phi sinh học từ môi trường Các cơ chế chống chịu và đápứng với các yếu tố bất lợi từ môi trường đã đang và sẽ được tập trung nghiên cứumạnh mẽ Thực vật vượt qua những điều kiện bất lợi của môi trường bằng sự pháttriển khả năng chống chịu (tolerance), đề kháng (resistance) hoặc né tránh(avoidance) Khả năng tập chống chịu (acclimation) với yếu tố bất lợi từ môi trườngcủa thực vật thì cho phép thực vật tăng cường tính chống chịu với các điều kiện bấtlợi ở ngưỡng lớn sau giai đoạn được tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở ngưỡng nhỏ

và vừa

Hình 1.3 Sơ đồ đơn giản của một quá trình nhận, truyền tín hiệu gây ra đáp ứng

tập chống chịu [21]

Một vài báo cáo đã cung cấp bằng chứng rằng thực vật có thể đáp ứng một cáchnhanh chóng hoặc cảm ứng mạnh mẽ, dẫn đến tăng cường khả năng chống chịu với cácyếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học từ môi trường [7] Có thể nói hiện tượng nàytương tự với quá trình gây đáp ứng miễn dịch bằng vacxin ở động vật Các quá trình sinh

lý đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường của thực vật có thể được kích hoạt nhanhhơn hoặc tốt hơn hoặc cả hai sau giai đoạn tập chống chịu Trước khi tìm hiểu kỹ hơn vềtính tập chống chịu của thực vật, phải nói đến một hiện tượng gần giống với nó đấy làquá trình hình thành các đáp ứng bằng các yếu tố gây đáp ứng (priming agents) và đượcgọi là giai đoạn chuẩn bị (priming state) Trong trường hợp này, các yếu tố gây đáp ứng

là các yếu tố như nitric oxide (NO), hydrogen peroxide (H2O2), hydrogen sulfide (H2S),các polyamine và các vi sinh vật hữu ích nhất định nhưng lại có khả năng gây tăngcường tính chống chịu của thực vật trước các bất lợi từ môi trường khác như hạn, mặn,nóng, lạnh hoặc các kim loại nặng… [21] Trong cơ chế tập chống chịu thì chính các yếu

tố bất lợi là các yếu tố gây đáp ứng với chính chúng

Cơ chế tập chống chịu được biết đến bao gồm cơ chế nhận tín hiệu từ các biểuhiện bất lợi từ môi trường, tiếp đến là quá trình truyền tín hiệu đó từ ―cảm biến‖ vàonhân Trong nhân, một số gen đặc hiệu liên quan đến việc đáp ứng lại với yếu tố bấtlợi sẽ được hoạt hóa và các protein được biểu hiện các đáp ứng thích hợp [27, 78]

(Hình 1.3) Các đáp ứng đó sẽ đảm bảo tái lập cân bằng nội môi trong tế bào, bảo vệchức năng màng sinh chất và protein nhằm chống chịu lại điều kiện bất lợi [14] Rấtnhiều gen được hoạt hóa theo chiều hướng giữ cân bằng trao đổi nước và các ion của

tế bào, bảo vệ chức năng các chaperone, giảm oxi hóa và bảo vệ áp suất thẩm thấu.Riêng trong cơ chế cân bằng thẩm thấu của mô, tế bào, các cây có xu hướng tăng sinhproline và một số loại đường như galactinol, glucose, fructose, sucrose, raffinosenhững chất này được biết đến là các chất bảo vệ thẩm thấu khi thực vật cần chống lạinhững bất lợi từ môi trường [71, 90] Những hoạt động đáp ứng qua gen biểu hiệnnhư thế của thực vật đa phần được điều hòa qua các yếu tố phiên mã Rất nhiều gen

mã hóa cho yếu tố phiên mã được xác định gia tăng biểu hiện trong các pha sớm khithực vật phản ứng với môi trường [10, 35, 42]

Các cơ chế liên quan đến quá trình đáp ứng của thực vật với các yếu tố bất lợi từmôi trường từ lâu đã trở thành tâm điểm của các nghiên cứu về sinh học nói chung vàthực vật nói riêng [21] Đề tài ―Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây

(Solanum tuberosum L.)‖ được thực hiện theo định hướng đó và mong muốn góp phần

tìm hiểu thêm về sức sống của thực vật trong các biến đổi của môi trường

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn được tiến hành trên cây khoai tây có

nguồn gốc từ hạt, giống HH7, được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển

Cây có củ - Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm – Viện Hàn lâm Khoa học

Nông nghiệp Việt Nam

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu

vitamin theo công thức môitrường khoáng cơ bản MSSorbitol

EDTA,IsopropanolEthanolUltrapure diluted waterAgarose

Universal DNA LadderDNA Loading Dye 6X10X BlueJuice

DNAse I

20

STT Hóa chất

First Strand cDNA Synthesis Kit

Cặp mồi GADPH 3’, GADPH5’, ef1α, P1, P2, P3

Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật và các hóa chất khác như:

aga, sucrose, ethanol, axit acetic, axit boric, EDTA, ethidium bromide… được sử

dụng đều có độ sạch phân tích

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị và máy móc thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự

nhiên – Đại Học Quốc Gia Hà Nội sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong

nucleic/protein

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân, thiết

bị khử trùng, lò vi sóng, bể ổn nhiệt, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, …

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu được tiến hành như sau:

Hình 2.1 Các nội dung nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán của khoai tây

(Solanum tuberosum L.) giống HH7.

2.2.1 Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro và tạo tập chống chịu

Hạt khoai tây giống HH7 được khử trùng bằng dung dịch hydropeoxit 15%trong 10 phút và được gieo trên môi trường khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS,1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar và sorbitol với hàm lượng khác nhau Cácnồng độ sorbitol sử dụng là: 0 mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM

Tỷ lệ nảy mầm của hạt được đánh giá và các hạt nảy mầm trên môi trường có

bổ sung sorbitol được coi là đã qua giai đoạn tập chống chịu

Sorbitol là một trong các đường polyol được sản sinh trong tế bào thực vật khigặp điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu Vì vậy, khi sử dụng sorbitol bổ sung vàomôi trường sẽ tạo môi trường hạn cho cây mà không có thêm ảnh hưởng nào khác

2.2.2 Phương pháp cấy chuyển mẫu và đánh giá các chỉ số sinh lý

Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân cây con có chiều cao 1,5 cm mang 2 láchuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy mầm vàcao hơn (Hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau khi gieo trên các môi trường tập chống chịu ( Môi trường khoáng cơ bản MS và hàm lượng sorbitol được ghi trong khung)

Như vậy, có 10 công thức cấy chuyển được thiết lập Các công thức chuyểnmôi trường này được chia thành 4 nhóm để đánh giá:

Hệ số nhân chồi =

Chiều cao chồi

Chiều cao chồi được đo từ điểm cắt mẫu ban đầu đến điểm cao nhất của chồisau thời gian nuôi cấy Chiều cao chồi trung bình được tính theo công thức:

Khi cấy chuyến, số rễ ban đầu ở mỗi công thức môi trường đồng nhất bằng 0

Số rễ trung bình của mỗi công thức chuyển môi trường được tính theo công thức:

Số rễ trung bình=

Trọng lượng tươi và trọng lượng khô

Mỗi công thức chuyển môi trường lấy 5 mẫu Mẫu được lấy ra từ môi trường,rửa với nước để loại bỏ thạch Thấm khô rễ, đặt lên đĩa pettri và cân Trọng lượngtươi của mẫu được xác định bằng công thức:

Trọng lượng tươi =

Sau khi mẫu được xác định trọng lượng tươi sẽ được sấy ở nhiệt độ 37oCtrong 24 giờ và cân lại Trọng lượng khô của mẫu được xác định bằng công thức:

Trọng lượng khô =

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll

Hàm lượng Chl được xác định dựa theo phương pháp của của Robert J Porra

[60] Chl được chiết từ mô lá trong aceton 80% với quy trình như sau:

- Cân 10 mg lá vào ống eppi

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu

Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu (Bates

và cs., 1973) [6] Quy trình được tiến hành theo các bước sau:

- Cân 50 mg lá và thân vào ống eppi, cho vào mỗi ống 1 viên bi nghiền

- Nghiền với nito lỏng bằng máy nghiền

- Bổ sung 1,5 ml acid sulfosalicylic 3% (w/v), lắc đều ống lên xuống

- Ly tâm 7000 vòng/20 phút

- Thu 300 µl dịch nổi, bổ sung 600 µl axit sulfosalicylic 3% (w/v) (Tỷ lệ 1:2)

- Thực hiện phản ứng màu: lấy 200µl dịch trong cho vào ống eppi, bổ sung

200 µl axit axetic và 200 µl dung dịch nynhidrin (0,1 g ninhydrin + 2,4 ml acetic acid+ 1,6 nml phosphoric acid 6M), ủ phản ứng ở 100oC trong 1 giờ, sau đó dừng phảnứng bằng cách làm lạnh trong đá bào ít nhất 15 phút

- Bổ sung 400 µl toluence vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều

- Thu 200 µl dịch nổi

- Bổ sung 800 µl toluence

- Đo độ hấp thụ với bước sóng 520 nm (A520)

Hàm lượng proline trong mẫu được tính toán bằng cách so sánh với đường chuẩn

Quy trình xây dựng đường chuẩn proline được tiến hành như sau:

- Pha proline chuẩn trong axit sulfosalicylic 3% (w/v) với các nồng độ: 0 mM,

Hình 2.3 Đường chuẩn proline

- Mối tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và giá trị độ hấp thụ được thểhiện bằng công thức:

Y= 0,007x – 0,001Trong đó:

x là nồng độ proline

y là độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm (A520)

Vậy công thức xác định nồng độ proline là:

x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM)Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo công thức:

Hàm lượng proline (µg/mg) = Trong đó:

V: thể tích dịch chiết proline (ml) m: khối lượng mẫu tươi (mg)

2.2.5 Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai tây (Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập chống chịu ở Arabidopsis thaliana

Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy mô,hàm lượng Chl và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50 mMmang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7 Tiến hành xácđịnh biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con khoai tây thuđược từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và môi trường không

có sorbitol ( mẫu ĐC)

Quy trình xác định biểu hiện một số gen mã hóa yếu tố phiên mã được tiếnhành theo sơ đồ hình 2.4

Thu mẫu Chọn gen đích

Kiểm tra, xác định hàm lượng RNA tổng số

Xử lý DNATổng hợp cDNAKiểm tra chất lượng cDNA

Xác định biểu hiện của các gen đích

Xử lý số liệu

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên

mã 2.2.5.1 Thu mẫu

Quá trình thu mẫu được tiến hành như sau:

- Chồi khoai tây in vitro giống HH7 được cấy chuyển đồng thời trên môi

trường MS không có sorbitol và môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol

- Thu mẫu ở 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h và 120hbằng cách cân 120 mg (±5 mg) mẫu thân và lá vào các ống eppi đã có bi nghiền vàthả ngay vào nitrogen lỏng

Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu (tủ -70oC) hoặc trong nitrogen lỏng cho đến khi tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo

2.2.5.2 Tách RNA tổng số

Quy trình tách RNA tổng số được tiến hành theo các bước sau [44]:

- Nghiền mẫu trong điều kiện nitrogen lỏng bằng máy nghiền mẫu thực vật Restch Mill tốc độ 25 Hz trong 1 phút

- Lấy ống eppi ra khỏi nitrogen lỏng cho vào bình đá bào, chờ 1-2 phút, làm ấm nắp ống bằng tay, mở từ từ, để ống trên giá để ống eppi

- Thêm 500 µl TRIzol vào mỗi ống Vortex kỹ.

- Ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút sau khi xong mẫu cuối cùng

- Thêm 200 µl chloroform vào mỗi mẫu Vortex

- Ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút

- Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4oC Dung dịch tách 3 pha

- Chuyển dịch nổi sang ống mới (Chỉ thu pha dịch trong tránh hoàn toàn pha trắng sữa thứ 2)

- Chuẩn bị hỗn hợp isopropanol và NaCl 2 M (1:1) để lạnh 4oC

- Bổ sung hỗn hợp vào dịch chiết với tỉ lệ 2:1 Lắc nhẹ ống bằng cách đảo lên xuống nhẹ tay

- Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút ở 4oC

- Đổ phần dịch ra cốc thủy tinh, giữ lại tủa

- Rửa tủa 2 lần với 500 µl ethanol 70% bằng ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4oC

- Để khô tủa ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan tủa trong 40 µl nước RNase – free

- Lắc 300 U/min trong 10 phút

Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose

và xác định hàm lượng, độ tinh sạch

2.2.5.3 Kiểm tra, định lượng và xác định độ tinh sạch RNA tổng số

RNA được kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose với quy trình như sau:

Chuẩn bị bản gel:

- Hòa tan 1,7g agarose trong 100 ml TAE 1x

- Đun nóng dung dịch để agarose hòa tan hoàn toàn

- Để dung dịch nguội bớt đến 50 - 60oC, thêm vào 1 µl redsafe hoặc 5 µl ethedium bromide, lắc đều

- Đổ bản gel với số giếng tương ứng với số mẫu

- Mix mẫu {2 µl nước + 3 µl mẫu + 1 µl dye caspa 6x}

- Tra mẫu lên giếng theo thứ tự