Nghiên cứu khả năng sử dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản

Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quangsinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi...20 2.3.2.. Khả năng lên men yếm kh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT

ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING

CỦA CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN

ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

LUÂṆ VĂN THAC̣ SĨ KHOA HOC̣

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thị Kim Thu

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG VI SINH VẬT

ĐỂ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING

CỦA CÁC VI KHUẨN VIBRIO GÂY BỆNH TRÊN

ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

Chuyên ngành : Vi sinh vâṭhoc ̣

LUÂṆ VĂN THAC̣ SĨ KHOA HOC̣

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt qua trình hoc ̣ tâp ̣ va thưc ̣ hiêṇ đềtai , em đa nhâṇ đươc ̣ sư ̣giup đơ

và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân

Đầu tiên , em xin bay to long biết ơn chân thanh va sâu sắc nhất đến người

luâṇ văn này

Em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ , tạo điều kiện của cô Đỗ Minh

Phương cùng các anh chị, các bạn thuộc phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học

trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô taịKhoa Sinh hoc ̣, đăc ̣ biêṭlàcác thầy

cô ơ Bô ̣môn Vi sinh vâṭhoc ̣, trương Đaịhoc ̣ Khoa hoc ̣ Tư ̣nhiên đa nhiêṭtinh giang

dạy và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích , phương phap luâṇ va nghiên cưu

khoa hoc ̣, làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em

Cuối cung, xin bay to long biết ơn chân thanh và sâu sắc nhất đến gia đinh ,

người thân , bạn bè đã luôn động viên , giúp đỡ , tạo điều kiện vàdành những tinh/

cảm thân thương - đólànguồn đông ̣ lưc ̣ manḥ me 0nhất đểtôi cóthểhoàn thành bản

luâṇ văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

HỌC VIÊN

Nguyễn Thị Kim Thu

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 5

1.1.Tổng quan vi khuẩn Vibrio 3

1.1.1 Đặc điểm chung của chi Vibrio 3

1.1.2 Môi trường nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio 3

1.1.3 Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio 4

1.1.4 Một số Vibrio gây bệnh trên người và động vật thuỷ sản 4

1.1.5 Phân loại Vibrio bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá 6

1.2 Hiện tượng cảm ứng mật độ (Quorum sensing) 8

1.2.1 Lịch sử phát hiện quá trình quorum sensing 8

1.2.2 Khái niệm quorum sensing 8

1.2.3 Cơ chế phân tử của quá trình QS ở một số vi khuẩn Vibrio 8

1.2.4 Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi khuẩn Vibrio 11

1.3 Các phương pháp ức chế quá trình QS được sử dụng hiện nay 12

1.3.1 Sử dụng chất đối kháng quorum sensing 12

1.3.2 Bất hoạt phân tử tín hiệu dựa vào enzym 13

1.4 Nghiên cứu về vi khuẩn ức chế quorum sensing và đối kháng với một số vi khuẩn Vibrio 14

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.2 Vật liệu nghiên cứu 16

2.2.1 Nguồn và chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 16

2.2.2 Hóa chất và thiết bị 17

2.2.3 Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu: 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang

sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi 20

2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng 22

2.3.3 Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, phân loại của các chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát sáng sinh học (liên quan đến QS) của Vibrio harveyi 23

2.3.4 Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn 26

2.3.5 Chỉ tiêu theo dõi chung 29

2.3.6 Phương pháp tính toán thống kê xử lý số liệu 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Xác định mối tương quan giữa mật độ tế bào và cường độ phát quang đo được của Vibrio harveyi tại cùng một thời điểm 30

3.2 Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi 31

3.2.1 Phân lập các vi sinh vật ở các vùng ao nuôi tôm, rừng ngập mặn, đất, bùn của tỉnh Nam Định và Ninh Bình 31

3.2.2 Xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi của các vi sinh vật phân lập 32

3.3 Kết quả phân tích định lượng khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV phân lập được 36

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng 38

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 38

3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH môi trường nuôi cấy 39

3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) trong môi trường nuôi cấy 40

3.5 Xác định đặc điểm hình thái và một số đặc điểm phân loại học khác của các vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi 41

3.5.1 Quan sát hình dạng tế bào của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự

phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi 42

3.5.2 Hình thái khuẩn lạc của hai chủng vi khuẩn tuyển chọn được 42

3.5.3 Khả năng lên men yếm khí của các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi 43

3.5.4 Khả năng di động của các chủng vi khuẩn triển vọng 44

3.5.5 Kết quả phân tích các đặc điểm sinh hoá của XTS1 45

3.6 Phân tích trình tự gen 16S rRNA của chủng XTS1 48

3.6.1 Khuếch đại gen 16S rRNA 48

3.6.2 Kết quả xác định loài vi khuẩn XTS1 ức chế sự phát sáng sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harvei bằng kỹ thuật sinh học phân tử 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 58

V parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trường 4

Bảng 2.1 Thành phần môi trường LB 0.5% NaCl nuôi cấy các VSV phân lập 19 Bảng 2.2 Thành phần môi trường TCBS để chọn lọc vi khuẩn Vibrio 19Bảng 3.1 Số chủng VSV phân lập được từ 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình 31Bảng 3.2 Kết quả phân lập được một số chủng vi khuẩn nghi ngờ có hoạt

tính ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi 32Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng ức chế sự phát quang sinh

học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1 38Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng ức chế phát quang sinh

học liên quan đến QS ở Vibrio harveyi của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 39Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) đến khả năng ức chế của 2 chủng

XTS1 và CP1 tới sự phát quang sinh học(QS) của Vibrio harveyi 41Bảng 3.6 Khả năng lên men yếm khí của một số chủng vi khuẩn có triển

vọng ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi 43Bảng 3.7 Kết quả thử nghiệm MR phân loại vi khuẩn dựa vào khả năng lên menđường glucose tạo sản phẩm acid bền 45Bảng 3.8 Kết quả thử nghiệm VP chủng vi khuẩn XTS1 46Bảng 3.9 Kết quả thử nghiệm ONPG chủng vi khuẩn XTS1 47Bảng 3.10 Kết quả xác định loài vi khuẩn ức chế sự phát sáng liên quan

đến QS ở Vibrio harveyi bằng kỹ thuật sinh học phân tử 49

DANH MUC̣ HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ phân loại các loài Vibrio bằng các phản ứng sinh hoá 7

Hình 1.2 Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri 9

Hình 1.3 Quorum sensing ở vi khuẩn Vibrio harveyi 10

Hình 1.4 Hai enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL 13

Hình 3.1 Đồ thị mô tả sự tương quan giữa giá trị OD600nm và lượng phát quang của Vibrio harveyi tại các thời điểm 0h, 6h, 12h và 18h 30

Hình 3.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1, CP1, CP10. 33

Hình 3.3 Đồ thị sinh trưởng của các chủng VSV 34

Hình 3.4 Kết quả khảo sát tính đối kháng giữa các chủng Vibrio harveyi và 3 chủng VSV phân lập được bằng phương pháp cấy vạch vuông góc 35

Hình 3.5 Kết quả khảo sát sự ức chế sinh trưởng giữa các chủng XTS1 và CP1 với V.harveyi bằng phương pháp đục lỗ thạch 36

Hình 3.6 Đồ thị biểu thị cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở các giếng thí nghiệm. .37

Hình 3.7 Hiệu quả ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của hai chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 37

Hình 3.8 Hình dạng tế bào XTS1 quan sát dưới vật kính 100x 42

Hình 3.9 Quan sát hình dạng tế bào CP1 dưới vật kính 100x 42

Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn XTS1 trên môi trường LB 3% NaCl và TCBS 43

Hình 3.11 Khả năng lên men yếm khí của 2 chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi 44

Hình 3.12 Khả năng di động của XTS1 và CP1 45

Hình 3.13 Kết quả thử nghiệm MR 46

Hình 3.14 Thử nghiệm VP của chủng vi khuẩn XTS1 47

Hình 3.15 Kết quả thử nghiệm ONPG của chủng vi khuẩn XTS1 48

Hình 3.16 Kết quả quả PCR khuếch đại đoạn 16S rADN của XTS1 49

Hình 3.17 Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của XTS1 trên GenBank 50

MỞ ĐẦU

Ngành thuỷ sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế củađất nước ta Quy mô của ngành thuỷ sản ngày càng mở rộng và vai trò của ngànhcũng tăng lên không ngừng trong nền kinh tế quốc dân Động vật thuỷ sản là mộttrong những nguồn cung cấp lương thực, thực phẩm và các sản phẩm tiêu dùngphong phú cho con người Trong đó, bao gồm các loại tôm, cua, cá,…

Tuy nhiên, mỗi năm ngành thuỷ sản nước ta lại bị thiệt hại nặng nề vì dịchbệnh, chủ yếu trên tôm nước lợ, cá nước ngọt, cá biển, nhuyễn thể… Các yếu tốngoại cảnh tác động lên động vật thuỷ sản bao gồm môi trường sống và tác nhângây bệnh Trong đó, dịch bệnh trên động vật thuỷ sản gây thiệt hại lớn chủ yếu là docác tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm, tác nhân gây bệnh kí sinh…) Mộttrong những vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản điển hình đó là các vi khuẩn

thuộc chi Vibrio [2 ; 22] Thiệt hại do bệnh thủy sản, đặc biệt là tôm lên đến 60000

ha (năm 2014) ảnh hưởng rất lớn đến người nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế

Các vi khuẩn Vibrio sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và

cửa sông, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển Đối với cá,

Vibrio spp chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng máu, đối với tôm Vibrio spp gây bệnh

phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin Những vi khuẩn này thường là tác nhângây bệnh cơ hội, khi động vật thuỷ sản chịu sự bất lợi từ yếu tố môi trường hoặc bịnhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng Động vật thuỷ sản yếu không có

sức đề kháng, các loài vi khuẩn Vibrio cơ hội gây bệnh nặng làm động vật này chết

rải rác tới hàng loạt [2]

Nhiều giải pháp để phòng, trừ bệnh do nhóm vi khuẩn này gây ra trên độngvật thuỷ sản như sử dụng kháng sinh, chế phẩm sinh học Tuy nhiên, hiệu quả củacác biện pháp này còn thấp Hơn nữa, do sử dụng nhiều kháng sinh mà các vi khuẩn

Vibrio đa phần đều kháng kháng sinh gây ảnh hưởng đến môi trường và càng làm

giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tậptrung vào việc làm rối loạn hệ thống “quorum sensing” – một dạng “giao tiếp của vikhuẩn” Quorum sensing (QS) là cơ chế thông tin liên lạc giữa các tế bào và đáp

ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng, dò tìm các phân tử tín hiệu.Vai trò của quorum sensing là điều khiển một số quá trình ở vi khuẩn gây bệnh như:sự phát sáng, sự tiếp hợp, sự hình thành biofilm, swarming… [1; 9] Việc ngăn chặn

hệ thống giao tiếp QS của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Vibrio nói riêng là hướng

đi mới nhằm ngăn ngừa khả năng gây bệnh của chúng mà không cần đặt chúng dướiáp lực chọn lọc (chẳng hạn như dùng kháng sinh hoặc chất hoá học để tiêu diệtchúng)

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu khả năng sử

dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thuỷ sản”.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan vi khuẩn Vibrio

1.1.1 Đặc điểm chung của chi Vibrio

Vibrio có vị trí phân loại như sau:

Vibrio thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng

hoặc hơi uốn cong, kích thước từ 0,3-0,5 x 1,4-2,6µm di động nhờ tiên mao, không

hình thành bào tử Đa số các Vibrio đều là các vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện Hầu hết

chúng đều phát triển trong môi trường nước biển (Na+ cần cho sự phát triển củachúng, là nhu cầu tuyệt đối) và không phát triển trên môi trường không có muối Đa

số các loài Vibrio sống hoại sinh, một số gây bệnh cho người và động vật; ví dụ như

Vibrio cholerae gây bệnh tả trên người, Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm, Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan trên cá Đặc trưng của các loài Vibrio là khả năng sống trong điều kiện pH cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở

môi trường axít Một số loài có thể phát triển rất nhanh (tăng gấp đôi trong 10 phút)[6; 7; 8; 40]

1.1.2 Môi trường nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio

Môi trường chọn lọc để phân lập các loài vi khuẩn Vibrio là môi trường thạch

TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar) TCBS có tính chọn lọc cao, đáp ứng nhu

cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Vibrio Tuy nhiên, môi trường TCBS chỉ có thể giúp phân loại vi khuẩn Vibrio thành hai nhóm: có sử dụng và không sử dụng đường

sucrose Các vi khuẩn có khả năng lên men sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu vàng

(Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus,…) và ngược lại, các vi khuẩn không có

khả năng sử dụng sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh (Vibrio parahaemolyticus,

Vibrio vulnificus…) [7 ; 8.]

Bảng 1.1 Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trường

thạch TCBS

Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS

Vibrio parahaemolyticus Xanh

Vibrio harveyi Màu xanh ở trung tâm, xung quanh vàng

1.1.3 Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio

Các vi khuẩn Vibrio cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, lên men

yếm khí, các chủng vi khuẩn phát sáng đều phát triển tốt ở môi trường có 3% NaCl,sinh indole và có khả năng tạo axít từ mannitol và trehalose, không sinh H2S vàUrease Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129 Hầu hết các vi khuẩn thuộc

nhóm Vibrio có thể tồn tại và nhân rộng ở các vùng nước bị tăng độ nhiễm mặn

(nồng độ muối cao, có thể lên tới 6% NaCl) và ở nhiệt độ 10-30oC Khi sinh trưởng

trong môi trường TCBS, một số loài Vibrio có khả năng lên men đường sucrose (Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus…) nên cho khuẩn lạc màu vàng [6; 8; 45].

1.1.4 Một số Vibrio gây bệnh trên người và động vật thuỷ sản

1.1.4.1 Lịch sử phát hiện bệnh gây ra do Vibrio

Vào những năm 1970, bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện bởi

Tukiash Vào thời gian này, dịch bệnh gây chết với tỷ lệ >50% ở động vật thuỷ sản

như cua xanh (Callinectes sapidus) Sau đó, năm 1977, Fisher đã công bố kết quả nghiên cứu bệnh trên các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus americarus), châu Á (Panulirus homarus) và công bố nguyên nhân bệnh là do nhiễm phải nhóm vi khuẩn

Vibrio [20].

Năm 1990, Hasawai cho rằng tác nhân gây bệnh đỏ thân ở tôm Sú (Thái Lan)là do phẩy khuẩn Còn ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng nguyên nhân

của bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo già Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Viện nuôi trồng thuỷ sản 3 thì bệnh đỏ thân ở tôm là do vi khuẩn Vibrio

alginolyticus (1 loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio) [42; 43; 44].

Bệnh vibriosis (bệnh do các vi khuẩn Vibrio gây ra) có thể quan sát được ở

khắp mọi nơi có nghề nuôi trồng thuỷ sản nước lợ và nước mặn Từ mẫu tôm, cá bị

mắc bệnh, thậm chí là mẫu đất nơi mà Vibrio thường có mặt, ta có thể phân lập được nhiều loài vi khuẩn Vibrio.

1.1.4.2 Vi khuẩn Vibrio harveyi

Vibrio harveyi là vi khuẩn thuộc chi Vibrio, họ Vibrionaceae Đặc điểm của

vi khuẩn này là: hình que, Gram âm, phát quang sinh học, di động nhờ roi cực, ưamặn và có khả năng trao đổi chất lên men và hô hấp Chúng không phát triển ở nhiệt

độ 4°C hoặc trên 35°C Có thể tìm thấy Vibrio harveyi sống tự do trong vùng biển

nhiệt đới, trong ruột của động vật biển và là mầm bệnh cơ hội của tôm, cá bơn, tômhùm…Chúng gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển

Tôm khi nhiễm vi khuẩn này thường phát bệnh sau khi nuôi một tháng Tômnhiễm bệnh có đặc điểm là bơi lội không định hướng, phản xạ chậm, khả năng bắtmồi giảm, một số con dạt vào bờ Quan sát vỏ và thân thấy màu cáu bẩn, cơ có màu

đục, gan teo, ruột rỗng; trong bóng tối phát ánh sáng xanh Vi khuẩn Vibrio harveyi

có thể sống được ở độ mặn từ 0 - 40‰, phát triển mạnh ở độ mặn 20 - 30‰ Khixâm nhập cơ thể tôm, vi khuẩn tấn công tế bào gan, dẫn tới viêm loét gan, suy giảmchức năng gan [21; 27]

1.1.4.3 Vi khuẩn Vibrio cholerae

Giống như Vibrio harveyi, Vibrio cholerae là vi khuẩn thuộc chi Vibrio,

nhóm Gram âm Đặc điểm của vi khuẩn này là: hình dấu phẩy, có một roi ở một cực

tế bào V cholerae lần đầu tiên được phân lập từ mẫu bệnh dịch tả bởi nhà giải phẫu học người Ý Filippo Pacini năm 1854 Vibrio cholerae thường gây bệnh tả cho

người [13 ; 14]

1.1.4.4 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Vi khuẩn này có dạng hình uốn cong, Gram âm, được tìm thấy trong nước lợ

và nước mặn Vibrio parahaemolyticus bao gồm các chủng có độc tố có khả năng gây bệnh và các chủng không gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính V.

parahaemolyticus có khả năng chịu đựng với các độ mặn, pH, nhiệt độ và dễ dàng

đeo bám trên các sinh vật phù du di chuyển theo dòng chảy V parahaemolyticus rất

phổ biến trong môi trường ở các vùng cửa sông, và một số ít hiện diện trong môitrường nước ngọt

Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm do Lightner (Đại

học Arizona, Mỹ) nghiên cứu phát hiện ra Tôm mắc bệnh này thường bị sưng gantuỵ dẫn đến chết Ngoài ra, vi khuẩn này còn gây bệnh phồng đuôi ở tôm, tuy khônglan thành dịch lớn nhưng cũng ảnh hưởng đến năng suất nuôi [23]

1.1.4.5 Vi khuẩn Vibrio alginolyticus

Vibrio alginolyticus là những vi khuẩn hình que ngắn, Gram âm, khi nuôi cấy

trên TCBS cho khuẩn lạc màu vàng do có khả năng lên men sucrose Vibrio

alginolyticus thường gây bệnh đỏ thân ở tôm làm tôm và ấu trùng chết hàng loạt và

bệnh xuất huyết, lở loét ở cá chẽm Vi khuẩn gây bệnh khi môi trường sống củathuỷ sản bị ô nhiễm nặng, thức ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém [37 ; 39]

1.1.5 Phân loại Vibrio bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá

Dựa vào các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước…) và các đặc điểm

sinh lý, sinh hoá, người ta có thể phân loại Vibrio thành các loài khác nhau Theo C.V.L Jayasinghe và cs, các loài Vibrio được phân loại dựa vào màu sắc khuẩn lạc

mọc trên TCBS (xanh hay vàng), phản ứng oxidase và VP test, khả năng mọc trênmôi trường 0% NaCl, phản ứng ONPG, phản ứng D-cellobiose, phản ứng LysineDecarboxylase (hình 1.1) [25]

Hình 1.1 Sơ đồ phân loại các loài Vibrio bằng các phản ứng sinh hoá [25] Chú thích:Growth on TCBS (Sinh trưởng trên

môi trường TCBS, Y (màu vàng), G (màu xanh)

1.2 Hiện tƣợng cảm ứng mật độ (Quorum sensing)

1.2.1 Lịch sử phát hiện quá trình quorum sensing

Nghiên cứu đầu tiên về quorum sensing trên vi khuẩn Vibrio fischeri được

thực hiện vào năm 1960 Kết quả nghiên cứu này cho thấy hiện tượng phát sáng xảy

ra khi có mặt số lượng lớn tế bào vi khuẩn Giả thuyết ban đầu của các nhà nghiêncứu là: môi trường chứa chất ức chế sự phát sáng và chất này bị loại bỏ khi vi khuẩnhiện diện với số lượng lớn

Các nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh rằng: Sự phát sáng do tích lũy phântử hoạt hóa gọi là autoinducer Autoinducer do vi khuẩn tạo ra và hoạt hóa sự phátsáng khi nó ở nồng độ cao Vi khuẩn có thể cảm nhận được mật độ tế bào thông quanồng độ autoinducer [48]

Sau đó, một loạt nghiên cứu đã tìm ra hệ thống quorum sensing trên các loài

vi khuẩn khác như Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus…

1.2.2 Khái niệm quorum sensing

Quorum sensing là cơ chế thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào, phối hợpvới sự biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn để đáp ứng lại mật độ tế bào bằng cáchsản xuất, giải phóng và dò tìm các phân tử tín hiệu nhỏ, được gọi là các phân tửautoinducer

Quorum sensing ảnh hưởng tới sự biểu hiện của nhiều quá trình tế bào, baogồm các quá trình hoạt động của các gen gây bệnh như phát quang sinh học, quátrình swarming, sự hình thành bào tử, hình thành biofilm, sản xuất các chất kháng

sinh, sự tạo thành độc tố, siderophore… Ở Vibrio harveyi, sự biểu hiện của các protein huỳnh quang sinh học được mã hoá bởi operon lux bị ảnh hưởng bởi mật độ

vi khuẩn qua hiện tượng cảm ứng mật độ [1]

1.2.3 Cơ chế phân tử của quá trình QS ở một số vi khuẩn Vibrio

Quá trình quorum sensing được phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn Vibrio

fisheri, và là nền tảng để khám phá hệ thống quorum sensing ở các Vibrio khác Tín

hiệu tham gia vào quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm nói chung đó làcác phân tử hoá học nhỏ, ví dụ như N-acyl homoserine lactones (AHLs), alkylquinolones (AQs),…

1.2.3.1 Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri

Khi mật độ tế bào V.fischeri thấp, autoinducer (3-oxo-C6-HSL, một AHL) ở

nồng độ thấp Ở mật độ tế bào cao, mức độ của autoinducer trở nên đủ để hoạt hoásự phiên mã của các gen sản xuất các enzyme luciferase, dẫn đến phát quang sinhhọc (Hình 1.2) Thật vậy, một tế bào đơn lẻ không có khả năng sản xuất đủluciferase để gây hiện tượng phát quang có thể nhìn thấy được Sử dụng quorumsensing, các tế bào có thể tiết kiệm năng lượng của mình cho đến khi các tế bàotương tự hội tụ đủ xung quanh, sau đó kết hợp hoạt động tạo ra ánh sáng có thể nhìnthấy được [9;10]

Hình 1.2 Quá trình quorum sensing ở Vibrio fisheri Chú thích: Target genes

(gen đích); protein I (protein sản xuất), protein R (protein điều hoà)

Các phân tử tín hiệu AHL được tạo ra bởi protein sản xuất, sau đó AHL sản sinh từcác tế bào xung quanh được gắn vào protein điều hoà, protein điều hoà cùng vớiphân tử tín hiệu này hoạt hoá phiên mã các gen đích

1.2.3.2 Quorum sensing ở Vibrio harveyi

Quorum sensing ở V harveyi sử dụng 3 hệ thống phân tử tín hiệu tế bào mà

có chức năng song song để điều hoà tích cực sự phát quang sinh học, sản xuấtmetalloprotease, siderophore, exopolysaccharide và điều hoà âm hệ thống tiết loạiIII theo cách thức phụ thuộc mật độ tế bào Hệ thống LuxM/N dựa vào HAI-1 đượctổng hợp bởi LuxM Hệ thống LuxS/PQ sử dụng phân tử tín hiệu AI-2 và được tổng hợpbởi LuxS Hệ thống CqsA/S sử dụng phân tử tín hiệu CAI-1 mà phụ thuộc vào

CqsA để tổng hợp chính nó Ba phân tử tín hiệu này là riêng biệt và làm việc “hợptác” trong quá trình điều hoà gen Các protein cảm biến (sensors) cho HAI-1, AI-2và CAI-1 gọi là LuxN, LuxQ và CqsS tương ứng, là những protein thuộc hệ thốngtín hiệu hai thành phần Ở mật độ tế bào thấp, nồng độ phân tử tín hiệu thấp, LuxO

bị phosphoryl hoá kích hoạt sự biểu hiện của các sRNA đi kèm với Hfq gây bất ổnmRNA mã hoá protein LuxR – yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing (Masterquorum sensing regulator - MQSR) Ở mật độ tế bào cao, các phân tử tín hiểu sảnxuất bởi LuxM, LuxS và CqsA được tích luỹ và bám vào các sensor tương ứng củachúng Tín hiệu liên kết được chuyển tới LuxN, LuxQ và CqsS thành phosphatase,dẫn tới LuxO bị dephosphoryl hoá Kết quả, LuxO bị bất hoạt, các sRNA không

được sao chép, mRNA của luxR được ổn định và dịch mã LuxR sản xuất phát

quang sinh học và sản xuất exopolysaccharide, siderophore và metalooprotease và

ức chế hệ thống tiết loại III (hình 1.3)[9;15;16;18;19;28;29;33;38]

1.2.3.3 Quorum sensing ở Vibrio parahaemolyticus

Hình 1.3 Quorum sensing ở vi khuẩn Vibrio harveyi [9] Chú thích: At low cell

density (mật độ tế bào cao); at high cell density (mật độ tế bào thấp).

Quá trình quorum sensing ở Vibrio parahaemolitycus cũng tương tự như ở

Vibrio harveyi, tuy nhiên yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing ở V parahaemolyticus là opaR (một homolog của luxR V.harveyi) (Hình 1.3).

1.2.4 Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi

khuẩn Vibrio

Quorum sensing là quá trình phổ biến và được bảo tồn ở các loài Vibrio,

tham gia vào nhiều quá trình sinh lý khác nhau và đặc biệt ảnh hưởng đến hệ thốngđộc lực của nhiều vi khuẩn thuộc loài này

1.2.4.1 Quorum sensing điều khiển sự sản xuất các yếu tố gây độc của các vi

khuẩn Vibrio

Ngoại độc tố (Exotoxin) đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của vikhuẩn bằng cách tạo ra các enzyme phân huỷ và tạo lỗ thủng trên màng tế bào vậtchủ, do đó cho phép vi khuẩn xâm nhập và lây lan sang các tế bào, mô xung quanh

Ở vi khuẩn Vibrio harveyi, độc lực của V harveyi (chủng 47.666-1) liên quan đến

việc sản xuất một protein ngoại bào được gọi là độc tố T1 với một khối lượng phân

tử khoảng 100 kDa Các protein ngoại bào được sản xuất trong giai đoạn giữa pha

log và có độc lực tương tự liên quan đến các protein trong Salmonella, Shigella, và các loài Bacillus Ngoài ra, quá trình quorum sensing ở vi khuẩn phát sáng này còn

điều hoà âm sự sản xuất các chitinase, phospholipase, siderophore, hệ thống tiết loạiIII [30] Đối với Vibrio alginolyticus, yếu tố gây độc chính của vi khuẩn này là một

serine protease kiềm ngoại bào – Asp có liên quan mật thiết với hệ thống quorum

sensing và cách thức sản xuất của độc tố này phụ thuộc vào mật độ tế bào Thực tế,sự biểu hiện ở mức độ thấp của yếu tố điều hoà tổng thể quorum sensing LuxR, gây

giảm biểu hiện của Asp Giả thuyết đặt ra là: LuxR kích hoạt phiên mã của gen asp bằng cách trực tiếp bám vào vùng promoter của nó Ở V cholerae, hai yếu tố độc

lực chính là độc tố cholerae (CT) và các sợi phối hợp điều hoà độc tố (toxin

coregulated pilus - TCP), mã hóa tương ứng bởi cụm gen ctx và gen tcp được gián

tiếp hoạt hoá bởi AphA Ở mật độ tế bào thấp, các sRNA (small RNA) được phiên

mã khi LuxO bị phosphoryl hoá Các sRNA gây bất ổn mRNA của hapR nhưng

thúc đẩy sự biểu hiện của AphA Ở mật độ tế bào cao, HapR được biểu hiện và ứcchế sự phiên mã AphA, dẫn đến ức chế sự hình thành các yếu tố độc lực [32; 35]

1.2.4.2 Quorum sensing ảnh hưởng đến kiểu hình liên quan tới độc lực khác

nhau trong các vi khuẩn Vibrio

Quorum sensing trong các vi khuẩn Vibrio cũng tham gia vào sự điều hoà

của nhiều yếu tố độc lực khác liên quan, như hình thành màng sinh học, khả năng

vận động, siderophore Trong V cholerae, trái ngược với các vi khuẩn khác khi

kích thích hình thành biofilm (màng sinh học) ở mật độ cao, vi khuẩn này sản xuấtmàng sinh học dày hơn khi mật độ tế bào thấp CqsA hoạt động thông qua HapR ứcchế sự biểu hiện của các operon tổng hợp polysaccharide [13]

Sự biểu hiện của hiện tượng phát quang sinh học trong V harveyi từ lâu đã

gắn liền với độc lực ở các chủng gây bệnh của loài này Biểu hiện kiểu hình phát

quang của V harveyi được kiểm soát ở mức độ phiên mã bởi một hệ thống quorum sensing không điển hình (không hoàn toàn giống hệ thống ở các Vibrio khác) Kiểu hình phát sáng liên quan đến QS ở V harveyi có tương quan mật thiết đến sự sản

xuất của metalloprotease và độc tố ngoại bào [30]

1.3 Các phương pháp ức chế quá trình quorum sensing được sử dụng hiện nay

Việc sử dụng các chất kháng sinh để tiêu diệt mầm bệnh trong nuôi trồngthuỷ sản đã làm cho vi khuẩn gây bệnh trở nên kháng thuốc Hiện nay, không nhữngmột số thuốc kháng sinh không còn hiệu quả mà còn gây ô nhiễm môi trường sốngcủa thuỷ sản, làm mất cân bằng sinh thái Do đó, nhiều phương pháp hữu hiệu hơnđã được nghiên cứu, đặc biệt là việc ứng dụng các hiểu biết về quá trình quorum

sensing trên vi khuẩn Vibrio Việc ngăn chặn quá trình này nhằm làm bất hoạt khả

năng gây độc của vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến chúng sẽ là một hướng tiếpcận mới Một số hướng tiếp cận làm gián đoạn quorum sensing đã được nghiên cứu,bao gồm:

- Ức chế tổng hợp các phân tử tín hiệu autoinducer

- Sử dụng chất đối kháng quorum sensing

- Gây bất hoạt quorum sensing dựa vào enzyme

- Ứng dụng các chất tương đồng kích thích quorum sensing

1.3.1 Sử dụng chất đối kháng quorum sensing

Dựa vào các phân tử tín hiệu như AI-2 và AHL để ứng dụng chất đối kháng quorum sensing Đối với phân tử AHL, người ta đã tìm ra hợp chất furanone chứa

halogen ở tảo đỏ có cấu trúc tương tự Dựa vào sự tương đồng này, đưa furanonegắn lên chất đáp ứng điều hoà khiến cho gen đích không được hoạt hoá Ngoài ra,các nhà nghiên cứu trước đây còn sử dụng phân tử AHL đối kháng (những AHL cókích thước 8C trở xuống để kích thích, còn những AHL có kích thước 10C trở lêndùng để ức chế) và phân tử AHL tổng hợp (sử dụng AHL tổng hợp (5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone để ức chế QS và qua đó làm tăng mức độ mẫncảm của biofilm đối với kháng sinh) [11; 12; 34].

Đối với phân tử AI-2, một số nghiên cứu đã tìm ra một furanone chứa

halogen thứ 2 chứa trong tảo đỏ Delisea pulchra Chất này có tác dụng giảm khả năng điều hoà AI-2, giảm sự hình thành biofilm ở E.coli và giảm khả năng phát sáng ở Vibrio harveyi.

1.3.2 Bất hoạt phân tử tín hiệu dựa vào enzym

Phân tử tín hiệu AHL hầu như phổ biến ở các vi khuẩn Những enzyme cókhả năng ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các loài vi khuẩn thuộc nhóm ß-Proteobacteria, α-Proteobacteria và γ-Proteobacteria cũng như ở một số loài thuộcnhóm vi khuẩn Gram dương Các enzym có khả năng phân huỷ sinh học phân tử tínhiệu AHL đó là AHL lactonase và AHL cyclase [31; 36]

Hình 1.4 Hai enzym AHL lactonase và AHL cyclase phân huỷ AHL.

Dưới xúc tác của enzym AHL acylase, phân tử tín hiệu AHL bị bẻ gãy mạchcarbon và phân tách thành axít béo và homoserine lactone, nhưng không làm thayđổi nhiều đến cấu trúc của AHL Còn enzyme AHL lactonase xúc tác mở vònglactone tạo thành N-acyl homoserine (hình 1.4)

Tác động của enzym này khiến cho phân tử AHL bị thay đổi về cấu trúc, gâytrở ngại đến việc gắn kết của AHL với protein điều hoà phiên mã ra LuxR Các

nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, enzym AHL lactonase được mã hoá bởi gen aiiA Gen aiiA lần đầu tiên được tìm thấy ở chủng Bacillus sp 240B1 Sau đó, các homolog (tương đồng) của gen aiiA đã được tìm thấy ở nhiều loài Bacillus khác, gồm có Bacillus thuringiensis, B subtilis, B cereus, B mycoides Các gen này có

độ tương đồng cao (89 – 96%) so với gen aiiA của chủng 240B1.

1.4 Nghiên cứu về vi khuẩn ức chế quorum sensing và đối kháng với một số vi

khuẩn Vibrio

Như đã biết, enzyme AHL lactonase được mã hoá bởi gen aiiA, và gen này được tìm thấy ở các chủng Bacilus Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cs sử dụng chủng Bacillus cereus được phân lập từ nước nuôi cá tra ở Đồng Tháp để khuếch đại gen aiiA từ chủng này bằng phương pháp PCR [40] Gen này được gắn vào vector, nhân dòng và biểu hiện nhờ vật chủ E.coli Gen aiiA mã hoá cho

enzyme AHL lactonase được biểu hiện và tách chiết, sau đó được đem thử hoạt tính

trên đĩa 96 giếng theo tỉ lệ 1:1 (50µl dịch nuôi Vibrio harveyi qua đêm đã pha loãng

5000 lần và 50µl AHL lactonase tách chiết từ E.coli) Kết quả cho thấy, cường độ

phát sáng của chủng hoang dại BB120 đã bị suy giảm ngay ở thời điểm sau 2 giờ,khi enzyme AHL-lactonase tái tổ hợp được bổ sung Việc bổ sung enzyme AHL-lactonase tái tổ hợp ở các nồng độ khác nhau đã không ảnh hưởng đến tốc độ tăng

trưởng của V harveyi Như vậy, protein AiiA tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng

Bacillus cereus có hoạt tính ức chế quá trình quorum sensing ở Vibrio harveyi mà

không ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn này

Theo R Chythanya và cs, Pseudomonas I-2 - một loài vi khuẩn biển, sản xuất các hợp chất ức chế các vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm bao gồm Vibrio

harveyi, V fluvialis, V parahaemolyticus, V vulnificus và V.damsela Chất ức chế

đã được tìm thấy là một hợp chất có phân tử lượng thấp, hòa tan trong chloroform

và bền với nhiều enzym thuỷ phân protein Pseudomonas I-2 có khả năng ứng dụng để kiểm soát Vibrio sp gây bệnh trên tôm trong nuôi trồng thủy sản Ngoài ra, dịch nổi (không có tế bào) chiết từ Pseudomonas I-2 có khả năng ức chế hoàn toàn vi

khuẩn Vibrio harveyi chỉ sau 12h Như vậy, rất có thể Pseudomonas I-2 đã tạo ra

một số thành phần anti-vibrio ngoại bào Những kết quả này là rất quan trọng vì vi

khuẩn V harveyi là một vấn đề lớn trong sản xuất tôm giống [5].

Hiện nay, việc tìm được những chủng vi sinh vật có khả năng ức chế quá

trình quorum sensing mà các vi khuẩn Vibrio này sử dụng để “liên lạc” với nhau, để

tạo độc tố gây bệnh là rất cần thiết Nếu tìm được những chủng VSV có hoạt tính

này sẽ hạn chế được các bệnh do Vibrio gây ra mà không làm ảnh hưởng đến cân

bằng sinh thái vi sinh vật

Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nội dung nghiên cứu

Vì quá trình quorum sensing ở các vi khuẩn Vibrio là tương đối giống nhau, trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn Vibrio harveyi là đại diện cho các vi khuẩn này để thực hiện các thí nghiệm V harveyi có một đặc điểm rất ưu việt cho việc

nghiên cứu, đó là khả năng phát quang sinh học do quorum sensing điều khiển Cácnội dung nghiên cứu chính như sau:

- Phân lập, tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát

quang sinh học liên quan đến quá trình quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi

- Xác định một số đặc điểm hình thái, phân loại của vi sinh vật tiềm năng cókhả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi

khuẩn Vibrio harveyi.

- Định danh các vi sinh vật có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học liên

quan đến quá trình quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi bằng kỹ thuật sinh học

phân tử

- Xác định một số điều kiện nhiệt độ, môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới khảnăng ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn

Vibrio harveyi

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Các thí nghiệm sử dụng các hóa chất, dụng cụ và thiết bị chuyên môn, đạt các tiêu chuẩn cơ bản dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học

2.2.1 Nguồn và chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

2.2.1.1 Nguồn vi sinh vật để phân lập các chủng có khả năng ức chế quorum sensing

Để phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình quorum sensing, chúng tôi sử dụng nguồn mẫu đất, bùn thu thập tại:

- Vườn Quốc Gia Xuân Thuỷ, huyện Giao Thuỷ, tỉnh Nam Định

- Vườn Quốc Gia Cúc Phương, thuộc địa giới hành chính của ba tỉnh NinhBình, Thanh Hoá và Hoà Bình

- Huyện Thái Thuỵ, tỉnh Thái Bình

Mẫu đất được lấy theo quy trình chuẩn của Hiệp hội Bảo vệ Môi trường Mỹ(EPA standard operating procedures, 2012), ở độ sâu 20 cm, bằng cách sử dụngdụng cụ lấy mẫu (sampling scoop) đã qua khử trùng bằng cồn 70% Bùn được lấytheo quy trình chuẩn của EPA(1999) bằng cách sử dụng gầu lấy mẫu Ponar

2.2.1.2 Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này là Vibrio harveyi NBRC

15634 được cung cấp bởi bảo tàng giống vi sinh vật NBRC, Nhật Bản

2.2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.2.1 Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

+ Hóa chất pha môi trường

- Pepton, NaCl xuất xứ Trung Quốc (Xilong)

+ Hoá chất dùng trong các phản ứng sinh hoá

- Hoá chất nhuộm Gram: tím kết tinh, Lugol, cồn tẩy, Safranin

- Hoá chất dùng trong phản ứng lên men yếm khí: Bromthymol blue (1%),Glucose 10%

- Hoá chất dùng trong phản ứng MR-VP: α-napthol 5%, KOH 40%, methylred

- Hoá chất dùng trong phản ứng ONPG: ONPG

(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside), lactose, phenol red

Các hoá chất trên có xuất xứ Trung Quốc, trừ ONPG (cung cấp bởi Merck)

+ Hóa chất dùng trong các phản ứng PCR, điện di

- Nước tinh khiết không có nuclease

- DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) do hãng Thermo Scientific cungcấp

- Mồi p63F, p1378R (IDT, Singapore)

- HydraGreen Safe DNA Stain 20000x, , Loading Dye 6x, Gene Ruler 1kb DNA ladder được cung cấp bởi Affymetric USB, Merck và Fermentas (Mỹ).

Tất cả do Macherey-nagel, Đức cung cấp

2.2.2.2 Dụng cụ, thiết bị, máy móc

- Đĩa petri, que cấy, đèn cồn

- Pipet và đầu côn các loại

- Tủ lắc ổn nhiệt WiseCube, Hàn Quốc

- Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)

- Box cấy vô trùng (Daihan Labtech, Ấn Độ)

- Nồi hấp khử trùng ES - 315 (Tomy, Nhật Bản)

- Máy đo phát quang TD-20/20 Luminometer (Promega, Mỹ)

2.2.3 Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu:

2.2.3.1 Môi trường LB 0,5 % NaCl

Môi trường này dùng để phân lập VSV và nuôi cấy chủng VK có khả năng

ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của V harveyi.

Bảng 2.1 Thành phần môi trường LB 0,5% NaCl nuôi cấy các VSV phân lập

2.2.3.3 Môi trường LB với nồng độ 1%; 3% và 5% NaCl

Môi trường với thành phần như bảng 2.1 nhưng với nồng độ NaCl là 3%

được sử dụng để nuôi cấy và phân lập Vibrio harveyi và các chủng đối kháng khác.

Ngoài ra, môi trường LB 3% NaCl với điều kiện pH = 6,5, pH = 8, pH = 9 cũngđược sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH khả năng ức chế sự phát sáng ở

Vibrio harveyi của các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân lập được.

Các môi trường LB với nồng độ NaCl là 1% và 5%, cùng với môi trường LBvới nồng độ NaCl 3%, pH 8 được dùng để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl

đến khả năng ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng đối

kháng khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng ức chế quá trình phát

quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi

2.3.1.1 Phân lập các vi sinh vật có khả năng đối kháng

+Phân lập vi sinh vật: Mẫu đất, bùn đã được thu thập về đem hoà tan trong

10 ml nước muối sinh lý khử trùng, voltex đều Lấy 1 ml dung dịch chuyển sangống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý khử trùng, voltex thu được dung dịch cónồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành các bước như trên để có dung dịch vớinồng độ pha loãng 10-3, 10-4 Hút 100µl dung dịch với các nồng độ trên nhỏ vào đĩapetri chứa môi trường LB chứa 0.5% NaCl và LB chứa 3% NaCl; trang đều Đểtrong tủ ấm 37C qua đêm, sau đó dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc chọn lọc

ra các khuẩn lạc và cấy ria sang đĩa môi trường mới Tách thuần các chủng đã phânlập cấy truyền trên môi trường đặc trưng Giữ chủng thuần trong glycerol 10%, hoặcống nghiệm thạch nghiêng

+ Môi trường phân lập vi sinh vật: LB 0.5% NaCl, LB 3% NaCl, TCBS.

2.3.1.2 Xác định khả năng ức chế quá trình phát quang sinh học liên quan đến

quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV đã phân lập

Sau khi chọn được các khuẩn lạc riêng rẽ khác nhau, tiến hành thử hoạt tính

ức chế phát quang sinh học của chủng vi khuẩn Vibrio đại diện là Vibrio harveyi

NBRC 15634

- Sử dụng đĩa 96 giếng Vibrio harveyi được nuôi lắc cho đến khi đạt OD600

~ 1 – 1,5 (lúc cường độ phát sáng mạnh) Các chủng vi sinh vật đã phân lập nuôi lắcđến OD600nm ~ 1 Cho hỗn hợp môi trường LB 3% NaCl mới, dịch nuôi lắc Vibrio

harveyi và dịch nuôi loại tế bào của các VSV đã phân lập vào đĩa 96 giếng theo tỉ lệ

tương ứng 300:10:3 (ở đây, chúng tôi sử dụng 300µl MT LB 3% NaCl, 10 µl dịch

nuôi lắc Vibrio harveyi và 3µl dịch nuôi lắc loại tế bào của các VSV đã phân lập).

Sau đó, đậy nắp để qua đêm ở nhiệt độ 28C

- Đọc kết quả: Giếng không sáng hoặc sáng yếu so với giếng đối chứng chỉ

có Vibrio harveyi: chủng VSV có khả năng ức chế sự phát sáng của Vibrio harveyi

hoặc ức chế sinh trưởng của vi khuẩn này Giếng sáng: chủng không có khả năng ứcchế

* Để xác định VSV có hoạt tính ức chế phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing hay ức chế sinh trưởng, thí nghiệm kiểm tra hoạt tính ức chế được tiến hành theo các phương pháp:

+ Thử khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng VSV triển vọng có hoạt

tính với Vibrio harveyi bằng phương pháp cấy vạch vuông góc [4]

- Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc của các chủng VSV phânlập có triển vọng cấy vạch thẳng lên góc đĩa petri, tiếp đó dùng que cấy vô trùng lấy

1 khuẩn lạc của Vibrio harveyi và cấy vuông góc, sát với đường cấy của các VSV

trên Để trong tủ 37C qua đêm

- Đọc kết quả: Nếu đường cấy của V harveyi mọc sát đường cấy của các

chủng VSV triển vọng, không có khoảng vô khuẩn thì các chủng VSV này không

ức chế sinh trưởng của V harveyi

+ Thử khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng VSV triển vọng có hoạt

tính với Vibrio harveyi bằng phương pháp đục lỗ thạch [4]

- Tiến hành: Dùng pipet hút dịch nuôi cấy của V harveyi nhỏ vào đĩa petri Tiếp theo, lấy que trang trải đều dịch tế bào V harveyi trên bề mặt đĩa thạch Sau đó, dùng dụng cụ đục 3 lỗ thạch ở trong đĩa petri đã trang đều V.harveyi Cuối cùng,

nhỏ dịch nuôi loại tế bào của các chủng VSV triển vọng có hoạt tính ức chế sự phát

sáng ở V harveyi Để đĩa petri thử hoạt tính trong tủ 37C qua đêm

- Đọc kết quả: Nếu xung quanh lỗ thạch không có vòng vô khuẩn thì các

chủng VSV trên không có khả năng ức chế sinh trưởng của V harveyi

2.3.1.3 Phân tích định lượng khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến

quorum sensing ở Vibrio harveyi của các VSV đối kháng

Để xác định rõ kết quả thu được, tiến hành đo cường độ phát quang từ cácgiếng thí nghiệm bằng máy TD-20/20 Luminometer Các giếng đo là giếng đối

chứng (giếng chỉ có môi trường, giếng chỉ có V harveyi, giếng chỉ có các chủng vi khuẩn XTS1, CP1), các giếng thử hoạt tính (giếng chứa V harveyi bổ sung dịch

nuôi của XTS1, CP1 và CP10) Thời điểm đo là 12h – 14h sau khi trộn hỗn hợp thí

nghiệm Đây là thời điểm Vibrio harveyi phát quang mạnh nhất và mật độ tế bào

cao nhất Các mẫu được đo lặp lại 3 lần Sự sai khác giữa các lần đo có ý nghĩathống kê khi p ≤ 0,05

2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức

chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng

2.3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vi khuẩn Vibrio harveyi, các VSV có hoạt tính ức chế sự phát sáng của V.

harveyi được nuôi lắc đến OD600nm ~ 1 – 1,5 Sau đó, cho tỉ lệ 300:10:3 tương ứng

môi trường LB 3% NaCl mới, vi khuẩn V harveyi và dịch nổi nuôi cấy của các VSV có hoạt tính ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở V harveyi

phân bổ vào đĩa 96 giếng Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ:20C, 26C, 32C và 35C Đọc kết quả ở các thời điểm 6h, 12h, 18h sau khi ủ

Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng của các giếng (quan sát được bằng mắt thường) ởcác thời điểm 6h, 12h, 18h

Vi khuẩn Vibrio harveyi, các VSV có hoạt tính ức chế sự phát sáng của V

harveyi được nuôi lắc đến OD600nm ~ 1 – 1,5 Sau đó, cho tỉ lệ 300:10:3 tương ứng

môi trường LB N% NaCl mới, vi khuẩn V harveyi và dịch nổi nuôi cấy của các

VSV có hoạt tính ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở V harveyiphân bổ vào đĩa 96 giếng Trong đó, độ mặn của môi trường (N%) được pha theo tỉlệ 1%, 3% và 5% Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 26C

Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng của các giếng (quan sát được bằng mắt thường) ởthời điểm 6h, 12h, 18h Chủ yếu quan sát vào thời điểm 12h, vì đây là thời điểm

Vibrio harveyi phát sáng cực đại.

Vi khuẩn Vibrio harveyi, các VSV có hoạt tính ức chế sự phát sáng của V.

harveyi được nuôi lắc đến OD600nm ~ 1 – 1,5 Sau đó, cho tỉ lệ 300:10:3 tương ứng

môi trường LB 3% NaCl mới, vi khuẩn V harveyi và dịch nổi nuôi cấy của các VSV có hoạt tính ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở V harveyi

phân bổ vào đĩa 96 giếng Trong đó, môi trường LB 3% NaCl được điều chỉnh pHđến các giá trị: 6,5; 8 và 9 Mỗi thí nghiệm được lặp lại 4 lần Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ:26C

Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng của các giếng (quan sát được bằng mắt thường) ởthời điểm 6h, 12h, 18h

2.3.3 Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, phân loại của các chủng vi khuẩn

có hoạt tính ức chế phát sáng sinh học (liên quan đến QS) của Vibrio harveyi

2.3.3.1 Phương pháp quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn

Sử dụng phương pháp nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn có

hoạt tính ức chế sự phát sáng sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio

harveyi [4].

+ Cách tiến hành:

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn hoà vào 1 giọt nước cất ở giữalam kính, hong khô

- Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần

- Nhuộm bằng tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Rửa bằng cồn tẩy trong 30 giây

- Nhuộm bổ sung bằng Safranin trong 1 phút

- Rửa nước, để khô trong không khí

- Nhỏ dầu, soi kính (dùng vật kính 100x)

- Kết quả: Gram dương: bắt màu tím Gram âm: bắt màu hồng

2.3.3.2 Phương pháp xác định khả năng lên men yếm khí của các chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế sự phát sáng sinh học liên quan đến quorum sensing

của Vibrio harveyi

+ Môi trường chọn lọc: Peptone (2g), NaCl (5g), KH2PO4 (0,3g), Agar (3g),

Bromthymol blue (1%) (3ml), H2O (1l), pH (7.1)

+ Phương pháp tiến hành: Đổ 5ml môi trường vào ống nghiệm, hấp khử

trùng 121C trong 20 phút, thêm 0,5 ml Glucose 10% vào mỗi ống nghiệm, cấy mỗichủng vi sinh vật vào 2 ống, bổ sung 1 lớp dày paraffin (đã hấp khử trùng) để tạo

điều kiện kị khí sau đó để ở điều kiện nhiệt độ 28oC Nếu có sự chuyển màu từ xanhsang đỏ ở cả 2 ống nghiệm thì đó là vi khuẩn lên men yếm khí.[20]

2.3.3.3 Phương pháp thử nghiệm tính di động

+ Nguyên tắc: Xác định khả năng di động của vi sinh vật

+ Môi trường: LB 3% NaCl 0,2% agar: peptone (10g); cao nấm men (5g);

NaCl (30g); agar (2g) pH ~ 8 Khử trùng 121C trong 20 phút

Đổ MT ra đĩa petri

+ Tiến hành: Vi khuẩn sau khi hoạt hoá được cấy bằng tăm vô trùng chấm

nhẹ vào đĩa petri đựng môi trường LB 3% NaCl 0,2% agar Cất đĩa petri đã cấy vi

khuẩn trong tủ 30C.

2.3.3.4 Phương pháp thử nghiệm MR (methyl red)

+ Nguyên tắc: Phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm axít bền.

VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm VK có phản ứng

MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính axít tạo thành lạichuyển hoá tạo thành các sản phẩm trung tính)

+ Môi trường MR – VP: Glucose (5g); peptone (5g); Na2HPO4 (5g) H2O

(1l) pH ~ 6,9

Chia 3ml mỗi ống nghiệm Tiệt trùng 121C/20 phút

+ Tiến hành: Vi khuẩn có hoạt tính ức chế sự phát sáng sinh học liên quan

đến quorum sensing được cấy trên môi trường MR – VP Ủ 37C từ 1 – 5 ngày

Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay Phản ứng (+): có màu đỏ, âm tính có màu vàng [20]

2.3.3.5 Phương pháp thử nghiệm VP (Voges–Proskauer)

+ Nguyên tắc: Phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzyme chuyển hoá 2,3

butanediol thành acetoin khi có oxy và chuyển hoá tiếp acetoin thành diacetyl

Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo thành phức diacetyl-guanidin có màu đỏ

+ Môi trường MR – VP: Glucose (5g); peptone (5g); Na2HPO4 (5g); H2O

(1000ml) pH ~ 6,9

Chia 3ml mỗi ống nghiệm Tiệt trùng 121C/20 phút

+ Tiến hành: Thuốc thử: Dung dịch A : α-napthol 5%.

- Cấy VSV trong môi trường MR-VP Ủ trong 24h – 48h, 37C

- Bổ sung thuốc thử vào MT (0,6ml A và 0,2ml B), lắc nhẹ

- Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất 4h

- Dương tính: Dịch thể chuyển sang màu đỏ Âm tính: Không đổi màu.[20]

2.3.3.6 Thử nghiệm ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranosidase)

+ Nguyên tắc: Phát hiện các VSV có hệ enzyme fl-galactosidase – enzyme

cảm ứng O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) có cấu trúc tương tự như

lactose Trong quá trình thủy phân, nhờ tác động của các enzyme β-galactosidase,ONPG phân cắt thành hai dư lượng, galactose và o-nitrophenol ONPG là hợp chấtkhông màu: O-nitrophenol có màu vàng.

+ Môi trường KIA: peptone (20g); lactose (20g); glucose (1g); NaCl (5g);

Feric ammonium citrate (0,5g); sodium thiosulphate (0,5g); agar (15g); đỏ phenol(0,025g); nước cất (1l) pH ~ 7,4 ± 0,2

+ Môi trường ONPG: casein peptone (7,5g); NaCl (3,75g); Na2HPO4

(0,35g); ONPG (1,5g); H2O (1l) pH ~ 7,5 ±0,2

- VK được cấy trên môi trường KIA (TSI) ở 37C qua đêm Sau đó, hoà tan

- Thêm 1 giọt toluene, lắc mạnh để giải phóng enzyme

- Đọc kết quả: Dương tính: Dịch thể chuyển sang màu vàng Âm tính: màu không đổi [20]

2.3.4 Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tuyển chọn được chủng VSV có triển vọng đối khángcao, tiến hành tách DNA tổng số, gen 16S rRNA được khuếch đại bằng phản ứngPCR với cặp mồi p63F (5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC3′,mồi xuôi) vàp1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG3’,mồi ngược) [24] được cungcấp bởi Integrated ADN Technologies - IDT (Singapore) Độ đặc hiệu và hiệu quảcủa cặp mồi này đã được nghiên cứu và thử nghiệm với nhiều loài vi khuẩn và mẫumôi trường, cho thấy cặp mồi này rất hữu ích cho khuếch đại gen 16S rADN trongnghiên cứu về sinh thái vi sinh vật

2.3.4.1 Phương pháp tách DNA tổng số

+ Nuôi cấy vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát quang liên

quan tới quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio được nuôi cấy trên môi trường LB

3% NaCl

+ DNA của các chủng vi khuẩn được tách chiết theo protocol sau:

- Hút 1 ml nước MQ đã khử trùng vào ống eppendorf.

- Dùng tăm bông vô trùng (hoặc que cấy) lấy khuẩn lạc đã nuôi cấy trên đĩamôi trường, hòa tan tế bào vào ống eppendoft đã chuẩn bị, trộn đều bằng vortex rồi

đem ly tâm ở 8000 vòng/ph trong 10 phút (rửa mẫu)

- Hút bỏ phần dịch  cho 300µl nước MQ vô trùng vào mẫu, trộn đều cho phầncặn hòa tan lại

- Bổ sung 300 µl hỗn hợp Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) mix

kỹ bằng vortex hoặc dùng tay trong khoảng 30 giây

- Ly tâm ở 14000v/p, nhiệt độ phòng, trong 12 - 15 phút

- Dùng pipet nhẹ nhàng hút pha dịch nổi trên cùng và chuyển sang 1 ốngeppendorf khác (200 µl)

- Bổ sung theo thứ tự: 1 µl Glycogen; 100µl ammonium acetate 7,5M; và 750

µl Ethanol 100%

- Ủ trong ngăn đá (- 20oC) qua đêm

- Ly tâm ở 14000v/p, 4C trong 30 - 40 phút để tủa DNA

- Gạn bỏ phần dịch, bổ sung 150 µl ethanol 70%, mix nhẹ bằng pipet

- Ly tâm ở 14000v/p, 4oC trong 10 phút để rửa DNA Lặp lại bước này 2 lần

- Nhẹ nhàng gạn bỏ phần dịch, để khô

- Bổ sung 20 – 100 µl nước PCR vào để hòa tan DNA (tùy vào mỗi mẫu)

- Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA