Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ p lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm

Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học vàdược phẩm là một hướng nghiên cứu mới, v

ĐAỊ HOCC̣ QUÔ ́

PHẨM

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣

Hà Nội - 2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 Tổng quan 2

1.1 Giới thiệu chung về chất kháng sinh 2

1.1.1 Lịch sử ra đời 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Đánh giá tác dụng 2

1.2 Kháng sinh β – Lactam 3

1.2.1 Định nghĩa 3

1.2.2 Cấu trúc và phân loại 3

1.2.3 Tính chất vật lý và hóa học 7

1.2.4 Tác dụng 7

1.2.5 Điều chế 8

1.2.6 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 9

1.3 Các phương pháp định lượng β – Lactam 11

1.3.1 Các phương pháp quang học 11

1.3.2 Các phương pháp điện hóa 12

1.3.3 Các phương pháp điện di mao quản 12

1.3.4 Sắc kí bản mỏng 13

1.3.5 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu. 17

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP- HPLC 18

2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC 18

2.2.2 Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC 20

2.2.3 Detector huỳnh quang 22

2.2.4 Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 23

2.2.5 Phân tích định lượng bằng HPLC 25

2.3 Kỹ thuật dẫn xuất hóa các β- Lactam với thuốc thử NBD-F 26

2.4 Dụng cụ và hóa chất 28

2.4.1 Máy móc và dụng cụ 28

2.4.2 Hóa chất 28

Chương 3: Kết quả và thảo luận 30

3.1 Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa β- Lactam và thuốc thử NBD-F 30

3.1.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa 30

3.1.2 Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất hóa 33

3.2 Khảo sát các điều kiện chạy sắc ký 36

3.2.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) 36

3.2.2 Chọn bước sóng của detector 37

3.3 Chọn pha tĩnh 37

3.4 Chọn pha động 38

3.4.1 pH dung dịch đệm 38

3.4.2 Tỉ lệ thành phần pha động 40

3.4.3 Nồng độ đệm acetat của pha động 44

3.4.4 Tốc độ pha động 47

3.5 Đánh giá phương pháp phân tích 50

3.5.1.Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 50

3.5.2.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 54

3.5.3 Độ đúng của phép đo 55

3.5.4 Độ lặp lại của phép đo 57

3.6 Phân tích mẫu thực 58

3.6.1 Phân tích mẫu dược phẩm 58

3.6.2 Phân tích mẫu sinh học 63

3.7 Kết quả một số phương pháp khác xác định kháng sinh cùng loại 68

3.8 Hướng phát triển của đề tài 70

KẾT LUẬN 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO. 73

PHỤ LỤC 79

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số Penicillin

2 Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số Cephalosporin

3 Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

4 Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của Spíc vào nhiệt độ phản ứng

5 Bảng 3.2 Sự phụ thuộc của Spíc vào thời gian phản ứng

6 Bảng 3.3 Sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất vào pH

pha động

8 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa

hữu cơ và đệm

9 Bảng 3.6 Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa

MeOH

10 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc của k’ vào tỉ lệ giữa ACN và MeOH

11 Bảng 3.8 Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm

12 Bảng 3.9 Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau

13 Bảng 3.10 Thời gian lưu của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc

độ pha động

14 Bảng 3.11 Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc

độ pha động

15 Bảng 3.12 Sự phụ thuộc của Spic vào nồng độ chất phân tích

16 Bảng 3.13 Các giá trị Ftính, Fbảng và phương trình đường chuẩn của

các kháng sinh β - LactamBảng 3.14 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất

Chuyên ngành Hoá Phân tích 6

19 Bảng 3.16 Độ đung của phép đo tại nồng độ các chất 0,40ppm

́́

20 Bảng 3.17 Độ đung của phép đo tại nồng độ các chất 0,80ppm

́́

21 Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại của phép đo theo diện tích pic

22 Bảng 3.19 Thông tin mẫu thuốc phân tích

23 Bảng 3.20 Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương phápthêm chuẩn trong mẫu thuốc

24 Bảng 3.21 Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng sovới kết quả in trên nhãn thuốc

25 Bảng 3.22 Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu

26 Bảng 3.23 Hiệu suất thu hồi của mẫu máu

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con ngườingày càng được quan tâm, đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏecon người

Trong y học hiện đại, các β - Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọngchữa bệnh con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm

1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay Nhờ các thuốc khángsinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả,thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều bệnh gây ra bởi vi khuẩn Nhưng, nếu liềulượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, khángthuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn Ngoài ra, còn gây lãng phí cho người bệnh

vì có những bệnh do vi rút không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùngkháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏengười bệnh Đối với những người cao tuổi , lươngg̣ dư kháng sinh trong nư ớc tiểunhiều, còn gây ra các bệnh về thận Đồng thời, lươngg̣ dư này thải ra môi trường se gây lên những hâụ quảvô cùng nghiêm trongg̣ Vì vậy, kiểm soát và phân tích thuốckháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụngchúng

Có rất nhiều phương pháp tách khác nhau Trong đó, phương pháp tách sắc

ký là phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời gian phântích ngắn

Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học vàdược phẩm là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm của nó ngày càngđược áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ Trên cơ

sở đó, chúng tôi chọn đề tài là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng

sinh họ β - Lactam trong các mẫu sinh học và dƣợc phẩm ”.

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum vàPenicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấmCephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên [1]

1.1.2 Cấu trúc và phân loại

O

COOM

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là:

(2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khácnhau Với M là gốc cation thường là: K, Na, H

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

β-

6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-6-{[3-(2-chlorophenyl oxazole-4-carbonyl]amino}

)-5-methyl- phenylacetyl]amino)

6-([(2R)-2-amino-2-* Các cephalosporin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn

với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác nhau bởi các

gốc R

R2 R1

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R)

8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ Các

cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng

trên gram âm yếu hơn thế hệ sau [1]

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc của các

II: tácyếu

1.1.3 Tính chất vật lý và hoá học

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước,

dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ

phân cực vừa phải Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng

thời nhóm –COOH và –NH2

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ

thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp

thụ)

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc

phân tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá

trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện Sinh tổng hợp vách tế bào bị

ngừng lại và ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-) Mặc khác, các penicillin còn hoạt

hóa enzim tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả

là vi khuẩn bị tiêu diệt

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu

kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ

rộng [13]

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam,theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả cáccách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi

là kháng methicillin) [13]

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dịứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốcphản vệ [13]

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú Chốngchỉ định dị ứng với thành phần của thuốc

Tổng hợp hoá học:

Chưa được ứng dụng rộng rãi

1.1.6 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Ta biết rằng, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chếkhác nhau đối với các vi trùng khác nhau Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh

do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus) Để điều trịbệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vìthiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở cácnước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cầnthiết, không đúng chỉ định và không đúng cách Từ đó, làm cho các vi khuẩn dầndần kháng thuốc, việc chữa trị bệnh ngày càng khó khăn và sự ô nhiễm môi trường

do kháng sinh gây ra càng trầm trọng hơn [42]

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R.Gonzales [4,46], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấptrên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần

và không điều trị được bằng kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiếnenterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus khángvancomycin Theo báo cáo của A.W McCormick [15] năm 2003, tỉ lệ pneumococuskháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004,

41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng caokhiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phươngtiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trongvòng 24 giờ Theo D.P Raymond [26], mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễmtrùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây

tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J Chalker [9], năm

1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnhnhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian dưới 5 ngày)

Theo [9], qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện BạchMai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không íttrẻ em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tửvong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyếttán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện NhiTrung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị khánghoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùnghuyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9% Đối với vikhuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc củaAmpiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụngkháng sinh từ nhiều chục năm nay Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, cácnhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý”(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằmchống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang pháttriển

Năm 2001, Tổ chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để KiểmSoát Sự Đề Kháng Kháng Sinh” Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả

các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăngcường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng vàchính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu.Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của cácthuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo,không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất.

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽbảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chếđược chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng

1.2 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam

1.2.1 Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quanghọc của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phươngpháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp phụ, chúng cũngtạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiềutrường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạykhá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của cácβ-lactam

A Fernández-González và cộng sự [17] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phứcvới AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thuđược 4.10-7M (0,16 mg/l) Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy chohiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống,huyết thanh…

Theo [30], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uốngbằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến sự thủy phân củakháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả tạo ra

phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l vàgiới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP 0,76 mg/l.

Wei Liu và cộng sự [49], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệluminol- K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tíchmột số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP) trong sữa đaṭgiới haṇ pháthiêṇ thấp : PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l; 0,1 mg/lCEP Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS,nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp,các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất khángsinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phântích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phântích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.2.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactamnhưng không phổ biến nhiều Theo [26], Daniela P Santos và cộng sự sử dụngsensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trongmôi trường đệm axetat 0,1M, pH= 5,2

1.2.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệuquả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứngdụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khácnhau

L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [37] sử dụng phương pháp điện dimao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện

di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5 Tiến hành phân tích tại thế điện di

10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s Phương pháp cho phép tách 6 khángsinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trongmẫu nước thải của trang trại chăn nuôi Giới hạn phát hiện từ 0,14 đến 0,27

mg/l, độ lệch chuẩn tương đối cho thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%, diện tích pic 1,3đến 4,15%; độ thu hồi trên 96%.

Biyang Deng và cộng sự [19] đã sử dụng phương pháp điện di với detectorđiện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độlệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu

Attila Gaspar và cộng sự [16] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh

họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zoneelectrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8.Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện

14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l Trong đó CEP và CEF có giớihạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l Mụcđích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họCephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C) Kết quả chothấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khipha loãng

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [38] sử dụng phương pháp CZE và detector UV– DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH =8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩthuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP,AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước (nước sông,nước thải…) Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 μg/lcùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%

1.2.4 Sắc ký bản mỏng ( TLC)

Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểmtra đánh giá sơ bộ các chất phân tích có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng mộtlúc song song rất tiện lợi Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo

quang có thể phân tích định tính và định lượng Tuy nhiên phương pháp này chỉdùng để định tính.

1.2.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùngquan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chấtthiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết cácchất

Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh  -lactam bằng phương pháp HPLC

Theo [50], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích

penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiệnchạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –(C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trongsữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg

J.M Cha và cộng sự [32] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích lactam trong nước sông và nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2,1mm×50 mm, 2,5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C =Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phútA/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút; nhiệt độ cột

β-450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin

có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/lvới nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang,với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao Như trong [19] C.Y.W Yang và cộng sựdùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò(pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346

nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5 μg/kg và 0,3 μg/kg Tuy vậy, docác β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng

quang hóa [17, 25] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứkhông áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.

Trong [33, 34], Boison J.O và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2(250mm*4,6mm, 5μm); pha động : ACN –Na2S2O3 15,7mM trong đệm photphat0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thờiAMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-5  g/kg

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độdẫn… để phân tích các β-lactam

Trong [24], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91% Còntrong [46], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để táchpenicillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, hiệu suất đạt89-117%

Khi tách và làm giàu các β - Lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPEthì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C18) và trao đổi iondựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ

K Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C18 và dung môi rửagiải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt hiệu suấtthu hồi 83-89%

Còn trong [32] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàuAMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt hiệu suấtthu hồi 77,1 - 95,9%

Trong [28] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để táchAMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nướcthải cho hiệu suất thu hồi 76-100%

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp nhưthực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương phápđều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích β – Lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đềcấp thiết đang được quan tâm Trong đó, chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫuthuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng Như chúng tôi

đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng khángsinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu làampicillin (AMP), cephalexin (CEP), cefaclor (CEF) là các kháng sinh β - Lactamđược sử dụng phổ biến hiện nay

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Tập trung vào nghiên cứu các vấn đề sau:

1 Tối ưu hóa các điều kiện để điều chế dẫn xuất giữa các chất phân tích và thuốc thử 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F).

- Chọn nhiệt độ của phản ứng dẫn xuất hóa

- Chọn thời gian của phản ứng dẫn xuất hóa

2 Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha

đảo sử dụng detector huỳnh quang (RP-HPLC).

- Chọn bước sóng của detector

- Chọn pha tĩnh

- Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ và các điều kiện khác,…

3 Điều kiện định lượng.

- Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

(LOQ)

-Độ đúng và độ lặp lại của phép đo

4 Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp.

-Phân tích mẫu dược phẩm (mẫu thuốc)

-Phân tích mẫu sinh học (mẫu nước tiểu và mẫu máu)

-So sánh với một số phương pháp khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP-HPLC

2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trìnhvừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học Nó là những cân bằng động xảy

ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liêntục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (phatĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách Trong quá trình đó chất tan luôn luôn đượcphân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một tốc

độ và thành phần pha động nhất định, hay gradient Nghĩa là đối với một phân tửchất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiềulần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗiphân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan làkhác nhau Quá trình sắc ký có thể xảy theo 3 cơ chế sau:

- Tương tác hấp phụ

- Tương tác trao đổi ion

- Tương tác theo cơ chế rây phân tử

Tương tác với 3 cơ chế trên có 3 phương pháp tiến hành tách khác nhau:

- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thường NP-HPLC) và hấp phụ pha ngược

RP-HPLC)

- Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

Hình 2.1 Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC

1 Bộ phận cấp dung môi (pha động) 3.Van bơm mẫu

5.Detector 7.Bơm mẫu tự động

Trong RP-HPLC thì pha tĩnh là vật liệu kém phân cực, thông thường chất mangtrong pha tĩnh là các loại silica trung tính đã được thế hoá bề mặt bằng các loại hợpchất kém phân cực như C18 , C8, Pha tĩnh này thường dùng để tách các hợp chấthữu cơ có độ phân cực khác nhau Khi tiến hành chạy sắc ký trên bề mặt pha tĩnhxảy ra các cân bằng động như sau:

Sr + Xi ↔ SrXi (Quá trình hấp phụ)

SrXi + M ↔ MXi + Sr (Quá trình giải hấp)

Trong đó: Sr là pha tĩnh

Xi là chất phân tích

SrXi chất phân tích hấp phụ trên pha tĩnh

M là pha động

MXi chất phân tích trên pha động

Ngoài bản chất của nền pha tĩnh, kích thước hạt nhồi và chiều dài cột tách cũng ảnhhưởng rất lớn đến khả năng phân tách các chất Do vậy, trong điều kiện phân tíchthực tế chúng ta phải nghiên cứu, khảo sát chọn pha tĩnh có cỡ hạt, chiều dài cộttách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu phân tích Thông thường đốivới một hỗn hợp chất phân tích nhất định, yếu tố quyết định đến hiệu quả tách ở đây

là các điều kiện về bản chất của pha tĩnh và thành phần pha động trong hệ HPLC.Sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) là phương pháp được dùng phổ biến nhấttrong quá trình tách phân tích và điều chế các hợp chất đang được quan tâm trongcác đối tượng sinh học, hoá học, dược học và y học Hệ RP-HPLC có các ưu điểmnổi trội sau:

1 Có độ linh động và độ chọn lọc cao

2 Có khả năng cân bằng cột nhanh, cột có hiệu lực cao, các pic cân đối

3 Pha động là nước hay hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thân thiện với môi trường

Nói chung, hệ RP-HPLC có độ linh hoạt và độ chọn lọc cao, dung môi làm phađộng có thể là dung môi hữu cơ hoà tan tốt trong nước như methanol, acetonitril,hay có thêm những dung dịch đệm pH được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định.Trong nhiều trường hợp nước là thành phần chính của pha động

Pha động có độ phân cực gần giống với độ phân cực của chất phân tích thì thời gianlưu của chất càng ngắn Chính vì điều này mà cần phải lựa chọn pha động sao chophù hợp Các yếu tố cần được quan tâm và lựa chọn cho mỗi hệ pha đó là:

1 Bản chất pha động

- Thành phần của chất tạo ra pha động

- Loại dung môi sử dụng

- pH của pha động

2 Tốc độ pha động:

Khi pha động đã có một thành phần phù hợp mà tốc độ rửa giải không phùhợp thì cũng chưa có kết quả tách sắc ký hoàn toàn tốt Khi tốc độ pha động tăng,thời gian lưu của chất giảm, đồng thời diện tích píc cũng giảm Do đó cần tiến hànhlựa chọn tốc độ pha động cho phù hợp để vừa tách hoàn toàn các chất, vừa đỡ tốndung môi mà vẫn đảm bảo tăng độ nhạy của phép phân tích

2.2.3 Detector huỳnh quang

Một số chất phân tích hay sản phẩm của chất phân tích với một chất khác(phản ứng có tính định lượng) có tính chất huỳnh quang thì xác định bằng detectorhuỳnh quang

Nguyên nhân sinh ra phổ huỳnh quang phân tử là do các điện tử hóa trị tự docủa nguyên tử hay điện tử hóa trị nằm trong liên kết hóa học (  , liên hợp  -  )của phân tử bị thay đổi mức năng lượng, chúng nhận năng lượng và ở mức nănglượng cao, trạng thái này không bền, nó bị suy biến và sau đó phát ra bức xạ Nhưvậy, quá trình sinh ra phổ huỳnh quang là tổ hợp của hai quá trình hấp thụ bức xạcủa phân tử và quá trình phát xạ huỳnh quang của nó Mặc dù tín hiệu huỳnh quang

là phát ra mọi hướng, nhưng chỉ có chùm tia phát xạ huỳnh quang nằm vuông gócvới chùm tia sáng kích thích là chùm phát xạ huỳnh quang có cường độ lớn và có ýnghĩa Chùm phát xạ huỳnh quang này đặc trưng cho mỗi loại phân tử

Nguyên tắc của detector huỳnh quang: dựa trên nguyên nhân sinh ra phổ

huỳnh quang Chiếu một chùm tia sáng kích thích có bước sóng xác định ( 1 ) phùhợp vào cuvet chứa mẫu phân tích, để chất phân tích phát ra chùm tia phát xạ huỳnh

quang của nó ( 2 ) Sau đó nhờ hệ quang học thu, phân tách lấy tia phát xạ huỳnhquang thích hợp cần đo hướng vào nhân quang điện để đo chúng, khuyếch đại vàbiểu diễn chúng.

Việc định lượng chất phân tích dựa trên sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường

độ của tia phát xạ huỳnh quang của chất với nồng độ của chất đó trong mẫu

Iq= kCLTrong đó:

k : Hằng sốL: Bề dày của cuvét (cm)C: Nồng độ của chất trong mẫu (mol/lít)

Iq: Cường độ chùm sáng kích thích

Như vậy, detector huỳnh quang gồm hai bộ đơn sắc, hai hệ quang Một hệ quangcung cấp chùm tia kích thích, một hệ quang thu nhận chùm tia phát xạ huỳnh quangcủa chất mẫu, vuông góc với chùm tia kích thích Detector huỳnh quang có độ nhạy

và độ chọn lọc cao

Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo của detector huỳnh quang.

2.2.4 Một số đại lƣợng đặc trƣng của HPLC

- Thời gian lưu và hệ số tách k’

Khi được nạp vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong mộtkhoảng thời gian nhất định Thời gian đó tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đếnlúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại Đó chính làthời gian lưu của chất (tRi)

tRi = to + t’Ri

Trong đó: to là thời gian không lưu giữ của chất (thời gian chết)

t’Ri là thời gian lưu thực của chất trên cột tách

Ngoài ra người ta còn sử dụng hệ số lưu giữ k’ để đánh giá khả năng tách

k’ =

k’ không phụ thuộc vào tốc độ dòng mà chỉ phụ thuộc vào thành phần pha động.Nếu k’ lớn thì thời gian rửa giải lâu, k’ bé thì píc của chất tiến gần đến pic dung môi

do vậy các chất không tách được

- Số đĩa lý thuyết và khả năng phân giải của cột tách

Đối với một cột tách sắc ký thì đại lượng đặc trưng cho cột tách là số đĩa hiệu dụngcủa cột tách và khả năng phân giải của cột tách

Số đĩa hiệu dụng:

N = 16t Ri  to 2

ef

W i 2

Trong đó: Nef là số đĩa hiệu dụng của cột tách

tR(i) là thời gian lưu của chất cần phân tích i trên cột tách (giây)

to là thời gian không lưu giữ ( thời gian chết:giây)

Wi là độ rộng chân pic của cấu tử i (giây)

Độ phân giải của hai chất rửa giải có vị trí cạnh nhau trên sắc đồ

R(i + 1,i)

là độ phân giải của 2 pic cạnh nhau trong sắc đồ

t’R(i +1), t’R(i) lần lươṭ làthời gian lưu thực của cấu tử i +1 và i

Wi +1, Wi lần lươṭ làđộ rộng chân píc của hai cấu tử i +1 và i

Hai đại lượng này có quan hệ chặt chẽ với nhau Nếu như số đĩa hiệu dụng càng lớnthì độ phân giải càng tốt Sự phụ thuộc này được mô tả bằng quan hệ toán học nhưsau:

Trong đó: R(i +1, i)

1 1 N f

4Trong đó  là thời gian lưu tương đối của hai cấu tử i + 1 và i



Trong điều kiện phân tích thực tế, chúng ta cần quan tâm tới độ phân giải của cộttách đối với một hỗn hợp chất phân tích cụ thể Cần phải nghiên cứu, khảo sát, chọnpha tĩnh về kích thước hạt nhồi, chiều dài cột tách như thế nào để đạt được độ phângiải theo yêu cầu đặt ra Thông thường đối với một hỗn hợp các chất phân tích nhấtđịnh thì yếu tố quyết định hiệu quả tách ở đây là các điều kiện và bản chất của phatĩnh, thành phần pha động trong hệ HPLC

2.2.5 Phân tích định lƣợng bằng HPLC

Trong điều kiện phân tích cố định đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất

là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách Do đó, có thể phân tích định tính cácchất trong mẫu chưa biết bằng HPLC thông qua thời gian lưu mẫu chất chuẩn đó

Để tiến hành phân tích định lượng, thông thường trong phương pháp HPLC người tabiểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích pic sắcký

H = k.Cb

S = k.CbTrong đó: H- chiều cao pic sắc ký của chất

S- diện tích pic sắc ký của chất k- hằng số

điều kiện thực nghiệm thực nghiệm b- hằng số

dàng hơn đo diện tích pic Nên trong phân tích lượng nhỏ, người ta thường đo chiềucao pic Tuy nhiên khoảng tuyến tính sẽ nhỏ hơn.

Trong luâṇ văn này, chúng tôi thiết lập quan hệ đo diện tích pic phụ thuộc vào nồng

độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định nồng độchất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn

- Phương pháp đường chuẩn

Nguyên tắc của phương pháp này là: pha một dãy mẫu chuẩn của chất phântích có nồng độ từ Co đến C5 và mẫu phân tích Cx …trong cùng một điều kiện phântích Sau đó tiến hành chạy sắc ký để ghi sắc đồ của dãy mẫu chuẩn và mẫu phântích Xác định chiều cao H hay diện tíc S của pic sắc ký trong tất cả các mẫu trên rồitiến hành dựng đường chuẩn theo quan hệ H=f(C) hay S=f(C) Từ giá trị Hx hay Sx

của mẫu phân tích, áp vào đường chuẩn chúng ta sẽ biết được nồng độ của chấttrong mẫu phân tích

- Phương pháp thêm chuẩn

Nguyên tắc thực hiện cũng giống với phương pháp đường chuẩn, tuy nhiênchúng ta dùng ngay chính dung dịch mẫu phân tích làm nền để pha chế dãy mẫuchuẩn Từ đường chuẩn thực hiện phép ngoại suy tuyến tính, ta sẽ tìm được giá trịnồng độ Cx của chất phân tích trong mẫu đã được bơm vào cột tách

2.3 Kĩ thuật dẫn xuất hóa các β- Lactam với thuốc thử NBD-F

Như trên đã trình bày, detector huỳnh quang là một detector rất nhạy và có độchọn lọc cao Chính vì lí do này, kĩ thuật HPLC với detector huỳnh quang đangngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích lượng vết, nhất là trong phân tíchcác mẫu sinh học Nhưng để sử dụng được kĩ thuật này, đòi hỏi chất phân tích haysản phẩm của chất phân tích với một chất khác phải có khả năng phát huỳnh quang.Trong thực tế, không có nhiều chất mà bản thân nó tự phát ra huỳnh quang Cácthuốc kháng sinh  - Lactam cũng là những chất không tự phát huỳnh quang Để sửdụng được kĩ thuật này, chúng ta phải dẫn xuất hóa nó với một chất khác

Theo [44], các tác nhân dẫn xuất hóa thường dùng là:

β-2.4 Dụng cụ và hoá chất

2.4.1 Máy móc và dụng cụ

Máy HPLC model LC-20AB của hãng Shimadzu bao gồm

- Bộ loại khí dung môi, Degasser–DGU-20A3

- Van trộn dung môi FCV-20AB

- Bơm dung môi 2 kênh LC-20AB

- Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO-20A

- Bơm mẫu tự động SIL-20A

- Detector huỳnh quang RF-10AXL

- Hệ điều khiển CBM-20Afile

- Phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC solution version 1.11

Máy đo pH

Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45  m ; bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt,

tủ sấy, máy ly tâm và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác

Thuốc thử NBD-F được pha trong MeOH với nồng độ 1000ppm và pha loãngdần bằng MeOH đến nồng đô g̣thấp hơn vàđươcg̣ bảo quản trong tủlanḥ