Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất cacbonyl αβ không no phân lập từ các cây thuốc dân tộc việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊNNGUYỄN NGHĨA VŨ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT CACBONYL αβ KHÔNG NO PHÂN LẬP TỪ CÂY THUỐC DÂN TỘC VIỆT NAM LUẬN VĂ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN NGHĨA VŨ

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT CACBONYL αβ KHÔNG NO PHÂN LẬP TỪ CÂY THUỐC

DÂN TỘC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Văn Ngọc Hướng

HÀ NỘI - 2014

MỤC LỤC

Trang

CHƯƠNG I 2

1.1 Nhóm chức cacbonyl αβ không no 2

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo của nhóm chức cacbonyl α β không no 2

1.1.2 Hoạt tính sinh học của nhóm cacbonyl αβ không no 3

1.1.3 Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong một số cây thuốc Việt Nam 6

1.3Vài nét về bệnh ung thư nguyên nhân gây bệnh 15

1.3.1 Khái niệm về ung thư 15

1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh 15

1.3.3 Phát hiện và chuẩn đoán ung thư 16

1.4 Bệnh dạ dày và vi khuẩn Helicobacter pylori 17

CHƯƠNG 2 TÊN ĐỀ TÀI, MỤC TIÊU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 20

2.1 Tên đề tài 20

2.2 Mục tiêu đề tài 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.5 Các phương tiện nghiên cứu 21

2.5.1 Các thiết bị nghiên cứu 21

2.5.2 Các hóa chất và dung môi 21

2.5.3 Dòng ung thư 21

2.5.4 Helicobacter pylori 21

2.6 Thực nghiệm 21

2.6.1.Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ 21

2.6.2 Phân lập Zerumbone từ cây gừng gió 22

2.6.3 Phân lập Curcumin I (Bis feruloylmetan). 23

2.6.4 Phân lập Rutin từ hoa hòe (Sophora Japonica L) 24

2.7 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan và ung thư vú. 25

2.7.1.Phương pháp phân tích 25

2.7.2.Dòng tế bào 25

2.7.3.Môi trường nuôi cấy 25

2.7.4.Các dụng cụ dùng 1 lần. 25

2.7.5.Chất chuẩn chứng dương tính. 25

2.7.6.Tính kết quả 25

2.8.Thử nghiệm hoạt tính chống HP của các hợp chất phân lập được 26

2.8.1.Phương pháp 26

2.8.2.Hóa chất và môi trường 26

2.8.3.Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có mẫu cần thử tính diệt khuẩn 26

2.8.4.Chuẩn bị canh khuẩn thử nghiệm 27

2.8.5.Pha loãng mẫu để thử nghiệm: đạt nồng độ 10mg/1ml 27

2.8.6.Nuôi cấy chủng vi khuẩn 27

2.8.7.Kiểm tra tính diệt khuẩn 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1.Đề tài và mục tiêu 29

3.2.Phân lập các hợp chất cacbonyl αβ không no trong các cây thuốc dân tộc đã chọn 33

3.2.1.Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ 33

3.2.2.Phân lập Zerumbone từ củ gừng gió 35

3.2.3.Phân lập Curcumin từ củ nghệ vàng 37

3.2.4.Phân lập Rutin từ hoa hòe 39

3.3.Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập đƣợc 40

3.3.1.Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất phân lập được 41

3.3.2.Khảo sát hoạt tính diệt vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) của các chất phân lập được 44

KẾT LUẬN 46

Danh mục bảng biểu

Bảng 1.1: Hằng số vật lý của 13 dẫn suất ent kauran 10

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H & 13C-NMR của Tonkinin 34

Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H & 13C -NMR của Zerumbone 36

Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H & 13C -NRM của hợp chất Của Curcumin I 38

Bảng 3.4: Hàm lượng % tế bào ung thư sống sót sau phép thử 41

Bảng 3.5: Nồng độ ức chế tối thiểu của các chất thử đối với tế bào ung thư 42

Bảng 3.6: Kết quả thử tiêu diệt HP của các chất phân lập được 45

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các cơ quan, các tổ chức và các cá nhân Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất tới tất cả các tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu luận văn này.

Trước hết tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên và Khoa Hóa, Phòng Đào tạo và Khoa Sau đại học của nhà trường cùng các thầy cô giáo, những người đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo- PGS.TS Văn Ngọc Hướng, người thầy đã trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn này.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến các đồng chí, đồng nghiệp trong Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đi học tập và nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn tất các bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.

Do thời gian nghiên cứu có hạn, luận văn của tôi chắc hẳn không thể tránh khỏi những sơ suất, thiếu sót, tôi rất mong nhận đuợc sự đóng góp của các thầy cô giáo cùng toàn thể bạn đọc.

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Nghĩa Vũ

Đặt vấn đề

Với diện tích trên 33 vạn km2và 1/3 là rừng núi lại nằm trong vùng nhiệt đới giómùa độ ẩm cao, mưa nắng nhiều, do đó thảm thực vật nước ta vô cùng phong phú và đadạng Theo thống kê mới nhất,hiện nước ta có trên 12 nghìn loài thực vật khác nhau, đặcbiệt có trên 320 loài thực vật được dùng trong y học dân tộc để chữa bệnh[1] Đây là mộtnguồn tài nguyên phong phú của đất nước Nghiên cứu các hoạt chất trong cây thuốc dântộc để chữa bệnh cho con người không chỉ là một nhiệm vụ chiến lược lâu dài mà còn lànguồn cảm hứng thú vị Nghiên cứu không chỉ có ý nghĩa khoa học với việc tìm kiếm cácchất mới, các chất có tác dụng sinh học quí giá chữa các bệnh hiểm nghèo, các mô hìnhchất chữa bệnh cho tổng hợp hóa học mà còn góp phần làm hiện đại hóa nền y học dân tộccủa đất nước

Trong những năm gần đây, các hợp chất có nhóm cacbonyl αβ không no được cácnhà khoa học thế giới đặc biệt quan tâm Hàng năm có hàng chục công trình công bố vềhoạt tính chống ung thư, chống viêm…của loại hợp chất này Theo hướng này, chúng tôiquan tâm đặc biệt những loại hợp chất cacbonyl αβ không no trong một số cây thuốc y học

cổ truyền của dân tộc với đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất

cacbonyl α β không no phân lập từ các cây thuốc dân tộc Việt Nam”.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Nhóm chức cacbonyl αβ không no

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo của nhóm chức cacbonyl αβ không no

Khung cơ sở của nhóm chức này có một nguyên tử oxy và 3 nguyên tử cacbon

R 3

Đáng chú ý, cả 3 nguyên tử cacbon này đều có lai hóa sp2 Ở nhóm cacbonyl, liên

kết σ được tạo thành do sự xen phủ orbital p

 cacbon1; còn liên kết π được tạo hành do sự xen phủ orbital p z của oxi với orbital không lai

hóa của nguyên tử cacbon 1 Ở liên kết đôi α β, liên kết

2 orbital lai hóa sp2 của 2 nguyên tử cabon 1 và cacbon 2; Còn liên kết hình thành là do sựxen phủ của 2 orbital pz không lai hóa của 2 nguyên tử cacbon này Mô tả các spin của cácđiện tử π, được chỉ trên hình 1.2

Hình 1.2

Nếu các nhóm thế ở các nguyên tử cacbon không có hiệu ứng không gian thì cácmặt phẳng điện tử π này song song với nhau một cách tuyệt đối và các liên kết π liên hợpvới nhau thành orbital π phân tử Như chỉ ra trên hình 1.3

R

Hình 1.3

Nhưng ở đây, oxi có độ âm điện lớn nên nó hút đôi điện tử π giữa nó với cabon lệch

về phía nó và kèm theo đó là đôi điện tử π giữa Cα và Cβ cũng lệch về phía Cα Kết quả sựlôi kéo này làm xuất hiện điện tích dương phần trên nguyên tử Cβ (Hình 1.4) Chính sựphân cực liên kết đôi αβ do nhóm cacbonyl gây ra làm nên sự khác biệt của liên kết đôi nàyvới các liên kết đôi của các hợp chất không có nhóm cacbonyl liên hợp





Hình 1.4

1.1.2 Hoạt tính sinh học của nhóm cacbonyl αβ không no

Chính cấu trúc đặc biệt trên mà ngoài các tính chất hóa học thông thường của liênkết đôi như cộng hợp ái điện tử, oxy hóa, khử hóa, ở nhóm cacbonyl không no còn xuấthiện một phản ứng đặc biệt gọi là phản ứng Michael; Đó là phản ứng cộng hợp ái nhân vàoliên kết đôi αβ ở cacbon β của hợp chất cacbonyl αβ không no[2] và chính sự xuất hiệnphản ứng này mà các hợp chất có nhóm cacbonyl αβ không no có các hoạt tính sinh họcquí giá mà các hợp chất có liên kết đôi khác không có, đáng chú ý nhất là hoạt tính chốngung thư và chống viêm

Minh chứng cho vấn đề này, chúng tôi lấy Zerumbone và Humulene làm ví dụ.Zerumbone là một Sesquiterpenxeton vòng lớn αβ không no, có công thức cấu tạo nhưhình 1.5a và tên hóa học là 2,6,9,9- Tetramethyl-E,E,E-cycloundecatri-2,6,9-ene-1-one

Hình 1.5a

Nó được phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960[3], từ cây gừng gió

(Zingiber zerumbet Smith) và được xác định công thức cấu tạo một cách đầy đủ chính xác

vào năm 1997.Humulene cũng được phân lập từ cây gừng gió vào 1968, có công thức cấutạo như hình 1.5b

13

Hình 1.5b

Trong 25 năm trở lại đây, Zerumbone được các nhà khoa học thế giới đặc biệt quantâm nghiên cứu hoạt tính sinh học Các kết quả nghiên cứu invitro và invivo cho thấyZerumbone không những có hoạt tính chống viêm mà còn có tác dụng ức chế mạnh sự pháttriển tế bào ung thư của 18 dòng ung thư người khác nhau : Ung thư gan[5], ung thư

Trong khi đó Humulene không có hoạt tính chống viêm mà cũng chẳng có hoạt tínhchống ung thư.

4

Nghiên cứu hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư của Zerumbone,người ta thấy Zerumbone loại trừ NF-kB và I-kB hoạt động, chúng là những tác nhân gâyung thư nên Zerumbone không những có tác dụng chống ung thư mạnh mà còn có tác dụng

phòng ngừa ung thư tốt[9] Zerumbone thúc đẩy sự tự chết (apoptosis) của tế bào ung thư

bằng cách loại trừ Glutathiol S-transferases hoạt động nhờ phản ứng cộng hợp ái nhân vàoliên kết đôi αβ của hợp chất có nhóm cacbonyl αβ không no (Hình 1.6a) Vì thế AkiraMurakami và cộng sự kết luận rằng, nhóm cacbonyl αβ không no quyết định cho hoạt tínhchống ung thư và chống viêm của loại hợp chất này (Hình 1.6a)[10]

Hình 1.6b

Sự trình bày trên cho thấy, nhóm cacbonyl αβ không no là nhóm chức sinh học củacác hợp chất cacbonyl αβ không no Khả năng tham gia phản ứng Michael của nhóm nàyquyết định khả năng hoạt động sinh học của chúng nhất là chống ung thư và chống viêm.

1.1.3-Các hợp chất cacbonyl αβ không no có trong một số cây thuốc Việt Nam

1.1.3.1-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong củ cây gừng gió (Zingiber zerumbet

Trong củ gừng gió có khoảng 0,4→0,65% tinh dầu, có 50→60 thành phần hóa họckhác nhau; Thành phần chủ yếu của tinh dầu gừng gió là Zerumbone chiếm từ 50→75%hoàn lượng tinh dầu[11]; Ngoài ra còn có Humulene, Humulene oxit… Ngoài Zerumbonengười ta còn phân lập được 13 dẫn xuất Flavonoit khác nhau đều có nhóm cacbonyl αβkhông no, có công thức tổng quát (Hình 1.8)

So sánh hoạt tính chống ung thư và chống viêm của Zerumbone và dẫn xuất của nóngười thấy khi khử hóa nhóm cacbonyl thành nhóm carbinol hay Metylen thì hoạt tínhgiảm một cách nhanh chóng.

Hình 1.9

Từ IC50 0,14µM của Zerumbone lên IC50 100µM của Humulen Điều này khẳngđịnh rằng, nhóm cacbonyl αβ không no quyết định hoạt tính chống ung thư và chống viêmcủa Zerumbone và là nhóm chức sinh học của Zerumbone[12] Zerumbone không những

có hàm lượng nhiều nhất trong củ gừng gió mà còn có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển

tế bào ung thư của 18 loại ung thư khác nhau[4] Hơn nữa nguyên liệu cho sản xuấtZerumbone ở nước ta có nhiều, cây gừng gió dễ trồng, dễ mọc, có năng xuất cao Với các lí

do trên Zerumbone được đưa vào chương trình trọng điểm phát triển Công nghệ hóa dượcquốc gia đến năm 2020 với Đề tài nghiên cứu công nghệ chiết tách Zerumbone từ cây gừng

gió (Zingiber zerumbet Smith) làm thuốc chống ung thư do PGS.TS Văn Ngọc Hướng làm

chủ nhiệm đề tài và thực hiện trong 2 năm 2010-2011 Đề tài đã được nghiệm thu xuất sắc

và đã chuyển sang dự án sản xuất thử nghiệm 2 triệu viên nang Zezunbone cho hỗ trợ điềutrị ung thư, thực hiện trong 3 năm từ năm 2013 đến năm 2015 tại Công ty Dược phẩm BắcNinh

1.1.3.2-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây khổ sâm Bắc Bộ(Croton tonkinensis Gagnep)

Khổ sâm Bắc Bộ là cây thuốc dân tộc nổi tiếng từ lâu đời, nó thuộc chi Croton vàđược Gagnep tìm thấy lần đầu tiên ở các tỉnh Bắc Bộ Việt Nam nên nó có tên khoa học là

Cronton tonkinensis Gagnep Cho đến nay, người ta vẫn chưa tìm thấy cây này ở các nước

khác, do đó có thể nói đây là cây đặc hữu của Việt Nam

Hình 1.10

Nhân dân sử dụng khổ sâm Bắc Bộ để chữa bệnh viêm loét dạ dày là chủ yếu Điềunày thể hiện trong Bài thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày của GS Dược sĩ Đỗ Tất Lợi[13].Nhưng hợp chất gì trong cây khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng chữa bệnh viêm loét dạ dày thìcho đến nay chưa ai khẳng định được Đây là vấn đề lý thú mà chúng tôi quan tâm

Ở Việt Nam, nhóm các nhà khoa học Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng và Phan MinhGiang là những người đầu tiên nghiên cứu hoạt chất sinh học trong cây khổ sâm Bắc

Bộ và cũng là những người đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc phân tử hợp chấtthuộc loại Diterpene có khung cơ bản ent-kauran là ent-7α-hydroxy-18-axetoxykaur-15-ene-16-

one và vì thế khổ sâm Bắc Bộ trở thành đề tài nghiên cứu khoa học cấp nhà nước:

“Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran diterpenoit có tác dụng chống ung thư vàchống viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ, mã số ĐT/ĐL 2005/05 do GS.TSKH Phan Tống Sơnlàm chủ nhiệm, PGS.TS Văn Ngọc Hướng và Phan Minh Giang là thành viên Kết quảnghiên cứu cho thấy các hợp chất phân lập được vừa có hoạt tính chống ung thư vừa có tácdụng chống viêm invitro Về sau Phan Minh Giang và Phạm Hồng Minh trong luận vănthạc sĩ và tiến sĩ của mình phân lập thêm một số dẫn xuất của ent-kauran từ cây khổ sâmBắc Bộ Chúng được liệt kê trong bảng 1.1

110518

Tất cả 13 hợp chất trong bảng 1.1 đều có nhóm chức 16-ene-15-one nghĩa là hợp

chất cacbonyl αβ không no Đáng chú ý nhất và có hàm lượng lớn nhất là ent-7

-hyoroxy-10

18-axetoxykaur-16-ene-15-one mà Phan Tống Sơn và cộng sự lần đầu tiên phân lập và xácđịnh cấu trúc phân tử của nó[14].

1.1.3.3-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây nghệ vàng (Curcuma longa

Cho đến nay, người ta đã tìm thấy 2 loại hợp chất cacbonyl αβ không no trong củnghệ vàng Loại chất thứ nhất là Sesquiterpene đó là Turmeron (1), Turmeron (2) và Curlon(3)[15].

5 Curcumin I (Bisferuloylmetan) R1=R2= OCH3

6 Curcumin II ( 4-Hydroxycinnamoyl metan) R1=OCH3 R2=OH

7.Curcumin III (Bis-4-hydroxycinnamoyl metan)

R1=R2=OH Ngoài ra còn có các Heptanoit khác 8,9,10,11,12

O

HO

OCH 3

Đáng chú ý nhất trong các loại hợp chất cacbonyl αβ không no là Curcumin I vì nó

là chất có hàm lượng lớn nhất và có hoạt tính sinh học chống viêm, làm liền da và chữabệnh đau dạ dày theo y học dân tộc[13]

1.1.3.4-Các hợp chất cacbonyl αβ không no trong cây hoa hòe (Sophora japonica L)

Hoa hòe nổi tiếng từ lâu đối với các vị thuốc dân gian để chữa các bệnh về timmạch[13] Chất có hoạt tính chính trong hoa hòe là Rutin, đây là một Flavonoit glycosid,một hợp chất cacbonyl αβ không no mà nhóm cacbonyl αβ không no nằm trong hệ thơmliên hợp

Hình 1.17: Rutin

Cây hoa hòe có ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt ở các nước Đông Nam Á Ởnước ta cây có ở nhiều nơi như Hà Nội, Ninh Bình, Nghệ An…Nhưng trồng nhiều nhất làhuyện Thái Thụy và huyện Tiền Hải, tỉnh Thái Bình Cây hoa hòe Việt Nam có 2 loại: Hoahòe nếp và hoa hòe tẻ

Hoa hòe nếp có chất lượng tốt hơn hoa hòe tẻ nên ở Tiền Hải và Thái Thụy chủ yếutrồng cây hoa hòe nếp

Hình 1.18

Hợp chất phổ biến nhất trong cây hoa hòe là Flavonoit, nó có trong tất cả các bộphận của cây hòe, nhưng hàm lượng cao nhất là trong nụ của cây hoa hòe Cho đến nay,người ta đã tìm thấy 14 loại Flavonoit trong nụ hoa của cây hoa hòe chúng chiếm từ15→30% tùy theo vùng trồng; trong đó Rutin có hàm lượng lớn nhất Vì vậy, chúng tôi chú

ý nhiều đến Rutin trong cây hoa hòe

1.3 Vài nét về bệnh ung thƣ nguyên nhân gây bệnh[17]

1.3.1 Khái niệm về ung thư

Ung thư là một nhóm các loại bệnh liên quan đến phân chia tế bào một cách vô tổchức không bị kiểm soát tạo thành các khối u gọi là ung thư Các tế bào này có khả năngxâm lấn vào các mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận, hoặc di chuyển đếnnơi xa (di căn) để phát triển và gây bệnh Hiện nay, người ta biết đến 200 loại ung thư khácnhau

1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân gây ung thư là sự hư hỏng của ADN, tạo nên các đột biến ở gen thiếtyếu là gen điều khiển quá trình phân chia phát triển tế bào (NF-kB) và gen kìm chế và kiểmsoát phân chia tế bào (I-kB) Ở tế bào bình thường NF-kB và I-kB luôn đi kèm nhau, liênkết với nhau bằng lực hóa trị NF-kB chịu trách nhiệm phân chia và phát triển tế bào; I-kBchịu trách nhiệm kìm chế và điều khiển NF-kB để cho sự phát triển tế bào diễn ra một cáchbình thường theo đúng lập trình của sự phát triển Trong trường hợp bất thường, vì một lý

do nào đó như môi trường bị ô nhiễm, hóa chất độc, nhiễm phóng xạ hạt nhân, I-kB bị hưhỏng trở thành I-kB hoạt động, nó không điều khiển được sự phân chia phát triển tế bàocủa NF-kB và NF-kB bị biến thành NF-kB hoạt động, nó điều khiển sự phân chia phát triển

tế bào một cách vô tội vạ và vô tổ chức tạo nên những khối u

Khối u là một khối mô bất thường, khi phát triển chậm chạp chỉ chèn ép các môxung quanh gọi là u lành tính và khi đó không gọi là bệnh ung thư; Nhưng khi nó phát triểnnhanh không những chèn ép dữ dội gây tổn hại các mô xung quanh mà còn di chuyển đếncác bộ phận khác hay cơ quan khác trongcơ thể để phát triển và gây tổn hại tại đó thì gọi là

u ác tính hay u di căn, lúc này gọi là bệnh ung thư và ung thư ác tính hay u ung thư di căn,

bệnh này vô cùng nguy hiểm tử vong là phổ biến Khái niệm u lành tính hay ác tính ở đâynên hiểu theo giải phẫu bệnh học Vì u lành nằm ở nơi không quan trọng như phần mềm cơthể hay ở da thì bệnh nhân có thể cùng chung sống suốt đời vói nó, nhưng u lành mà ở nơiquan trọng như ở não thì bệnh nhân sẽ bị tai biến nảo và tử vong trong thời gian ngắn.

1.3.3 Phát hiện và chuẩn đoán ung thư

Ở đâu có phát triển bất thường trong cơ thể nghĩa là có khối u thì nên nghĩ ngay đến

có thể là ung thư Vì ban đầu hầu hết bệnh nhân ung thư không có triệu chứng lâm sàng rõràng Bệnh ung thư có thời gian ủ bệnh lâu có khi đến 10 năm, nên khi đã có triệu chứng

rõ ràng thì bệnh đã phát triển trầm trọng việc chữa trị vì vậy vô cùng khó khăn Do đó,phát hiện sớm ung thư vô cùng quan trọng Kinh nghiệm điều trị bệnh ung thư của y họcthế giới cho thấy rằng, ung thư phát hiện sớm có thể điều trị khỏi đến 60%-70%, còn ungthư phát hiện muộn có thể trở thành nan y vô phương cứu chữa, không điều trị được Vìvậy, WHO khuyến cáo mọi người nên thường xuyên khám sức khỏe định kỳ để phát hiệnbệnh ung thư trước khi mới có mầm mống Khoa học hiện đại đã tạo ra các phướng phápxét nghiệm nên phẩu thuật và xạ trị không cho phép phát hiện sớm bệnh ung thư để cóbiện pháp phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị sớm Khi đã có khối u thì lập tức đi khám vàsinh tiết tế bào nhằm xác định u lành hay u ác tính để có phương pháp điều trị kịp thời vàthích hợp Cho đến nay có 4 phương pháp điều trị ung thư: phẫu thuật, xạ trị liệu, hóa trịliệu và một số phương pháp khác

Phương pháp hóa trị liệu truyền thống, không chỉ dùng độc lập mà còn hỗ trợ củacác phương pháp phẫu thuật và xạ trị liệu

Hóa trị liệu điều trị ung thư là dùng các hóa chất làm thuốc để điệu trị bệnh ung thư.Hóa trị liệu có ưu điểm là dùng phổ biến và dùng điều trị cho nhiều dòng ung thư khácnhau, đặc biệt là ung thư máu (Leukenia), loại bệnh ung thư không có khối u và định vịnên phẫu thuật và xạ trị là vô nghĩa; Số loại thuốc cho hóa trị liệu lại phong phú và đadạng Nhưng hóa trị liệu cũng có nhược điểm là gây tác dụng phụ cho các tế bào bìnhthường và gây hại cho một số cơ quan Vì vậy, việc chọn các chất chỉ tác dụng gây độc với

tế bào ung thư nhưng không ảnh hưởng hay gây tác dụng phụ đối với tế bào bình thường

và các cơ quan trong cơ thể là vô cùng quan trọng

Cho đến nay, hóa trị liệu bệnh ung thư theo ba hướng chính: Thứ nhất tìm kiếm cácchất đóng vai trò I-kB để điều chỉnh sự sinh sản của tế bào; Thứ hai tìm kiếm các chất cóhoạt tính loại trừ NF-kB và I-kB hoạt động làm cho ung thư không phát triển được; Thứ

ba là tìm kiếm các chất có tác dụng thúc đẩy sự tự chết (Apoptosis) của tế bào ung thư làmđình trệ sự phát triển của ung thư

Taxos phân lập từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana) là một ví dụ điển hình.Vinblastine và Vincristine phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus Roseus (L.) cũng là

những thuốc chống ung thư nổi tiếng hay Cisplatin là một thuốc chống ung thư vú, cổ tửcung và buồng trứng truyền thống

Zerumbone phân lập từ cây gừng gió (Zingiber zerumbet Smith) đang được các nhà

khoa học thế giới quan tâm nghiên cứu làm thuốc ung thư

Việc tìm kiếm các chất có hoạt tính chống ung thư cũng có nhiều thuận lợi vì ngàynay người ta đã phân lập được nhiều dòng ung thư và nuôi cấy chúng để thử nghiệm sựgây độc invitro của các loại hóa chất khác nhau, nhằm tìm kiếm các chất có cường độmạnh để nghiên cứu làm thuốc chống ung thư

Kho tàng thảo dược nước ta rất phóng phú và đa dạng, kinh nghiệm sử dụng câythuốc dân tộc đã có hàng nghìn năm nay nên hướng tìm kiếm nghiên cứu các chất trongthảo dược làm thuốc chống ung thư là nghiên cứu hấp dẫn và có triển vọng Hơn nữa,ngày nay một vấn đề rất lớn đối với bệnh ung thư là phòng ngừa ung thư và chống tái phátung thư nên nhu cầu thuốc càng thêm lớn

1.4 Bệnh dạ dày và vi khuẩn Helicobacter pylori[18]

Trước đây, người ta cho rằng, cơ chế sinh bệnh của loét dạ dày - tá tràng là do sựmất cân bằng giữa hệ thống phá hủy niêm mạc (acid dịch vị, pepsin) và hệ thống bảo vệ(lớp mucin, niêm mạc dạ dày) Do đó, mục tiêu điều trị là làm giảm tiết acid và tăng cườngbảo vệ niêm mạc dạ dày Sau khi điều trị lành và ngưng thuốc, các ổ loét lại rất dễ bị táiphát, cho nên người bệnh cần phải uống thuốc duy trì lâu dài

Năm 1983, sự phát hiện ra Campylobacter pylori và mối liên quan của nó với bệnhloét dạ dày tá tràng đã đưa hai nhà khoa học người Úc được giải thưởng Nobel Y học vàonăm 2005 Tuy nhiên, khi nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn, người ta nhận thấy nó

không hoàn toàn giống như Campylobacter, vì vậy vi khuẩn đã được chính thức đổi tênthành Helicobacter pylori (HP).

Nhiễm HP là một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người.ViệtNam cũng thuộc vùng có tỷ lệ nhiễm HP cao, khoảng >70% ở người lớn Đường lây nhiễmchủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng) hoặc lây trực tiếp (miệng - miệng) qua nước bọt

Ở những nơi có điều kiện vệ sinh kém, nguồn lây lan quan trọng là nước và thức ăn bị nhiễm

HP là một loại xoắn khuẩn Gram âm, có 3-5 chiên mao Nhờ cấu tạo này mà vikhuẩn có thể chui sâu và sống được trong lớp nhầy bao phủ trên niêm mạc dạ dày Ngoài

ra, nó còn có khả năng tiết ra men urease làm thủy phân urê thành CO2 và amôniăc (NH3)tạo nên một lớp có tính kiềm bao bọc xung quanh nó Khi gặp môi trường không thuận lợi,

vi khuẩn có thể biến đổi thành dạng hình cầu, tạm ngưng hoạt động và ngưng tiết men urease Đến khi gặp điều kiện thích hợp, nó sẽ hoạt động trở lại

- Nhiễm HP xảy ra trên 90% người bệnh có loét tá tràng, trên 70% người bệnh có loét dạdày

- Nhiễm HP xảy ra trên 90% người bệnh có viêm dạ dày

- Nhiễm HP xảy ra trên 50% người bệnh có chứng khó tiêu không do loét

- Nhiễm HP gây nguy cơ ung thư dạ dày (tỷ lệ 90%) cao gấp 2-6 lần so với những người chưa bị nhiễm

Ngoài ra nhiễm HP còn liên quan đến một số bệnh khác như:

 Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản (GERD)

 Bệnh tim thiếu máu cục bộ

 Ban xuất huyết giảm tiểu cầu vô căn (ITP)

 Thiếu máu thiếu sắt không rõ nguyên nhân

Nhiễm HP mãn tính làm cho hệ thống bảo vệ chống lại acid dạ dày bị yếu đi Cónhiều loại thuốc có hiệu quả trong việc điều trị loét dạ dày như thuốc trung hoà axit(antacids), thuốc ức chế thụ thể H2 và các thuốc ức chế bơm proton (PPI).Tuy nhiên, cácnhóm thuốc này không diệt được hoàn toàn HP trong dạ dày Do đó, loét dạ dày có thể táiphát sau khi ngưng thuốc Vì vậy, nếu tìm thuốc diệt được HP thì sẽ ngăn chặn được loét

dạ dày và không tái phát; Tìm được thuốc diệt được HP nhất là HP kháng với thuốc kháng sinh là một nhiệm vụ quan trọng của dược học hiện đại.

Ngoài ra, điều trị HP cũng được cho là yếu tố quan trọng trong việc ngăn ngừa các bệnh ung thư dạ dày, đại tràng

CHƯƠNG II TÊN ĐỀ TÀI, MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Tên đềtài:Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất cacbonyl αβ không no phân lập từ các cây thuốc dân tộc Việt Nam

2.2 Mục tiêu của đề tài

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp phân lập các hợp chất cacbonyl αβ không no từ một sốcây thuốc dân tộc Việt Nam

2.2.2 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất cacbonyl phân lậpđược

2.2.3 Khảo sát hoạt tính chống vi khuẩn gây bệnh đau dạ dày Helicobacter pylori (HP)của các chất phân lập được

2.2.4 Nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử của các hợp chất cacbonyl αβkhông no và hoạt tính sinh học của các hợp chất đưa thử

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Tổng quan về hợp chát cacbonyl αβ không no và hoạt tính sinh học

2.3.2 Tổng quan về hợp chất cacbonyl αβ không no trong các cây thuốc dân tộc: Gừng

gió(Zingiber zerumbet Smith);Khổ sâm Bắc Bộ(Croton tonkinensis Gagnep); Nghệ vàng (Curcuma longa L)và Hoa hòe(Sophora japonica L).

2.3.3 Xây dựng phương pháp phân lập các hợp chất cacboxyl αβ không no trong 4 loạicây thuốc nêu trên

2.3.4 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan G2, ung thư vú biểu mô MCF7 vàhoạt tính chống vi khuẩn HP của các sản phẩm phân lập được

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Dùng phương pháp chiết chọn lọc và các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất cacbonyl αβ không no trong 4 cây thuốc đã nêu ở trên

2.4.2 Dùng các phương pháp phổ hiện đại để khẳng định cấu trúc phân tử của các chấtphân lập được

2.4.3 Dùng phương pháp do WHO quy định để thử hoạt tính chống vi khuẩn gây đau

dạ dày Helicobater Pylori của các chất nghiên cứu

2.4.4 Dùng phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của NCI để thử hoạt tính chống ung thư của các chất nghiên cứu

2.5.1 Các thiết bị nghiên cứu

 Phổ IR ghi trên máy Impact 410- Nicolet 760 FT-IQ; Ép viền KBr

 MS ghi trên máy Hewlett Pachard HP5890 Serie II

 Các loại phổ cộng hưởng từ hạt nhân ghi trên máy Brucker Advance500MHz chuẩn nội TMS, độ chuyển dịch hóa học được biểu thị ppm, hằng

số J Hz

 Bảng mỏng sắc ký 60F254 của Merck

 Silicagel cột cỡ 40-60µm của Merck

2.5.2 Các loại hóa chất và dung môi đều dùng của Merck

2.5.3 Dòng ung thư gan Hep-G2 (Hepatocullutar carcinoma) do NCI cung cấp

Ung thư biểu mô vú MCF7 (Human Breast adenocarcinoma) 20 NCI cung cấp

2.5.4 Helicobacter pylori NCTC 11638 Quốc tế

Helicobacter pylori 524N13 chúng tôi phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng

2.6.1. Phân lập Tonkinin từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep)

1a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:

 Mẫu khổ sâm Bắc Bộ thu mua tại Hòa Bình vào tháng 8 năm 2011 Mẫu do TS Nguyễn Quốc Bình, Viện Tài nguyên Thực vật cung cấp

 Mẫu sau khi thu mua loại bỏ các lá vàng úa chỉ lấy những lá xanh tốt không sâu bệnh Rồi phơi khô trong phòng và nghiền thành bột có cỡ là 1-1,5mm.

 Chiết ngâm ở nhiệt độ phòng, 2kg bột lá khổ sâm Bắc Bộ (đã chuẩn bị

ở 2a), bằng 6 lít MeOH chia làm 3 lần, mỗi lần 3 ngày Gộp dịch chiếtMeOH, cất quay chân không ở 600C đến còn 500ml, pha thêm 250ml nướccất và chiết bằng n-hexan để loại hết Bigment rồi pha thêm 250ml nước nữa

và dùng

600ml hỗn hợp dung môi n-hexan/ Etylaxetat tỷ lệ thể tích 1:1, mỗi lần

200ml để chiết hoạt chất, gộp dịch chiết làm khô bằng Na2SO4 khan, cất loại dung môi thu 25g cao H1, hiệu xuất 1,25% tính theo nguyên liệu thô

 Sắc ký cột H1 trên cột dài 120cm,  3cm nhồi silicagel cỡ hạt 60µm theo phương pháp nhồi ướt, rửa cột bằng dung môi n-hexan, axeton2/1; thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 10ml; sắc ký lớp mỏng các phân đoạnthu được và

40-gộp phân đoạn 1535 có sắc phổ giống hệt nhau và có 1 vết: loại dung môi

và kết tinh lại nhiều lần trong hệ dung môi EtOH/ H2o thu được chất rắn, kýhiệu là Tonkinin, kết tinh hình kim mầu trắng, nóng chảy 85-860C, sắc ký lớpmỏng cho 1 vết Rf=0,72 dung môi n-hexan/EtOAc 7,5/2,5 V/V hiện màu tímvới Vanillin,… Phổ của sản phẩm xem phụ lục 5,6

 Các tư liệu phổ của Tonkinin xem phụ lục 1→9 số liệu phổ và phân tích xem phần kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.2.1

2.6.2 Phân lập Zerumbone từ cây gừng gió(Zingiber zerumbet Smith)

2a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:

 Mẫu củ gừng gió được thu mua tại Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc vàotháng 11 năm 2011 Mẫu do TS Nguyễn Quốc Bình Viện Tài nguyên Thựcvật cung cấp

 Mẫu sau khi thu mua được rửa sạch đất và cát loại bỏ phần hư hỏng vànghiền thành bột mịn cỡ 1-2 mm và bảo quản trong tủ lạnh

22

 Ép thủy lực 2 kg bột củ gừng gió tươi đến khô kiệt Nước ép đượcchiết bằng n-hexan ba lần mỗi lần 150ml; Bã ép cũng được chiết với n-hexan ba lần mỗi lần 150ml trong 3 ngày.

 Gộp 2 dịch chiết n-hexan, làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất loại hexan thu dấu không phân cực B

n- Kết tinh chậm B ở -150C rồi lọc qua phễu thủy tinh G1 thuZerumbone thô và đầu không phân cực C Kết tinh phân đoạn Zerumbonethô trong dung môi thích hợp n-hexan-axeton-Etylaxetat thu đượcZerumbone tinh khiết 4

g Hiệu xuất theo nguyên liệu tươi

3a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý

 Củ nghệ vàng da cam (Curcumin lorga L) thu mua tại tỉnh Hưng Yênvào tháng 11 năm 2011 do GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn phân loại và giámđịnh

 Mẫu sau khi thu mua được rửa sạch đất cát và loại bỏ phần hư hỏngrồi thái thành lát mỏng 1-2mm, phơi sấy ở ≤ 500C và nghiền thành bột mịnvới cỡ hạt ≤ 2mm

 Cho 300g bột nghệ vàng đã chuẩn bị (3a) vào buồng chiết và 700mlToluen vào bình chiết của bộ Soxlec Tiến hành chiết cho đến lúc dịch chiếttrong Để nguội trong bình chiết xuất hiện kết tủa Lọc kết tủa thu được15,2g hiệu xuất 7,06% ký hiệu là C Sắc ký lớp mỏng C với hệ dung môi

CHCl3/CH3COOH 9/1 V/V cho 3 vết có Rf 0,69; 0,56 và 0,35 hiện màu sắcphổ với tử ngoại cho 3 màu tương ứng vàng, xanh sáng và hồng Sắc ký Ctrên cột cao 80cm, đường kính là 1,7cm, nhồi Silicagel cỡ hạt 40-60 µm theophương pháp nhồi ướt, trong CHCl3 tỷ lệ chất phân tách và chất hấp phụ1/60, rửa cột bằng CHCl3/ CH3COOH 9/1 V/V với tốc độ 1ml/phút và thu

150 phân đoạn mỗi phân đoạn 5ml Các phần đoạn 2 đến 32 có sắc phổgiống hệt nhau cả về Rf và màu sắc phổ được gộp lại và loại dung môi thuđược 12g chất kết tinh màu vàng và nhiệt độ nóng chảy 183-1840C; hiệuxuất 78,7% tính theo trọng lượng chất phân tách ký hiệu là C1, các phổ C1

xem phụ lục 20 đến 28 Số liệu phổ và xác định cấu trúc phân tử xem kếtquả và thảo luận 3.2.2

2.6.4 Phân lập Rutin từ hoa hòe (Sophora japonica L)

4a Mẫu thực vật và phương pháp xử lý:

 Nụ hoa hòe nếp được thu mua từ huyện Tiền Hải tỉnh Thái Bình vàotháng 8 năm 2010 Mẫu được GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn phân loại và giámđịnh

 Đun 50g bột hoa hòe với 300ml EtOH 78% có 5% NaDBSA trong 40phút rồi lọc nóng, bã lọc được đun lại 2 lần nữa Gộp 3 dịch lọc lại và côquay đến 1/4 thể tích rồi axit hóa đến pH=5 bằng HCl 1M Lọc kết tủa, rửabằng

nước lạnh đến pH=6,5, sấy khô thu được 20g Rutin thô, hiệu xuất 40% Kếttinh lại Rutin thô trong EtOH/H2O thu được Rutin tinh khiết, có điểm nóngchảy 195-1970C; Sắc ký lớp mỏng với MeOH/HCOOH 6/4 V/V cho

Rf=0,65 hiện màu vàng với Vanillin/H2SO4 2%

 Phổ UV và IR xem phụ lục 29, 30

2.7 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan và ung thƣ vú

- Thực hiện thử nghiệm này tại Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc

24

2.7.1 Phương pháp phân tích

- Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993) hiệnđang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đạihọc Dược, Đại học Tổng hợp Iilinois, Chicago, Mỹ

2.7.2 Dòng tế bào

- Dòng Hep –G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

- MCF7: Human Breast adenocarcinoma (Ung thư biểu mô vú)

2.7.3 Môi trường nuôi cấy

- DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEM (Minimum EssentialMedium With Eagle’s salt) Có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non- Essential Amino Acids);10% BCS (Bovine Calf Serum)

- Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sufoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic

- Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo

% so với đối chứng Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và

so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:



sc(%)   100



25

- Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán Excel để tìm ra

% trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức củaDucan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ

 Kết quả thử xem bảng 3.4 và 3.5 phần bàn luận kết quả

2.8 Thử nghiệm hoạt tính chống HP của các hợp chất phân lập đƣợc

- Thử nghiệm này được thực hiện tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương

2.8.1 Phương pháp

- Dựa vào phương pháp thử nghiệm của tổ chức Y tế thế giới (WHO)

2.8.2 Hóa chất và môi trường

- Thạch máu ngựa 10%

- Khoáng Oxydase

- Dung dịch Catalase

- Urease

2.8.3 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có mẫu cần thử tính diệt khuẩn

- Thạch máu cơ bản (Blood agar base) được chuẩn bị theo hướng dẫn của hãng sản xuất

(Merck)

- Để nguội thạch đến 500C thêm 10% máu ngựa và huyết dịch của mẫu thử nghiệm

26

2.8.4 Chuẩn bị canh khuẩn thử nghiệm

- Vi khuẩn được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý 8,5‰ đạt nồng độ 3x108 cfu/ml (Mc Faland 1.0)

- Pha loãng bậc 10 đạt nồng độ vi khuẩn thử nghiệm 106 cfu/ml

2.8.5 Pha loãng mẫu để thử nghiệm: đạt nồng độ 10mg/1ml.

- Các tuýp được lắc, trộn đều cho đến khi lượng bột tan đều thành huyết dịch

2.8.6 Nuôi cấy chủng vi khuẩn

- Cấy chủng vi khuẩn chuẩn:

 H.pylori NCTC 11638 (chủng quốc tế)

 Chủng H.Pylori 524N13 (chủng được phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng)

- Helicobacter pylori 133 trên môi trường thạch máu ngựa 10%, ở điều kiện 5-6% O2,8-10% CO2, 80-85% N2 (túi Gas CampyGentm Oxoid, Anh), 370C/72h

2.8.7 Kiểm tra tính diệt khuẩn

- Cấy huyết dịch vi khuẩn 106 lên các đĩa thạch ở các nồng độ khác nhau

- Cho các đĩa thạch đã cấy vi khuẩn vào bình nuôi ở điều kiện kiện 5-6% O2, 8-10%

CO2, 80-85% N2(túi Gas CampyGentm Oxoid, Anh), 370C/72h

- Sau 48-72 giờ nhuộm soi khuẩn lạc rồi xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn