Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn streptomyces toxytricini (VN08 a12) kháng bệnh bạc lá lúa do xanthomonas oryzae

Một trong những giải pháp quan trọngnhất phòng trừ bệnh bạc lá lúa hiện nay là sử dụng các dòng lúa mang gen kháng bệnh.Tuy nhiên, các dòng lúa chỉ mang một vài gen kháng đơn lẻ, được nu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ VÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN

Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA

DO Xanthomonas oryzae

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ VÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN

Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA

DO Xanthomonas oryzae

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Dương Văn

Hợp TS Phạm Thế Hải

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Kim Nữ Thảo Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn này.

Em cũng xin chân thành cảm ơn TS Phan Thị Phương Hoa (chủ nhiệm đề tài Nafosted số 106.03 - 2010.34 “Sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn dùng cho đấu tranh sinh học và diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam”) và các thành viên tham gia đề tài đã hỗ trợ cho em kỹ thuật chuyên môn để em hoàn thành luận văn.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn trong suốt quá trình em thực hiện luận văn.

Em xin cảm ơn TS Kyung Sook Bae, TS Song Gun Kim và cử nhân Hyangmi Kim Bảo tàng giống chuẩn (KCTC), Viện Khoa học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong thời gian học tập ngắn hạn tại Hàn Quốc để em hoàn thành luận văn.

Em xin cảm ơn TS Hiroshi Kinoshita trường Đại học Osaka Nhật Bản đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu để em hoàn thành luận văn này.

Xin cảm ơn sinh viên Vũ Thị Kim Chi đã hỗ trợ em một số công việc thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu để em hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.

Hà Nội, ngày 2 tháng 10 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Vân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 4

1.1 Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa 4

1.1.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2 Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa 5

1.2 Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa 7

1.2.1 Sử dụng thuốc hóa học 7

1.2.2 Chọn giống lúa kháng bệnh 8

1.2.3 Khống chế sinh học 11

1.3 Xạ khuẩn 12

1.3.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn 12

1.3.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn 14

1.3.3 Sử dụng xạ khuẩn trong khống chế sinh học 16

1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trong kiểm soát bệnh bạc lá lúa 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.1.1 Các chủng Xoo 19

2.1.1.2 Các chủng xạ khuẩn 20

2.1.1.3 Vi sinh vật kiểm định 20

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20

2.1.2.1 Hóa chất 20

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị 21

2.1.2.3 Môi trường nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật 22

2.2.1.1 Phương pháp thỏi thạch 22

2.2.1.2 Phương pháp đục lỗ thạch 23

2.2.2 Phân loại bằng đặc điểm hình thái 23

2.2.2.1 Hình thái khuẩn lạc 23

2.2.2.2 Hình thái chuỗi sinh bào tử và bề mặt bào tử 23

2.2.3 Hóa phân loại 24

2.2.3.1 Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào 24

2.2.3.2 Phân tích thành phần menaquinone 24

2.2.3.3 Phân tích thành phần axit béo 25

2.2.3.4 Phân tích thành phần G+C trong ADN 25

2.2.4 Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S - rADN 25

2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn 27

2.2.5.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 27

2.2.5.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 27

2.2.5.3 Lựa chọn thể tích nuôi cấy thích hợp 28

2.2.5.4 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 28

2.2.5.5 Lựa chọn cách cấy giống 28

2.2.6 Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo 28

2.2.6.1 Tách dịch chiết thô 28

2.2.6.2 Tinh sạch bằng silica gel 28

2.2.6.3 Tinh sạch bằng HPLC 29

2.2.7 Xác định khối lượng phân tử bằng khối phổ (MS) 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Khả năng kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 31

3.2 Phân loại chủng VN08 - A12 32

3.2.1 Phân loại bằng hình thái 32

3.2.2 Hóa phân loại 33

3.2.2.1 Thành phần axit amin trong thành tế bào 33

3.2.2.2 Thành phần menaquinone 34

3.2.2.3.Thành phần axit béo 35

3.2.2.4 Thành phần G + C trong ADN 37

3.2.3 Trình tự 16S rADN 38

3.3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng VN08 - A12 39

3.3.1 Môi trường nuôi cấy thích hợp 39

3.3.2 Thời gian nuôi cấy thích hợp 40

3.3.3 Thể tích nuôi cấy thích hợp 41

3.3.4 Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 41

3.3.5 Cách cấy giống thích hợp 42

3.4 Tinh sạch và phân tích hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08 - A12 43

3.4.1 Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08 - A12 43

3.4.2 Phân tích trọng lƣợng phân tử 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 1

-DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa [37] 8

Bảng 2 Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa [15] 9

Bảng 3 Danh sách 10 chủng Xoo phân lập được ở miền Bắc Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 4 Chương trình phân tích HPLC 29

Bảng 5 Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 31

Bảng 6 Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 31

Bảng 7 Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 32

Bảng 8 : Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 35

Bảng 9 Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 36

Bảng 10 Kết quả phân tích thành phần GC của chủng VN08 - A12 38

Bảng 11 Hoạt chất của VN08 - A12 thu được từ các phân đoạn khi tinh sạch bằng silica gel 44

Bảng 12 Hoạt chất của VN08 - A12 thu được từ HPLC từ phân đoạn 4.1 45

Bảng 13 Chương trình chạy HPLC phân tích thành phần axit amin 1

Bảng 14 Phân tích thành phần menaquinone chuẩn 2

Bảng 15 Phân tích thành phần axit béo chuẩn 3

Bảng 16 Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S 5

-DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo 5 Hình 2 Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9] 6 Hình 3 Tổn thương ít trên lá của giống lúa IRBB21 chứa gen Xa21 do bệnh bạc lá

lúa ở Ấn Độ [19] 10

Hình 4 Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn 14

Hình 5 Cuống sinh bào tử của một số chủng xạ khuẩn 14

Hình 6 Bản đồ phân bố của 10 chủng Xoo ở miền Bắc Việt Nam được sử dụng

trong nghiên cứu 20

Hình 7 Khuẩn lạc và chuỗi bào tử của chủng VN08 - A12 33

Hình 8 Chuỗi bào tử và bào tử của chủng VN08 - A12 33

Hình 9 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng thành phần axit amin trong thành tế bào củachủng VN08 - A12 34

Hình 10 Kết quả phân tích LC thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 35Hình 11 Sắc ký đồ thành phần axit béo của chủng VN08 - A12 36

Hình 12 Sắc ký đồ thành phần GC của chủng VN08 - A12 37

Hình 13 Cây phân loại chủng VN08 - A12 dựa trên trình tự gen 16S – rADN 39

Hình 14 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất

kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 40

Hình 15 Ảnh hưởng của thời gian cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng

sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 40

Hình 16 Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh

hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 (S toxytricini) 41

Hình 17 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh

hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 42Hình 18 Ảnh hưởng của cách cấy giống đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế

vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 43

Hình 19 Quy trình tách dịch chiết thô của chủng VN08 - A12 44

Hình 21 Phổ HPLC của hoạt chất sau tinh sạch 47

Hình 22 Phổ hấp thụ UV của hoạt chất sau tinh sạch 47

Hình 23 Kết quả phân tích khối phổ của chủng VN08 - A12 48

Hình 24 Cấu trúc hóa học của factumycin [31] 48

Hình 25 Cấu trúc của factumycin [46] 49

Hình 26 Cụm gen sinh tổng hợp factumycin (A) WAC5292 (Streptomyces toxytricini) và (B) Streptomyces cattleya……… 49

Hình 27 Sắc ký đồ thành phần menaquinone chuẩn 2

Hình 28 Sắc ký đồ thành phần axit béo chuẩn 4

-Hình 29 Hoạt tính kháng Xoo của VN08 - A12 trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 7

Hình 30 Hoạt chất kháng sinh của chủng VN08 A12 7

TLC Thin- layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

VTCC Vietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật)

Xoo Xanthomonas oryzae pv Oryzae

MỞ ĐẦU

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra,

xuất hiện khá phổ biến trên các khu vực trồng lúa ở Việt Nam, đặc biệt tập trung ởkhu vực đồng bằng sông Cửu Long Bệnh gây hại trong vụ lúa hè thu nhiều hơntrong vụ đông xuân do thời tiết ẩm ướt, nhiều sương mù, độ ẩm không khí cao.Bệnh xuất hiện và gây hại từ giai đoạn lúa đẻ nhánh đến đòng trổ và chín Bệnh bạc

lá lúa gây thiệt hại rất nặng nề cho ngành nông nghiệp, làm giảm năng suất lúa 25

-50 %, thậm chí mất trắng (Số liệu thống kê của cục bảo vệ thực vật) Do đó, việckiểm soát và ngăn chặn sự bùng phát của bệnh bạc lá lúa là vấn đề rất quan trọng và làmối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học Một trong những giải pháp quan trọngnhất phòng trừ bệnh bạc lá lúa hiện nay là sử dụng các dòng lúa mang gen kháng bệnh.Tuy nhiên, các dòng lúa chỉ mang một vài gen kháng đơn lẻ, được nuôi trồng liên tục

trên diện rộng dẫn đến tình trạng các chủng Xoo có khả năng gây

bệnh ngay cả khi có các gen kháng đó [18] Chính vì vậy, việc kiểm soát bệnh bạc

lá lúa bằng biện pháp sinh học đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà nghiêncứu [36] Một trong những biện pháp sinh học đó là việc sử dụng xạ khuẩn đểkhống chế vi khuẩn gây bệnh, đây là biện pháp có triển vọng cao, an toàn với môitrường và có hiệu quả về kinh tế

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương, được biết đến như nguồn sinh cácchất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học Trong số khoảng hơn 10000 loạithuốc kháng sinh được phát hiện do vi sinh vật thì có đến hai phần ba được phân

lập từ xạ khuẩn mà chủ yếu thuộc chi Streptomyces; và nhiều chất trong đó là các

thuốc kháng sinh đang được ứng dụng và sản xuất rộng rãi hiện nay [6] Ngoài ra

xạ khuẩn còn là nguồn sinh các loại vitamin, enzym, chất ức chế miễn dịch, hocmônsinh trưởng Số loài xạ khuẩn trong tự nhiên ước tính lớn hơn rất nhiều so với con

số 1000 loài được công bố Đồng thời xạ khuẩn luôn là nguồn vi sinh vật rất giá trịtrong việc tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới Bộ sưu tập hơn 3000 chủng

xạ khuẩn đang được bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi Sinh và Côngnghệ sinh học, ĐHQGHN hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất có hoạt tính sinh học

mới dùng cho việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở Việt

Nam hiện nay Trong nghiên cứu này, được sự tài trợ của quỹ đề tài NAFOSTED,

TS Phan Thị Phương Hoa và các cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn và lựa

chọn được 17 chủng có khả năng kháng tất cả 10 chủng Xoo Trong đó, lựa chọn

chủng VN08 - A12 là một tác nhân kiểm soát sinh học của bệnh bạc lá lúa ChủngVN08 - A12 có nhiều ưu điểm nổi bật đã được thử nghiệm ngoài đồng ruộng và thuđược kết quả rất đáng mừng Kết quả cho thấy chủng VN08-A12 không chỉ có thể

làm giảm chiều dài tổn thương của cây lúa do nhiễm Xoo, mà còn làm giảm đáng kể tổn thất năng suất của giống lúa bị nhiễm Xoo [23] [24] Chính vì vậy, để phát triển

một chế phẩm khống chế sinh học để kiểm soát bệnh bạc lá lúa, chúng tôi đã tiến

hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae”.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thể nhƣ sau:

 Phân loại chủng xạ khuẩn VN08 - A12

 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ƣu nhất để khả năng sinh hoạt chất của chủng xạ khuẩn là cao nhất

 Tinh sạch và xác định cấu trúc của hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi chủng xạ

khuẩn VN08 - A12

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa

1.1.1 Giới thiệu chung

Bệnh bạc lá lúa - hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf blightdisease) là một trong những bệnh phổ biến trong các nước trồng lúa Bệnh bạc lálúa được phát hiện lần đầu ở vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản ngay từ những năm

1884 [45] Hiện nay, bệnh bạc lá đã xảy ra trên rất nhiều quốc gia, đặc biệt ở châu

Á Ở nhiều nước châu Á, căn bệnh này đã trở thành đại dịch trên lúa Bệnh có thểlàm giảm sản lượng ở mức độ khác nhau, tùy thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh củacây, mức độ nhạy cảm của giống lúa và ảnh hưởng của môi trường Ở một số nướcchâu Á và Đông Nam Á, bệnh bạc lá lúa thường làm giảm năng suất 10 - 20 %nhưng có thể lên đến 50% [33] [38] Ở Nhật Bản, thiệt hại năng suất ước tính là 20

- 30% thậm chí đến 50% Ở vùng nhiệt đới, bệnh phá hoại gây ảnh hưởng nặng tớihàng triệu ha lúa Ở Ấn Độ, thiệt hại về sản lượng từ 6 đến 60% Việc giảm sảnlượng chủ yếu là do giảm số lượng bông và trọng lượng hạt [43]

Ở Việt Nam, tuy khả năng lây lan thành dịch của bệnh bạc lá lúa không cao

như các bệnh dịch hại khác như rầy nâu, đạo ôn, hậu quả do bệnh bạc lá lúa gây rakhông hề thua kém những dịch hại khác Theo số liệu thống kê của cục Bảo vệ Thựcvật, từ năm 1999 - 2003 diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nước là108.691,4 ha (miền Bắc là 86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích bịhại nặng nhất là 156,76 ha và diện tích mất trắng là 80 ha Cho đến năm 2013 diện tíchlúa nhiễm bệnh bạc lá là 135,4 nghìn ha, tăng gấp 6,5 lần so với năm 2010 Từ năm

2010 đến năm 2011 diện tích cây mắc bệnh tăng nhẹ và đột ngột tăng cao trong giaiđoạn từ năm 2011 đến năm 2012 Diện tích lúa bị mắc bệnh năm 2012 là 90,543 nghìn

ha, cao gấp gần 4 lần so với năm 2011 (26 nghìn ha) đến năm 2013 diện tích lúa bị mắcbệnh đã tăng đến 135,4 nghìn ha Trong đó diện tích lúa bị nhiễm nặng là hơn 9,5 ngàn

ha Tình trạng mất trắng vẫn đang diễn ra và tăng cao trong các năm trở

lại đây tập trung nhiều tại các tỉnh phía bắc và một số tỉnh vùng đồng bằng sôngCửu Long Tuy nhiên, kết quả khảo sát mới đây của chi cục cho thấy, vụ hè thu

2014, lần đầu tiên bệnh này đã xuất hiện tập trung ở cánh đồng huyện Đạ Tẻh , LâmĐồng và diện tích nhiễm bệnh lên đến 25 ha và tỷ lệ gây hại từ 50% - 80% (cao hơnnhiều so với bình quân chung cả nước)

Bệnh bạc lá phát sinh trong suốt thời kỳ lúa chín nhưng các triệu chứng bệnhđiển hình thường xuất hiện từ thời kỳ đẻ nhánh đến thời kỳ trổ và chín, đạt đỉnh ởgiai đoạn ra hoa [33] Bệnh bạc lá lúa được chia làm hai giai đoạn: giai đoạn

“Kresek” và giai đoạn cháy lá Kresek là giai đoạn phá hoại nghiêm trọng nhất, toàn

bộ lá của cây chuyển màu vàng nhạt và héo Nếu xảy ra trong thời kỳ đẻ nhánh sớm

sẽ dẫn đến mất mùa một phần hoặc hoàn toàn Cây con dưới 21 ngày tuổi dễ bịkresek ở nhiệt độ từ 28oC đến 34oC [5] Chính vì vậy, bệnh lây lan dễ dàng hơn ởvùng khí hậu ấm áp và ẩm Trong giai đoạn cháy lá, lá có màu vàng đặc trưng vớigợn sóng trên phiến lá (hình 1)

Hình 1 Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo.

(www.thaibinhseed.com.vn/benh-bac-la-lua)

1.1.2 Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa

Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) Vi khuẩn này có tế bào hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 đến 1 µm,

chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vim, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vikhuẩn Gram âm và không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màuvàng (hình 2) [9] Vi khuẩn này chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫnđến nhiễm trùng toàn thân cây lúa Ngoài ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗthùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thương dọc theo gân lá [39].

5µm

Hình 2 Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9]

Loại vi khuẩn này đầu tiên được các nhà khoa học Nhật Bản, Hori và Bokura

đặt tên là Bacillus oryzae từ năm 1911 và được đổi tên nhiều lần [33] Sau đó, do

phát hiện là tác nhân gây bệnh bạc lá lúa, loài vi khuẩn này được đổi tên thành

Xanthomonas campestris pv oryzae để phân biệt với các tác nhân gây bệnh sọc lá

X. campestris pv oryzicola [51] Năm 1990, Swings phát hiện ra vi khuẩn gây bệnh bạc lá và bệnh sọc lá khác biệt với các vi khuẩn gây bệnh X campestris khác nên phân loại lại thành một loài riêng biệt X oryzae, bao gồm pv oryzae và pv.

oryzicola Bằng các phân tích giải trình tự DNA, protein và phân tích thành phần acid béo, vị trí phân loại của Xanthomonas oryzae đã được khẳng định và công

nhận đến ngày nay [49] [50]

Xoo là một loại vi khuẩn Gram âm, màu vàng, sản sinh lượng lớn

polysaccharide ngoại bào (EPS) Các chủng đột biến thiếu EPS không có khả năng

gây bệnh bạc lá lúa [44] Xoo chỉ có thể tồn tại trong đất từ một đến hai tháng, ngoài

khuẩn này sẽ được kích hoạt khi gặp độ ẩm thích hợp và sinh trưởng trong gốc rạ

cũng như trong một số loại cỏ như Leersia sp Giả thuyết tác nhân gây bệnh là từ

giống lúa hay từ ADN của hạt giống nhiễm bệnh đã bị loại bỏ [16] [48] Các vikhuẩn gây bệnh bạc lá xâm nhập vào cây qua các vết thương xây xát ở trên lá domưa bão gây ra và qua các lỗ khí khổng, sau đó sẽ gây bệnh trên các mô và từ đó sẽnhân và lây lan toàn bộ cây dẫn đến nhiễm trùng toàn thân [26] Vi khuẩn lây lanthông qua nước tưới, mưa và gió Nước tưới cũng được coi là tác nhân đóng góplớn vào sự lây lan của bệnh này trên diện rộng đất canh tác Tuy nhiên, vi khuẩn chỉtồn tại được trong nước dưới 15 ngày [45]

1.2 Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa gây tổn thất nặng nề và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sảnxuất lúa gạo trên toàn thế giới, do vậy đòi hỏi phải có chiến lược quản lý nhằmchống lại sự bùng phát của dịch bệnh Bước đầu cần thực hiện để kiểm soát bệnhbạc lá lúa là làm giảm tác nhân gây bệnh và ngăn chặn phát triển của tác nhân gâybệnh trên cây chủ Điều này có thể được thực hiện thông qua việc sử dụng các hóachất, giống kháng bệnh, và tác nhân sinh học

thuốc diệt nấm dithiocarbamate cũng ức chế sự phát triển của Xoo bằng cách ngăn

chặn quá trình sinh tổng hợp acid béo và lipid [54] Một vài loại thuốc kháng sinhnhư streptocycline và các thuốc diệt nấm như zineb, carbendazim cũng được chứng

minh là có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh in vitro Một số chất diệt khuẩn như

kasugamycin, phenazin và streptomycin có thể ngăn chặn được các vi khuẩn gâybạc lá lúa, nhưng lại có nhược điểm là giá thành đắt và không thân thiện với môitrường Việc sử dụng các thuốc hóa học luôn mang lại hậu quả rất nặng nề đối vớimôi trường Đồng thời, cũng chưa có phương thức kiểm soát bằng hóa chất nàomang lại hiệu quả cao bởi vì khả năng tồn tại và phát triển của các chủng khángthuốc.

1.2.2 Chọn giống lúa kháng bệnh

Chọn giống lúa kháng bệnh hiện nay cũng là phương pháp đang được quan

tâm Hiện nay, 23 gen kháng bệnh bạc lá lúa (Xa) đã được công bố (bảng 1) Các đoạn mồi cũng đã được thiết kế để phát hiện các gen Xa trên các giống lúa khác

nhau (bảng 2)

Bảng 1 Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa [37]

Tên gen Xa Tên gen Xa Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện

Bảng 2 Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa [15]

Xa21F 5'-ATA-GCA-ACT-GAT-TGC-TTT-GC-3' Xa-21

Xa 21 R 5'- CGA - TCG - GTA - TAA- CAG-CAA-AAC-3'

RG136 F 5' - TCC-CAG-AAA-GCT - ACA-GC-3' Xa-13

RG136 R 5' - GCA-GAC-TCC-AGT=TTG-ACT-TC-3'

Gen Xa21 lần đầu tiên được phát hiện trong một giống lúa hoang dại Oryza longistaminata và đã dược chuyển vào giống lúa IR24 để tạo ra giống lúa kháng

bệnh IRBB21 [30] Ở Ấn Độ và Philippin, giống lúa này đã được chứng minh là có

khả năng kháng với hầu hết các chủng Xoo Tuy nhiên, cho đến nay một số chủng Xoo ở một số vùng của châu Á đã được phát hiện là có thể vượt qua được gen kháng Xa21 trong giống lúa IRBB21 (hình 3) [18]

Hình 3 Tổn thương ít trên lá của giống lúa IRBB21 chứa gen Xa21 do bệnh bạc lá

lúa ở Ấn Độ [19]

Các nghiên cứu về bệnh Xoo cuối những năm 2000 đã được phát triển lên từ

việc phân lập, chuẩn đoán và định dạng bằng hình thái vi khuẩn, lên mức sử dụng các

kĩ thuật phân tử (ví dụ như chuẩn đoán bệnh nhanh bằng PCR, giải trình tự các gen

kháng bệnh Xoo trên lúa, dùng phương pháp đánh dấu gen để chuyển gen kháng vào

các dòng lúa) [3] [47] Các nhà khoa học Việt Nam kết hợp với Viện nghiên cứu lúa

quốc tế (IRRI) của Nhật Bản và xác định các gen kháng Xa7, Xa21 (trội) và

Xa5 (lặn) có tính kháng cao đối với hầu hết các dòng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá

lúa ở các tỉnh phía Bắc [47], đồng thời xác định các dạng bệnh gây ra bởi các chủng

Xoo đã phân lập được từ các mẫu lúa trồng tại đồng bằng sông Cửu Long [13].

Tuy nhiên, việc sử dụng liên tục và trên diện rộng các gen kháng bệnh đơn lẻ

đã dẫn đến sự chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh có khả năng phá vỡ sức khángbệnh của cây Vì thế, việc chuyển tổ hợp các gen kháng được cho là giải pháp lâudài cho việc làm chậm lại sự xuất hiện các dòng vi khuẩn gây bệnh miễn dịch vớicác dòng lúa có gen kháng bệnh Các gen khác nhau kháng các dòng, các chủng, cácdạng sinh học của vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tổ hợp các gen đó làm rộng phổ

tác động kháng lại sự đa dạng của các chủng Xoo gây bệnh Hơn nữa, bằng cách tổ

hợp các gen chính và các gen phụ kháng bệnh bạc lá lúa sẽ làm kéo dài sức khángbệnh ở cây lúa [8] Do vậy, các nghiên cứu hiện nay đang tìm cách chuyển nhiềugen kháng vào một giống lúa tạo tính kháng ổn định cao

1.2.3 Khống chế sinh học

Các thuốc hóa học đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc kiểm soátbệnh bạc lá lúa nhưng không được ứng dụng rộng vì những biến đổi khó lường củacác tác nhân gây bệnh Sự xuất hiện các quần thể kháng thuốc đặt ra mối đe dọanghiêm trọng cho chiến lược kiểm soát hóa học lâu dài Đồng thời, các chất hóa họcthường rất độc hại đối với người sử dụng, gây ảnh hưởng đến các loài sinh vậtkhác, và tích lũy qua thời gian dài sẽ gây ảnh hưởng trầm trọng lên hệ sinh thái.Việc chọn tạo giống kháng bệnh cũng đã được áp dụng nhưng các nhóm quần thểkháng lại gen kháng bệnh cũng phát triển nhanh chóng Do đó, kiểm soát sinh họcđược cho là một giải pháp sinh thái có hiệu quả cho việc ngăn ngừa bệnh bạc lá lúa

Vì thế khống chế sinh học kết hợp với các biện pháp kể trên có thể là giải pháp tốthơn để điều trị bệnh bạc lá lúa Islam và Bora (1998) đã đưa ra biện pháp phòng trừ

bệnh bạc lá bằng việc sử dụng 2 chủng vi khuẩn Rhizobacterial vào việc khử trùng

hạt giống Kết quả cho thấy việc xử lý hạt giống không chỉ có tác dụng làm giảmảnh hưởng của bệnh bạc lá mà còn có tác dụng làm tăng năng suất lúa [27]

Ngoài ra, các nghiên cứu của Gnanamanickam và các cộng sự của ông ở Ấn

Độ và Philipin đã tìm thấy chủng Pseudomonas fluorescens và một số chủng Bacillus được phân lập từ các mẫu vùng rễ lúa, có khả năng ức chế sự phát triển của Xoo trong phòng thí nghiệm [17] Năm 2008, Ji và cộng sự công bố chủng

Lysobacter antibioticus được phân lập từ rễ cây lúa ở tỉnh Yunnan, Trung Quốc, cókhả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật,

trong đó có Xoo [29].

1.3 Xạ khuẩn

1.3.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN caohơn 55% Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có

khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn [12] Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ

Actinomycetales, 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Xạ khuẩn phân bố chủ yếu

trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tựnhiên Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất.Trong đất xạ khuẩn chiếm từ 9% - 45% tổng số vi sinh vật, số lượng trung bình khoảng

106 - 108 tế bào/ g đất Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất

mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đấtgiàu chất dinh dưỡng hữu cơ, khoáng và lớp đất trên bề mặt (đến

40 cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn Trong 1 g đất canh tác có thể có tới 5 x

106 tế bào xạ khuẩn, trong khi đó đất vùng sa mạc, nóng, khô, độ ẩm thấp, nghèochất dinh dưỡng, có số lượng xạ khuẩn thấp hơn 10 - 100 lần, dao động trong khoảng

104 - 105 tế bào/ 1 g đất Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc nhiều vào độ

pH của môi trường, thường có nhiều trong lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu,trong khoảng pH 6,0 - 8,0 Xạ khuẩn không có nhiều trong lớp

đất kiềm hay axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [4]

Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn và ở nấm men màthường rắn chắc, thô ráp, dạng vôi, dạng nhung tơ, hay dạng mang dẻo, không trongsuốt Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ loại xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy,đường kính khuẩn lạc trung bình 0,5 - 2 mm Khuẩn lạc của xạ khuẩn có nhiều màusắc khác nhau như đỏ, da cam, vàng, lam, hồng, nâu, tím Màu sắc của xạ khuẩncũng được coi là một trong những đặc điểm phân loại quan trọng [1].

Trên môi trường đặc, đa số xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh(aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium) Nhiều loại chỉ có

khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí

sinh Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần(conidia hay conidiospores) Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì đượcgọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores) Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra

ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa) Các chuỗi bào tử

trần có thể chỉ là 1 bào tử (như ở Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Promicromonospora, Micromonospora và Thermomonosspora), có thể có 2 bào tử (như ở Microbispora), có thể là chuỗi ngắn (như ở Nocardia, Pseudonocardia, Streptoverticillium, Sporichthya, Actinomadura, Microtetraspora, Streptoalloteichus, Glycomyces, Amycolata, Amycolatopsis, Catellatospora,và Microellobosporia), có thể là chuỗi dài (như ở Streptomyces, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Kibdelosporangium, Kitasatosporia, Saccharothrix, nhiều loài ở Nocardia, Nocardioides, Pseudonocardia, Amycolatopsis và Streptoverticillium), có

thể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tương tự bó sợi của nấm (như ở

Actinosynnema và Actinomadura) Các chuỗi bào tử có thể thẳng, xoắn hoặc lượn

sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng Các cuống sinh bào tử (sporophore) và cuốngsinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể riêng rẽ hoặc phân nhánh Các đặc điểmhình thái này rất quan trọng khi tiến hành định tên xạ khuẩn Tuy nhiên, xạ khuẩnhoàn toàn khác biệt so với nấm ở những đặc điểm sau: Xạ khuẩn không có nhânthật, đường kính khuẩn ty và bào tử nhỏ hơn so với ở nấm, khuẩn ty không có vách

ngăn, xạ khuẩn là đích tấn công của các phage, không nhạy cảm với các chất kháng sinh kháng nấm nhƣ các polyen, không chứa chitin và cellulose [2].

Hình 4 Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn

(A) Actinoplanes brasiliensi (VTCC - A - 2908) (B) khuẩn lạc chủng Streptomyces lannensis (VTCC-A2780).

Hình 5 Cuống sinh bào tử của một số chủng xạ khuẩn

(C) Nonomuraea roseoviolacea (VTCC - A - 2062) (D) Streptomyces

malachitofuscus (VTCC - A - 2789).

1.3.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh Trong số 5500 chất kháng sinh hiện nay có 4000 chất có nguồn gốc từ

xạ khuẩn Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ khángrộng, kìm hãm và ức chế được nhiều loại vi sinh vật khác nhau [35].

Rất nhiều chất kháng sinh được sinh ra bởi xạ khuẩn đang được sử dụngrộng rãi trong thực tế hiện nay như:

Streptomycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces griseus có khả năng kháng các vi

khuẩn Gram dương khá mạnh, được sử dụng để diều trị các bệnh dịch hạch, ho gà

và quan trọng hơn cả là bệnh lao [40]

Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được phát hiện từ chủng xạ

khuẩn Streptomyces fradiae, có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương và Gram

âm, đặc biệt chống được nhiều loại vi khuẩn kháng penicillin và streptomycin [25]

Gentamycin: Có nguồn gốc từ Micromonospora purpurea, có phổ kháng sinh

rộng, có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram dương như tụ cầu, phế cầu đã kháng lạipenicillin và Gram âm như màng não cầu, lậu cầu Trong y học hiện nay,

Gentamycin chủ yếu dùng để diều trị các bệnh nhiễm Pseudomonas [19].

Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ một số chủng xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces Loại kháng sinh này có phổ rộng, chống lại được cả vi khuẩn Gram

dương lẫn Gram âm Ngoài được sử dụng trong y học, tetracyclin còn được sửdụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm [7]

Cloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezueae, có phổ

kháng sinh rộng với vi khuẩn Gram dương và Gram âm [42]

Erythromycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces erythreus, có phổ kháng sinh rộng

đối với các vi khuẩn Gram dương, được sử dụng để điều trị viêm phổi do

Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [52].

Novobiocin: Có nguồn gốc từ Streptomyces spheroides và Streptomyces niverus,

có hoạt tính mạnh với các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt có khả năng chống các tụcầu đã kháng penicillin và một số chất kháng sinh khác [34]

Amphoterycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces nodosus, được dùng để điều trị các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [10].

Actinomycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces antibiticus có hoạt tính kìm hãm sự

phát triển của các khối u ác tính, được dùng để điều trị một số bệnh ung thư [53]

Daunorubixin: Có nguồn gốc từ Streptomyces coeruleorubidus, được dùng để

điều trị các bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [41]

1.3.3 Sử dụng xạ khuẩn trong khống chế sinh học

Một trong những phương pháp kiểm soát sinh học được tập trung nghiêncứu đó là sử dụng các chủng xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn có khả năng thúc đẩytăng trưởng thực vật bằng cách tác động trực tiếp như thải ra sắt, photpho hòa tan

và sản sinh các hormone thực vật hoặc gián tiếp như ức chế tác nhân gây bệnh hoặccảm ứng các cơ chế kháng của thực vật chống lại mầm bệnh [14] [22]

Một số chủng thuộc chi Streptomyces đã được chứng minh là không những

hỗ trợ thực vật trong việc hấp thu các chất dinh dưỡng mà còn kiểm soát các tác

nhân gây bệnh cho cây trồng [20] Năm chủng Streptomyces spp (CAI 24, CAI

-121, CAI - 127, KAI - 32 và KAI - 90) được phân lập từ cỏ ở các đống ủ đã được

báo cáo là có hoạt tính chống lại bệnh héo lá ở đậu xanh do Fusarium oxysporum gây ra Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn Streptomyces được chọn lọc này cũng có khả

năng sinh siderophore, indole acetic acid (trừ KAI - 90), hydrocyanic acid, cellulase(chỉ KAI - 32 và KAI - 90) và protease (chỉ CAI - 24 và CAI - 127) [20]

Năm 2006, Prapavathy và cộng sự công bố hiệu quả của chủng Streptomyces

sp PM5 trong việc ức chế sự tăng trưởng của nấm gây bệnh đạo ôn Pryricularia oryzae và nấm gây bệnh bạc lá lúa Rhizoctonia solani Ngoài ra, một số chủng Streptomyces spp phân lập từ 21 mẫu đất Indonesia được công bố có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis và Gram âm Xanthomonas axonopodis [32].

Trước đây, các nghiên cứu về khống chế sinh học để kiểm soát các bệnh trênlúa chưa được chú ý nhiều, nhưng gần đây, đã có một vài thành tựu có ý nghĩa.Trong đó có sử dụng các vi khuẩn có mối quan hệ với thực vật như là các tác nhânkhống chế sinh học Ví dụ như các nghiên cứu của Gnanamanickam và các cộng sự

của ông tại Ấn Độ và Philipin đã tìm thấy chủng Pseudomonas fluorescens có khả năng ức chế sự phát triển của Xoo gây bệnh bạc lá lúa [17] Ngoài ra chủng còn cho

thấy có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh trên cây như vikhuẩn, nấm, virus và giun sống kí sinh Các kết quả thử nghiệm đã chứng minh

chủng P fluorescens này có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh cây củ

cải đường, lúa mạch và cây thuốc lá Các nghiên cứu của Ji và cộng sự năm 2008

đã cho thấy chủng Lysobacter antibioticus 13-1 có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loài nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật, trong đó có Xoo [29] Chủng này

có khả năng kìm hãm sự phát triển của Xoo hiệu quả lên tới 69.7% Những thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy hiệu quả làm giảm sự có mặt của Xoo trên lúa từ 59.1-r73.5% Hiệu quả ức chế Xoo của chủng Lysobacter antibioticus 13-1 thử trên

các dòng lúa khác nhau có biến động tùy theo từng dòng lúa Thêm vào đó hiệu quả

ức chế này còn phụ thuộc vào từng chủng Xoo gây bệnh [29].

1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trong kiểm soát bệnh bạc lá lúa

Tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, TS Phan Thị Phương Hoa vàcộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn đang được lưu giữ tại Bảo tàng giốngchuẩn Vi sinh vật (VTCC) và tìm được 167 chủng được lựa chọn với khả năng

kháng cao nhất cả hai chủng kiểm định Micrococcus luteus NBRC 13867 và Escherichia coli NBRC 14237 [23] Các chủng xạ khuẩn này được tiếp tục sàng lọc khả năng kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 và R10 do PGS TS Phan Hữu

Tôn (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) và cộng sự phân lập Trong số 167

chủng xạ khuẩn này, 17 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo Để nghiên cứu khả năng kháng đặc hiệu đối với Xoo của các 17 chủng xạ khuẩn, các

chủng vi sinh vật Bacillus subtilis NBRC 3134, Saccharomyces cerevisiae NBRC

10217, Azotobacter sp VTCC - B - 106 và Pseudomonas putida VTCC - B - 657

được sử dụng 5 chủng VN06 A 353, VN08 A 306, VN08 A 352, VTCC

-A - 99, VN10 - -A - 44 và VN08 - -A12 có tính đặc hiệu cao với Xoo, chúng chỉ ức

chế một loại vi sinh vật kiểm định Trong số đó, chủng VN08 - A12 sinh trưởng tốt

nhất và không gây ức chế những vi sinh vật có lợi như Azotobacter sp (VTCC B

-106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657) Những thử nghiệm ngoài đồng ruộng trên 2 giống lúa Oryza sativa L SS1 và Oryza sativa L KD18 cho thấy dịch nuôi cấy của chủng VN08 - A12 làm giảm đáng kể tổn thương do Xoo gây ra trên lá lúa [23].

Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung nghiên cứu các

đặc điểm sinh học để phân loại và phân tích hoạt chất kháng Xoo do chủng

VN08-A12 sinh ra

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Các chủng Xoo

10 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam đã nhận

được từ PGS TS Phan Hữu Tôn và cộng sự (trường Đại Học Nông Nghiệp Hà

Nội) Danh sách và nơi phân bố của 10 chủng vi khuẩn Xoo trên được trình bày

trong bảng 3 và hình 6

Bảng 3 Danh sách 10 chủng Xoo phân lập được ở miền Bắc Việt

Nam được sử dụng trong nghiên cứu

1 R1 Khang dân, Bắc thơm 7 Bắc Ninh, Hà Nội

3 R3 Nhị ưu 838, Hương cốm Nghệ An, Thái Bình

5 R5 Khang dân, Bắc thơm Nghệ An, Hải Dương

Hình 6 Bản đồ phân bố của 10 chủng Xoo ở miền Bắc Việt Nam được sử dụng

trong nghiên cứu

2.1.1.2 Các chủng xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 được phân lập năm 2008 hiện đang đượclưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật học (VTCC), Viện Vi sinh vật vàCông nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội

- Fusarium oxysporum (ATCC - 7601)

- Staphylococcus aureus (ATCC - 29923)

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

- Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose đượcmua từ hãng Merck (Đức)

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, MnCl2, Na2CO3, ZnCl2, ZnSO4 được nhập từ các hãngcủa Trung Quốc.

- Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone của hãng Merck (Đức)

- Các loại hóa chất khác như thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) được sản xuất ở Nhật, Trung Quốc, Việt Nam

- Các dung môi như ethanol, iso - propanol, methanol, acetone, ethylacetateđược mua từ hãng Fisher (Mỹ)

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)

- Kính hiển vi điện tử Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan)

- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam

2.1.2.3 Môi trường nghiên cứu

+ Môi trường 2M (g/ l): tinh bột - 20, bột đậu tương - 15, cao nấm men - 2, CaCO3

+ Môi trường A - 3M g/l): glucose - 5, glycerol - 20, tinh bột - 20, pharmamedia -

15, cao nấm men - 3, Diaion HP - 20 - 10, pH 7,0

+ Môi trường A - 16 (g/ l): glucose - 20, pharmamedia - 10, CaCO3 - 5

+ Môi trường SKS (g/ l): tinh bột - 10, glucose - 10, bột đậu tương - 10, peptone -

5, CaCO3 - 3

+ Môi trường YS (g/l): cao nấm men - 2, tinh bột - 10, thạch - 16

+ Môi trường PSA (g/ l): Khoai tây - 300, Na2HPO4 - 2, Ca(NO3)2 - 0.5, pepton - 5,sucrose - 15, thạch - 16, pH 7,0

+ Môi trường YM (g/ l): Glucoza - 10, pepton - 5, cao nấm men - 3, cao malt - 3, thạch - 15

+ Môi trường thạch thường (g/ l): Pepton - 5, cao thịt - 2, NaCl - 1, thạch - 15, pH –7,0

+ Môi trường Muller - Hinton (g/l): Cao thịt - 3 ; casein thuỷ phân – 17,5; tinh bột tan – 1,5; thạch 17; pH 7,4 + 0,2

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật

2.2.1.1 Phương pháp thỏi thạch

Vi sinh vật kiểm định được nuôi trên môi trường Muller - Hinton, PSA,

YM, hoặc thạch thường Dịch nuôi vi sinh vật kiểm định (1 - 5 ml/ l) được thêmvào môi trường đã khử trùng và để nguội đến 40 - 45C và đổ ra đĩa petri Sau đócác thỏi thạch có xạ khuẩn được đặt lên đĩa, ủ ở 30oC trong 24 giờ Hoạt tính kháng

vi sinh vật được đánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh thỏi thạchtheo công thức D - d (D: đường kính vòng kháng trên đĩa thạch, d: đường kính của

lỗ đục) (mm)

2.2.1.2 Phương pháp đục lỗ thạch

Môi trường chứa vi sinh vật kiểm định được chuẩn bị như trong phương phápthỏi thạch Sau đó, 4 - 5 lỗ trên đĩa thạch được tạo bằng khoan đục lỗ 100 µl dịchnuôi hoặc mẫu được nhỏ vào mỗi lỗ, ủ ở 30oC trong 24 giờ Khả năng ức chế đượcđánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh lỗ, theo công thức D - d (mm)

2.2.2 Phân loại bằng đặc điểm hình thái

2.2.2.2 Hình thái chuỗi sinh bào tử và bề mặt bào tử

Hình thái chu i sinh bào t đỗi sinh bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học ử được quan sát dưới kính hiển vi quang học ược quan sát dưới kính hiển vi quang họcc quan sát dưới kính hiển vi quang họci kính hi n vi quang h cển vi quang học ọc

s d ng phử được quan sát dưới kính hiển vi quang học ụng phương pháp cắm lamen nghiêng 45 ương pháp cắm lamen nghiêng 45ng pháp c m lamen nghiêng 45ắm lamen nghiêng 45 oC trên đĩa th ch YS đã c yạch YS đã cấy ấy

ch ng x khu n, 30ủng xạ khuẩn, ủ ở 30 ạch YS đã cấy ẩn, ủ ở 30 ủng xạ khuẩn, ủ ở 30 ở 30 oC trong 7 - 14 ngày

Ngoài ra, chuỗi bào tử và bề mặt bào tử cũng được quan sát dưới kính hiển

vi điện tử quét qua các bước sau:

- Cố định mẫu: Đặt thỏi thạch có bào tử xạ khuẩn lên lam kính nghiêng 45oC trong bình có chứa osmium oxide 2% trong 2 - 3 giờ

- Rửa mẫu: Mẫu được rửa lần lượt bằng ethanol ở các nồng độ 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 95% và 100% trong 15 phút Sau đó, mẫu được ngâm trong isopentylacetate 100% trong 12 giờ

- Làm khô mẫu: Mẫu được làm khô bằng thiết bị có phun ngập khí nitơ trong

20 phút

- Quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét

2.2.3 Hóa phân loại

2.2.3.1 Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào

Chuẩn bị thành tế bào: Tế bào ướt (1 - 2 ml) + 5 ml nước cất vô trùng + hạt

thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đường kính 0, 11 - 0, 12 mm) Phá tế bào bằng sóng siêu

âm ca.180 trong 1 - 1,5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong Ly tâm với tốc độ

10000 vòng/ 30 phút Bỏ dịch trên Thêm 3 ml SDS 4% Giữ ở 100oC trong 40 phút

Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút trong 30 phút ở 30oC loại bỏ dịch trên Rửa vớinước ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000 vòng/ phút trong 30 phút) Đôngkhô qua đêm

2 - 3 mg thành tế bào được bổ sung 200 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil HCl 4 N, ủ ở 100oC qua đêm.Mẫu được làm khô bằng hút chân không (khoảng 24 giờ) Thêm 200 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil nước cất,chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút trong 5 phút Dịchtrên được thu và lọc qua màng lọc

Phân tích mẫu bằng sắc ký bản mỏng TLC: Mẫu (3 - 5 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil) và các axit aminchuẩn (1 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil) DAP, Ala, Gly, Glu, Lys được chấm lên bản sắc ký cellulose (phụ lục1) Bản sắc ký được nhuộm bằng ninhydrin ở 100oC trong 5 phút Các axit amin sẽhiện lên dưới dạng các chấm màu tím

Phân tích mẫu bằng HPLC: 10 - 20 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil mẫu và các axit amin chuẩn (25 nmol)được làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ, thêm 20 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil Ethanol/ DW/Triethylamine 2/ 2/ 1, làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ Thêm 20 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vilEthanol/ DW/ Triethylamine/ Phenylisothiocyanate 7/ 1/ 1/ 1, giữ ở nhiệt độ phòngtrong 20 phút, làm khô bằng hút chân không trong 2 giờ Mẫu được hòa tan bằng0,5 ml dung dịch A và được phân tích bằng HPLC (phụ lục 1)

2.2.3.2 Phân tích thành phần menaquinone

100 - 500 mg tế bào khô được hòa tan trong 10 - 15 ml Chloroform:methanol (2: 1), trộn bằng khuấy từ chậm trong 3 giờ Ly tâm 3000 vòng/ phút

trong 10 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng cô quay Hòa tan bằng 1,5 ml acetone,làm khô bằng hút chân không.

Mẫu được hòa tan bằng 50 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil ethanol, chấm lên bản gel silica Menaquinoneđược phát hiện bằng tia UV, sau đó được cạo ra chuyển vào ống eppendorf, thêm1,5 ml acetone, ly tâm 3000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằngnitơ lỏng Thêm 50 - 100 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và khối phổ(MS) (phụ lục 2)

2.2.3.3 Phân tích thành phần axit béo

5 mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1 ml, vortex 5 - 10 giây, giữ ở 100oCtrong 5 phút, vortex 5 - 10 giây, giữ tiếp ở 100oC trong 25 phút, để nguội xuốngnhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80oC Thêm 2

ml dung dịch methyl hóa (R2) giữ ở 80oC trong 10 phút Thêm 3 ml dung dịch tách(R3) trộn đều, loại bỏ lớp dưới Thêm 3 ml dịch rửa (R4), ly tâm 2000 vòng/ phúttrong 3 phút, chuyển 2/3 lớp trên sang ống đựng mẫu Mẫu được phân tích bằng sắc

ký khí (hệ thống MIDI)

2.2.3.4 Phân tích thành phần G+C trong ADN

25 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil ADN (2 - 25 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vig) giữ ở 60oC trong 1 giờ, giữ ở 100oC trong 2 phút,chuyển lên đá Thêm 25 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil đệm acetate (phụ lục 5), giữ ở 37oC trong 1 giờ Thêm

25 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil đệm Glycine (0,1 M, pH 10,4) và 2 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil alkaline photphatase (0,35 U/ μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vil), giữ ở

37oC trong 1 - 2 giờ Phân tích bằng HPLC (phụ lục 4)

2.2.4 Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S – rADN

Tế bào xạ khuẩn thu từ 1,5 ml dịch nuôi cấy được hòa tan trong 100 l TE,thêm 0,4 mg lysozyme, ủ 37oC trong 1 giờ Thêm 100 l SDS 10% (w/v), ủ 37oCtrong 30 phút Thêm 8 l ARNase 3 mg/ ml, ủ ở 37oC trong 30 phút Thêm 12 l

proteinase K (5 mg/ ml), ủ 15 phút ở 56oC Thêm 1 V phenol: chloroform: isoamylalcohol (P: C: I = 25: 24: 1), ly tâm 15000 vòng/ phút, 15 phút, thu lớp dịch trên.Thực hiện bước này 3 lần Thêm 1/ 10 V natri acetate 3 M và 2,5 V ethanol 100%,đặt trong đá 30 phút Ly tâm 15000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn, rửa bằngethanol 70% Làm khô, hoà tan trong 50 l TE.

Thành phần phản ứng (l): 10X buffer - 10; dNTP 2 mM - 10; mồi 27F (10pM) - 2; 1525R (10 pM) - 2; Taq polymerase (5u/l) - 2; ADN khuôn (50 - 100g/

 Phản ứng khuếch đại ADN cho đọc trình tự

Thành phần Terminator Ready Reaction Mix (Termix): Buffer 5X - 9 l, Bigdye Ready Reaction premix -18 l, H2O - 9l

Thành phần phản ứng PCR: Termix - 8 l, dNTP 2 mM - 10, Mồi - 1 l, ADNkhuôn - 1 l (nồng độ ADN là 40 - 60 g/ ml), H2O - 10 l

- Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen:

mẫu lên đá Mẫu được đọc trình tự bằng máy ABI 3100 Avant.

 Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của ADNr 16S được phân tích bằng phần mềm CLUSTAL W Cáctrình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữliệu của DDBJ, EMBL, GenBank Cây phát sinh được xây dựng theo phương phápcủa Saitou và Nei (1987) với độ lặp lại 1000 lần trên phần mềm ClustalX2 vàClustalW2

2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn

2.2.5.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Chủng VN08 - A12 (3% giống cấp 1) được nuôi trong 25 ml của 6 môitrường: 3M, 16M, 2M, 301, N8, SKS trong bình tam giác 250 ml, lắc ở 150 vòng/

phút trong 4 ngày Dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo

phương pháp đục lỗ thạch

2.2.5.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp

Chủng VN08 - A12 được nuôi cấy như trên trong môi trường SKS Dịch

nuôi cấy (1 ml) được thu sau 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày, thử hoạt tính đối kháng Xoo R2

theo phương pháp đục lỗ thạch

2.2.5.3 Lựa chọn thể tích nuôi cấy thích hợp

Chủng VN08 - A12 (3% giống cấp 1) được nuôi trong 25, 50, 75, 100, 125,

150 ml môi trường SKS trong bình tam giác 250 ml, lắc 150 vòng/ phút trong 4

ngày Dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt tính kháng Xoo R2 theo phương pháp

đục lỗ thạch

2.2.5.4 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy

Chủng VN08 - A12 được nuôi trong môi trường SKS, lắc 150 vòng/ phút ởcác nhiệt độ 25, 30, 35, 40oC trong 4 ngày Dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt

tính kháng Xoo R2 theo phương pháp đục lỗ thạch.

2.2.5.5 Lựa chọn cách cấy giống

Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 được cấy bằng các cách khác nhau: giống cấp

1, giống cấp 2 và bào tử (1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108 bào tử/ ml), lắc

150 vòng/ phút ở 30oC trong 4 ngày Dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt tính

kháng Xoo R2 theo phương pháp đục lỗ thạch.

2.2.6 Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo

2.2.6.1 Tách dịch chiết thô

Dịch nuôi cấy (100 ml) được ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 10 phút, thudịch trong Thêm 50 ml ethylacetate, lắc đều, ly tâm ở 4oC vận tốc 8000 vòng/ phúttrong 10 phút Thu lớp dịch phía trên, bổ sung khoảng 0,02 g Na2SO4, lắc đều, lọclấy dịch trong, cô đến khô, hòa tan lại bằng 1 ml methanol

2.2.6.2 Tinh sạch bằng silica gel

Silica gel (20 ml) hòa vào hexan và nhồi vào cột Các dung môi cần sử dụng:(1) Hexan 100%

(2) 80% Hexan: 20% ethyl acetate