Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú epinephelus SP phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp 07

Vì vậy việc phát triển và ứng dụng các chế phẩm sinh học, đặc biệt là vắc xintrong NTTS có ý nghĩa cấp thiết trong việc quản lý dịch bệnh đạt hiệu quả cao hơn.Bên cạnh sự phát triển nhan

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



-MẪN HỒNG PHƯỚC

NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ Epinephelus sp PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI

TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Tâm

PGS.TS Võ Thị Thương Lan

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành vàsâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Tâm và PGS.TS Võ Thị Thương Lan, đã hướng dẫntận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính cũng như phươngpháp từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11-15 Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộKhoa Sinh học, Phòng Sau đại học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên -ĐHQGHN, đặc biệt là tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học

- Viện Đại học Mở Hà Nội đã chia sẻ khó khăn, giúp tôi triển khai các nội dung của

đề tài

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, gia đình, bạn bè

đã động viên và nhiệt tình ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Tác giả luận văn

Mẫn Hồng Phước

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ 4

1.1.1 Cá mú 4

1.1.2 Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN) 6

1.1.3 Tình hình dịch bệnh VNN 7

1.1.4 Phòng và điều trị bệnh VNN 9

1.2 VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS VIRUS -NNV) 10

1.2.1 Nguồn gốc 10

1.2.2 Bộ gen của Betanodavirus 10

1.2.3 Cơ chế gây bệnh của Betanodavirus 13

1.3 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG VÀ VẮC XIN PHÒNG BỆNH VNN CHO CÁ MÚ 16

1.3.1 Đáp ứng miễn dịch ở cá xương 16

1.3.2 Một số kết quả nghiên cứu vắc xin phòng bệnh VNN ở cá mú 19

1.3.3 Các loại vắc xin sử dụng cho cá 20

1.3.4 Nguyên tắc dùng vắc xin cho cá 22

1.4 MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT GEN 25

1.4.1 Các enzyme sử dụng trong kỹ thuật gen 25

1.4.2 Vector plasmid 27

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 30

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.1.2 Các sinh phẩm 30

2.1.3 Hóa chất 30

2.1.4 Môi trường và dung dịch 31

2.1.5 Thiết bị 32

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Phương pháp tách dòng 33

2.2.2 Phương pháp biểu hiện 41

2.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 46 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA NNV 52

3.1.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số 52

3.1.3 Kết quả tách dòng gen 55

3.1.4 Biến nạp vector tái tổ hợp pGEMT-T4 Easy vào E coli JM109 56

3.1.5 Kiểm tra bằng PCR và phản ứng cắt của enzyme giới hạn 57

3.1.6 Kết quả giải trình tự gen T4 mã hóa kháng nguyên vỏ của NNV 59

3.2 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CỦA NNV 61

3.2.1.Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 61

3.2.2 Biểu hiện gen T4 trong vi khuẩn E coli BL21(DE3) 66

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO KHÁNG THỂ CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP 72

3.3.1 Kết quả đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ 72

3.3.2 Kết quả đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 79

PHỤ LỤC 87

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Bốn kiểu gen chính của Betanodavirus 12

Bảng 2.1 Mồi khuếch đại gen T4 30

Bảng 2.2 Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu 32

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt gen T4 36

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 và pGEM - T 37

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 39

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng xử lý pGEM - T/T4 bằng enzyme hạn chế 40

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 vào pET-32a(+) 42

Bảng 3.1 So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen T4 thu được 59

Bảng 3.2 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở hệ thống in vitro 73

Bảng 3.3 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở mô hình in vivo 73

Bảng 3.4 Kết quả xác định hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus 75

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Một số loài cá mú nuôi chủ yếu 4

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của Betanodavirus 10

Hình 1.3 Cấu trúc gen của Betanodavirus 11

Hình 1.4 Sơ đồ pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen 28

Hình 1.5 Plasmid pET-32a + .28

Hình 2.1 Quy trình tách dòng gen T4 33

Hình 2.4 Quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV 41

Hình 2.5 Quy trình đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 46 Hình 3.1 Biểu hiện của cá mú khi mắc bệnh hoại tử thần kinh 52

Hình 3.2 Kết quả điện di RNA tổng số 53

Hình 3.3 Kết quả RT-PCR của 10 mẫu RNA tổng số 54

Hình 3.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm RT-PCR 55

Hình 3.5 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEMT- T4 56

Hình 3.6 Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường LB có Ampicilin, chất chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG 57

Hình 3.7 Tách plasmid từ khuẩn lạc trắng 57

Hình 3.8 Điện di PCR kiểm tra sự mang gen T4 của plasmid tách được 58

Hình 3.9 Điện di sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra sự mang gen T4 của plasmid tách được bằng EcoRI 58

Hình 3.10 So sánh độ tương đồng của đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4 của Betanodavirus mã số HM017077.1 61

Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+- T4 62

Hình 3.12 Cắt vector pGEMT-T4(A) và vector pET32a+ (B) bằng enzyme EcoRI63 Hình 3.13 Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 và vector pET32a + .64

Hình 3.14 Đĩa khuẩn lạc thu được sau khi chuyển gen pET32a + -T4 vào E coli JM109 64

Hình 3.15 Điện di đồ kiểm tra sự tạo thành vector pET32a+-T4 trong vi khuẩn E coli JM109

Hình 3.16 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong vector tái tổ hợp 65

Hình 3.17 Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a+-T4 vào E.coli BL21 66

Hình 3.18 Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E coli BL21(DE3) mang vector pET32a+-T4 67

Hình 3.19 Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả năng biến nạp vector tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) 67

Hình 3.20 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% các mẫu thuộc dòng số 1 và 2 68

Hình 3.21 Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng số 3, 4 69

Hình 3.22 Kết quả Westen blot của protein tái tổ hợp T4 71

Hình 3.23 Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE 72

: Grouper spleen: Indirect fluorescent antibody test: isopropyl β-D- thiogalactoside: Nervous necrosis virus

: Non coding region: Open reading frame: Red spotted grouper nervous necrosis virus: Stripped jack nervous necrosis virus

: Ultraviolet light: 50% Tissue culture infective dose: Viral nervous necrosis

: Tris Buffer Saline: TBS - Tween

: Lubria – Bertani: Phosphate buffer: Immunoglobulin G

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm pháttriển nhanh nhất trên thế giới Ở Việt Nam, nghề nuôi trồng thủy sản đã khôngngừng phát triển và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong ngành Thủy sản nóiriêng và kinh tế đất nước nói chung Với kim ngạch xuất khẩu năm 2010 đạt 4,94 tỷUSD thì đây là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho tổng kim ngạch xuấtkhẩu của Việt Nam Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn)cho biết, giai đoạn 2011 – 2015 ngành Thủy sản hướng đến sự phát triển bền vững,

là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn, có khả năng cạnh tranh cao và hội nhập vữngchắc với thế giới Mục tiêu quan trọng hàng đầu là đẩy mạnh xuất khẩu đạt kimngạch 6,5 tỷ USD vào năm 2015 và chiếm khoảng 37% trong khối nông lâm ngưnghiệp Vì vậy việc quản lý dịch bệnh trên các đối tượng chủ lực là yếu tố quantrọng để đạt được mục tiêu trên Tuy nhiên hiện tại nghề NTTS tại Việt Nam đanggặp phải những trở ngại lớn như dịch bệnh xuất huyết trên cá rô phi, bệnh đốm đỏtrên cá trắm cỏ, bệnh đốm trắng trên tôm sú, bệnh virus trên cá biển (cá mú, cáchẽm, cá bơn)…[3] Để quản lý các dịch bệnh trên các đối tượng quan trọng, nhiềugiải pháp đã được đặt ra như: lựa chọn các con giống sạch bệnh, quản lý tốt môitrường, dinh dưỡng, sử dụng thuốc và hóa chất, tuy nhiên chưa mang lại hiệu quảcao Vì vậy việc phát triển và ứng dụng các chế phẩm sinh học, đặc biệt là vắc xintrong NTTS có ý nghĩa cấp thiết trong việc quản lý dịch bệnh đạt hiệu quả cao hơn.Bên cạnh sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi cá nước ngọt thì nghề nuôi cáven biển và cá biển vẫn khẳng định được vai trò của mình Trong đó, đối tượng cá

mú với những ưu điểm như cá có giá trị kinh tế cao, thịt thơm, ngon đang đượcquan tâm phát triển Tuy nhiên, khi phát triển nuôi cá mú với mật độ cao và nuôithâm canh thì cũng phát hiện một số bệnh ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng

cá Qua nghiên cứu, người ta đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên

cá mú thường là virus, nấm, vi khuẩn mà trong đó nguy hiểm nhất là bệnh hoại tửthần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và võng mạc (VER-Viral

Encephalopathy) do Betanodavirus còn gọi là Piscine nodavirus gây ra Chúng gây

bệnh trên cá mú ở tất cả các độ tuổi, song thường gặp nhiều nhất ở giai đoạn ấutrùng (từ 10-25 ngày tuổi) và cá giống Biểu hiện lâm sàng là cá bỏ ăn, bơi lờ đờtrên mặt nước, bơi không định hướng Não xung huyết, cá nhiễm bệnh có biểu hiệnrối loạn về thần kinh như: bơi không bình thường, lòng vòng không định hướng,mất thăng bằng, đầu chúc xuống dưới Cá bệnh ít hoạt động, đầu treo trên mặt nướchoặc nằm dưới đáy bể, đáy lồng Cá chết sau 3-5 ngày có dấu hiệu bệnh với tỷ lệcao, có thể từ 80-100% Ở nước ta, bệnh xuất hiện ở hầu hết các vùng nuôi cá mútrên cả nước từ tháng 5-10, đặc biệt khi mưa nhiều, khi nhiệt độ khoảng 25-30ºC

Tỷ lệ chết do bệnh gây ra dao động từ 50- 100% tùy thuộc vào loài và giai đoạnxuất hiện bệnh [4]

Từ tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăngđòi hỏi các biện pháp phòng bệnh hiệu quả Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễndịch khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó vắc xin phòng bệnh cho cá là giải pháphữu hiệu Ở nước ta hiện tại vắc xin sử dụng để phòng bệnh cho cá mú là vắc xinbất hoạt, tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt khoảng 60-65% Vì vậy, cần có một vắc xin có hiệulực cao hơn, đem lại khả năng phòng bệnh tốt hơn, giúp giảm thiểu sự thất thoát dobệnh Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng đến việc tạo ra chủng vi khuẩn tái tổhợp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV làm tiền đề cho việc

nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh cho cá mú, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú Epinephelus sp phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Nghiên cứu gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp T4 của virus phục vụ côngtác chẩn đoán và nghiên cứu nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh hoại tử thầnkinh ở cá mú

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T4 của virus gây bệnh hoại

tử thần kinh (NNV) ở cá mú

(2) Biểu hiện gen thành công kháng nguyên bề mặt của NNV trong tế bào vi

khuẩn E.coli BL21(DE3).

(3) Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp:

- Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợptrên thỏ

- Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợptrên cá mú

NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ

Cá mú chấm tổ ong (E merra) Cá mú bleekeri (Epinephelus bleekeri)

Hình 1.1 Một số loài cá mú nuôi chủ yếu

Cá mú là loại cá nước mặn, sống tại những vùng nước ấm, phân bố chủ yếu

ở vùng biển nhiệt đới và á nhiệt đới, tập trung nhiều loài ở vùng biển Thái BìnhDương Theo Viện Hải dương học Nha Trang, nước ta có khoảng trên 30 loài cá

mú vạch (E brunneus), cá mú chấm tổ ong (E merra), cá mú đỏ (E akaara), cá mú hoa nâu (E fuscoguttatus), cá mú cáo (E megachir), cá mú đen (E heeberi), cá mú

mỡ (E tauvina) Vùng biển Bắc Bộ có cá mú mỡ, cá mú đen, cá mú cáo Vùng biển

miền Trung có cá mú đỏ Vùng biển Đông và Tây Nam Bộ có cá mú đỏ, cá mú mỡ.Ngoài ra, cũng còn nhiều loài có giá trị cao nhưng chưa được đưa vào nuôi phổ

biến, chủ yếu có được là do đánh bắt như cá mú nghệ (E lanceolatus).

Nhiệt độ thích hợp cho cá mú là từ 22 - 28oC, thích hợp nhất là từ 25 - 28oC.Chúng thường sống ở các hốc đá, các áng, vùng ven bờ quanh các đảo có rạn đá san

hô, nơi có độ sâu từ 10 - 30 m, chịu đựng được độ mặn rộng từ 11 - 41‰ Cá múthuộc loài cá dữ, có tính ăn thịt và bắt mồi theo phương thức rình mồi, thường sănmồi ở nơi yên tĩnh Cá con mới nở ăn động vật phù du, cá lớn cỡ từ 8 - 12 cm ănđộng vật sống (cá con, tôm, tép ), cá mú rất ít khi ăn mồi đã chết và mồi chìm ởđáy

Ở cá mú có sự chuyển đổi giới tính đực cái Thông thường lúc còn nhỏ chúng là

cá cái, nhưng khi đạt đến kích cỡ và tuổi nhất định thì chuyển thành cá đực Tuy nhiên,

vẫn có một số ít không có sự chuyển đổi giới tính Cá mú có thể đẻ quanh nămnhưng tập trung vào những tháng lạnh, nhiệt độ thấp, vì thế ở từng vùng khác nhau,mùa vụ xuất hiện cá giống cũng khác nhau Sức sinh sản của cá khá cao, mỗi concái có thể đẻ từ vài trăm ngàn đến vài triệu trứng Tại Việt Nam, nguồn cá giống chủyếu được đánh bắt ngoài tự nhiên vào tháng 5 đến tháng 7 ở miền Bắc và tháng 1đến tháng 3 ở miền Trung, ngoài ra có thể nhập khẩu từ Đài Loan, Philippines,Trung Quốc… Năm 2005, Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản TW2 chính thứcthông báo ương giống thành công loài cá mú đen chấm đỏ Hiện tại, một số trungtâm giống cũng tự sản xuất được một lượng giống nhất định nhưng còn rất ít so vớinhu cầu giống của thị trường nội địa [64]

Cá mú có giá trị kinh tế rất cao, giá thị trường hiện nay đối với loài cá múđen và cá mú hoa nâu là 200.000 - 300.000 đồng/kg (kích cỡ từ 800 g - 1 kg) Với

cá mú chấm đỏ loại này có giá 400.000 - 500.000 đồng/kg [65] Vì vậy, hiện nay

ngoài việc đánh bắt tự nhiên, phong trào nuôi cá mú lồng bè cũng rất phát triển Cá

mú có thể được nuôi trong các lồng tre, bè gỗ có phủ lưới, được đặt cố định hay thảnổi ở các vùng biển ít gió bão, sóng nhẹ như các vịnh, đầm phá Tuy nhiên, cá múthường gặp một số bệnh do vi sinh vật gây ra như: bệnh đốm đỏ, bệnh hoại sơ,bệnh đường ruột, bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết…[3] Một trong những bệnhnguy hiểm nhất do vius gây ra là bệnh hoại tử thần kinh, thường xảy ra ở giai đoạn

ấu trùng và cá giống Cá bị bệnh thường có tỉ lệ chết cao và nhanh Hiện nay chưa

có thuốc đặc trị đối với bệnh này, biện pháp chủ yếu vẫn là phòng ngừa bằng cáchđảm bảo vệ sinh và cách ly với các nguồn virus tiềm tàng

1.1.2 Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN)

Bệnh hoại tử thần kinh hay gọi là bệnh não và võng mạc do Betanodavirus còn gọi là Piscine nodavirus gây ra [66] Virus này ký sinh trong tế bào chất của tế

bào thần kinh trong não và trong võng mạc mắt Bệnh xuất hiện ở nhiều loài cá biển

và phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau [22] Những chi tiết đầu tiên mô

tả về bệnh vào những năm 1989 - 1991, bệnh được phát hiện gần như đồng thời tại

Úc, Na Uy, Pháp và Nhật Bản [14],[15],[28],[41] Bệnh VNN sau đó đã được pháthiện trên 30 loài cá biển thuộc 14 họ trên vùng biển Thái Bình Dương, khu vực ĐịaTrung Hải, Scandinavia và Bắc Mỹ [24] Bệnh thường gặp ở cá nuôi lồng như cá

mú điểm đai (Epinephelus malabaricus) Thái Lan, cá mú mỡ (E tauvina) Singapore, cá mú vân mây (E moara), cá mú chấm đỏ (E akaara) - Nhật Bản, cá

-mú bảy sọc (E septemfasciatus) - Hàn Quốc, cá -mú lưng gù (Cromileptes altivelis)

- Indonesia Khi nhiễm bệnh, cá thường bỏ ăn, bơi lội mạnh không định hướng, đầuchúc xuống dưới, chết rải rác, có sự xung huyết trong não mà có thể nhìn thấyđược Cá chết và hấp hối hầu hết đều có bóng hơi trương phồng Cá chết sau 3 - 5ngày có dấu hiệu bệnh, tỷ lệ chết 70 - 100% ở cá hương (2,5 - 4 cm), khi cá lớn (15

cm) tỷ lệ chết giảm còn 20% Ở Việt Nam, các loài cá mú (Epinephelus spp) nuôi

lồng thường gặp bệnh hoại tử thần kinh Bệnh phát từ tháng 5 đến tháng 10, đặcbiệt khi mưa nhiều, nhiệt độ thích hợp cho bệnh phát triển là từ 25 - 30oC [67]

Trong những năm gần đây, VNN đã thực sự trở thành mối đe dọa đối vớingành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới Năm 1994 - 1995, bệnh này đã gây chết 80

- 90% cá bột và cá giống loài E akaara ở Nhật Fukuda và cộng sự (1996) cũng khẳng định rằng Nodavirus chính là tác nhân gây bệnh cho E.septemfasciatus ở Nhật,

bệnh thường xảy ra khi nhiệt độ cao (tháng 7 - 8) Bệnh VNN cũng được báo cáo tại một

số nước khác: Tại Thái Lan, bệnh thường xảy ra trên cá mú

E.malabaricus, gây chết 100% nếu cá ở giai đoạn nhỏ, cá lớn chết 20% (Danaxado

và cộng sự, 1995), bệnh có thể xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cánhưng khả năng nhiễm bệnh nặng nhất là giai đoạn ấu trùng dưới 20 ngày tuổi; TạiTriều Tiên, bệnh có thể gây chết tới 80% số cá chỉ trong một vài tuần (Salem vàcộng sự, 1996) [7]

1.1.3.2 Tình hình dịch bệnh VNN ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số loài cá thuộc họ cá mú cũng đã phát hiện thấy sự hiện

diện của VNN Trong đó có các loài: E coioides, E fuscogutatus, E tauvina, E lanceolatus, E malabaricus ở Khánh Hoà; loài E coioides ở Cát Bà (Hải Phòng) và

Cửa Hội (Nghệ An)

Bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển tại Việt Nam được báo cáo lần đầu tiên

vào năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng ở Hạ Long - Quảng Ninh.

Kết quả điều tra ở huyện Vân Đồn, Quảng Ninh (2002) có số lồng bị bệnh BệnhVNN phát triển mạnh vào mùa có nhiệt độ cao, ở nhiệt độ 28oC độc lực của virusnày mạnh hơn nhiều so với nhiệt độ 16oC [67]

Ở Khánh Hòa (2008), có khoảng 30% hộ nuôi cá biển chịu tác hại của bệnhnày Giai đoạn cá nhỏ (5 - 20 cm) thường chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn Tỷ lệ chết

có thể đến 50 - 100% và đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng Cũng ở Khánh Hòa vào tháng

7 năm 2008, người ta đã phát hiện bệnh VNN trên cá mú cỡ 5 - 6 cm nuôi tại bè của trườngĐại học Nha Trang, bệnh lây lan rất nhanh và gây chết 100% cá trong vòng một tuần Khi cátrong lồng bị bệnh, người ta còn quan sát được một số loài cá khác sống xung quanh lồngcũng có dấu hiệu tương tự Kết quả điều tra sơ bộ của khoa Nuôi trồng thủy sản - Đại họcNha Trang cho thấy cá nuôi tại vùng biển Khánh Hòa thường gặp bệnh có dấu hiệu tương tựnhư bệnh hoại tử thần kinh [4]

Vào tháng 5/2010, tại hai khu vực nuôi cá mú nước lợ bằng lồng của chi hộinghề cá Hương Giang và chi hội nghề cá Thái Dương Thượng Tây thuộc xã HảiDương, huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế đã diễn ra hiện tượng cá mú đangnuôi từ một đến hai tháng tuổi chết hàng loạt, số lượng thiệt hại ước tính trên 25vạn con thả nuôi với tổng giá trị thiệt hại khoảng 450 triệu đồng Cá bị bệnh có dấuhiệu bỏ ăn, màu sậm, xương sống cong lên, mắt lồi, bơi lòng vòng, chết rất nhanh,chết đồng loạt

Theo số liệu của Nguyễn Ngọc Du và cộng sự, đối với cá mú nuôi tại VũngTàu, bệnh VNN thường xảy ra trên cá giống, 53/64 mẫu bị nhiễm bệnh (tương ứng82,8%), tỷ lệ chết do virus gây hoại tử thần kinh là từ 90 - 100% [2]

Một nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2006) về VNN trên

cá song chấm nâu tại tỉnh Hải Phòng và Nghệ An cũng cho thấy có dấu hiệu của VNNthông qua kết quả biểu hiện bệnh lý bên ngoài và kết quả nghiên cứu mô bệnh học [7]

1.1.4 Phòng và điều trị bệnh VNN

Bệnh VNN đã được phát hiện hơn 20 năm, nhưng những hiểu biết về cơ chếbệnh và dịch tễ học vẫn còn hạn chế, đó cũng có thể là một trong số các lý do khiếncho chưa có loại vắc xin nào đạt được hiệu quả mong muốn Vì vậy, những biệnpháp đảm bảo vệ sinh, tránh các nguồn lây nhiễm vẫn được coi như là biện phápchủ yếu để tránh gây thiệt hại lớn, cụ thể:

- Lựa chọn cá bố mẹ không mang virus bằng cách kiểm tra trứng cá trước khi cho cá đẻ bằng kỹ thuật PCR

- Sát trùng bể ương và dụng cụ bằng Chlorine 100 ppm 1 tuần/lần và rửa kỹlại bằng nước sạch trước khi sử dụng Khử trùng trứng đã thụ tinh bằng ozone,

ozone có thể trung hòa hoàn toàn những virus bám trên bề mặt của trứng, do đógiảm khả năng nhiễm bệnh cho ấu trùng, hàm lượng O3 là 1 g /lít trong 1 phút(Grotmol và Totland, 2000) [68] Ngoài ra, có thể sử dụng một trong số những hóachất diệt virus như: iodophor - loại dung dịch có hiệu quả ngay cả ở nồng độ thấp

25 - 100 ppm (Frerichs, 2000), (Maltese và Bovo, 2001) [27],[37]; dung dịchhypochlorite cũng có hiệu quả khá tốt (Arimoto, 1996) [9]

- Khoanh vùng, tiêu hủy những dìa nuôi, lồng nuôi có dấu hiệu của bệnh VNN; loại bỏ những đàn cá bột khi đã phát hiện VNN dương tính thông qua kỹ thuật PCR

- Tăng hoạt động trao đổi nước trong bể ương ấu trùng để đảm bảo môitrường tốt và loại bỏ bớt tác nhân gây bệnh Theo Munday và cộng sự (2002), nước đivào bể ương nên được xử lý với ozone và không quay vòng Tuy nhiên, nếu điều kiệnkhông cho phép thì chỉ nên tái sử dụng tối đa 1/2 lượng nước của bể [42] Xử lý nước đivào bể nuôi với tia UV cũng được nhiều tác giả khuyến cáo

- Đối với cá nuôi lồng bè trên biển, thả giống kích cỡ nhỏ mang lại hiệu quảkinh tế cao hơn, nhưng do nguy cơ của bệnh VNN gây tác hại lớn ở giống cỡ nhỏ, vì vậynên thả giống cỡ lớn để hạn chế tác hại của bệnh VNN

1.2 VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS

VIRUS - NNV)

1.2.1 Nguồn gốc

Virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) thuộc giống Betanodavirus, họ Nodaviridae Tên gọi Nodavirus được bắt nguồn từ tên của một ngôi làng ở Nhật Bản là Nodamura (hiện nay là thành phố Nodashi), nơi mà Nodavirus được phân

lập đầu tiên [52]

1.2.2 Bộ gen của Betanodavirus

1.2.2.1 Cấu trúc gen của Betanodavirus

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của Betanodavirus

Betanodavirus không có màng bao, hình cầu, đường kính 25 - 30 nm, 20 mặt

đối xứng, vỏ bao gồm 180 protein

Bộ gen của Betanodavirus là RNA mạch đơn, sợi (+), tuyến tính hai phía, có

cấu trúc phân đoạn gồm hai tiểu phần RNA-1 và RNA-2

- Tiểu phần lớn RNA-1 dài 3103 nucleotit mã hóa cho 2 protein: RNApolymerase phụ thuộc RNA hay gọi là protein A (chứa khoảng 982 axit amin, khối

lượng phân tử ước tính 110 kDa) và protein B (11 kDa)

- Tiểu phần nhỏ RNA-2 dài 1433 nucleotit mã hóa cho phân tử protein vỏlớn có kích thước 42 kDa Trên RNA-2 chứa một khung đọc mở mã hóa cho mộtprotein vỏ, có hai vùng bảo tồn cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp) [41],[53].

Hình 1.3 Cấu trúc gen của Betanodavirus

- Đôi khi bộ gen của Betanodavirus có sở hữu thêm một phân đoạn RNA-3.

RNA-3 là một hệ gen phụ (371 nucleotit) có chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóaprotein B2 (giả thuyết là một protein không cấu trúc, có chức năng ức chế sau phiênmã) [16],[25],[32],[56] RNA-3 được hình thành từ quá trình sao chép RNA-1, chỉ

có trong các tế bào bị nhiễm và không được đóng gói thành các hạt virus [39],[47]

1.2.2.2 Phân loại kiểu gen của Betanodavirus

Dựa trên tính tương đồng của một trình tự khoảng 421 bp trên RNA-2, type

huyết thanh, vật chủ đặc hiệu và nhiệt độ phát triển tối ưu ở điều kiện invitro, giống Betanodavirus được chia thành 4 kiểu gen chính (bảng 1.1) [33],[47],[48],[55].

Bảng 1.1 Bốn kiểu gen chính của Betanodavirus

Type

Nhiệt độ

tối ưu thanh

halibut, Atlantic cod, flounders

nervous necrosis virus)

RGNNV

Các loài cá nước ấm: Groupers,

(Red-spotted grouper C Asian seabass, European 25 - 30ºCnervous necrosis virus) seabass

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các kiểu gen khác nhau của Betanodavirus

phân bố theo các vùng địa lý khác nhau và tính gây bệnh cũng khác nhau:

- Kiểu gen BFNNV và TPNNV có nhiệt độ phát triển tối ưu thấp hơn 20ºC.Đây là kiểu gen gây bệnh đối với cá sống ở những vùng biển có nhiệt độ lạnh như:

12

- Kiểu gen SJNNV là kiểu gen mà bộ gen được nghiên cứu khá kỹ lưỡng ởcác nước Nhật Bản, Mỹ và Châu Âu Nhiệt độ thích hợp thường thấp hơn 25ºC Cá

bị bệnh chủ yếu là cá sọc

- Kiểu gen RGNNV là kiểu gen gây bệnh nhiều nhất ở các nước thuộc khuvực Thái Bình Dương Nghiên cứu của các tác giả ở nhiều quốc gia như: Trung

Quốc, Đài Loan, Philippines, Indonesia đều cho thấy Betanodavirus có kiểu gen

RGNNV gây bệnh trên các loài cá biển ở các quốc gia này Hệ gen của RGNNVđược giải trình tự đầy đủ vào năm 2003 cho thấy kích thước RNA-1là 3105 bp,trong đó từ nucleotit 79 đến 3027 là vùng ORF mã hóa cho protein A (RNA -dependent RNA polymerase), kế 2 bên là vùng 5' và vùng 3' không mã hóa (NCR -non coding region) với kích thước lần lượt là 78 bp và 76 bp Từ trình tự trên, khốilượng phân tử dự đoán của RNA-1 của RGNNV là khoảng 992.735 Da Vùng ORF

mã hóa cho protein A với khối lượng phân tử ước tính 110.420 Da Phân tử protein

A có kích thước 982 axit amin, cũng đã được giải trình tự đầy đủ Ngoài ra, từnucleotit 2753 đến 2980 là đoạn gen mã hóa cho protein B có kích thước 75 axitamin, kích thước protein này tương đương giữa nhiều loài NNV ở những kiểu genkhác nhau, vai trò của protein B trong quá trình tái bản của NNV chưa được làm rõ.RNA-2 của RGNNV có kích thước 1434 bp, trong đó từ nucleotit 27 đến 1043 mãhóa cho protein vỏ của virus có kích thước 338 axit amin Hai vùng 5' NCR và 3'NCR có kích thước lần lượt là 26 nucleotit và 390 nucleotit Khối lượng phân tửước tính của RNA-2 là 459.025 Da và mã hóa cho protein capsid khối lượngkhoảng 37.004 Da [16],[36],[45],[58]

1.2.3 Cơ chế gây bệnh của Betanodavirus

1.2.3.1 Sự xâm nhập của virus

Những tổn thương mô bệnh học liên quan tới nhiễm Betanodavirus đều

chứng minh một cách rõ ràng rằng virus tấn công trước tiên vào hệ thần kinh trungương (CNS) và võng mạc, nơi có vị trí tái bản của nó Tuy nhiên còn có

những quan điểm khác nhau về con đường cũng như phương thức lây truyền củaNNV trong cơ thể cá.

Theo Nguyen và cộng sự (1996), một trong số những điểm tái bản đầu tiên

có thể là ở tủy sống Từ đó virus có thể tới não đầu tiên và sau đó là tới võng mạcthông qua dây thần kinh thị giác [46]

Munday (1992) và Grotmol (1999) lại đưa ra giả thuyết rằng lớp biểu môphân tầng của ruột trước có thể là điểm tái bản đầu tiên của virus Virus được đưavào thông qua nước và thức ăn, ở đây chúng dễ dàng tương tác và thông qua dâythần kinh sọ não, virus có thể được đưa đến não và gây bệnh tích điển hình tại đây[29],[43]

Ngoài ra, Mladineo (2003) còn phát hiện kháng nguyên ở thùy khứu giác,điều ấy cho thấy khoang mũi cũng có khả năng là một đường vào của virus bêncạnh đường qua mang, miệng, da (Peducasse, 1999) [40],[50]

Một số tác giả khác cũng cho biết, kỹ thuật IFAT cho phép phát hiện thấyvirus ở những cơ quan khác nhau của những cá thể cá sống sót sau dịch bệnh như:tuyến sinh dục, gan, thận, ruột, dạ dày nhưng lại không phát hiện thấy virus ở CNS

và võng mạc [26] Kết quả đó củng cố thêm giả thuyết về sự nhiễm virus của trứng

cá qua con đường tuyến sinh dục

1.2.3.2 Phương thức lây lan bệnh

Qua quan sát từ thực tế cùng với một số thí nghiệm dưới những điều kiệnđược kiểm soát, các nhà khoa học đều cho thấy tồn tại hai phương thức lây truyềnbệnh VNN: phương thức lây truyền theo chiều ngang và phương thức lây truyềntheo chiều dọc [29]

a) Sự truyền bệnh theo phương ngang

Là sự lan truyền virus trực tiếp từ những con cá bị bệnh sang những con khỏe hoặc gián tiếp thông qua thức ăn, dòng chảy lưu vực mang tới hay qua các vật dụng

Có rất nhiều nghiên cứu trên ấu trùng và cá bột của nhiều loài cá khác nhau

để xác nhận về những yếu tố liên quan đến con đường lây truyền theo phươngngang Các thí nghiệm lây nhiễm theo nhiều cách đã được thực hiện: lây nhiễmbằng cách nhốt chung các con cá khỏe mạnh với những con cá bệnh, lây nhiễmbằng cách ngâm cá trong nước có hòa dịch virus Kết quả đều cho thấy cá bị nhiễmbệnh và có tỉ lệ chết tùy thuộc hàm lượng virus cho thí nghiệm cao hay thấp Điều

đó cho thấy môi trường nước vẫn luôn là môi trường trung gian cho sự truyền virus

từ những con cá bị bệnh, xác chết thối rữa của chúng hay từ những nơi khác

Năm 1998, Skrilis và Richards đưa ra giả thuyết về khả năng nhiễm bệnh

thông qua thức ăn tươi hàng ngày như Artemia salina và Brachionus plicatilis,

những sinh vật phù du, tuyến trùng thường dùng làm thức ăn cho cá ở giai đoạn ấutrùng Nhưng những kết quả phân lập virus và kiểm tra mô học ở 2 loài trên đều chokết quả âm tính, vậy nên mới chỉ dừng lại ở giả thuyết rằng chúng chỉ có vai trò nhưnhững cá thể mang virus cơ học [54] Đến năm 2005, Chi và cộng sự đã chính thức

phân lập được virus từ nguồn thức ăn hàng ngày cho cá như: Artemia salina, Tigriopus japonicas, Acetesinte medius và khẳng định đó cũng là một trong những

nguồn lây nhiễm virus [19] Những nghiên cứu của Mori (2005) tiếp đó cũng đãcủng cố thêm cho nhận định trên Ngoài ra, việc những con cá trong cùng một bểnuôi ăn thịt lẫn nhau cũng được xem như là một con đường lây nhiễm virus [38]

b) Sự truyền bệnh theo phương dọc

Giả thuyết về sự lây truyền theo phương dọc được đưa ra khi Arimoto (1992)

phát hiện thấy virus ở trứng đã thụ tinh của striped jack bằng phương pháp ELISA

[8] Liên tục tiếp đó là những phát hiện tương tự bằng phương pháp PCR và IFATđược báo cáo Một số báo cáo cũng chứng tỏ sự truyền theo phương dọc đã được

phát hiện ở cá chẽm châu Âu, cá bơn Nhật Bản, cá chẽm châu Á [11],[21],[61]

1.3 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG VÀ VẮC XIN PHÒNG BỆNH VNN CHO CÁ MÚ

1.3.1 Đáp ứng miễn dịch ở cá xương

Đáp ứng miễn dịch là tập hợp một chuỗi các phản ứng của cơ thể chống lại

sự xâm nhập của bất kỳ một vật lạ bên ngoài nào dù có hại hay không có hại để bảo

vệ tính toàn vẹn của cơ thể

Ở cá xương, đáp ứng miễn dịch được chia làm hai loại: đáp ứng miễn dịch

tự nhiên (đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu) và đáp ứng miễn dịch thu được (đáp ứngmiễn dịch đặc hiệu)

1.3.1.1 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Miễn dịch tự nhiên được quy định bởi đặc tính của giống, loài Miễn dịch tựnhiên thường có sẵn khi cơ thể được sinh ra và nó được di truyền từ thế hệ nàysang thế hệ khác Đối với cá xương, miễn dịch tự nhiên được hình thành nhờ cáchàng rào bề mặt và các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu

a) Các hàng rào bề mặt

Dịch nhờn: là yếu tố đặc thù và được bao phủ toàn bộ cơ thể cá Dịch nhờn

không những giúp cá giảm ma sát khi vận động bơi lội mà còn đóng vai trò quantrọng trong việc bảo vệ cá chống lại sự xâm nhập của các vi sinh vật hay các vật lạ

từ môi trường vào cơ thể cá Do đó, nếu cá bị mất dịch nhờn thì sẽ mẫn cảm hơnvới tác nhân gây bệnh và dễ bị nhiễm bệnh hơn

Da: da cá tương đối khác với các động vật trên cạn là không hóa sừng nhưng có khả năng phục hồi rất nhanh do sự hình thành lớp tế bào Malpighi huy

động từ vùng lân cận Phản ứng phì đại các tế bào Malpighi và lớp biểu bì cũng rấtnhanh, giúp cho da trở thành một hàng rào vật lý tương đối vững chắc để bảo vệ cơthể Ngoài ra, ở cá có vẩy thì chính hệ thống này sẽ bảo vệ da và cơ thể cá đượcvững chắc hơn

Mang: là cơ quan đặc biệt và khác hẳn với các động vật trên cạn Mang là

nơi thực hiện quá trình hô hấp cơ bản của cá, cũng là nơi tiếp xúc thường xuyên vớicác sinh vật bên ngoài môi trường Cho nên, mang là con đường xâm nhiễm quantrọng của mầm bệnh Tuy nhiên, ở mang thì có sự tập trung của đại thực bào rất cao,

nó cũng được bao phủ bởi dịch nhờn và sự xuất hiện của các tế bào Malpighi giúpcho mang có khả năng thực hiện được chức năng chống lại các sinh vật từ bênngoài môi trường

b) Yếu tố miễn dịch không đặc hiệu

Các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu gồm các yếu tố ức chế sinh trưởngnhư: tranferin, interferon, lisin có trong bổ thể, protein có trong phản ứng C vàlectin Ngoài ra, ở cá xương còn có hàng rào bảo vệ cấp tế bào như: đại thực bào,bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, bạch cầu ái kiềm cũng đóng vai trò quan trọngtrong hệ miễn dịch không đặc hiệu trên cá Nhưng những hiểu biết về chức năng và

cơ chế hoạt hóa của các tế bào này trên cá xương còn hạn chế so với ở người vàđộng vật bậc cao

1.3.1.2 Đáp ứng miễn dịch thu được

a) Miễn dịch thu được

Miễn dịch thu được là loại miễn dịch mà cơ thể sinh vật tiếp thu được trongquá trình sống Miễn dịch thu được còn gọi là miễn dịch đặc hiệu được chia làm 2loại: miễn dịch chủ động và miễn dịch thụ động

- Miễn dịch chủ động: là loại miễn dịch mà tự bản thân cơ thể sinh vật tạo rakhi tiếp xúc với kháng nguyên Nếu miễn dịch chủ động mà có sự tham gia của conngười như dùng vắc-xin để phòng bệnh thì được gọi là miễn dịch chủ động nhântạo Miễn dịch chủ động do cơ thể tiếp thu tự nhiên trong môi trường sống được gọi

là miễn dịch chủ động tự nhiên Trường hợp này xảy ra khi sinh vật đã qua khỏi sauđợt dịch bệnh, hoặc mầm bệnh không đủ gây thành dịch bệnh nhưng vẫn có khả

năng kích thích cơ thể sinh kháng thể, miễn dịch này giúp cho cá có khả năng khôngmắc lại bệnh đó khi bị tái nhiễm.

- Miễn dịch thụ động: là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu từ bên ngoài.Trường hợp miễn dịch thụ động có được do con người tạo ra như tiêm huyết thanh

để phòng và trị bệnh, được gọi là miễn dịch thụ động nhân tạo

b) Cơ chế bảo vệ đặc hiệu ở cá xương

- Cơ quan lympho: thận được xem là cơ quan lympho ngoại vi của cá, là nơixảy ra quá trình bắt giữ, xử lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống đáp ứngmiễn dịch Các tế bào lympho tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch cũng cónguồn gốc và chức năng gần giống như động vật trên cạn

- Đáp ứng miễn dịch dịch thể: khi kháng nguyên xâm nhập vào trong cơ thể

cá, hệ thống tế bào bạch cầu, chủ yếu là đại thực bào vây bắt và trình diện kháng nguyên,

xử lý và trình diện yếu tố quyết định kháng nguyên lên bề mặt làm kích

hoạt các tế bào lympho T Tế bào lympho T kích thích lên tế bào lympho B chuyểnthành tương bào sản sinh kháng thể Tương bào xuất hiện và tăng số lượng tronglách và thận sau một tuần từ khi có kháng nguyên kích thích Kháng thể trong huyếtthanh thường xuất hiện khi số lượng tương bào đạt giá trị cao nhất khoảng ngàythứ 10 - 15 và hàm lượng Ig tăng lên mạnh mẽ và đạt cực đại vào ngày thứ 20 - 30sau khi tiêm kháng nguyên So với động vât có vú, pha mẫn cảm ở cá kéo dài hơn,thời gian duy trì hàm lượng kháng thể lâu hơn

- Miễn dịch qua trung gian tế bào: các đặc điểm qua trung gian tế bào ở độngvật có vú đều có trên cá, tuy nhiên hệ thống này chưa được nghiên cứu kĩ trên cá

- Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở mang: mang đóng vai trò quan trọng trong việchấp thụ kháng nguyên, đặc biệt kháng nguyên không hòa tan Mang có khả năng sản xuấtkháng thể tại chỗ cho nên mang đóng vai trò đề kháng quan trọng đối với cá

- Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở da: IgM đã được phát hiện trong dịch nhớt của

da cá Do sự có mặt của lympho, tương bào và đại thực bào ở biểu bì mà khẳng định có sự đáp ứng miễn dịch cục bộ trên da cá

- Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở dịch nhầy: khi gây miễn dịch bằng cách ngâmhoặc cho ăn, có thể kích thích việc hình thành kháng thể trong lớp dịch nhầy màkhông làm gia tăng kháng thể trong huyết thanh

1.3.2 Một số kết quả nghiên cứu vắc xin phòng bệnh VNN ở cá mú

Vắc xin là một chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên Khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật sẽ kích thích cơ thể tạo ra một trạng thái miễn dịch, giúp cơ thể chống lại mầm bệnh (Outteridge, 1985) Dùng vắc xin cho cá là giải pháp giúp phòng chống lại đặc hiệu các tác nhân gây bệnh hoặc tạo kháng thể chống lại hormon giải phóng Gonadotropin (GnRH) là chất kìm hãm sự thành thục của cá để nâng cao năng xuất cho cơ sở nuôi (Gudding và cộng sự, 1999).

Từ năm, 1942, Duff đã dùng vi khuẩn Aeromonas salmonicida vô hoạt,

trộn vào thức ăn cho cá hồi để phòng bệnh xuất huyết, kết quả công cường độc cho thấy 25% cá thí nghiệm chết trong khi đó 75% cá đối chứng chết Hiện tại, trên thế giới đã có các vắc xin thương mại hóa để phòng các bệnh do

vi khuẩn như A salmonicida, V salmonicida, V viscosis, V ordalii, V.

anguillarum, Y ruckerii, R salmoninarum, F psychrophilum, F columnarae,

P salmonis, L garvieae, S iniae, P piscicida, E ictaluri và các bệnh do

virus như IPNV, PDV, IHNV, VHSV, ISAV, Iridovirus Các vắc xin này đã

đang được sử dụng có hiệu quả ở các nước có nghề cá phát triển như: Na Uy, Chi Lê, Mỹ, Nhật Bản, Anh, Canada, Hy Lạp, Ý, Pháp, Tây Ban Nha, Iceland (Sommerset, Krossoy và Frost, 2005) Nhờ sử dụng vắc xin mà lượng kháng sinh được sử dụng cho cá hồi giảm từ 600kg/800 ngàn tấn cá năm 2003

xuống còn 300 kg/1000 tấn cá năm 2008, điều này chứng tỏ vai trò của vắc xin trong nuôi trồng thủy sản ngày càng lớn.

Đối với bệnh do virus, vắc xin phòng bệnh chủ yếu được sản xuất từ kháng nguyên bất hoạt và tái tổ hợp Vắc xin bất hoạt được sản xuất từ virus nuôi cấy trên các dòng tế bào liên tục của cá như: BF 2 (tế bào cá mang xanh

Lepomis macrochirus), SHK 1 (tế bào thận trước của cá hồi Atlantic), EPC

(tế bào biểu mô cá chép), CHSE 214 (tế bào được tạo ra từ phôi cá hồi vua),

FHM (tế bào cá mè trắng), RTG 2 (tế bào tuyến sinh dục của cá hồi vân) (OIE, 2006, 2007) Các loài virus khác nhau sẽ thích nghi với các dòng tế bào mẫn cảm khác nhau Virus được nuôi cấy, thu hồi và gây bất hoạt bởi các loại hóa chất như formalin, binary ethylenimine nhưng yêu cầu cấu trúc kháng nguyên còn nguyên vẹn Mặc dù vắc xin này có hiệu quả cao trong việc tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho cá, tuy nhiên điều bất lợi trong sản xuất và sử dụng vắc xin bất hoạt đó là đòi hỏi lượng lớn kháng nguyên cho mỗi liều tiêm

và đưa vắc xin vào cơ thể theo đường tiêm thì mới đạt được hiệu quả mong muốn (Evelyn, 1997)

1.3.3 Các loại vắc xin sử dụng cho cá

- Vắc xin bất hoạt: Là các vi sinh vật bị giết bằng hóa chất hoặc bằng nhiệt (ví dụ như formaline, β – probiolacton, cồn , nhiệt độ, UV, tia X) Các

yếu tố trên chỉ làm chết mầm bệnh nhưng không làm biến tính protein nên vẫn giữ được độ độc tính của mầm bệnh Đặc tính của loại vắc xin này khi đưa vào cơ thể thì chậm sinh ra kháng thể (khoảng 7 đến 14 ngày) Hầu hết các loại vắc xin này chỉ gây đáp ứng miễn dịch không hoàn toàn và ngắn hạn cần phải tiêm nhắc lại nhiều lần Tuy nhiên độ an toàn của vắc xin này khá cao.

Trước đây, vắc xin phòng bệnh cho cá được sản xuất chủ yếu ở dạng bất hoạt và được sử dụng ở dạng ngâm Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến

cho cá con để tạo ra đáp ứng miễn dịch ngắn, giúp bảo vệ cá ở giai đoạn nhỏ

dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố stress Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn lại hướng đến các loại vắc xin tiêm, mặc dù khả năng bảo hộ đạt được là do kháng nguyên nhưng hiệu lực và độ dài bảo hộ lại phụ thuộc vào các chất bổ trợ Đối với cá hồi, vắc xin nhũ dầu mặc dù có hiệu quả cao đối với bệnh

Furunculosis nhưng lại gây tổn thương ở xoang phúc mạc của cá Nghiên

cứu lựa chọn chất bổ trợ là yêu cầu quan trọng trong quy trình sản xuất để

đảm bảo tính an toàn của vắc xin (Evensen và cộng sự, 2005).

- Vắc xin sống giảm độc lực: là vắc xin sản xuất dựa vào biến đổi gene của chủng vi khuẩn gây bệnh Công việc quan trọng nhất là xác định gene độc lực

và loại bỏ gene độc lực trước khi sử dụng vi khuẩn vẫn còn sống Mầm bệnh có thể được cấy chuyển qua môi trường tế bào hoặc qua động vật nhiều lần nên giảm độc tính nhưng vẫn giữ tính kháng nguyên Một loại khác đó là

chọn chủng vi khuẩn không gây độc nhưng có cấu trúc tế bào gần giống với chủng vi khuẩn gây bệnh và quan trọng là chủng vi khuẩn đó phải kích thích được hệ miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh.

- Vắc xin tái tổ hợp: là loại vắc xin có thành phần chính là gene độc lực

của chủng vi sinh vật gây bệnh được tổng hợp và đưa trực tiếp vào cơ thể cá

hoặc được nhân lên trong vi sinh vật mang trước khi đưa vào cá Đây là công nghệ sản xuất vắc xin mới nhất và thường áp dụng trong việc sản xuất vắc xin phòng bệnh do virus gây ra.Vắc xin tái tổ hợp được sản xuất ở hai dạng, vắc xin tiểu phần và vắc xin DNA Vắc xin tiểu phần được sản xuất bằng cách sử dụng một đoạn phân tử DNA mã hóa kháng nguyên đặc hiệu để tổng hợp nên phân tử protein có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đầy đủ chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó Đoạn gen mã hóa kháng nguyên được biểu hiện trong một hệ thống vật chủ có đặc điểm là tổng hợp protein có bản chất kháng nguyên đặc hiệu và dễ dàng sản xuất ở quy mô thương mại Vắc xin tiểu phần

được đánh giá là an toàn do không gây nguy cơ mắc bệnh cho cá, hiện tại, vắc-xin này đã được sản xuất để phòng bệnh do IPNV gây trên cá hồi Vắc xin DNA hoạt động theo nguyên tắc tạo đáp ứng miễn dịch di truyền, hệ thống miễn dịch của vật chủ được chủng vắc xin phản ứng với kháng nguyên

do chính nó tổng hợp từ một đoạn DNA hoặc RNA mã hóa kháng nguyên của mầm bệnh được đưa vào cơ thể Thay cho việc sản xuất kháng nguyên, người ta phân lập gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu rồi gắn vào vector plamide hoặc virus Vắc xin DNA được đánh giá là có triển vọng trong công tác phòng bệnh cho động vật thủy sản bởi nó kết hợp được các khả năng của vắc xin nhược độc và vô hoạt, hiện tại vắc xin này đã được nghiên cứu để phòng bệnh do IHNV và VHSV (Einer-Jensen và cộng sự, 2008).

Để nâng cao hiệu lực của loại vắc xin vô hoạt, người ta phải trộn thêm các chất bổ trợ miễn dịch như adjuvant hoặc lybosome Các chất bổ trợ có tác dụng tăng sức miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch của các loại vắc xin chết, nhưng các chất bổ trợ cũng gây phản ứng viêm tại chỗ Các chất bổ trợ hiện nay thường dùng là keo phèn, phèn chua và bổ trợ dầu khoáng Các vắc xin keo phèn và phèn chua là những vắc xin có lịch sử lâu đời, còn vắc xin có

bổ trợ dầu còn mới mẻ ở nước ta, tỷ lệ sản xuất vắc xin vô hoạt chiếm đến 90 – 95%, trong vắc xin vô hoạt thì vắc xin keo phèn chiếm đến 90%

Sử dụng vắc xin có bổ sung và không có bổ sung chất bổ trợ cho thấy: vắc-xin chỉ chứa kháng nguyên tạo ra hiệu lực miễn dịch hạn chế, không kéo dài, phản ứng sau tiêm xảy ra với tỷ lệ cao Còn những vắc xin có bổ sung chất bổ trợ sẽ tạo được một miễn dịch mạnh hơn, thời gian miễn dịch kéo dài hơn

1.3.4 Nguyên tắc dùng vắc xin cho cá

Một trong nhữngyếu tố quyết định hiệu lực của vắc xin tiêm là liều tiêm, hầu hết các vắc xin tiêm được tiêm vào xoang phúc mạc của cá Trong

một số trường hợp tiêm chủng vắc xin cho cá bố mẹ để gây miễn dịch thụ động cho cá con, người ta thường tiêm vào lưng để tránh ảnh hưởng đến trứng Thể tích liều ban đầu của các loại vắc xin thường được tính toán lượng kháng nguyên đủ để tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ trong 0.2ml Tuy nhiên, các loại tá dược mới có thể giảm thể tích liều tiêm xuống 0.1ml (Evensen và cộng sự, 2005).

Tần suất tiêm chủng vắc xin ở cá cũng hoàn toàn khác với động vật trên cạn Trong quá trình tiêm, cá cần được gây mê để hạn chế tổn thương ở mức tối thiểu, mặc dù rủi ro do gây mê không cao nhưng có thể gây stress dẫn tới tình trạng giảm ăn trong thời gian ngắn sau khi tiêm Bên cạnh đó, một số trường hợp có thể gia tăng nhiễm nấm và các tác nhân nhiễm trùng cơ hội Vắc xin được tiêm một liều duy nhất cần được nghiên cứu để áp dụng cho cá, vắc xin DNA là giải pháp tốt để giải quyết vấn đề này (Fernández, 2001) Bên cạnh đó, việc sử dụng nhiều loại vắc xin cho cá phải được tính toán cụ thể để tránh phản ứng tổn thương phúc mạc.

Đối với cá biển, sau giai đoạn ương giống cá được thả vào môi trường gần giống với điều kiện tự nhiên, sự tiếp xúc thường xuyên và lâu dài của cá với mầm bệnh có sẵn trong môi trường có thể dẫn tới khả năng mắc bệnh trở lại sau khi tiêm vắc xin Do vậy, vắc xin sử dụng trong giai đoạn này chủ yếu được sử dụng qua đường ăn Công nghệ vắc xin ăn đã được đánh giá là giải pháp lý tưởng để quản lý dịch bệnh cho cá nuôi tuy nhiên vẫn còn một số yếu

tố hạn chế đó là dạng bào chế, bảo quản và phân phối và sử dụng vắc xin sao cho đảm bảo giảm thiểu nhất việc gây thất thoát kháng nguyên Hiện tại, vắc xin được phối trộn với thức ăn bằng các hình thức bổ sung chất kết dính hoặc đưa vào trong quy trình sản xuất thức ăn Với phương thức này, kháng nguyên vắc xin phải được “áo ngoài” sao cho không bị ảnh hưởng bởi nhiệt

độ và áp xuất cao trong quy trình sản xuất thức ăn Bên cạnh đó, độ axit cao ở

ruột trước của cá cũng là thách thức đối với những nhà nghiên cứu sản xuất vắc xin ăn, kháng nguyên cần được bảo quản tránh ảnh hưởng của đường tiêu hóa để tiếp xúc được với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch để tạo bảo

hộ cho vật chủ.

Một thách thức khác của vắc xin ăn là phải đảm bảo rằng cá nhận được

đủ lượng kháng nguyên cần thiết Cá được nuôi với mật độ lớn sẽ tương đối khó khăn để đảm bảo rằng tất cả các cá thể đều nhận được vắc xin Lượng kháng nguyên sử dụng cho phương pháp này lớn hơn nhiều so với phương pháp tiêm, đặc biệt là vắc xin dùng cho cá lớn như cá hồi trong giai đoạn thả

ở biển Mặc dù vậy, các vắc xin đường uống phòng bệnh viêm ruột và

Vibriosis đã được sản xuất và thương mại hóa thành công trên cá hồi

(Sommerset, Krossoy và Frost, 2005).

Việc sử dụng vắc xin cho cá được sử dụng bởi một số cách thức khác nhau Đối với cá ở giai đoạn ấu trùng và ương giống, phương pháp ngâm là giải pháp tốt nhất để có thể gây miễn dịch bảo hộ phù hợp mà giảm thiểu được các ảnh hưởng stress Vắc xin được pha loãng để đảm bảo liều kháng nguyên phù hợp và ngâm cá trong khoảng 30 giây- 1 phút.Trong thời gian ngâm vắc xin phải thực hiện sục khí đồng thời đảm bảo nhiệt phù hợp đối với sinh lý cá Điều này quan trọng, bởi lẽ phản ứng miễn dịch của cá phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ của nước trong đó cá được lưu giữ, dưới nhiệt độ 4-5ºC phản ứng miễn dịch sẽ không đủ để bảo hộ cho cá Không phối hợp sử dụng nhiều loại vắc xin cùng lúc và chỉ cá khỏe mạnh mới được sử dụng vắc xin.

Phương pháp cho ăn có thể thay đổi tùy theo loại vắc xin.Vắc xin ăn có thể được trình bày dưới ba hình thức: áo ngoài thức ăn bằng các chất kết dính như dầu gan mực, lecithin hoặc gelatin; phun vắc xin lỏng vào thức ăn; hoặc kết hợp vắc xin vào thức ăn trong thức ăn trong quá trình sản xuất Ở dạng lỏng, vắc xin cần để nhiệt độ phòng (20oC) trong 1 giờ trước khi sử dụng để

ổn định, nếu có hiện tượng tách lớp cần lắc mạnh chai vắc xin cho đến khi lớp phân cách phân tán hoàn toàn Chuyển thức ăn viên vào trong máy trộn và

từ từ đổ hoặc phun vắc xin vào thức ăn viên Trộn bột viên ít nhất là 2 phút sau khi bổ sung vắc xin Giữ cho thức ăn trong 1 giờ trước khi cho ăn để vắc xin thấm đều vào viên thức ăn.

Với phương pháp tiêm, dù thực hiện tiêm chủng bằng máy tự động hoặc bằng tay thì cá cần được sử dụng thuốc an thần hoặc thuốc mê để dễ dàng và an toàn khi tiêm Cá bị bỏ đói trước khi gây mê và một vài ngày sau khi tiêm cá mới ăn uống bình thường trở lại Điều này có thể gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cá Kỹ năng của người tiêm vắc xin có ảnh hưởng lớn đến kết quả tiêm phòng Tốc độ tiêm, kích thước kim tiêm là các yếu tố quan trọng để đảm bảo an toàn cho cá, chiều dài kim cần đảm bảo rằng vắc xin được đưa đúng vào xoang phúc mạc, chiều dài không thích hợp với kích thước của cá có thể gây chết do gây tổn thương bàng quang, bóng hơi hoặc thận Độ sắc của kim đảm bảo không gây tổn thương tại vết tiêm, tránh nhiễm trùng thứ cấp do vi khuẩn kỵ khí hoặc nấm lây nhiễm từ cácvị trí tiêm Kích thước của kim quá lớn sẽ dẫn đến việc chảy vắc xin qua vết tiêm vì vậy không đảm bảo liều tối ưu, kim quá nhỏ có thể gây khó khăn khi tiêm các vắc xin nhũ dầu.

1.4 MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT GEN

1.4.1 Các enzyme sử dụng trong kỹ thuật gen

1.4.1.1 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE)

Enzyme giới hạn là các enzyme thuộc nhóm enzyme endonuclease có khảnăng nhận biết và cắt sợi dài DNA tại các vị trí (site) đặc thù thành các đoạn ngắn.Căn cứ vào khả năng nhận biết và vị trí cắt đặc hiệu trên phân tử DNA, người ta

- Loại I: Enzyme nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA

và cắt cách trình tự nhận biết khoảng 1000 - 5000 nucleotit

- Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó

- Loại III: Enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng

20 nucleotit

Các RE loại II là nhóm duy nhất đƣợc sử dụng trong các thao tác sinh học

phân tử, chúng có thể cắt tạo đầu bằng (SmaI, AluI…) hoặc đầu so le (EcoRI, BamHI, PacI, XmaI…) Các đoạn DNA cắt đầu bằng không có khả năng tự dính lại

với nhau, để nối chúng cần sử dụng enzyme nối DNA ligase hoặc các adaptorchuyên dụng cho mỗi loại enzyme Các đoạn DNA có đầu sole có thể tự nối lại vớinhau mà không cần sự có mặt của enzyme nối, do đó enzyme giới hạn tạo đầu so leđƣợc sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen

1.4.1.2 DNA ligase

Enzyme DNA ligase là loại enzyme xúc tác hình thành các liên kếtphosphodieste nối các đoạn DNA với nhau Mỗi loại DNA ligase có các tính chấtđặc trƣng riêng, có khả năng nối các đoạn DNA đầu bằng hoặc đầu so le Ví dụ

enzyme E coli DNA chỉ nối các đoạn DNA có đầu cắt so le; còn T4 DNA ligase làenzyme đƣợc tách chiết từ thực khuẩn thể T4, có khả năng nối các đoạn DNA cắtđầu bằng hoặc đầu so le, đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật gen Trong kỹ thuậtgen còn sử dụng một số loại enzyme khác tham gia vào phản ứng nối DNA nhƣ T4polynucleotide kinase, alkaline photphatase…

1.4.1.3 DNA polymerase

Là enzyme xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’ - 3’ Phần lớn các DNApolymerase dùng một bản mẫu là DNA để làm khuôn cho sự tổng hợp (DNApolymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase) Một trong các polymerase đặc

biệt là enzyme phiên mã ngƣợc sử dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA Ngoài ra

còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase có thể thêm các nucleotit vàođầu 3’ của mạch DNA mà không cần khuôn.

1.4.1.4 Enzyme phiên mã ngược

Đây là enzyme có vai trò quyết định trong quá trình hình thành ngành sinhhọc phân tử Eucaryota Enzyme này do các retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộgen RNA của chúng trong tế bào vật chủ Enzyme phiên mã ngược tổng hợp lênmột đoạn DNA bổ sung (cDNA - complementary DNA) từ RNA khuôn theo chiều

5’ - 3’ khi có mặt của mồi Các ứng dụng chủ yếu là: thiết lập ngân hàng cDNA, tiếnhành phản ứng PCR trên mRNA và xác định trình tự của các axit nucleic bằngphương pháp sử dụng các dideoxynucleotit

1.4.2 Vector plasmid

Plasmid là những phân tử DNA xoắn kép dạng vòng, có kích thước nhỏ, nằmtrong tế bào chất của tế bào vi khuẩn hoặc tế bào nấm men Kích thước trung bìnhcủa plasmid từ 1 - 5 kb, plasmid có khả năng tự tái bản độc lập với sự phân chia tếbào Plasmid cho cài gắn các đoạn DNA lạ, không gây ảnh hưởng tới chức năng vàhoạt động của tế bào Plasmid ở vi khuẩn mang một số ít gen như các gen xác địnhgiới tính F, gen kháng chất kháng sinh, gen sinh độc tố

1.4.2.1 Vector plasmid tách dòng

Vector pGEM-T Easy (3015bp) là vector tách dòng được thiết kế với nhiềuđặc điểm của một vector đa chức năng, có khả năng ứng dụng cao trong lĩnh vựccông nghệ gen Đây là vector đã được mở vòng, tại mỗi đầu mút của vòng mở cómột base Timin (ddT) tự do Sản phẩm PCR cuối cùng được tạo thành luôn có gắnvới base Adenin (A) nên vector này có khả năng gắn trực tiếp vào với sản phẩmPCR mà không cần có xúc tác của enzyme nối pGEM-T Easy có chứa sẵn cácgene: lacZ, ori, f1-origin, AmpR Trong đó ori là những gen có chức năng tái bảntrong tế bào vi khuẩn, lacZ dùng để nhận biết tế bào đã được chuyển gen hay gọi làgen chỉ thị, AmpR có vai trò là gen kháng kháng sinh có tác dụng lựa chọn các tếbào vi sinh vật có mang vector

Hình 1.4 Sơ đồ pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen

1.4.2.2 Vector plasmid biểu hiện

Vector biểu hiện gen là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo lên các protein lai

Hình 1.5 Plasmid pET-32a +