Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và chỉ thị sinh học phân tử một số loài thuộc chi sâm (panax l ) mọc tự nhiên ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---Phạm Thị Ngọc NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI SÂM PANAX L... ĐẠI HỌ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Phạm Thị Ngọc

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI

SÂM (PANAX L.) MỌC TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Phạm Thị Ngọc

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ CHỈ

THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI

SÂM (PANAX L.) MỌC TỰ NHIÊN Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Thực vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS PHẠM THANH HUYỀN PGS TS NGUYỄN TRUNG THÀNH

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM N

Đ ho n th nh lu n v n n y, t i nh n rất nhi u s gi p ủthầy, , nh kho họ trong l nh v sinh họ , th v t họ

ủ m nh

T i ũng xin tr n trọng ảm n Ban l nh ạo Viện D liệu, ồngnghiệp, n ộ Kho T i nguyên D liệu tạo mọi i u kiện thu n l i trongcông tác và nghiên ứu ũng nh ho nh ng l i khuyên qu u t i ho n thiện

vietnamensis H & Grushv.‖, Ch ng tr nh T y B v i t i ―Ứng ụng giải

ph p kho họ ng nghệ ph t tri n nguồn nguyên liệu v tạo sản phẩm từ h i

lo i y thu S m vũ iệp (Panax bipinnatifidus Seem.) v T m thất ho ng (Panax

stipuleanatus H.Ts i K.M Feng) v ng T y B ‖ và Qu họ ổng N g o tại Việt

N m T i xin tr n trọng v t l ng ảm n

n 31 t n 01 năm 2018

T c giả uận v n

Phạm Thị Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

T i xin m o n

tr h n trong lu n v n

t i xin hịu ho n to n tr

s liệu v kết quả trong lu n v n n y l trung th v ất k ng tr

nh n o kh Tất ả nguồn th ng tin liệt kê trong t i liệu th m khảo Nếu g s i s t h nhiệm

n 31 t n 01 năm

2018

T c giả uận v n

Phạm Thị Ngọc

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Ch ng 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng qu n nghiên ứu v hi Panax L trên thế gi i 3

1.1.1 Lịc sử n ên cứu c Panax L . 3

1.1.2 C c n ên cứu p ân loạ c Panax L sử dụn s n ọc p ân tử 7

1.2 Tổng qu n nghiên ứu v hi S m (Panax L.) Việt N m 11

1.2.1 C c lo t u c c Sâm (Panax L.) đã được n ận ở V ệt am 11

1.2.2 Lịc sử n ên cứu c Sâm (Panax L.) ở V ệt am 13

1.2.2 ên cứu p ân loạ c c lo t u c c Panax L ở V ệt am sử dụn s n ọc p ân tử 16

1.3 Tổng qu n v ph ng ph p nghiên ứu 18

1.3.1 C c loạ c ỉ t ị v dấu c uẩn tron n ên cứu t ực vật 18

1.3.2 Cơ sở k oa ọc của v ệc sử dụn c c trìn tự AD bảo t ủ tron p ân tíc quan ệ p t s n ở t ực vật 19

1.3.3 C c p ươn p p xâ dựn câ quan ệ p t s n . 22

Ch ng 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Mụ tiêu nghiên ứu 26

2.2 Đ i t ng, ị i m v v t liệu nghiên ứu 26

2.2.1 Đố tượn n ên cứu 26

2.2.2 Địa đ ểm n ên cứu 26

2.2.3 Vật l ệu n ên cứu 27

2.3 Nội ung nghiên ứu 30

2.4 Ph ng ph p nghiên ứu 31

2.4.1 P ươn p p k ảo cứu kế t ừa t l ệu 31

2.4.2 P ươn p p đ ều tra t u t ập mẫu vật 32

2.4.3 P ươn p p n ên cứu t ực vật ả p ẫu 32

2.4.4 P ươn p p n ên cứu s n ọc p ân tử 33

2.4.4.1 T c c ết AD tổn số 33

Ch ng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 X ịnh th nh phần lo i thứ thuộ hi Panax L Việt N m 37

3.2 Đặc đ ểm ìn t 41

3.2.1 Tam t ất oan v Tam t ất l xẻ 41

3.2.2 Sâm n ọc l n v c c t ứ (var et ) 49

3.2.3 Tam t ất bắc – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 61

3.2.4 Đặc đ ểm ìn t c un của c Panax L ở V ệt am 66

3.3 Đặ i m giải ph u 67

3.3.1 Tam t ất oan – Panax stipuleannatus H.T.Tsai et K.M.Feng 67

3.3.2 Sâm n ọc l n v c c t ứ 70

3.3.3 Tam t ất bắc – Panax notoginseng (Burkill) F.H Chen 74

3.3.4 So s n đặc đ ểm ả p ẫu ữa c c lo v t ứ lo của c Panax L ở V ệt am 79

3.4 Nghiên ứu hỉ thị ph n tử v m i qu n hệ i truy n ủ m u thu th p v i t xon trong ng hi Panax L 79

3.4.1 Tác c ết AD tổn số v k uếc đạ vùn en ITS-rDNA và matK 79

3.4.2 P ân tíc v ả trìn tự vùn en ITS-rDNA và matK 80

3.4.3 Xâ dựn câ p t s n c ủn loạ c o c c lo t u c c Panax ở V ệt Nam 90

3.5 So s nh h nh th i v x y ng kh ph n loại ho lo i thứ thuộ hi

Panax L. Việt N m 94

KẾT LUẬN 98

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

-PHỤ LỤC 9

-Phụ lụ 1 C tr nh t ITS v gen m tK lấy từ Gen nk sử ụng trong nghiên ứu ph n t h qu n hệ ph t sinh 9

-Phụ lụ 2 C m u tiêu ản Type ủ lo i thuộ hi Panax L. sử ụng trong nghiên ứu 14

-Phụ lụ 3 D nh s h tiêu ản nghiên ứu trong ph ng tiêu ản v ảo t ng 15 -Phụ lụ 4 Kết quả x ịnh tên kho họ m u thu th p 23

-DANH MỤC HÌNH ẢNH

H nh 3.1 Ảnh hụp một s tiêu ản tiêu ản lo i Panax bipinnatifidus 39

H nh 3.2 A Ảnh hụp tiêu ản NIMM.911; B Ảnh hụp tiêu ản NIMM.348 40

H nh 3.3 Ảnh hụp tiêu ản Typus KUN.0560452 loài Panax stipuleanatus

H nh 3.8 Dạng l hét nguyên ủ T m thất ho ng – Panax stipuleanatus H.T.Tsai

et K.M.Feng A L mặt trên; B L mặt i 44

Hình 3.9 Hình thái các lá chét nguyên ủ T m thất ho ng – Panax stipuleanatus

H nh 3.12 Cụm ho T m thất ho ng - Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng46

H nh 3.13 L trên ụm ho T m thất ho ng - Panax stipuleanatus H.T.Tsai et

K.M.Feng 46

H nh 3.14 A H nh th i ho ủ T m thất ho ng ; B Cu ng ho kh ng g i thịt 46

H nh 3.15 L t t ọ ầu ủ T m thất ho ng – Panax stipuleannatus H.T.Tsai et

H nh 3.24 H nh th i l S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha & Grushv 52

H nh 3.25 H nh th i l hét ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha &

Grushv 53

H nh 3.26 L ng trên l S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha & Grushv 53

H nh 3.27 Cụm ho ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha & Grushv 53

H nh 3.28 H nh th i ho ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha & Grushv 54

H nh 3.29 G i thịt trên u ng ho nh ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha

& Grushv 54

H nh 3.30 H nh th i v m u s ho ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis

H nh 3.33 Cụm quả ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha & Grushv 55

H nh 3.34 H nh th i ạng quả ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha &

Grushv 56

H nh 3.35 Dạng quả h i hạt khi h n ủ S m ngọ linh – Panax vietnamensis Ha

& Grushv 56

H nh 3.36 H nh th i hạt S m ngọ linh - Panax vietnamensis Ha & Grushv 56

Hình 3.37 Hình thái Sâm lai châu - Panax vietnamensis var fuscidiscus K.

Komatsu, S Zhu & S.Q Cai 57

Hình 3.38 Hình thái lá Sâm lai châu 58

H nh 3.39 C ạng th n rễ ủ S m l i h u - Panax vietnamensis var fuscidiscus

K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai 58

H nh 3.40 H nh th i ho ủ S m l i h u - Panax vietnamensis var fuscidiscus K.

Komatsu, S Zhu & S.Q Cai 58

H nh 3.41 Ph n t h th nh phần ho ủ S m l i h u - Panax vietnamensis

var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai 59

H nh 3.42 Mặt t ọ ầu ủ S m l i h u - Panax vietnamensis var fuscidiscus

K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai 59

H nh 3.43 Quả non ủ S m l i h u - Panax vietnamensis var fuscidiscus K.

Komatsu, S Zhu & S.Q Cai 59

H nh 3.44 H nh th i hung ủ S m pux il ileng - Panax sp.2 60

H nh 3.45 H i mặt l l ng ủ S m pux il ileng - Panax sp.2 60

H nh 3.46 H nh th i ho ủ S m pux il ileng – Panax sp.2 61

H nh 3.48 Đ ầu ằng ủ S m pux il ileng – Panax sp.2 61

H nh 3.49 H nh th i hung ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 63

H nh 3.50 Th n rễ ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 63

H nh 3.51 L t t ng ng th n ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 64

H nh 3.52 H nh th i l hét ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 64

H nh 3.53 Cụm ho ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 64

H nh 3.54 Ho ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 65

H nh 3.55 Ho ổ ọ v i ầu lõm v v i nhụy xẻ h i ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 65

H nh 3.56 Hạt ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 65

H nh 3.57 Đặ i m vi ph u l ủ T m thất ho ng – Panax stipuleannatus H.T.Tsai et K.M.Feng 68

H nh 3.58 Cấu tạo vi ph u th n kh sinh T m thất ho ng - Panax stipuleannatus H.T.Tsai et K.M.Feng 69

H nh 3.59 Cấu tạo vi ph u rễ ủ T m thất ho ng l xẻ 70

H nh 3.60 Ảnh hụp vi ph u l Panax vietnamensis 71

H nh 3.61 Đặ i m vi ph u th n kh sinh ủ Panax vietnamensis 72

H nh 3.62 Đặ i m vi ph u l p ần v 1 phần ủ th n rễ lo i Panax vietnamensis

73

H nh 3.63 Đặ i m vi ph u th n rễ lo i Panax vietnamensis 73

H nh 3.64 Một s ặ i m trong th n rễ ủ lo i Panax vietnamensis 74

H nh 3.65 Vi ph u l ủ T m thất – Panax notoginseng (Burkill) F.H Chen 75

H nh 3.66 Ph u iện th n kh sinh ủ T m thất - Panax notoginseng (Burkill)

H nh 3.74 Kết quả iện i sản phẩm PCR gen matK ủ m u nghiên ứu 80

Hình 3.75 C y qu n hệ ph t sinh trên ph i h p v ng gen ITS-rDNA và matK

gi m u thu th p v t xon ng hi Panax L. trên ph ng ph pMaximum Likelihood 91

Hình 3.76 C y qu n hệ ph t sinh trên ph i h p v ng gen ITS-rDNA và matK

gi m u thu th p v t xon ng hi Panax L. trên ph ng ph pBayesian 92

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 L lị h m u thu th p 28

Bảng 2.2 Đoạn mồi sử ụng ho PCR v giải tr nh t 35

Bảng 2.3 Th nh phần v i u kiện phản ứng PCR nh n ản v ng gen ITS-rDNA vàmatK 35

Bảng 3.1 Vị tr kh iệt tr nh t oạn gen ITS ủ m u P stipuleanatus và

Panax sp.1 v m u lo i P stipuleanatus trên genbank……….81

Bảng 3.2 Vị tr kh iệt tr nh t oạn gen ITS-RDNA ủ m u S m ngọlinh, Sâm lai châu, Sâm puxailaileng và Sâm langbian 82

Bảng 3.3 Nh ng vị tr kh iệt tr nh t oạn gen ITS-rDNA ủ lo i thứ lo inghiên ứu v i lo i thuộ hi Panax 83

Bảng 3.4 Nh ng vị tr kh

stipuleanatus và Panax sp.1 v

iệt tr nh t oạn gen matK ủ m u P.

m u lo i P stipuleanatus trên genbank 86

Bảng 3.5 S s i kh tr nh t nu leoti e oạn gen m tK gi S m ngọ linh, S mlai châu, Sâm puxailaileng và Sâm langbian 87

Bảng 3.6 Nh ng vị tr kh iệt tr nh t oạn gen matK ủ lo i thứ lo inghiên ứu v i lo i thuộ hi Panax 88

Bảng 3.7 So s nh ặ i m h nh th i lo i thứ thuộ hi Panax L. ViệtNam 95

kh ng kế hoạ h nên ng ứng tr nguy ị tuyệt hủng o V v y vấn ảotồn y thu n i hung v nhất l nh ng lo i ng ị e ọ tr th nh m i qu n

t m h ng ầu trong hiến l ảo tồn ạng sinh họ n t [18, 23]

Theo t i liệu ng , y thu thuộ iện ị e ọ Việt N m hiệnlên t i on s trên 100 lo i [2, 18] Trong họ Ngũ gi (Ar li e e) t i

7 loài, riêng chi Panax L. Việt N m gồm 3 lo i mọ t nhiên l S m vũ iệp

(Panax bipinatifidus Seem.); T m thất ho ng (Panax stipuleanatus C T Tsai & K.

M Feng) và S m ngọ linh (Panax vietnamensis Ha et et Grushv.) u l i t ng

ng xếp hạng k nguy ấp [2] Đ y l nh ng lo i y thu qu , nh ngphạm vi ph n v k h th quần th ủ h ng rất nh hoặ tr nên hiếmgặp kh ng hỉ Việt N m m ả trên phạm vi to n thế gi i

Do gi trị sử ụng v gi trị kinh tế o, ả lo i n y ị t m kiếm,

kh i th ến mứ kiệt quệ trong t nhiên S m vũ iệp v T m thất ho ng

xếp hạng k nguy ấp (CR), n S m ngọ linh ng y n y oi l tuyệthủng ngo i t nhiên (EW) Cả lo i n y v o D nh lụ y thu(2006), S h Đ Việt N m (2007), Phụ lụ IA – lo i nghiêm ấm kh i th v

sử ụng v mụ h th ng mại ủ nghị ịnh 32 2006 NĐ-CP ng y 30 03 2006 vquản l th v t rừng, ộng v t rừng nguy ấp, qu hiếm V y ũng l trong

s 17 lo i th v t thuộ Dan mục lo n u cấp quý ếm được ưu t ên bảo vệ

theo Nghị ịnh s 160 2013 NĐ-CP ng y 12 11 2013 ủ Thủ t ng Ch nh phủ [3,

4, 5] Mặ l nh ng lo i gi trị o ả trong kho họ v kinh tế nh v y

1

nh ng Việt N m nh ng nghiên ứu v lo i n y v n h nghiên ứu to niện, m i hỉ t p trung nghiên ứu v th nh phần h họ , v rải r một snghiên ứu v ặ i m sinh họ , nh n gi ng v trồng i th Nhằm ung ấp

nh ng n liệu v s kho họ phụ vụ ng t ảo tồn, ph t tri n ũng nh

ng t ịnh nh, ph n iệt lo i S m ản ị này ủ Việt N m, h ng t i lhọn t i ―Nghiên cứu đặc điểm hình th i, giải phẫu và chỉ thị sinh học phân

tử một số oài thuộc chi Sâm (Panax L.) mọc tự nhiên ở Việt Nam‖.

2

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan c c nghiên cứu về chi Panax L trên thế giới

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu chi Panax L.

Chi Panax L l một hi nh trong họ Nhân sâm (Ar li e e) trên thế gi ighi nh n 12 lo i v 1 thứ Ph n Đ ng B h u Á, o gồm v ng Viễn Đ ng

Ng , Trung Qu , Tri u Tiên, Nh t Bản, xu ng ến v ng Đ ng B Ấn Độ, Nep l,Việt N m v ả v ng B M [47, 79, 85]

Chi Panax L. C rl Linnaeus m tả lần ầu tiên từ n m 1753 v i lo i

huẩn l Panax quinquefolius ph n B M [57] S ng thế kỷ 19, một s lo i

kh ng nh Giả nh n s m – P pseudoginseng W ll. Nep l; Nh n s m

– P ginseng Meyer B Tri u Tiên, Đ ng B Trung Qu v Viễn Đ ng Ng ;

S m Nh t P japonicum Meyer Nh t Bản v Trung Qu ; S m vũ iệp – P.

bipinnatifidus Seem. Đ ng B Ấn Độ, Nep l v Trung Qu [28, 33] Nh v y,

ến u i thế kỷ 19, hi Panax L. 6 lo i C n ứ v o n liệu m i thu ,

n m 1975 Trung Qu ổ sung thêm một lo i m i l P stipuleanatus H T Tsai

& K M Feng ồng th i n ng ấp t xon thứ ủ P pseudoginseng Wall củ

t giả tr th nh lo i ho n hỉnh [83] N m 1985, một loài m i kh

t m thấy Việt N m l S m ngọ linh – P vietnamensis Ha et Grushv [6]

n ng tổng s lo i thuộ hi Panax L trên thế gi i lên 12 loài và 1 thứ, trong B

M 2 lo i (P quinnquefolium và P trifoliatus), c lo i n lại ph n h u

Á, o gồm 6 lo i Trung Qu , 3 lo i Nh t Bản v 5 lo i Việt N m(k ả 2 lo i y trồng nh p nội) [17]

Theo Linnaeus (1753) i m kh iệt ủ hi Panax L so v i hi kháctrong họ Ar li e e l ầu 2 , ho m u 5, xếp v n h y xếp l p Trong gi i oạn

n y, s l ng lo i iết n t, nên t giả hỉ gi i hạn ặ i m ủ ho :

ho vừ xếp l p vừ xếp v n Đ y l ặ i m h nh ủ hi ph n iệt v i các

hi kh ủ họ Ar li e e Tuy nhiên, v i h s p xếp n y th ặ i m ủ hi

3

Panax o gồm một s hi kh thuộ họ Ar li e e, ặ iệt l hi Nothopanax

[57]

Theo qu n i m trên, De C n olle (1830) huy n một s lo i thuộ hi

Nothopanax vào chi Panax [35] K từ y vị tr ph n loại v m i qu n hệ ph t sinh

ủ hi Panax kh ng s ồng nhất v qu n i m gi t giả Decaisne và

Pl n hon (1854) ho rằng ặ i m h nh ủ hi Panax l i xếp v n, nên huy n

2 loài P quinquefolius và P trifolius sang chi Aralia, ồng th i h p nhất ho

chi Polyscias Forest, Clerodendron Nutt, Pseudopanax Koch và Maralia Pet vào

chi Panax [36] Nh v y, v i h s p xếp nh trên, t giả ho rằng ặ

i m h nh th i ủ hi Panax ên ạnh i xếp v n n ặ i m th n g và thânthảo Đồng v i qu n i m trên, t giả Benth m v Hooker (1867), Clarke(1879) tiếp tụ s t nh p hi Nothopanax vào chi Panax, ồng th i huy n hi Panax

v o t ng (tri e) P n e e Đến th i i m n y, s l ng lo i thuộ hi Panax lên ến

25 lo i, ph n hủ yếu v ng nhiệt i h u Á, h u Phi, Newzel n vAustralia [28, 33]

N m 1868, Seemann xem xét lại vị tr ph n loại hi Panax v ho rằng

nh ng m tả ủ Linn eus v ặ i m h nh th i ặ tr ng ủ hi Panax là không

rõ ràng Theo t giả, ặ i m h nh ph n iệt hi Panax so v i hi khtrong họ Ar l i e e l i 5, xếp l p, ầu 2 V i ặ i m n y th 2 lo i P.

quinquefolius và P trifolius thuộ v hi Panax v m i qu n hệ gần v i hi

Aralia Đ i hiếu v i ặ i m ủ hi kh thuộ họ Ar li e e, t giả ghi

nh n một ặ i m ặ iệt n r s kh iệt gi hi Panax so v i hi kh l

th n ạng ủ Qu , t giả huy n lo i th n ạng ủ tr y hi

khác vào chi Panax, ồng th i huy n một s lo i kh ng th n ạng ủ r kh i

chi Panax Nh v y, hi Panax có 3 ặ i m qu n trọng l m s ph n iệt v i

hi kh trong họ Ar li e e l : th n ạng ủ, i 5, xếp l p, ầu 2 V i qu n

i m trên, t giả huy n 61 lo i r kh i hi Panax, v hi n y hỉ n lại

loài: P trifolium L., P quinquefolius L., P.ginseng Mey., P pseudoginseng Wall.,

P japonicus Mey và P bipinnatifidus Seem V i lo i P fructicosus ặ i m l

4

i xếp v n, Seem nn xếp v o hi Nothopanax v ồng th i lấy lo i n y l type

danh pháp cho chi Nothopanax [64] C lẽ y l qu n i m nhi u nh nghiên

ứu v hi Panax ho l ph h p h n ả Một lần n khẳng ịnh lại qu n i m

ủ Seem n (1868), H rm (1897) nghiên ứu tất ả ặ i m ủ lo i

S m ph n trên th gi i nh : qu n sinh sản, qu n sinh ng v ho rằng

chi Panax nguồn g từ hi Aralia, i m kh iệt y l th n ạng ủ Britton

v Brown (1913) tiếp tụ xem xét vị tr ph n loại chi Panax v ồng t nh v i qu n

i m ủ Seem n (1868) v H rm (1897), hỉ r loài P quinquefolius ặ i m

ại iện ho hi: th n ạng ủ, ho m u 5 xếp l p, ầu 2 , v lo i m tả lần

ầu tiên, nên lấy lo i này làm type danh pháp cho chi Panax [48] Hoo (1961) khi

nghiên ứu v hệ th ng họ , m i qu n hệ ph t sinh v ph n ủ t xon trong họ

Ar li e e ho rằng Panax nguồn g ph t sinh từ Acanthopanax Vì Acanthopanax ặ i m ho m u 5, l l ng ứng mọ trên g n l , th n thảohay th n ạng y ụi nh T giả ho rằng ặ i m th n thảo l ặ i m t ng

ồng qu n trọng nhất, các loài Aralia hầu nh kh ng ặ i m n y Qu n i m

n y ủ Hoo hầu nh kh ng nh n s ồng t nh ủ nh nghiên ứu v

Panax [50].

N m 1970, H r một lần n xem xét ặ i m ủ hi Panax trên m u

v t ủ lo i thuộ hi Panax h u Á thu ngo i t nhiên ũng nh

trên m u l u gi Bảo t ng th v t Qu , t giả th ng nhất v i qu n

i m nghiên ứu tr v ặ i m ủ hi Panax: th n ạng ủ, ho m u 5 xếp

v n h y xếp l p, ầu 2 v m i qu n hệ gần v i hi Aralia Tuy nhiên, theo tác

giả lo i trong chi Panax ặ i m h nh th i iến ổi rất l n so v i

ph n loại kh trong họ Ar li e e Do , việ ịnh loại lo i trong hi Panax

l việ rất kh kh n nếu hỉ v o một ặ i m h nh th i n o Theo t giả

ph n iệt lo i thuộ hi Panax, tr tiên xếp lo i v o 1 trong 3 huẩn h nh th i

ủ th n rễ (Rhizome type): th n rễ ạng th n ủ ( rot type); th n rễ t kéoi; v th n rễ t ng n nh t tr Tiếp theo l ặ i m h nh th i l ,

i, tr ng, s l ng hỉ nhụy, quả C h ph n loại v o h nh th i th n rễ tr

5

rồi m i ến ặ i m qu n sinh ng v sinh sản Xiang và Lowry(2007) p ụng x y ng kh ph n loại hi Panax Trung Qu [47].

Wen (1993), Wen v Zimmer (1996), Plunkett v ộng s (1996) v o

ặ i m h nh th i, h nh th i giải ph u, hạt phấn v sinh họ ph n tử ho rằng hi

Panax m i qu n hệ gần gũi v i hi Aralia Đến th i i m hiện n y, hệ th ng

qu n i m v o h nh th i, giải ph u v sinh họ ph n tử u th ng nhất v ho

rằng hi Panax m i qu n hệ gần v i hi Aralia, i m kh kh iệt hủ yếu ễ

ng nh n thấy so v i hi Aralia là th n ạng ủ, l kép h nh h n vịt, noãn 2-3 [74,76]

S u n m 1970, vị tr ph n loại v hệ th ng ph t sinh ủ hi Panax hầu nh

kh ng th y ổi Tuy nhiên o ặ i m h nh th i iến ổi rất l n, ng y trong mộtloài v ng ph n kh nh u th ặ i m h nh th i ũng kh nh u [47],ồng th i ng y ng nhi u ph t hiện m i nên từ ến n y, việ ghi nh n s

l ng lo i trong hi Panax s th y ổi theo th i gi n v t y v o qu n i m ủcác nh nghiên ứu Ở nử ầu ủ th p niên 1970, qu n niệm v th nh phần lo i

S m h u Á ủ nh nghiên ứu ũng rất kh nh u v s ổ sung nhi utaxon m i Gần y, qu n hệ ph t sinh gi t xon thuộ hi Panax x y

ng kh ng hỉ v o ặ i m h nh th i m n sử ụng tr nh t ADN m

vạ h (hoặ gọi l hỉ thị ADN – DNA barcode), tuy v y v n h s th ng nhất

gi nh m t giả C th nh n thấy s kh nh u gi qu n i m ph n loại

v s l ng lo i, s sp xếp v ph n hi lo i v i lo i trong hi Panax qua

th i k th o nguyên nh n s u: t nh ạng v h nh thái trong chi

Panax; qu n i m v hệ th ng ph t sinh v o ặ i m h nh th i rất ạng;việ sử ụng DNA r o e kh nh u h tr ho nghiên ứu ph n loại; smặt ủ t xon m i ph t hiện

C t xon thuộ hi Panax ã iết u l i t ng gi trị sử ụng cao

v xem l ―thần uộ s ng‖ [42], o v y h ng loạt ng tr nhnghiên ứu trên thế gi i v ũng nh Việt N m tiến h nh nhằm th ẩy sản

6

xuất, kh i th , sử ụng hiệu quả Nhi u nhất l nghiên ứu v th nh phần h

v l , tiếp ến l nghiên ứu v nh n gi ng, nh t , hế iến, hệ th ng

họ th v t, ạng i truy n, ảo tồn ạng nguồn gen Do kh nhi ucông trình nghiên ứu ng trên tạp h , s h huyên khảo v th ngtin trên ph ng tiện ại h ng liên qu n ến Sâm Nói cách khác, các loài Sâm

l i t ng th v t một s u n h t l n i v i nh ng ng i l m ng tnghiên ứu trong nhi u l nh vụ trên to n thế gi i Nh ng ng tr nh nghiên ứu v

s m v n ng tri n kh i ho nh ng ph t hiện ột ph v mặt th nh phần

lo i gần y kh ng nhi u

1.1.2 Các nghiên cứu phân loại chi Panax L sử dụng sinh học phân tử

Hiện n y, xu h ng hung ủ thế gi i trong nghiên ứu ph n loại n i hung

v ph n loại th v t n i riêng ứng ụng nhi u ph ng ph p ải tiến m nghiệu quả o, trong việ sử ụng DNA r o e trong nghiên ứu m i qu n

hệ i truy n, x ịnh hỉ thị ph n tử v vị tr ph n loại ủ t xon thunhi u th nh t u Tổng h p nghiên ứu v ph n loại v qu n hệ ph t sinh

t xon thuộ hi Panax v o ADN r o e th nh n thấy một s h ngnghiên ứu h nh trong việ họn lọ v ng ảo thủ o ph n t h, nh gi

Ở h ng nghiên ứu thứ nhất, nh nghiên ứu sử ụng tr nh t v ng gen

ảo thủ n lẻ (DNA r o e n) ph n t h Fushimi v ộng s (1996) sửụng tr nh t gen 18S rRNA ph n iệt 3 lo i Panax là P ginseng, P japonicus

và P quinquefolius ho thấy h ng kh nh u vị tr 497, 499, 501 v 712 trên

v ng tr nh t 18S rRNA ng hi u i 1809 p [44] Wen và Zimmer (1996) khinghiên ứu v qu n hệ ph t sinh v ị th v t hi Panax khảo s t 12 lo i

Panax v i 6 huẩn ngoại thuộ hi Aralia, kết quả hỉ r rằng tổng hi u ivùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 iến ộng từ 606 ến 608 p trong ITS1 l 220-221

bp, 5,8S là 163bp và ITS2 là 222-224 p Từ t giả hỉ r hi Panax có

qu n hệ gần v i hi Aralia Kết quả v qu n hệ ph t sinh trên v ng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 theo ả h i ph ng ph p Neigh or joining v M ximum likelihood cho

thấy: P trifolius tá h iệt kh i nh m t xon Panax n lại th nh nhánh riêng

7

t ng t nh huẩn ngoại Aralia racemosa; P stipuleanatus và P pseudoginseng l p nh

m v i nh u tạo nh nh l n riêng t h kh i nh nh t xon n lại gồm 2 nh nh: nh nh thứ nhất

hỉ P notoginseng v nh nh thứ h i gồm 3 ph n nhánh:

(1) l nh m gồm P sinensis, P major và P stipuleanatus 2; (2) l nh m gồm P.

omeiensis, P zingiberensis, P stipuleanatus 1 và P wangianus; (3) l nh m gồm:

P ginseng, P quinquefolius và P japonicus. Đi u ng l u trong y qu n hệ

phát sinh trên là hai taxon P stipuleanatus 1và P stipuleanatus 2 dù mang cùng tên

nh ng lại l p nh m v i t xon rất kh nh u v theo t giả l l p nh m v i

t xon ng khu ph n (P stipuleanatus1 v i P omeiensis Si hu n v P.

stipuleanatus 2 v i P major Hu ei, Trung Qu v n h nh u khoảng 1000km) Kết quả n y từng l m t giả phải suy xét ến s tạp nhiễm héo ADNtrong ph ng th nghiệm v phải giải tr nh t lại t i khẳng ịnh S u khi nghiên

ứu thêm v h nh th i, t giả nh n thấy t nhất lo i P major, P omeiensis

và P stipuleanatus ạng l hét xẻ th y v n l ặ i m m Seem nn m tả

cho loài P stipuleanatus v o n m 1868 [76].

Ngan F v ộng s (1999) khuế h ại v x ịnh tr nh t trong v ngribosome ITS1-5,8S-ITS2 ủ 6 lo i Panax gồm P ginseng Mey., P quinquefolius L.,P notoginseng (Burkill) Chen, P japonicus Mey., P trifolius L và P major

Ting Kết quả giải tr nh t ho thấy 6 t xon nghiên ứu s s i kh nh u v tr nh

t v ng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 C t giả ũng sử ụng k thu t RFLP ph n

t tr nh t vùng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 nhằm x y ng ph ng ph p nh n ạng

t xon khảo s t ng v i h i lo i th ng ng l m giả l Mirabilis jalapa L và Phytolacca acinosa Rox Kết quả l ph ng ph p n y th s h u ụng trong

ph n iệt h i lo i P ginseng và P quinquefolius v i nh u v v i nguyên liệugiả [59]

Y ng v ộng s (2001) so s nh tr nh t v ng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 3thứ thuộ lo i P ginseng l thứ J kyung gồm 2 hủng n ng nghiệp Yunpoong vChunpoong; thứ Chunggyung v thứ Hw ngsook Kết quả ho thấy thứ Hw ngsook

ặ tr ng i quả m u v ng kh iệt hủng n lại vị tr nu leoti e 14 (G

8

th yv À) Trong nghiên ứu n y, t giả ũng sử ụng các tr nh

t nghiên ứu ph n t h qu n hệ ph t sinh gi liệu Gen nk kết h p v i

t xon [80]

Kim v ộng s (2007) so s nh tr nh t v ng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 09

hủng n ng nghiệp P ginseng kh nh u ng v i h i lo i P japonicus và P.

quinquefolius Kết quả so s nh n y ho phép ph n iệt lo i khảo s t i 3 vị tr

h nh nu leoti e n ồng th i ho phép ph n iệt h i hủng Nh n s m h nh ủ

H nQu l Gopoong v Kumpoong kh i hủng kh i một vị tr h nh ntrên v ng tr nh t ITS1-5,8S rRNA -ITS2 u i 619 nu leoti e tất ả

m u Từ kết quả n y ũng ho thấy v ng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 kh ng hỉ th h

h p trong ph n iệt lo i m n th ph n iệt hủng n ng nghiệp chi

Panax [52].

Wang v ộng s (2010) trên một h nh nu leoti e n tr nh t ti u

n vị yto hrome oxi se trên ộ gen ty th ph n iệt hủng ―Chunpoong‖

thuộ lo i Panaxginseng v i hủng kh Nh v y, việ sử ụng DNA r o e

n trong ph n loại, x ịnh taxon và ph n t h qu n hệ ph t sinh hủ yếu trênvùng gene ITS1-5,8S rRNA-ITS2 v v i tr nh t n y, th ph n iệt

taxon trong chi Panax v i nh u [73]

Ở h ng nghiên ứu thứ h i, nh nghiên ứu sử ụng tr nh t v nggene lạp th ph i h p v i v ng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 ph n t h Đi n h nh hoviệ sử ụng ITS1-5,8S rRNA -ITS2 n lẻ trong nghiên ứu qu n hệ ph t sinh hi

Panax là hai nhà nghiên ứu Wen v Zimmer (1996) m rộng nghiên ứu ằngviệ ph i h p nhi u ADN r o e nghiên ứu qu n hệ ph t sinh hi Panax [75].

Cũng theo ph ng thứ n y, Zuo v ộng s (2011) khảo s t 11 lo us DNA

r o e, kết quả h nh th nh nên một hệ th ng x ịnh lo i s m h nh x vhiệu quả ho ả h i mụ h th ng mại v ảo tồn C t giả sử ụng 95 m u

s m ại iện ho tất ả t xon thuộ hi Panax ghi nh n Việ giải tr nh t

barcode atpF-atpH không thành ng o ấu tr poly-N Tuy nhiên các vùng rbcL,

rpoB, và rpoCl nh n thấy l t iến ộng nhất, hỉ từ 1 ến 8 vị tr iến

9

ộng C t giả sử ụng matK, psbK-I, psbM-trnD, rps16 và nadl ph n iệt

từ 4 ến 6 trong s 8 lo i riêng iệt nh ng hỉ ph n iệt từ 1 ến 5 trong s 19

t p h p trong nh m thuộ lo i P bipinnatifidus C hỉ thị ph n tử psbA-trnH và

ITS l nh ng v ng iến ộng nhất v khả n ng ứng ụng t t trong x ịnh ả

mứ ộ lo i v nh m lo i Ngo i r , t giả ũng ã hứng minh việ kết h p

psbA-trnH v ITS l hiệu quả ho việ x ịnh tất ả lo i v t p h p lo i

trong chi Panax Trong nghiên ứu n y, t giả hỉ r rằng v i ph ng ph p khuế h

ại ủ m nh, 100% m u th khuế h ại v giải tr nh t th nh ng Ở

nh m nghiên ứu thứ , nh nghiên ứu sử ụng tr nh t v ng gen lạp th

ph i h p v i v ng gene 18S ri osome RNA ph n t h [84]

C th nh n thấy xu h ng nghiên ứu huy n ần từ sử ụng DNA

r o e n (18S rRNA) s ng việ ph i h p thêm DNA r o e kh nghiên

ứu qu n hệ ph t sinh hi Panax Kom tsu v ộng s (2001) sử ụng tr nh tgene 18S rRNA trong nh n v gen lụ lạp matK khảo s t qu n hệ giP.

vietnamensis v i 5 t xon kh gồm P ginseng, P japonicus, P pseudoginseng subsp himalaicus, P japonicus var major và P quinquiefolius v i huẩn ngoại l

loài Hedera hexlix Kết quả ho thấy tr nh t gene 18S rRNA P vietnamensis là

1809 p gi ng hệt v i P quinquefolius v i u hiện s th y thế nucleotid so v i

ả P japonicus var major và P pseudoginseng subsp himalaicus Gen matK có

hi u i ằng nh u ả 6 t xon Tr nh t n y ủ P vienamensis kh iệt so v i

P japonicus var major, P pseudoginseng subsp himalaicus, P ginseng, P.

japonicus và P quinquefolius lần l t 4, 5, 9, 9 v 10 vị trí nucleotid Thông qua

ph ng ph p M ximum p rsimony, y ph t sinh x y ng lại trên phân

t h tổ h p ả h i gen 18S rRNA - matK, kết quả ho thấy P vietnamensis thuộ

ng nh m v i lo i Panax kh v qu n hệ gần v i P japonicus var major

và P pseudoginseng subsp himalaicus [55].

Shu v ộng s (2003) m tả một thứ m i ủ P vienamensis là P vienamensis var fuscidiscus trên tr nh t nu leoti e ủ gene 18s rRNA v

matK C tr nh t n y xem xét ph n iệt P vietnamensis var fuscidiscus

10

v i sáu lo i kh thuộ hi S m Qu n hệ ph t sinh gi P vietnamensis var fuscidiscus v lo i kh l m rõ v P vietnamensis var fuscidiscus có

m i qu n hệ rất gần v i P vietnamensis [67] Shu và ộng s (2003) khảo s t qu n

hệ ph t sinh ủ 13 lo i thuộ hi Panax trên tr nh t gen lụ lạp matK và gen

trong nhân 18S rRNA Chi u i ủ gen trnK iến ộng từ 2537 ến 2573 p t y

v o từng lo i, trong khi tr nh t gen matK là ịnh 1512 p tất ả loài

Tr nh t gen 18S rRNA hi u i 1808 – 1809 p, hỉ 9 ki u tr nh t gen 18SrRNA qu n s t 13 lo i kh nh u Ph n t h m i qu n hệ ph t sinh, t p

h p liệu v gen trnK và matK r m i qu n hệ ph t sinh lo i

trong chi Panax v i nh nh l n hỉ r t ng ứng v i 3 nh m l n t xon[66] Trong y qu n hệ ph t sinh gi t xon so s nh, i m ần l u l h i

taxon có cùng tên P japonicus nh ng nguồn g kh nh u (từ Nh t Bản v từTrung Qu ) lại thuộ h i nh nh l n kh nh u T xon i lo i P pseudoginseng subsp himalaicus thu th p từ v ng kh nh u lại thuộ ng nh nh l n v i P.

japonicus nguồn g từ Trung Qu , trong khi h nh lo i P pseudoginseng lại

ng v i lo i P stipuleanatus l p th nh một nh nh C t giả l giải rằng t xon P.

pseudoginseng subsp himalaicus H r (1970) xem l i lo i ủ lo i P.

pseudoginseng n t giả Wu v ộng s xếp th nh một thứ ủ P japonicus là

h rõ v mặt nh ph p, ần giải quyết vấn n y ng v i việ ặt lại tên cho P.

japonicus nguồn g từ Trung Qu [66]

Qu n v ộng s (2003) ã trên s tr nh t gen matK và 18S rRNA

kết h p v i th nh phần h họ hứng minh một h rõ r ng lo i S m mọ ại

My m r h nh l P Zingiberensis [61].

1.2.1 Các loài thuộc chi Sâm (Panax L.) đã được ghi nhận ở Việt Nam

 Sâm vũ d ệp:

Tên kho họ ủ lo i S m vũ iệp

Berthol C rl Seem nn x ịnh lần ầu tiên l

nh th v t họ ng i Đứ Panax

bipinnatifidus Seem vào

11

n m 1868 [64] Đến n m 1879, Ch rles B ron Cl rke huy n lo i n y s ng hi

Aralia v lấy tên l Aralia bipinnatifidus (Seem.) C B Clarke, 1879 [33] Sau

Cl rke n Is Henry Burkill lại xếp S m vũ iệp ng lo i v i S m M song

l một thứ kh ủ Aralia quinnquefolia (L.) Dec Et Plan var major Burkill 1902

(Kew Bull 1902:7); Aralia quinnquefolia (L.) Dec Et Plan var elegantior Burkill.

1902 (Kew Bull 1902:8) [29] Qu n i m trên tồn tại ến gần gi thế kỷ 20, khiHui-Lin (1992) nghiên ứu hệ th v t Đ ng Á, ng S m vũ iệp tr lại hi

Panax L., y l một qu n i m ng n nh nghiên ứu ồng t nh Từ

ến n y, mặ S m vũ iệp th xếp v o lo i, lo i phụ hoặ thứ (v r.)

kh nh u, nh ng lo i n y v n thuộ hi Panax L Nh ng tên kho họ kh nh u

ủ lo i S m vũ iệp th k ến nh : Panax pseudoginseng Wall var

bipinnatifidus (Seem.) Li., 1942; Panax pseudoginseng Wall var major (Burkill)

Li, 1942.; Panax major Ting ex Pei, 1958.; Panax pseudoginseng Wall subsp.

hymalaycus Hara, 1970.; Panax pseudoginseng Wall var elegantior (Burkill) Hoo

et Tseng, 1973.; Panax japonicus Mey var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng,

th ng nhất rằng S m vũ iệp l một t xon lo i ho n hỉnh, trên s ổ sung một

s hỉ thị ADN Vì thế, S m vũ iệp lại tr lại v i tên kho họ l Panax

bipinnatifidus Seem. o Berthol C rl Seem nn x ịnh từ n m 1868

(Panax pseudoginseng var bipinnatifidus Hoo et Tseng) ng v i lo i S m vũ iệp.

V s u, khi ầy ủ n liệu, T m thất ho ng ng l lo i m i i v i

kho họ (Panax stipuleanatus H Ts i et M Feng, 1975) i một nh m ác nhà

th v t họ Trung Qu Đến n m 2000, trong một ng ủ Jun Wen, t giảũng thừ nh n T m thất ho ng l một lo i ộ l p v i tên kho họ

m tả một thứ m i ủ Panax vietnamensis H & Grushv v ặt tên l Panax vietnamensis var fuscidiscus K Kom tsu, S Zhu & S.Q C i, ph n V n N m,Trung Qu Thứ n y kh v i thứ huẩn 4 vị tr nu leoti trên gen trnK (01

nu leoti trên v ng m rộng 5’, 02 nu leoti trên v ng gen m tK v 01 nu leotitrên v ng rộng 3’) Trên s ph n t h liệu gen trnK và 18S-rRNA ho thấy

h i thứ ủ lo i S m ngọ linh P vietnamensis Ha & Grushv var vietnamensis và thứ P vietnamensis var fuscidiscus K Kom tsu, S Zhu & S.Q C i m i qu n hệgần gũi v hung nh nh v i P zingiberensis nguồn g V n N m (Trung

Qu ) [67]

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chi Sâm (Panax L.) ở Việt Nam

Mặ l nh ng lo i y thu gi trị nh ng ng tr nh nghiên ứu v

th v t Việt N m v Đ ng D ng từ th i Ph p thuộ v n h ghi nh n ph n

t nhiên ủ lo i thuộ hi Panax Việt N m Đến n m 1964, Viện D liệuthu một s m u ủ lo i y thu tên l ―Ph n xiết‖ o ồng o ng i

D o v M ng S P gi i thiệu [17] Th ng 7 n m 1964 nh th v t họ ng i

13

Trung Qu Ngô Chỉnh D t gi m ịnh tiêu ản thuộ hi Panax L l u gitại Viện D liệu, trong m u s NIMM.911 và NIMM.348 thu xã Tả Ph nhuyện S P tỉnh L o C i ng y 14 6 1964 x ịnh tên kho họ l Panax bipinnatifidus Seem Đến n m 1969, lo i n y m i Grushvitzky v ộng s

ng trong một loạt ng tr nh nghiên ứu v họ Ar li e e mi n B ViệtNam [7, 46] Từ , S m vũ iệp ghi nh n trong tất ả t i liệu v ythu v hệ th v t Việt N m

Panax ặ h u ủ khu hệ th v t Việt N m l S m ngọ linh – Panax

vietnamensis H & Grushv trên m u thu th p v ng n i Ngọ Linh (KonTum v Quảng N m) [6]

Đến n m 1993, khi xuất ản ộ ―C y Việt N m‖ Montre l (C n ),Phạm Ho ng Hộ m tả 3 lo i thuộ hi Panax L. Việt N m l S m h i lần

hẻ - P bipinnatifidus Seem Ho ng Liên S n, S m nh t – P japonica (Nees)

Meyer có L ng i n, Kon Tum v Giả nh n sâm – P pseudoginseng W ll.

Sa Pa [11] Trong lần t i ản v o n m 2000, ngo i h i lo i S m h i lần hẻ v Giảnhân sâm, Phạm Ho ng Hộ n ổ sung thêm một lo i S m ngo linh – P.

vietnamensis Ha et Grushv c Gi L i – Kon Tum C n lo i S m Nh t ng ghi

L ng i n v ả Kon Tum Nh v y theo Phạm Ho ng Hộ, trên ị ản tỉnh KonTum hoặ Gi L i – Kon Tum ũ, ả h i lo i S m nh t v S m ngọ linh Còn

i v i S m nh t Kon Tum, ng kh ng ghi rõ nguồn m u x ịnh v n i ph n

ụ th , i u n y g y tr ngại ho việ x ịnh lo i S m nh t k trên th s

ph n t nhiên Việt N m h y kh ng Trong khi , theo qu n i m ủ H ThịDụng (1996), lo i S m nh t o Phạm Ho ng Hộ từng ghi nh n L ng i n ũng

h nh l S m việt n m h y S m ngọ linh m i H Thị Dụng v Grushvitzky

14

ng l

lo i m i i v i kho h

ọ v ặt tên l P vietnamensis Ha et Grushv.,

1985 [7]

N m 2005, s u khi nghiên ứu v hệ th ng lại lo i thuộ hi Panax L Việt N m, t

giả Nguyễn T p kết lu n hi Panax L Việt N m 5 lo i, trong 3 lo i mọ t nhiên l S m vũ iệp – P bipinnatifidus Seem., T m thất ho ng –

P stipileanatus H.T.Tsai et K.M.Feng và S m ngọ linh – P vietnamensis Ha et

Grushv C ng v i h i lo i nh p trồng l Nh n s m – P ginseng v T m thất P.

notoginseng Đồng th i ũng h nh thứ m tả lo i T m thất ho ng – P.

stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng Từ ến n y, trong t i liệu nh : ―C

lo i y thu ần ảo tồn‖, ―D nh lụ y thu Việt N m‖, ―D nh lụ th v tViệt N m‖ u p ến lo i T m thất ho ng – P stipuleanatus H.T.Tsai et

K.M.Feng k trên [17, 18]

Đến n m 2013, Ph n Kế Long & s ghi nh n ổ sung ho hệ th v t

Việt N m thứ P vietnamensis var fuscidiscus K.Kom tsu, S.Zhu & S.Q.C i v n

ph t hiện tr V n N m, Trung Qu Nh m nghiên ứu ph t hiệnmột s i m ph n ủ thứ lo i n y tại M ng Tè, T m Đ ng v S n Hồ tỉnh

H.T.Ts i et K.M.Feng ( trên tr nh t v ng gen ITS-rDNA) C m u ặ

i m hung l l từ kh ng xẻ th y ến xẻ th y 1 lần (th y n ng hoặ s u); u ng l

có lá kèm [16] Đến n m 2016, Trần Ngọ L n v ộng s nghiên ứu ặ i m

h nh th i, th nh phần h họ v hỉ thị ADN ủ m u gọi l "S mpux il ileng" ũng thu th p ị i m trên Nghiên ứu ho thấy m u n y

m i qu n hệ gần gũi v i S m ngọ linh (Panax vietnamensis), kh x v i T m

thất ho ng (Panax stipuleanatus) v S m vũ iệp (P bininnatificus) v kết lu n

"S m pux il ileng" thuộ lo i hoặ i lo i ủ S m ngọ linh – Panax

vietnamensis Ha et Grushv C m u n y t giả ho rằng ặ i m ặ

tr ng ph n iệt v i "T m thất ho ng" ặ i m "th n rễ m ng t mọ ng 1

h ng, khi sấy kh th ng ẻo v huy n m u en" trong khi lo i "T m thất

ho ng" "th n rễ t th ng mọ so le, khi sấy kh th ng ứng v huy n

m u tr ng" [14] Tuy nhiên nh ng ặ i m qu n trọng kh lại h m tả

N ng V n Duy & s (2016) khi nghiên ứu ặ i m h nh th i v hỉ thị

ph n tử v ng gen ITS1-5.8S-ITS2, 18S rRNA và matK ủ h i quần th "S m

l ng i ng" ph n o nguyên L m Viên (n i L ng Bi ng, L m Đồng) ng

y l thứ m i ủ lo i S m ngọ linh v ặt tên l P vietnamensis Ha &

Grushv var langbianensis N.V Duy V.T Tran & L.N Trieu [8].

1.2.2 Nghiên cứu phân loại các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam sử dụng sinh học phân tử

Việ sử ụng hỉ thị ph n tử nh RADP, SSR, ISSR trong ph n loại vphân t h qu n hệ ph t sinh gi t xon th v t Việt N m tri n kh ikhá nhi u, tuy nhiên trên i t ng t xon Panax th hỉ ghi nh n nghiên

ứu ―Sử ụng hỉ thị ph n tử ADN kết h p v i ấu hiệu h nh th i trong nghiên

ứu ph n loại một s y thu Việt N m‖ o Viện D liệu hủ tr v TS.Nguyễn V n T p l m hủ nhiệm Trong ng tr nh n y, v i qu n i m lo i

s m mọ t nhiên tại Việt N m l P vietnamensis, P bipinnatifidus và P.

16

thuộ lo i P bipinnatifidus v nh m thứ gồm m u l hét nguyên thuộ

loài P stipuleanatus trong y qu n hệ ph t sinh D trên hệ s t ng ồng itruy n gi m u v s l p nh m ủ h ng, m u l xẻ trung gi n l thuộ

loài P bipinnatifidus Khoảng h i truy n gi P vietnamensis và hai loài P.

vietnamensis var vietnamensis v i lo i trong hi Panax trên kết quả ph n

t h th ng tin i truy n oạn gen ITS-rDNA Kết quả ho thấy P vietnamensis có

m i qu n hệ i truy n gần gũi v i lo i P notoginseng v h ng kh nh u 18nucleotide [22]

N m 2016, Lê Ngọ Triệu và cs sử ụng hỉ thị ph n tử inter simplesequen e repe t nh gi ạng i truy n v iến ị ủ 46 th ủ quần th

S m l i h u ph n t nhiên Việt N m Kết quả nh gi ộ ạngquần th o v i mứ He = 0.2300, I = 0.3665 v PPB = 9698% Kết quả ũng

ho thấy nh m th tr ng th nh mứ ộ ạng i truy n o h n so v i

nh m th tuổi nh , s iệt h i truy n o (Gst = 0.0499) v i khoảng h

i truy n gi nh m tuổi l 0.0298, hệ s t ng ồng gi th ủ nh m

17

tuổi l n ltrung nh so v i s suy

ạng

nh m tuổi nh Nghiên ứu

i truy n v iến ị ủ quần th

nh gi

S m l ichâu [56]

1.3 Tổng quan về phương ph p nghiên cứu

1.3.1 Các loại chỉ thị và dấu chuẩn trong nghiên cứu thực vật

Ng y n y, trên thế gi i, nh m thu nguồn g từ thảo mộ ng y

ng qu n t m ph t tri n nh v o t nh n to n ũng nh l i thế v hi ph sảnxuất ủ h ng Thị tr ng thế gi i v thu nguồn g thảo mộ , o gồm ả

liệu th , t nh ạt trung nh 62 tỷ l M một n m Ư t nh ến n m

2050, o nh thu ủ thị tr ng n y th ạt ến 5000 tỷ l M (K lp n ,2004) Trong ho n ảnh , việ hứng minh s kho họ v tiêu huẩn ho

ng nghệ o hế thu từ thảo v i tr hết sứ qu n trọng C sản phẩm

từ thảo th ng kém ổn ịnh v th nh phần v t nh, tr i ng v isản phẩm t n tổng h p nh n tạo từ ho hất tinh khiết v quy tr nh

ng nghệ ổn ịnh Ch nh v v y, ng t ki m ịnh v ảm ảo hất l ng nguồnnguyên liệu n ầu l yêu ầu thiết yếu tạo loại thu nguồn gthảo v i hất l ng ổn ịnh v n to n

Việ nhầm l n lo i thảo v i nh u trong qu tr nh thu h i, hế iến

v sử ụng l hiện t ng h y gặp, o trong t nhiên th tồn tại nhi u lo i h nh

th i t ng t kh ph n iệt Thêm n , trong nhi u n n y họ ổ truy n kh nh u,một y liệu th gọi ằng nhi u tên kh nh u hoặ y liệu

kh nh u lại tên tr ng nh u V v y, yêu ầu tr tiên i v i ng nh ngnghiệp hế iến thu từ thảo l phải x ịnh h nh x nguồn nguyên liệu

n ầu C nhi u ph ng ph p ịnh loại y liệu, nh sử ụng hỉ thị

S ph t tri n ủ ng nghệ sinh họ ung ấp thêm nh ng ng ụ m i ho ng t ịnh loại

thảo trên hỉ thị ADN Nh ng hỉ thị ADN th ng ng th k ến l RFLP (Restri te Fr gment Length

Polymorphism), RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP-PCR, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence

Repe t) C hỉ thị ADN nhi u l i thế ng k so v i hỉ thị ảm qu nhoặ ho họ vn hầu nh kh ng ị ảnh h ng i yếu t m i tr ng, ngoạiảnh, tuổi y h y t nh trạng sinh l khi thu h i Đồng th i, sử ụng hỉ thịADN n th nh gi mứ ộ ạng i truy n trong lo i y thu

Nh v y, sử ụng hỉ thị ADN tr hết sẽ gi p ho việ ph n t h h nh xcác loài cây thu h y gi loại liệu g y nhầm l n H n n , v i việ nh

gi v mứ ộ ạng i truy n trong lo i n l s họn tạo gi ng

y thu n ng suất o, ũng nh trong việ ảo tồn h nh x nguồn genquý

1.3.2 Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự ADN bảo thủ trong phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật

Hệ th ng h l qu tr nh th m , m tả v giải th h t nh ạng ủ thế

gi i sinh v t V o n m 1758, Linn eus x y ng hệ th ng ph n loại m ng t nhthứ t tr khi ph t tri n họ thuyết tiến h S xuất hiện v ph t tri n ủ kthu t ph n tử m ặ iệt l phản ứng hu i polymer h - PCR h nh th nh nênmột l ng l n liệu sẵn s ng ho việ giải tr nh t ADN v k thu t l mnảy sinh ADN fingerprint T nh phổ iến ủ liệu ph n tử trên Gen nk hiện

n y cho phép m rộng ph n t h r t xon kh ngo i t xon thu

m u Nhi u ạng ặ i m m ng t nh th ng tin, ặ iệt l tr nh t ADNứng ụng trong nghiên ứu m i qu n hệ ph t sinh v qu tr nh tiến h th

19

v t C th v t o m ng trong n ộ gene: ộ gene trong nh n, ộ gen ty

th v ộ gen lạp th Tỷ lệ th y thế nu leoti e ộ gen n y xảy r kh ngồng u [53] Tỷ lệ th y thế nu leoti e m i ộ gen nh gi th ng

qu việ qu n s t th y thế nu leoti e h ng loạt th v t một v h i l mầm[78] Bộ gene ty th mứ ộ th y thế nu leoti thấp nhất, trung nh khoảng (0,2

- L,l) X 10-9 th y thế ho một vị tr trong một n m Bộ gene lạp th mứ ộ th ythế nh nh h n h t t, khoảng (1,1 - 2,9) X 10-9 thay thế ho một vị tr trong một

n m Tr i lại, ộ gene trong nh n tỷ lệ th y thế nu leoti e nh nh h n gấp 150 lần

hi phần ph n tử n lại th nh một v ng LSC (l rge single- opy region) v mộtvùng ssc (small single-copy region) [51] Th nh phần, k h th , ấu trúc và trình

t ủ ộ gene lụ lạp x ịnh l mứ ộ ảo thủ o trong các nghiên

ứu v tiến h T nh ảo thủ o n y hỉ r rằng ất k th y ổi n o v ấu tr ,

h s p x p h y th nh phần u liên qu n mạnh mẽ ếnqu n hệ ph t sinh C

phần kh nh u ủ ộ gene tiến h theo tỷ lệ kh nh u v t ng i h m

mứ ộ tr nh t nu leoti e Nh ng v ng kh ng m h ủ ộ gene lụ lạp tiến hnhanh h n nh ng v ng m h [78] C ột iến t ng oạn h y mất oạn t h lũytrong vùng kh ng m ng m xảy r v i tỷ lệ ng ng v i s th y thế nu leoti e v

nghiên ứu qu n hệ ph t sinh th gene

matK và vùng tr nh t kh ng m v t gồm: gene rbcL, gene atpB,16S rRNA,

Gen matK là gen mã hóa cho protein s tiến h nh nh nằm trên v ng

LSC v i ộ i xấp xỉ 1500 p, ồng phiên m v i gen trnK [31] Gen matK gồm 1

oạn ORF hứ 509 o on nằm trong intron ủ gen matK v ng nh h rõ

hứ n ng C nghiên ứu sử ụng tr nh t gen matK x y d ng y ph t sinh

ho thấy gen matK t nh ạng h n nh ng gen khác có trong lụ lạp, o trthành gen m rker qu n trọng gi p ph n loại th v t B i gen matK th ễ

ng khuế h ại ng v i v ng intron kh ng m ng m h i ầu ủ n , mrộng tr nh t lên ến 2400-2700 p nên việ sử ụng v ng n y ứng ụng nhi utrong nghiên ứu qu n hệ ph t sinh gi lo i v trong một lo i [69] Mặt khác,

một phần gen matK ũng th ng sử ụng x y ng qu n hệ ph t sinh [84]

+ C tr nh t ảo thủ ộ gene trong nh n: Bộ gene trong nh n k h

th l n nhất trong s ộ gen th v t (1,1 X 106 ến 110 X 106 k p) v ogồm rất nhi u gen Phần l n n l nghiên ứu v qu n hệ ph t sinh ằng hỉ thị

ph n tử sử ụng tr nh t ADN ri osome trong nh n, ấu tr n ản ủ ADN

ri osome l một n vị lặp n, m i n vị nh thế th lặp lại ến h ng ng n lầntrong ộ gen Bộ gen trong nh n hứ một v ng s o m ấu tr o gồmkhoảng tr ng ên ngo i v ng s o m (ETS), tiếp theo l gen 18S m h ho ti u

n vị nh và gen 26S mã h ho ti u n vị l n v n ph n h nh u i một gen

nh h n là 5,8S C khoảng tr ng trong v ng phiên m (ITS1 v ITS2) t h r i

nh ng gen vừ p Chi u i ủ v ng m ng m l gi ng nh u th

v t: gen 18S l khoảng 1800 p, 26S l khoảng 3300 p v gen 5,8S l khoảng

160 p Họ gen rRNA hứ v ng ảo thủ o nh 18S, 26S th sử ụngsuy lu n qu n hệ ph t sinh mứ ộ ph n loại o C oạn tiến h

nh nh nh v ng ITS th l thích h p nhất trong so s nh lo i v nh ng

hi gần nh u C tr nh t 18S rRNA th ng sử ụng rộng rãi h n tr nh t26S cho ả h i v ng ng ải ứng ụng rộng nh nh u K h th trên

3000 p ủ 26S rRNA ản tr việ sử ụng n , ặ iệt l trong việ giải tr nh t

21

to n ộ gen Tr i lại, k h th ủ 18S rRNA khoảng 1800 p gi p ho n

u tiên l họn h n khuế h ại ằng PCR v giải tr nh t Th tế ho thấy y

qu n hệ ph t sinh sử ụng tr nh t 18S rRNA kh ồng ạng v i y qu n hệ ph tsinh sử ụng tr nh t rbcL nhi u mứ ộ ph n loại th v t hạt k n [69] Gen 5,8SrRNA ễ ng khuế h ại v giải tr nh t khi sử ụng mồi ịnh vị trêngen 18S v 26S rRNA nh ng t khi sử ụng suy lu n qu n hệ ph t sinh i

t nh ảo thủ o v k h th é (164-165 p) Tỷ lệ vị tr m ng th ng tin ti m

n ng ho ph n t h qu n hệ ph t sinh t ng ng v i gen 18S rRNA

V ng ITS: ITS1 ph n h gen 18S rRNA v i gen 5,8S rRNA còn ITS2phânh gen 5,8S rRNA v i gen 26S rRNA Vùng ITS hiện hu một h rộng r i

i 700 p th v t ho C rất nhi u mồi tổng th thiết kế ho việkhuế h ại v giải tr nh t v ng ITS m tả C tr nh t ITS v n gi u GC

l m ho việ giải tr nh t tr nên kh kh n [26] Việ ho thêm DMSO h y BSA

v o PCR h y phản ứng giải tr nh t m ng lại hiệu quả o [77] C tr nh t ITSạng h n tr nh t ủ gen rRNA th v t hạt k n [82] C tr nh t ITS iếnộng một h hiệu quả ho phép giải quyết nh ng u h i v qu n hệ ph t sinh

nh ng t xon qu n hệ họ h ng gần C tr nh t ITS sử ụng rất th nh côngtrong việ x y ng lại lị h sử tiến h

1.3.3 Các phương pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh

C y qu n hệ ph t sinh x y ng nhằm m h nh h lị h sử tiến h ủmột nh m tr nh t h y sinh v t Việ t i hiện m i qu n hệ ph t sinh th

th hiện ằng ph ng ph p trên khoảng h i truy n hoặ trên

ặ i m nh tr nh y s u y:

+ C c phương pháp dựa trên khoảng c ch

H i thu t to n th ng ụng trên so s nh khoảng h theo ặp l Ph ng

ph p l p nh m kh ng trọng s ng trung nh s họ (UPGMA - unweightedPairGroup Method using arithmetic Averages) [68] v Gom ụm l n n (Neigh orjoining) [63] B ầu tiên trong phép ph n t h n y l t nh to n x y ng m

22

tr n khoảng h theo ặp gi n vị ph n loại khảo s t th ng qu

ặ i m kh nh u v tr nh t ủ h ng Đ hiệu hỉnh, thng th ng ng i t sửụng hiệu hỉnh khoảng h ằng một m h nh tiến h n o , hẳng hạn nh môhình Jukes-Cantor, mô hình Felsentein, m h nh h i th ng s ủ Kimur , m h nhTamura, mô hình Tamura và Nei

Phương pháp Neighbor joining

Thu t to n Neigh or joining sử ụng trong ph ng ph p n y xây

ng y qu n hệ ph t sinh m tỷ lệ tiến h t nh t o v kh nh u gi

ng kh nh u Ph ng ph p Neigh or joining ũng t ng t nh ph ng ph pgom ụm UPGMA, tuy nhiên kh i niệm ụm l n n (gần nh u) kh i khi m

h i tr nht gọi l l n n trong một y nếu nh gi h ng hỉ uy nhấtmột n t Đi un y th hiện nhằm ki m so t t nh hu ng h i n t gần

nh u nhất kh ngphải l l n n nh u trong y th t Neigh or joining xem l

ph ng ph p kh t tv sử ụng rộng r i C thu t to n trong ph ng ph p

23

ho n thiện gi p hoviệ việ xử l t p h p liệu l n tr nên ễ ng h n[63].

Trong khi ph ng ph p trên khoảng h th ng tin tr nh t th nhmột on s n ( i u iễn

khoảng h) th ph ng ph p trên ặ t nh lại g ng suy lu n m i qu n hệ ph t sinh trên to n ộ

ặ t nh riêng lẽ nh nucleotid hay amino acid

Phương pháp Giản tiện tối đa (Parsimony)

Ở ph ng ph p trên nguyên l giản tiện t i , một s l ng

tr x ịnh l m ng th ng tin v h nh th ủ y qu n hệ ph t sinh D

,h nh th t t nhất họn r v o việ giảm thi u h s l ng

th y thế ần thiết giải th h vị tr m ng th ng tin C ph ng ph p

nguyên lý giản tiện t i kh ng trên suy lu n m h nh hi n h [49]

vị

v o

vị trtrên

Phương pháp khả năng đúng cao nhất (Maximum likelihood)

H i ph ng ph p M ximum likelihoo v B yesi n l nh ng ph ng ph psuy lu n v o x xuất [30] Cả h i ph ng ph p n y ặ i m th m nviệ sử ụng m h nh suy lu n v tiến h ph n tử v ho phép r suy

lu n m ng t nh th ng kê nghiêm ngặt Cả h i ph ng ph p n y i h i phải huyên

s u v m y t nh V i ph ng ph p M ximum likelihoo , một m h nh iến ộng vtiến h ph n tử sử ụng ấn ịnh khả n ng ng m ng t nh x xuất trong

m i qu n hệ ph t sinh i v i liệu tr nh t ủ n vị ph n loại ho tr Suy lu n khả n ng ng o nhất v o t m r y qu n hệ ph t sinh

x xuất o nhất i v i liệu [40]

Suy luận Bayesian

Ph ng ph p suy lu n B yesi n trên quy lu t B yes Mụ tiêu ủ

ph ng ph p suy lu n B yesi n v qu n hệ ph t sinh kh ng hỉ l suy lu n r một

qu n hệph t sinh ng m h n n l nh n ầy ủ ph n x xuất v s u

i v ito n ộ qu n hệ ph t sinh khả Đi u n y l nh s kết h p

24

khả n ng ng v i ph n x xuất n ầu ủ th ng s v tiến h Một

l ng rất l n y qu n hệ ph t sinh khả r , ồng ngh v i phân

t h qu n hệ ph t sinh B yesi n ần phải th hiện i ph ng ph p dtrên thu t to n Monte C rlo [81]

Nh v y từ khi t ầu ghi nh n Việt N m ho t i n y, s l ng

lo i v i lo i trong chi Panax L. nhi u th y ổi Đi m qu tất ảnghiên ứu ến th i i m hiện tại th Việt N m lo i v i lo i thuộ hi

Panax L gồm : T m thất (Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen) (lo i nh p trồng); T m thất ho ng (Panax stipuleanatus C T Tsai & K M Feng); S m ngọ linh (Panax vietnamensis var vietnamensis Ha et et Grushv.); Sâm lai châu (Panax

vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai) và Sâm Langbian

(Panax vietnamensis var langbianensis N.V Duy, V.T Tran & L.N Trieu) Ngoài

r n h i t xon h h h n v tên kho họ l t xon v n gọi l S m vũiệp v i h nh th i gi ng T m thất ho ng (Panax stipuleanatus C T Tsai & K M.

Feng), tr nh nhầm l n v i lo i Panax bipinnatifidus Seem chúng tôi tạm gọi l

T m thất l xẻ - Panax sp.1 T xon n lại ph n n i Pux il ileng thuộ huyện

K S n tỉnh Nghệ An gọi v i tên S m pux il ileng, h ng t i tạm gọi l

Panax sp.2 Các loài thứ lo i thuộ hi Panax L. Việt N m u l nh ng ythuộ iện hiếm gặp, v k h th quẩn th nh trên thế gi i ũng nh Việt

N m Đ y l nh ng y thu gi trị sử ụng v gi trị kinh tế o V thế h ng

ị s n t m v kh i th qu mứ Đ l một trong nh ng nguyên nhân làm cho

lo i thứ lo i k trên xếp v o iện k nguy ấp th m h thtuyệt hủng ngo i thiên nhiên (S m ngọ linh) V i mụ tiêu ung ấp nh ng s

v n liệu kho họ phụ vụ ng t ảo tồn v ph t tri n các loài Sâm ViệtNam, ũng nh ng t ịnh nh, ph n iệt các lo i S m ễ nhầm l n, v ki mịnh liệu ủ loài Sâm này, chúng t i l họn t i Nghiên cứu đặc

(Panax L.) mọc tự nhiên ở Việt Nam.

25

Chương 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Ho n thiện

(Panax L.) hiện

liệu ặ i m hình thái và vi ph uViệt N m và nghiên ứu x

hoịnh

loài thuộ

hỉ thị sinh họ

hi S m

ph n tửcho các lo i thuộ hi Sâm này

2.2 Đối tượng, địa điểm và vật iệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các i t ng nghiên ứu thuộ phạm vi ủ Lu n v n n y l loài thuộ

chi Panax L hiện Việt N m gồm:

 C lo i i lo i ph n t nhiên Việt N m:

 T m thất ho ng (Panax stipuleanatus C T Tsai & K M Feng)

 S m ngọ linh (Panax vietnamensis var vietnamensis Ha et et Grushv.)

 Sâm lai châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu &

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

a Đ ều tra n ên cứu n o t ực địa

- Đi u tr , thu th p m u tại v ng rừng thuộ tỉnh L o C i, Hà Giang (T m thất ho ng,

T m thất l xẻ), Quảng N m v Kon Tum (S m ngọ linh), S n La, Lai Châu (Sâm laichâu), Nghệ An (S m pux il ileng)

26