Xác Định Và Đánh Giá Mối Liên Quan Giữa Đa Hình Gen Growth Hormone (Gh) Đến Năng Suất Và Chất Lượng

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi đã chọn đề tài: “XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH GEN GROWTH HORMONE GH ĐẾN NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG SỮA CỦA BÒ HOLSTEIN FRIE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN DI TRUYỀN

- O0O

-XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA

ĐA HÌNH GEN GROWTH HORMONE (GH) ĐẾN

NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG SỮA CỦA BÒ

HOLSTEIN FRIESIAN ( HF) x LAI SIND

Cần Thơ, Ngày … tháng … năm 2010 Cần Thơ, Ngày … tháng … năm 2010

Cần Thơ, Ngày … tháng … năm 2010

DUYỆT KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây Nếu có sai sót gì tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tác giả luận văn

Trần Ngọc Thuận

LỜI CẢM TẠ

Trước tiên, tôi xin gởi lời cảm tạ đến ba, mẹ và chị hai của tôi, những người đã có

ơn sinh thành và luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi được học tập như hôm nay

Họ là những người rất quan trọng với bản thân tôi, nhưng tôi chưa một lần nói được lời cảm ơn với họ

Tiếp theo, tôi xin gởi lời cảm ơn đến tất cả các thầy, cô trong bộ môn Chăn Nuôi và

Di Truyền, những người đã tận tình chỉ dạy, tận tụy trong công việc để truyền đạt

tất cả các kinh nghiệm cho tôi, giúp tôi có được nguồn kiến thức vững chãi trước khi rời ghế nhà trường Đặc biệt, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Thầy

Nguyễn Trọng Ngữ, người đã hướng dẫn tôi làm luận văn này, Thầy là một người

rất tận tụy và luôn lo lắng, truyền đạt tất cả các kiến thức, các kỹ năng trong thời gian tôi thực hiện đề tài này Đồng thời, tôi cũng xin gởi lời cảm tạ đến Thầy

Nguyễn Văn Hớn và Cô Nguyễn Thị Hồng Nhân, Thầy và Cô là hai người Cố

Vấn Học Tập đáng kính với riêng cá nhân tôi và tập thể lớp tôi, người luôn đi với chúng tôi suốt 4 năm dài Đại Học

Cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm tạ rất nhiều đến chị Mai Thị Ngọc Hương và chị Lê Thụy Bảo Quỳnh, 2 chị đã tận tình giúp đỡ cũng như là luôn sẵn sàng chỉ dẫn truyền đạt kinh nghiệm Đồng thời, qua đây tôi cũng gởi lời cảm tạ đến anh Trung, anh Bo là hai người bạn của hai chị, cảm tạ anh Dương Vũ, chị Vũ Thị Kim Anh và tất cả các thành viên đang làm việc tại phòng thí nghiệm thức ăn thuộc bộ môn chăn nuôi

Đặc biệt, tôi xin gởi lời cảm tạ đến tất cả các người bạn học của lớp tôi, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi để tôi có tự tin hơn trong việc học của mình

Chân thành cảm tạ.

Cần Thơ, ngày… tháng 05 năm 2010

Người viết

Trần Ngọc Thuận

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ v

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

TÓM LƯỢC 1

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 2

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình phát triển chăn nuôi bò sữa ở nước ta 3

2.2 Sơ lựơc đặc điểm một số giống bò sữa ở Việt Nam 3

2.2.1 Bò Holstein Friesian (HF) 3

2.2.2 Bò lai F1 (lai HF x lai Sind) 4

2.2.3 Bò lai F2 ( Lai F1 x HF) 5

2.2.4 Bò lai F3 (lai F2 x HF) 5

2.2.5 Sản lượng sữa của các giống bò sữa 7

2.3 Sinh lý tiết sữa ở bò 7

2.3.1 Sự sinh sữa 7

2.3.2 Sự thải sữa 7

2.4 Thành phần sữa bò 8

2.5 Chu kỳ tiết sữa của bò 8

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất của bò sữa 9

2.6.1 Yếu tố di truyền 9

2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường 9

2.6.2.1 Dinh dưỡng 9

2.6.2.2 Thời tiết khí hậu môi trường 9

2.6.2.3 Những yếu tố cá thể 10

2.7 Giới thiệu khái quát về đa hình kiểu gen Growth Hormone (GH) 10

2.7.1 Giới thiệu 10

2.7.2 Cấu trúc 10

2.7.3 Phương pháp nhân gen bằng PCR 11

2.7.3.1 PCR .11

2.7.3.2 Mồi (primer) .11

2.7.3.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 12

2.7.4 Kỹ thuật PCR-RFLP .12

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP .13

3.1 Phương tiện thí nghiệm 13

3.1 Thời gian và địa điểm 13

3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 13

3.2 Đối tượng và phương pháp thí nghiệm 13

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 13

3.2.2 Phương pháp thí nghiệm 13

3.2.2.1 Mẫu sữa: 13

3.2.2.2 Mẫu máu: 14

Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 17

4.1 Kết quả tách chiết DNA 17

4.2 Kết quả nhân gen PCR 17

4.3 Kết quả giải trình gen và phát hiện đột biến gen 18

4.4 Kết quả xác định đa hình gen GH bằng kỹ thuật PCR-RFLP 18

4.5 Tần số allele và kiểu gen quan sát 19

4.6 Tần số allele và kiểu gen theo nhóm giống 20

4.6.1 Tần số allele và kiểu gen theo giống bò lai F1 20

4.6.2 Tần số allele và kiểu gen theo giống bò lai F2 20

4.6.3 Tần số allele và kiểu gen theo giống bò lai F3 + F4 .21

4.7 Các chỉ tiêu năng suất sữa 21

4.7.1 Năng suất sữa theo nhóm giống 21

4.7.2 Năng suất sữa theo lứa đẻ 23

4.7.3 Năng suất sữa theo kiểu gen 23

4.8 Chỉ tiêu về chất lượng sữa 25

4.8.1 Mối liên quan giữa giống và các chỉ tiêu chất lượng sữa 25

4.8.2 Mối liên quan giữa lứa đẻ và các chỉ tiêu chất lượng sữa 25

4.8.3 Mối liên quan giữa kiểu gen và các chỉ tiêu chất lượng sữa 26

Chương 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Đề nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Sản lượng sữa của các giống bò sữa qua một chu kỳ cho sữa 7

Bảng 2.2: Sản lượng sữa của các giống bò sữa qua các lứa đẻ 7

Bảng 2.3: Tỷ lệ phần trăm sản lựơng sữa qua từng tháng cho sữa so với tổng sản lựơng sữa cho cả chu kỳ 7

Bảng 2.4: Thành phần sữa đầu và sữa thường 8

Bảng 4.1: Năng suất sữa theo nhóm giống 22

Bảng 4.2: Năng suất sữa theo lứa đẻ 23

Bảng 4.3: Năng suất sữa theo kiểu gen 24

Bảng 4.4: Mối liên quan giữa giống và các chỉ tiêu chất lượng sữa 25

Bảng 4.5: Mối liên quan giữa lứa đẻ và các chỉ tiêu chất lượng sữa 26

Bảng 4.6: Mối liên quan giữa kiểu gen và các chỉ tiêu chất lượng sữa 27

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Bò Holstein Friesian (HF) 6

Hình 2.2: Bò lai F1 (lai HF x lai Sind) 6

Hình 2.3: Bò lai F2 ( Lai F1 x HF) 6

Hình 3.1: Tách DNA mẫu máu 15

Hình 4.1: Mẫu chứa DNA sau khi tách chiết 17

Hình 4.2: Kết quả nhân gen GH 17

Hình 4.3a: Đoạn gen GH bình thường 18

Hình 4.3b: Đột biến điểm (C  T) trên gen GH .18

Hình 4.4: Một đoạn gen GH được cắt bởi enzym giới hạn MspI 19

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Tần số allele và kiểu gen quan sát 19

Biểu đồ 4.2: Tần số allele và kiểu gen theo giống bò lai F1 20

Biểu đồ 4.3: Tần số allele và kiểu gen theo giống bò lai F2 20

Biểu đồ 4.4: Tần số allele và kiểu gen theo giống bò lai F3 + F4 21

TÓM LƯỢC

Công tác giống gia súc, đặc biệt là chọn lựa giống bò sữa cho năng suất và chất lượng sữa tốt ngày càng được chú trọng Đa phần người chăn nuôi bò sữa hiện nay chủ yếu là chăn nuôi hộ gia đình hoặc trang trại chăn nuôi nhỏ Kiến thức về giống chưa cao, chủ yếu chọn lựa giống theo phương pháp cổ điển (kinh nghiệm có từ lâu đời) Công nghệ sinh học phát triển và đã được áp dụng vào công tác chọn giống Yếu tố di truyền gen trong chọn giống ngày càng cấp thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi đã chọn đề tài:

“XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH GEN GROWTH HORMONE (GH) ĐẾN NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG SỮA CỦA BÒ HOLSTEIN FRIESIAN ( HF) x LAI SIND” Mục tiêu của đề tài: tìm ra đa hình gen GH và phân tích mối liên quan của điểm đa hình này với các chỉ tiêu năng suất cũng như chất lượng sữa của các giống bò lai góp phần làm cơ sở cho quá trình chọn giống gia súc

Qua khảo sát chúng tôi thu được một số kết quả sau:

Xác định được một điểm đa hình trên intron 3 của gen GH (C/T), với tần số allele C và T tương ứng là 0,53 và 0,47 và tần số kiểu gen CC (0,28), CT (0,51) và TT (0,21) Bên cạnh

đó kết quả phân tích cũng cho thấy tần số allele C và kiểu gen CC có xu hướng tăng theo từng nhóm giống.

Chỉ tiêu về năng suất sữa:

Kiểu gen khác nhau có xu hướng ảnh hưởng đến năng suất sữa, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê Cụ thể kiểu gen đồng hợp tử CC cho năng suất sữa cao hơn (10,8 kg/ngày/con) so với kiểu gen dị hợp tử CT (10,4 kg/ngày/con).

Chỉ tiêu về chất lượng sữa:

Kiểu gen CC cho tỷ lệ mỡ sữa cao (5,25%) so với kiểu gen CT (4,19%), nhưng tỷ lệ đạm sữa ở kiểu gen CT (3,87%) lại cao hơn kiểu gen CC (3,61%), nhưng sự sai khác này không

có ý nghĩa thống kê.

Tóm lại, đa hình (C/T) của gen GH có khuynh hướng ảnh hưởng đến năng suất sữa và tỷ lệ

mỡ sữa của giống bò HF x lai Sind.

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Chăn nuôi bò cho sữa là một ngành nghề khá mới ở nước ta, so với các nước trên thế giới nước ta luôn kém cả về năng suất và chất lượng sữa

Nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm không thích hợp để nuôi các giống

bò sữa cao sản so với các nước có khí hậu mát mẻ, chính điều này đã ảnh hưởng khá lớn đến năng suất sữa Ngoài ra, công tác nuôi dưỡng cũng ảnh hưởng khá lớn đến năng suất và chất lượng sữa Đa phần người chăn nuôi thường thiếu kiến thức trong công tác nuôi, nhu cầu dinh dưỡng không đảm bảo cho nhu cầu tiết sữa hằng ngày của con vật, vì thế thường dẫn đến tình trạng cạn sữa Công tác quản lý đàn bò không đúng quy tắc cũng ảnh hưởng đến việc phát triển đàn bò ở địa phương Tuy nhiên, vấn đề ảnh hưởng nghiêm trọng đến tính năng sản xuất sữa ở các giống bò được xem xét nhiều nhất đó là yếu tố di truyền về giống Đa phần người dân chăn nuôi ít hiểu biết hoặc là không hiểu về vấn đề này, họ thường chọn giống theo kinh nghiệm nhân gian truyền đạt lâu đời như căn cứ vào phả hệ, đặc điểm ngoại hình hay tính năng sản xuất của con mẹ để tiến hành chọn lọc, vì vậy vật nuôi có thể không đạt năng suất và chất lượng sữa như mong muốn

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ di truyền trong lĩnh vực chăn nuôi, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu sâu sắc về đa hình gen di truyền liên quan đến các tính trạng tốt trên nhiều gia súc Ở Việt Nam,

Đặng Thị Dung et al (2004) đã nghiên cứu thành công mối tương quan giữa đa hình kiểu gen β-Lactoglobulin, k-casein đến năng suất và chất lượng sữa của bò

Chính những thành tựu này đã giúp cho người chăn nuôi hiểu thêm về các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng sữa, mà quan trọng trong đó là các đa hình gen

di truyền, đồng thời cũng giúp cho người chăn nuôi có thể đến gần hơn với khoahọc, để có thể có những phương pháp chọn giống cũng như là chăm sóc phù hợp hơn so với tình hình chăn nuôi trước đó

Xuất phát từ các yêu cầu trên, chúng tôi đã nghiên cứu và tiến hành đề tài: “Xác

định và đánh giá mối liên quan giữa đa hình gen Growth Hormone (GH) đến năng suất và chất lượng sữa của bò Holstein Friesian (HF) x lai Sind”

Mục tiêu của đề tài: tìm ra đa hình gen GH và phân tích mối liên quan của điểm đa hình này với các chỉ tiêu năng suất cũng như chất lượng sữa của các giống bò lai góp phần làm cơ sở cho quá trình chọn giống, chọn lọc và lai tạo đàn bò sữa phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, đồng thời cho sản lượng và chất lượng sữa tốt nhằm tăng hiệu quả kinh tế của vùng chăn nuôi

Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình phát triển chăn nuôi bò sữa ở nước ta

Theo Đỗ Kim Tuyên (2008) số lượng bò sữa nước ta đã tăng từ 11 ngàn con năm

1990 lên 35 ngàn con năm 2000, tăng trưởng bình quân 12,3%/năm Tổng sản lượng sữa tươi tăng từ 9,3 ngàn tấn lên 52,2 ngàn tấn, tăng trưởng bình quân 18,8%/năm Sữa tươi sản xuất trong nước mới đáp ứng được khoảng 8% nhu cầu tiêu thụ, 92% sản phẩm sữa phải nhập khẩu

Từ khi có Quyết định 167/2001/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 26/10/2001 về một số biện pháp và chính sách phát triển bò sữa Việt Nam thời kỳ 2001-2010, các địa phương cơ quan ban hành nhiều chính sách về phát triển chăn nuôi bò sữa Số lượng bò sữa tăng từ 41,2 ngàn năm 2001 lên 113,2 ngàn con năm

2006, tốc độ tăng đàn bình quân trong giai đoạn này là 24,9%/năm, trong đó các tỉnh phía Bắc tăng 43,7%/năm, các tỉnh phía Nam tăng 22,1%/năm

Năm 2006-2007 tốc độ phát triển đàn bò sữa chậm lại, nguyên nhân chủ yếu là giá thành sữa cao, giá thu mua sữa chưa hợp lý, trong khi giá thức ăn chăn nuôi tăng 5,5-6,3%, hiệu quả chăn nuôi bò sữa thấp Tỷ lệ thay thế đàn cao do người chăn nuôi mạnh dạn loại thải những bò năng xuất thấp và sinh sản kém

Các tỉnh có đàn bò tăng như Thành phồ Hồ Chí Minh, Long An, Sóc Trăng, Tiền Giang, Tây Ninh, Quảng Ninh Những địa phương này có lợi thế gần nhà máy chế biến, chi phí vận chuyển sữa thấp, có nguồn phụ phẩm nông-công nghiệp do đó giảm chi phí thức ăn trong cơ cấu giá thành, người chăn nuôi có kinh nghiệm chăn nuôi bò sữa, có hệ thống dịch vụ kỹ thuật, thú y tốt Một số tỉnh có chính sách hỗ trợ phù hợp cho phát triển chăn nuôi bò sữa của địa phương mình, một số tỉnh có sự trợ giúp của dự án quốc tế

Năm 2007 tình hình phát triển về đàn bò sữa đã được người chăn nuôi các tỉnh quan tâm về số lượng và chất lượng Số lượng bò sữa có tốc độ cao hơn cùng kỳ năm

2006 do giá thu mua sữa từ đầu năm đã được điều chỉnh và đã tăng đột biến trong cuối tháng 6 Từ ngày 23/6 giá thu mua sữa trong cả nước đã tăng từ 4,6-5,0 ngàn đồng lên 7,0-7,2 ngàn đồng/lít Giá sữa tăng cao là một trong những điều kiện khuyến khích người chăn nuôi có điều kiện đầu tư và chăm sóc đàn bò sữa tốt hơn

2.2 Sơ lựơc đặc điểm một số giống bò sữa ở Việt Nam

2.2.1 Bò Holstein Friesian (HF)

Là giống bò sữa nổi tiếng thế giới, được tạo ra từ tỉnh Fulixon phía bắc Hà Lan từ thế kỷ thứ 14 và không ngừng được cải thiện về phẩm chất, năng suất Đến thế kỷ

15 thì được đưa ra các nước trên thế giới, nước ta nhập bò lang trắng đen vào năm 1960-1970.

Bò có màu lông lang trắng đen, một số có màu lang trắng đỏ Các điểm trắng đặc trưng là: điểm trắng ớ tráng, vết trắng ở vai kéo xuống bụng và bốn chân, đuôi trắng

Là giống bò có khả năng cho sữa cao và cải tạo các giống bò khác theo hướng sữa

Vì thế các nước thường dùng bò HF thuần lai tạo với bò địa phương nhằm tạo ra giống bò lang trắng đen của nước mình

Bò lang trắng đen thành thục sớm, 15-20 tháng tuổi có thể cho phối giống Có khối lượng cơ thể lớn: bê sơ sinh nặng 35-45 kg, bò cái trưởng thành nặng 450-750 kg,

Hầu hết các nước có ngành sữa phát triển đều nuôi giống bò HF Vì bên cạnh khả năng cho sữa cao bò còn khả năng cho thịt lớn Bê đực nuôi thịt công nghiệp đạt 400-450 kg lúc 15 tháng tuổi, tỷ lệ thịt xẻ 50-55%

Để phát triển chăn nuôi bò sữa trong nước, ngay từ những năm 1960-1970, chúng ta

đã nhập bò lang trắng đen của Trung Quốc, Cuba và phát triển chúng thành bằng nhân thuần và lai chúng với bò lai Sind

Kết quả nghiên cứu nhiều năm cho thấy, bò HF thuần chỉ thích nghi với những vùng có khí hậu mát mẻ, nhiệt độ bình quân cả năm dưới 21oC, như cao nguyên Mộc Châu (Sơn La), Đức Trọng (Lâm Đồng)… Những vùng khác, khí hậu nhiệtđới nóng ẩm, không thích hợp với chúng Chính vì vậy để có bò sữa nuôi được rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau của cả nước, đáp ứng nhu cầu sản xuất sữa, chúng ta đã tiến hành nghiên cứu, lai tao bò HP thuần với bò vàng Việt Nam đã được “Zebu hóa” (Phùng Quốc Quảng, 2001)

2.2.2 Bò lai F1 (lai HF x lai Sind)

Theo Phùng Quốc Quảng và Nguyễn Hữu Vũ (2002) bò lai đời 1 (F1) có ½ máu

HF, được tạo ra bằng cách lai giữa bò đực HF với bò cái lai Sind Hầu hết bò lai F1 màu lông đen, nếu có vết lang trắng thì rất nhỏ, ở dưới bụng, bốn chân, khấu đuôi

và trên trán

Bê sơ sinh có khối lựơng 20-25 kg Bò cái trưởng thành nặng 350-420 kg, bò đực trưởng thành nặng 500-550 kg Sản lượng sữa đạt 2500-3000 kg/chu kỳ Ngày cao nhất có thể đạt 15-20 kg Tỷ lệ mỡ sữa 3,6-4,2% Thời gian cho sữa có thể kéo dài trên 300 ngày.

Bò F1 thành thục sớm, mắn đẻ động dục lần đầu bình quân lúc 17 tháng tuổi, có khi sớm hơn, chỉ 13-14 tháng Tuổi đẻ lứa đầu bình quân lúc 27 tháng Khoảng cách giữa 2 lứa đẻ là 13-14 tháng

Bò lai F1 chịu đựng tương đối tốt điều kiện nóng (30-35oC), ít bệnh tật Do có nhiều

ưu điểm, ở những vùng mới chăn nuôi bò sữa, bò F1 được xem là đàn bò chủ lực

2.2.3 Bò lai F2 (Lai F1 x HF)

Theo Việt Chương và Nguyễn Việt Thái (2003) bò lai F2 được tạo ra bằng cách lai

bò đực giống HF (nhẩy trực tiếp hoặc thụ tinh nhân tạo) với bò cái lai F1 (bò lai F2

có ¾ máu HF) Về ngoại hình bò lai F2 gần giống với bò HF thuần, với màu lông lang trắng đen

Bê lai sơ sinh F2 cân nặng 30-35 kg Bò đực trưởng thành cân nặng 600-700 kg Bò cái nặng trung bình 400-450 kg Tuổi động dục lần đầu 13-18 tháng tuổi, tuổi lứa đẻ đầu 26-31 tháng tuổi

Trong điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng tốt, bò lai F2 cho năng suất sữa cao hơn bòlai F1 Trong một chu kỳ vắt sữa 280-300 ngày, năng suất có thể đạt 3000-3500 kg hoặc cao hơn Tỷ lệ mỡ sữa 3,2-3,8%

Trong điều kiện nóng ẩm (nhiệt độ trên 30oC), bò lai F2 kém chịu đựng hơn so với

bò F1

2.2.4 Bò lai F3 (lai F2 x HF)

Bò lai F3 được tạo ra bằng cách lai bò đực giống HF (nhẩy trực tiếp hoặc thụ tinh nhân tạo) với bò cái lai F1 (bò lai F3 có 7/8 máu HF) Về ngoại hình bò lai F3 gần giống với bò HF thuần, với màu lông lang trắng đen, có màu trắng nhiều hơn

Bò cái có tầm vóc lớn (400-450 kg), bầu vú phát triển Bò thích nghi kém hơn, nhưng nếu được nuôi dưỡng chăm sóc tốt thì cho năng suất cao Năng suất bình quân khoảng 13-14 kg/ngày (3900-4200 kg/chu kỳ), có thể đạt 15kg/ngày (4500 kg/chu kỳ) Tại TPHCM và Bình Dương các giống bò cao sản đạt sản lượng hơn

6000 kg/chu kỳ Bò lai F3 cho năng suất cao hơn bò lai F1 và F2 tuy nhiên bò lai F3 chịu nóng kém nên cần phải có kỹ thuật nuôi thật tốt và có đủ điều kiện về khí hậu thì nuôi được bò lai F3 nếu không thì nên chọn nuôi giống bò F2 (Sở Nông Nghiệp

và Phát Triển Nông Thôn, 2003)

2.2.5 Sản lượng sữa của các giống bò sữa

Bảng 2.1: Sản lượng sữa của các giống bò sữa qua một chu kỳ cho sữa

Năng suất

sữa/chu kỳ (kg) 5000 – 6000 2500 – 3000 3000 – 3500 3900 – 4200

Bảng 2.2: Sản lượng sữa của các giống bò sữa qua các lứa đẻ

Năng suất sữa (kg/30 ngày) Giống

Số ngày cho sữa/chu kỳ

F1 1800 – 2200 2200 – 2500 2500 – 3000 270 – 310 F2 2200 – 2500 2500 – 3000 3000 – 3500 280 – 320

Bảng 2.3: Tỷ lệ phần trăm sản lựơng sữa qua từng tháng cho sữa so với tổng sản lựơng sữa cho cả chu kỳ

Tháng cho sữa Giống

Cộng

(Đinh Văn Cải et al, 2007)

2.3 Sinh lý tiết sữa ở bò

2.3.1 Sự sinh sữa

Theo Nguyễn Văn Thu (2001) khi trâu bò có mang thì cán cân bình quân của

estrogen và progesterone làm cho bầu vú phát triển, nhưng chúng không cho phép

sữa được tạo ra Điều này cho thấy rằng nhau thai có vai trò quan trọng trong cán cân bình quân này Khi gia súc đẻ cán cân bị đảo lộn dưới sự tác động của kích thích tố, do nhau thai được tống ra ngoài, sữa sẽ được tạo ra Kích thích tố có liên

quan đến sự tạo sữa là LTH (prolactin) Kích thích tố này đã khởi động cho một quá

trình cho sữa và cũng chính nó duy trì chu kỳ cho sữa của gia súc

2.3.2 Sự thải sữa

Sự bú, vắt sữa bằng tay hay bằng máy, về mặt vật lý học thì nó có thể tạo ra một áp suất âm ở bể của núm vú như thể sữa sẽ duy chuyển từ bên trong bầu vú ra ngoài Tuy nhiên sự thải sữa là một phản xạ có điều kiện, phản xạ bị chi phối bởi thần kinh

và kích thích tố (KTT) Sự bú hay vắt sữa sẽ kích thích bầu vú tạo ra những khoái cảm đối với gia súc Các xung động này được chuyển về não thùy sau và não thùy

sau sẽ tiết ra oxytocin Nó sẽ được đưa vào máu và chuyển đến bầu vú kích thích

các biểu mô cơ và cơ trơn co thắt để đẩy sữa ra ngoài Những xung động thần kinh

này không những kích thích não thùy sau tiết ra oxytocin mà còn kích thích não

thùy trước tiết ra LTH, STH, ACTH để kích thích tạo ra sữa Do vậy sự thải sữa và tiết sữa là 2 quá trình có thể xảy ra đồng thời hay riêng biệt ADH cũng có tác động

lên sự thải sữa với mức bằng 20% oxytocin (Nguyễn Văn Thu, 2001).

2.4 Thành phần sữa bò

Sản phẩm chính của bò sữa là sữa bò Trong sữa bò có nước, các chất hữu cơ (casein, albumin, globulin, lactose, lipit, vitamin, hoocmon, các chất hoạt tính sinh học .) và các chất khoáng đa-vi lượng, tính ra có đến trên 100 loại các chất dinh dưỡng khác nhau Sữa bò trong 5-7 ngày đầu của chu kỳ tiết sữa gọi là sữa đầu, những ngày tiếp theo gọi là sữa thường Thành phần sữa đầu và sữa thường có nhiều điểm khác nhau (Hội chăn nuôi Việt Nam, 2002)

Bảng 2.4: Thành phần sữa đầu và sữa thường

Thành phần Sữa đầu Sữa thường

(Hội chăn nuôi Việt Nam, 2002)

2.5 Chu kỳ tiết sữa của bò

Chu kỳ tiết sữa của bò cái được tính từ ngày đầu tiên sau khi đẻ đến khi cạn sữa Bò cái sản lượng sữa thấp, chu kỳ tiết sữa ngắn, khoảng 240-270 ngày Thời gian tối ưu của chu kỳ tiết sữa ở bò cái hướng sữa là 300-305 ngày, trong mối quan hệ với khoảng cách 2 lứa đẻ là 12 tháng

Quy luật phân tiết sữa trong 1 chu kỳ sữa ở bò được chia làm 2 giai đoạn Giai đoạn

1 bắt đầu từ sau khi đẻ, năng suất sữa (kg/ngày) có xu hướng tăng lên từ từ, đạt giá trị cao ở 60 đến 90 ngày đầu của chu kỳ Sau đó là giai đoạn 2, năng suất sữa có xu hướng giảm thấp song song với quá trình thoái hoá của tuyến bào Để đánh giá khả

năng cho sữa của bò cái theo mức giảm sữa, người ta thường tính hệ số giảm sữa (HSGS).

Tổng sữa tháng trước (kg) - Tổng sữa tháng sau (kg)

HSGS(%) = x1000

Tổng sữa tháng trước (kg)

HSGS biến động rất rộng từ +5 đến 12% phụ thuộc vào di truyền môi trường và cả đặc tính cá thể của bò sữa Hệ số giảm sữa càng thấp thì lượng sữa vắt được trong chu kỳ sữa càng cao (Nguyễn Xuân Trạch, 2003)

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất của bò sữa

2.6.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường

2.6.2.1 Dinh dưỡng

Bò sữa rất nhạy với điều kiện dinh dưỡng, mức độ dinh dưỡng quá thấp sẽ không đủnăng lượng và nguyên liệu cho quá trình tổng hợp sữa, nhưng cho ăn quá dư thừa so với tiềm năng di truyền của giống sẽ làm cho bò sữa béo phì, dẫn đến khả năng kiềm hãm sự tạo sữa của bò cái Tỷ lệ đạm trong khẩu phần bò lai trong giới hạn 13%-15% trong hàm lượng vật chất khô của khẩu phần Sự mất cân đối các tỷ lệ dinh dưỡng như: tỷ lệ E/P, hàm lượng xơ, tỷ lệ Ca/P, K/Na,… đều làm giảm khả năng tạo sữa của bò cái (Nguyễn Xuân Trạch và Mai Thị Thơm, 2004)

2.6.2.2 Thời tiết khí hậu môi trường

Sức sản xuất sữa của bò chịu ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp của điều kiện nhiệt

độ, không khí, ẩm độ, bức xạ mặt trời, áp suất khí quyển… song sản lượng sữa không bị ảnh hưởng trong phạm vi nhiệt độ 5-21oC Nhiệt độ thấp hơn 5oC hoặc cao hơn 21oC sản lượng sữa giảm từ từ Nhiệt độ cao hơn 27oC sản lượng sữa giảm rõrệt Tuy nhiên nhiệt độ thích hợp tối đa và tối thiểu cho sức sản xuất sữa ở mỗi giống bò khác nhau Sản lượng sữa của bò HF giảm đi nhanh chóng khi nhiệt độ

môi trường cao hơn 21oC và ở nhiệt độ thấp thì bò HF không bị ảnh hưởng kể cả khi -13oC (Nguyễn Xuân Trạch và Mai Thị Thơm, 2004).

Thời gian phối có chữa sau khi đẻ: bò cái khỏe mạnh sẽ phục hồi sức khỏe và động dục trở lại sau khi đẻ 30-45 ngày, bình thường là 60-80 ngày Quy trình kỹ thuật đề nghị phối cho bò sữa sau khi đẻ khoảng 60-90 ngày là tối ưu nhằm khai thác cả hai tiềm năng sinh sản và sản xuất sữa của bò cái

Bệnh ở bò sữa: bò cái có thể mắc các loại bệnh khác nhau trong thời gian tiết sữa Bệnh viêm vú bò thường rất phổ biến trên đàn bò sữa, sữa vú viêm thường bị loại Người ta cho rằng bệnh viêm vú đã làm thiệt hại 3,5% sản lượng cả đàn, cộng thêm các trường hợp viêm vú lâm sàng đã làm cho sữa xấu không dùng được, thiệt hại lên đến 5% sản lượng sữa (Nguyễn Xuân Trạch và Mai Thị Thơm, 2004)

2.7 Giới thiệu khái quát về đa hình kiểu gen Growth Hormone (GH)

2.7.1 Giới thiệu

Growth Hormone (GH) là một hormone tăng trưởng ở người và gia súc Nó ảnh

hưởng đến sự tăng trưởng, tiết sữa và sự cho sữa Cũng như nó có thể làm tăng sản lượng sữa, nhưng lại gây nguy cơ giảm tỷ lệ mỡ sữa và đạm sữa (Etherton et Bauman, 1998)

2.7.2 Cấu trúc

Theo Wallis (1973) hormone tăng trưởng ở bò (Growth Hormone (GH)) là một protein dựa trên chuỗi poly-hormone peptid đơn nặng khoảng 22kDa (kilo Dalton) Cấu trúc của nó là một chuỗi polypeptid gồm khoảng 191 axit amin, được tổng hợp,

lưu giữ và được tiết ra bởi các tế bào ở thùy trước tuyến yên được gọi là

somatotroph Nó có cấu trúc khá tương đồng với prolactin Khoảng 70% là protein

có khối lượng 22kDa, 10% là isoform có khối lượng 20kDa, và phần còn lại bao

gồm nhị trùng, sulphated và glycosylated isoforms Ngoài ra, sự thay thế đa hình của amino axit Leucine hoặc Valine tại vị trí 127 trên đoạn gen càng làm tăng đa

dạng về tần số của 2 allele này

Theo Lucy et al (1993) phân tích thống kê cho thấy, năng suất sữa hàng ngày trong

Leucine kiểu gen Leucine/lần cao hơn (p <0,01) so với Leucine/Valine (22,76 kg so với 16,96 kg), bò với kiểu gen Leucine Valine/khác biệt đáng kể từ Leucine/Leucine

và Valine/Valine kiểu gen đặc biệt là chất béo (4,95% so với 4,13% và 4,82%,

tương ứng) và đạm (4,00% so với 3,47% và 3,79%, tương ứng)

Theo Hediger et al (1990) đa hình gen GH nằm trong chromosome 19, gen này có

chứa khoảng 5 exon (năm vùng gen chính thức có chức năng phiên mã) được phân cách bởi các intron (các vùng gen không phiên mã) Có rất nhiều thể đa hình đã được xác định trong gen GH Zhou et al (2005) đã tìm ra thể đa hình ở exon thứ 5 (GH1) với 2 allele (A và B), trong intron thứ 3 (GH2) với 2 allele (C và D) và vùng thứ 3 (GH3) với 2 allele (E và F) Qua đó, Zhou cũng đã chứng minh được ở đa hình GH1 thì các con bò mang kiểu gen AA sẽ cho sữa thấp hơn các con bò mang kiểu gen AB và BB trong kỳ tiết sữa đầu tiên, qua đó thấy được tính trội hoàn toàn của allele B so với A Đồng thời, ở đa hình GH2 thì những con bò mang kiểu gen

CC, có ý nghĩa ở mức tin cậy là 5% trong thời kỳ tiết sữa đầu tiên cao hơn so với kiểu gen CD và DD, kết quả này chỉ ra rằng allele C trội hoàn toàn so với allele D trong nhân tố sản lượng sữa Còn ở đa hình GH3, theo Vakasinovic at al (1999) thì không có sự khác biệt ý nghĩa của các kiểu gen tại đa hình GH3 đối với tính trạng sản lượng sữa

2.7.3 Phương pháp nhân gen bằng PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.7.3.1 PCR (phản ứng chuỗi polymerase)

Do Karl Mullins và cộng sự phát minh 1985 Nhờ enzym DNA xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới của chu kỳ tiếp

theo Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi (primer)

(Khuất Hữu Thanh, 2005)

2.7.3.2 Mồi (primer)

Là những đoạn oligonucleotid mạch đơn có kích thước khoảng 6–100 bp, có trình

tự bắt cặp bổ sung với trình tự ở hai đầu mạch khuôn Mồi càng dài khả năng tổng hợp DNA mới càng chính xác Ngược lại, khi mồi ngắn quá sự bắt cặp giữa mồi và khuôn thuận lợi, nhưng kết quả PCR kém độ chính xác Có 2 loại mồi là mồi xuôi

(sense primer) và mồi ngược (antisense primer) tham gia phản ứng PCR.

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm có 3 giai đoạn:

Giai đoạn biến tính: dung dịch phản ứng (buffer) cần phải có đầy đủ các thành phần cần thiết cho tái bản DNA (dNTP, enzym DNA polymerase, Mg++…) Phân tử

DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA khuôn một ít, thường là 94–95oC trong 30 giây đến 1 phút Nếu đoạn khuôn DNA có tỷ lệ

G – C cao, chuỗi G, C liền nhau dài cần tính toán để có nhiệt độ phù hợp

Giai đoạn lai: nhiệt độ hạ thấp dưới Tm của các mồi, các mồi bắt cặp với khuôn Thường ở chế độ nhiệt khoảng 60oC-70oC, tùy thuộc độ lớn và Tm của các mồi, thời gian từ 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn tổng hợp: ở 72oC các enzym DNA polymerase hoạt động tốt nhất (thường

dùng Taq DNA polymerase tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng “Themocellus aquaticus”) Thời gian khoảng từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc kích thước

của trình tự DNA cần khuếch đại Sau 25 đến 35 chu kỳ từ một đoạn DNA khuôn, khuếch đại đến 225-235 bản sao Trong quá trình PCR, sau những chu kỳ đầu, ở các chu kỳ cuối nhiệt độ tăng lên 1-2oC Do về sau lượng mồi giảm lượng khuôn tăng lên, mặt khác enzyme Taq DNA polymerase hoạt động yếu dần do tác động của nhiệt độ, vì vậy tăng nhiệt độ ở các chu kỳ sau để làm tăng hiệu quả tổng hợp DNA (Khuất Hữu Thanh, 2005)

2.7.4 Kỹ thuật PCR-RFLP (Restristion Fragment Length Polymorphism)

Theo Khuất Hữu Thanh (2005) kỹ thuật RFLP đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi các enzyme giới hạn là kỹ thuật tạo nên các đoạn cắt khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ đặc trưng cho từng phân tử DNA Qui trình thực hiện RFLP bao gồm các bước:

- Tách chiết và tinh sạch DNA

- Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi cùng một cặp RE

- Điện di

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Phương tiện thí nghiệm

3.1.1 Thời gian và địa điểm

 Địa điểm tiến hành: đề tài được thực hiện tại Bộ môn Di Truyền – Khoa Nông Nghiệp & SHƯD – trường Đại Học Cần Thơ

 Thời gian thực hiện đề tài: 01/01/2010 – 30/04/2010

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

Mẫu sữa, mẫu máu

Thùng đá giữ lạnh mẫu

Máy đo các chi tiêu về sữa

Cân điện tử để cân hoá chất

Tủ sấy, tủ đông, tủ lạnh

Máy chạy điện di PCR, máy chạy PCR, máy tính

Một số hóa chất thí nghiệm như: EDTA, TE, NaOAC, SSC, SDS…

3.2 Đối tượng và phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên các giống bò sữa lai F1, F2, F3… được nuôi ở Nông trường Sông Hậu và hợp tác xã chăn nuôi bò sữa Long Hoà thuộc thành phố Cần Thơ Các con bò đều được đánh số tai, quản lý tốt, tiêm ngừa các bệnh truyềnnhiễm, và được theo dõi năng suất và chất lượng sữa thường xuyên

Phương pháp phân tích:

Mẫu sữa sau khi lấy về được cho vào phân tích bằng máy phân tích sữa tự động

“Lacto Star”, các chỉ tiêu phân tích bao gồm: mỡ sữa (Fat), đạm sữa (Đạm), đường sữa (Lactose), khoáng sữa (Solid)…

3.2.2.2 Mẫu máu:

Cách lấy mẫu:

Mẫu máu được lấy trực tiếp từ 40 con bò đang cho sữa, thông qua tĩnh mạch cổ Sau đó được ký hiệu theo số tai trên bò và cho vào ống falcon 15 ml, trong ống có chứa khoảng 2ml dung dịch chống đông máu EDTA 0,01 mM, lượng máu phải lấy

từ 10-15 ml Quá trình này phải được thực hiện nhanh vì để lâu máu sẽ bị đông lại, ảnh hưởng đến thí nghiệm

Phương pháp phân tách máu:

Máu sau khi lấy về được trữ trong tủ đông ở nhiệt độ -20oC, vì vậy trước khi phân tách mẫu phải được giải đông trong nước ấm

Các bước tiến hành của quy trình tách DNA:

Các mẫu máu thường thu dưới dạng 1 ml máu toàn phần, bảo quản trong ống đựng chân không chứa EDTA đông lạnh ở -70oC

Giải đông, cứ 1 ml máu thêm 1 ml đệm 1xSSC và hòa trộn Ly tâm 10 phút với

13000 rpm Gạn bỏ phần dịch nổi, lấy tủa

Thêm 1 ml đệm 1xSSC vào phần tủa, lắc rung, ly tâm 10 phút với 13000 rpm và gạn bỏ dịch nổi

Thêm 375 μl dung dịch 0,2 M NaOAc vào mỗi tủa và lắc rung ngắn Sau đó thêm

25 μl dung dịch SDS và 5 μl ProK, lắc rung ngắn và ủ 1 giờ ở 55oC

Thêm 120 μl phenol chloroform và lắc rung 30 giây Ly tâm các mẫu 10 phút với

13000 rpm

Hút khéo lớp lỏng sang một ống ly tâm 1,5 ml mới; thêm 1 ml 100% EtOH lạnh, hòa trộn và ủ 15 phút ở -20 oC

Ly tâm 10 phút với 13000 rpm, gạn bỏ dịch nổi và làm khô tự nhiên

Thêm 180 μl đệm TE, lắc rung và ủ 10 phút ở 55oC

Thêm 20 μl 2M NaOAc và hòa trộn Thêm 500 μl 100% EtOH lạnh, hòa trộn và ly tâm 10 phút với 13000 rpm

Gạn bỏ dịch nổi và rửa tủa với 1 ml 70% EtOH Ly tâm 10 phút với 13000 rpm

Gạn bỏ dịch nổi và hút khô chân không 10 phút

Thêm 200 μl Tris-HCl 10 mM vào và ủ qua đêm ở -20oC, lắc rung đều đặn để hòa đều DNA nhân Bảo quản mẫu DNA ở -20oC

Hình 3.1: Tách DNA mẫu máu

Kỹ thuật đổ gel Agarose và chạy điện di

Sau khi tách DNA xong, tiến hành đổ gel để chạy điện di Cho 80 ml TAEx1 cho vào beaker, sau đó cân chuẩn 0,8g Agarose cho vào beaker, đem beaker cho vào lò

vi sóng trong thời gian 60 giây (lặp lại 2 lần) để Agarose tan hết trong TAEx1, sau

đó lấy lọ ra ngoài dùng giấy bạc đậy kính và để nguội trước khi đổ gel Sau khi

dung dịch nguội ta cho vào 8µl Ethidium Bromide vào và lắc đều, rồi tiến hành đổ

gel, gel phải được đổ nhẹ tránh có bọt khí làm hỏng gel, hoặc mờ gel, mẫu gel sau khi đổ xong, để gel đặc lại xong tiến hành bom mẫu

Bơm mẫu vào giếng:

Lấy 5 µl mẫu, trộn đều với dung dịch Loading Buffer, sau đó bơm đều lên các giếng

của gel, tiến hành chạy điện di ở cường độ dòng điện 400 mA, trong 15 phút ở hiệuđiện thế 120V, rồi tiến hành xem mẫu và chụp mẫu thông qua máy chụp gel “gel Logic 212” để xác định các mẫu có DNA, nhằm mục đích chạy PCR cho các mẫu

đó

Phương pháp PCR-RFLP xác định kiểu gen:

Cách tiến hành chạy PCR: lấy 2 l DNA với 18 l hỗn hợp bao gồm PCR buffer: 2l, MgCl2: 1 µl, dNTP: 0,5 µl, mồi xuôi: 0,5 µl, mồi ngược: 0,5 µl, Taq: 0,25 µl, nước cất 2 lần 13,25 l Chu trình nhiệt có 3 giai đoạn: 94oC – 3 phút; (94oC – 1 phút, 58oC – 50 giây, 72oC – 1 phút) x 35; 72oC – 7 phút

Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR được thiết kế dựa theo Zhou et al (2005) với trình tự như sau:

GH (M57764), 327 bp

GH (mồi xuôi): 5’ – CCCACGGGCAAGAATGAGGC - 3’ (20 nucleotide)

GH (mồi ngược): 5’ – TGAGGAACTGCAGGGGCCCA – 3’ (20 nucleotide)

Sản phẩm PCR được giải trình tự để khẳng định tính đặc hiệu của cặp mồi và phát hiện đột biến Sau khi xác định được vị trí đột biến, mẫu DNA của các cá thể bò

được nhân lên bằng PCR, sau đó được ủ với enzyme giới hạn MspI ở 37oC trong 15 phút và quan sát trên Agarose gel 1%, từ đó có thể xác định được kiểu gen của tất

Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

4.1 Kết quả tách chiết DNA

Mẫu máu sau khi giải đông được tiến hành tách chiết DNA

Hình 4.1: Mẫu chứa DNA sau khi tách chiết

Sau khi quan sát các mẫu đã tách chúng tôi đưa ra nhận định mẫu DNA thông qua quá trình điện di đồ hoàn toàn tinh sạch, hình ảnh quan sát thông qua “Gel Logic 212” cho hình ảnh rất rõ, chứng tỏ có nồng độ cao DNA trong các mẫu tách chiết, thích hợp cho các quá trình nhân gen, cắt enzym giới hạn và giải trình tự (Hình 4.1)

DNA