Xác Định Hàm Lượng Melamine Trong Thức Ăn Thủy Sản Bằng Phương Pháp Miễn Dịch

TÓM TẮTĐề tài “Xác định hàm lượng melamine trong thức ăn thủy sản bằngphương pháp miễn dịch” được tiến hành nghiên cứu nhằm đưa phương pháp miễn dịch phổ biến rộng rãi cho các phòng kiểm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

ĐƯỜNG TÀI THẮNG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRONG THỨC

ĂN THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

ĐƯỜNG TÀI THẮNG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRONG THỨC

ĂN THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s PHẠM VĂN HÙNG

2010

TÓM TẮT

Đề tài “Xác định hàm lượng melamine trong thức ăn thủy sản bằngphương pháp miễn dịch” được tiến hành nghiên cứu nhằm đưa phương pháp

miễn dịch phổ biến rộng rãi cho các phòng kiểm nghiệm áp dụng hay các công

ty, xí nghiệp nhằm ngăn chặn sự gian dối trong thương mại trong việc phân

tích xác định hàm lượng melamine trong thức ăn thủy sản Mục tiêu của đề tàilà: xác định giá trị sử dụng của phương pháp thông qua việc xác định độ nhạy,

độ thu hồi, độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu thức ăn thủy sản và áp

dụng phương pháp này để phân tích melamine trong thức ăn thủy sản từ các cơ

sở thức ăn thủy sản Nội dung của đề tài là xác định độ nhạy, độ thu hồi, độ lặplại của phương pháp miễn dịch và áp dụng phương pháp này phân tích 32 mẫuthức ăn thủy sản từ các công ty thức ăn thủy sản

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp hấp thu miễn dịch dùngenzyme liên kết (ELISA) có độ nhạy cao với giá trị LOD = 0,395 mg/kg nhỏgấp 6 lần so với giới hạn tối đa cho phép của melamine trong thức ăn thủy sản,

độ thu hồi trung bình ở nồng độ 1 mg/kg là 102,31%; ở nồng độ 2 mg/kg là

99,44%; ở nồng độ 3 mg/kg là 98,41% và độ thu hồi trong khoảng từ 1 mg/kg

đến 3 mg/kg là 80-119,9%, độ lặp lại của phương pháp là 100%

Từ những thông số thực nghiệm, phương pháp này đã được áp dụng đểphân tích 32 mẫu thức ăn thủy sản lấy từ các cơ sở thức ăn thủy sản, phát hiện7/32 mẫu có hàm lượng melamine từ 0,414 đến 0,571 mg/kg nhưng nếu ápdụng mức giới hạn tối đa cho phép thì 32 mẫu đều không phát hiện

Với kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đề nghị việc áp dụng

phương pháp phân tích melamine bằng kĩ thuật Elisa là hoàn toàn phù hợp

nhằm góp phần ngăn chặn thức ăn có lạm dụng melamine được sử dụng làmnguồn thức ăn thủy sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi và ảnh hưởng

đến năng suất nuôi thủy sản và gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ dừng lại trong việc phân tích melamine trongthức ăn thủy sản mà không phân tích hàm lượng melamine trên nhiều nền mẫukhác nhau nên các nghiên cứu tiếp theo cần dùng phương pháp miễn dịch đểphân tích melamine trên nhiều nền mẫu khác nhau (cá, thịt…)

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành tốt luận văn và có được kết quả như ngày hôm nay.Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Thủy Sản, quí thầy

cô trong Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản đã tạo mọi điều kiện giúp

em hoàn thành tốt luận văn này và quí thầy cô trường Đại học Cần Thơ đãtrang bị cho em những kiến thức vô cùng quý giá trong suốt quá trình học tậptại trường

Em vô cùng cảm động và xin gửi lòng biết ơn sâu sắc nhất, chân thànhnhất đến thầy Phạm Văn Hùng phó giám đốc Trung tâm Chất lượng Nông LâmThủy Sản vùng 6 (NAFIQAD 6) đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiệnthuận lợi giúp em hoàn thành luận văn một cách tốt nhất Thầy đã truyền đạtcho em nhiều kinh nghiệm và kiến thức quí báu từ thực tiễn, giúp em có thểvững bước hơn và tự tin hơn trên bước đường phía trước

Bên cạnh đó, em cũng chân thành cảm ơn chị Liên, anh Hồ, anh Sơn vàcác anh chị khác ở phòng kiểm nghiệm Hóa Trung tâm Chất lượng Nông LâmThủy Sản vùng 6 đã tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tại cơquan

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động

viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Cần Thơ, ngày 14 tháng 05 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Đường Tài Thắng

MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT i

LỜI CẢM TẠ ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.3 Nội dung của đề tài 1

1.4 Thời gian thực hiện 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về melamine 3

2.1.1 Melamine 3

2.1.2 Các chất tương tự Melamine 3

2.1.3 Ứng dụng 4

2.1.4 Nghiên cứu của thế giới về melamine và cyanuric acid trong thủy sản 5

2.1.5 Ảnh hưởng của melamine và cyanuric acid 5

2.2 Phương pháp phân tích melamine .6

2.2.1 Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng m liên kết (ELISA) 6

2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS) 7

2.3 Giới thiệu chung về quy trình vận hành cơ bản hệ thống máy Elisa/Biorad 8

2.3.1 Quy trình sử dụng tủ ủ 8

2.3.2 Quy trình sử dụng máy rửa 8

2.3.3 Quy trình sử dụng máy đọc 9

2.4 Các thông số kỹ thuật cơ bản của bộ chế phẩm phân tích ELISA 9

2.4.1 Các thông số kỹ thuật ghi sẵn trên bảng hướng dẫn sử dụng của bộ chế phẩm phân tích 9

2.4.2 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng khác (không ghi kèm trong chế

phẩm phân tích) 10

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Địa điểm thực hiện đề tài 11

3.2 Vật liệu nghiên cứu 11

3.2.1 Mẫu thí nghiệm 11

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ sử dụng 11

3.2.3 Hóa chất sử dụng 12

3.2.4 Các thành phần của chế phẩm 12

3.3 Phương pháp nghiên cứu 12

3.3.1 Các thông số cần xác định trong triển khai phương pháp 12

3.3.2 Qui trình phân tích melamine trên Elisa 13

3.3.3 Cách thức tiến hành 14

3.3.4 Bố trí thí nghiệm 15

3.3.5 Phương pháp thu thập, tính toán và xử lý số liệu 16

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Xây dựng đường chuẩn 19

4.1.1 Mục đích 19

4.1.2 Cách tiến hành 19

4.1.3 Kết quả 19

4.1.4 Kết luận 20

4.2 Xác định giá trị của nền mẫu và giới hạn phát hiện 20

4.2.1 Mục đích 20

4.2.2 Cách tiến hành 20

4.2.3 Kết quả 21

4.2.4 Kết luận 22

4.3 Xác định độ thu hồi 22

4.3.1 Mục đích 22

4.3.2 Cách tiến hành 22

4.3.3 Kết quả 22

4.3.4 Kết luận 26

4.4 Xác định độ lặp lại 27

4.4.1 Mục đích 27

4.4.2 Cách tiến hành 27

4.4.3 Kết quả 27

4.4.4 Kết luận 31

4.5 Áp dụng phương pháp miến dịch phân tích các mẫu thức ăn thủy sản lấy từ các cơ sở thức ăn thủy sản 31

4.5.1 Mục đích 31

4.5.2 Cách tiến hành 31

4.5.3 Kết quả 32

4.5.4 Kết luận 33

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề xuất 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC 36

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Tính đặc hiệu của chế phẩm thử sử dụng 10

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm triển khai phương pháp 15

Bảng 4.1: Kết quả phân tích giá trị độ hấp thu 19

Bảng 4.2: Kết quả phân tích 7 mẫu trắng 21

Bảng 4.3: Giá trị độ thu hồi ở từng nồng độ thêm vào mẫu trắng của đợt phân tích thứ nhất 23

Bảng 4.4: Giá trị độ thu hồi ở từng nồng độ thêm vào mẫu trắng của đợt phân tích thứ hai 24

Bảng 4.5: Giá trị độ thu hồi ở từng nồng độ thêm vào mẫu trắng của đợt phân tích thứ ba 25

Bảng 4.6: Giá trị độ thu hồi của 3 đợt phân tích 26

Bảng 4.7: Giá trị số lạc của 3 đợt phân tích khi thêm 1 mg/kg chuẩn melamine vào mẫu trắng 28

Bảng 4.8: Giá trị số lạc của 3 đợt phân tích khi thêm 2 mg/kg chuẩn melamine vào mẫu trắng 29

Bảng 4.9: Giá trị số lạc của 3 đợt phân tích khi thêm 3 mg/kg chuẩn melamine vào mẫu trắng 30

Bảng 4.10: Kết quả phân tích 32 mẫu thức ăn thủy sản trong 4 ngày thực nghiệm 32

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của melamine 3

Hình 2.2: Cấu trúc phân tử của cyanuric acid 3

Hình 2.3: Cấu trúc phân tử của ammelide 4

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của ammeline 4

Hình 2.5: Tủ ủ có bộ phận làm mát 8

Hình 2.6: Máy rửa 8

Hình 2.7: Máy đọc Elisa 9

Hình 3.1: Bộ chế phẩm Elisa …………. 12

Hình 3.2: Khay phân tích 96 giếng 12

Hình 4.1: Đồ thị đường chuẩn 20

Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ melamine thêm vào và nồng độ melamine phân tích được 31

phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ)LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

ppm Part per million (Phần triệu)

ppb Part per billion (Phần tỷ)

Phần 1:

ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Từ sau sự kiện sữa Trung Quốc có hàm lượng melamine cao gây tửvong và bệnh sỏi thận cho rất nhiều trẻ em ở nước này vào năm 2008 đã đưavấn đề thực phẩm có melamine trở thành điểm nóng trên các tờ báo và đã córất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về tác hại của melamine đối với vật nuôi và con

người cũng như cách “nhận diện” melamine có trong thực phẩm

Melamine là chất khá độc hại được lạm dụng đưa vào bột, sữa và sảnphẩm từ sữa, bánh kẹo… và đặc biệt là được lạm dụng đưa vào thức ăn thủysản Mục đích của việc đưa melamine vào thức ăn thủy sản nhằm làm tăng độ

đạm Đạm melamine là đạm không tiêu hóa được nên được gọi là đạm giả

không những không có giá trị dinh dưỡng mà còn gây hại Vấn đề bức thiết

được đặt ra là tìm ra phương pháp phân tích melamine trong thức ăn thủy sản

một cách nhanh nhất và có nhiều ưu điểm

Có nhiều phương pháp phân tích melanmine như: sắc ký lỏng hiệu năngcao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC/MS), sắc ký lỏng hai lần khối phổ(LC/MS/MS) Các phương pháp thường cho thời gian phân tích dài, đầu tưtrang thiết bị đắt tiền Trong khi đó, phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùngenzyme liên kết (ELISA) là phương pháp mới nhưng dễ thực hiện, phân tích

số lượng lớn trong một thời gian kiểm tra, kiểm tra độ nhạy cao, chi phí thiết

bị khá rẻ và đặc biệt là có thời gian phân tích ngắn

Cần xây đựng phương pháp phân tích melamine nhằm phục vụ chonhiều xí nghiệp, công ty để ngăn chặn sự gian dối Thêm vào đó, việc xác định

hàm lượng melamine trong thức ăn thủy sản là vấn đề cần thiết Vì vậy, đề tài

“Xác định hàm lượng melamine trong thức ăn thủy sản bằng phương pháp

miễn dịch” được tiến hành nghiên cứu

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp thông qua việc xác định độ

nhạy, độ thu hồi, độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu thức ăn thủy sản

Áp dụng phương pháp miễn dịch để phân tích melamine trong thức ănthủy sản từ các cơ sở thức ăn thủy sản

1.3 Nội dung của đề tài

Đề tài dự kiến nghiên cứu các nội dung sau:

1.3.1 Xác định độ nhạy (giới hạn phát hiện – LOD) của phương phápthông qua việc phân tích melamine trong mẫu trắng để tìm nồng độ thấp nhất

mà phương pháp có thể phát hiện được

1.3.2 Xác định độ thu hồi của phương pháp bằng cách phân tích mẫuthức ăn thủy sản có thêm chuẩn melamine nhằm đánh giá độ chính xác của

phương pháp

1.3.3 Xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách phân tích mẫuthức ăn có thêm chuẩn melamine nhằm đánh giá sự ổn định của phương pháp

trong cùng điều kiện thí nghiệm

1.3.4 Áp dụng phương pháp này phân tích các mẫu thức ăn thủy sản lấy

từ các cơ sở thức ăn thủy sản

1.4 Thời gian thực hiện

Từ tháng 02/2010 đến tháng 05/2010

Phần 2:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về melamine

2.1.1 Melamine

Tên hóa học: 1,3,5-triazine 2,4,6-triamine

Trọng lượng phân tử: 126,12

Công thức phân tử:C3H6N6

Ở điều kiện môi trường bình thường, melamine là chất bột trắng có

khối lượng riêng 1.574 kg/m3, tan ít trong nước (độ tan khoảng 3,1 g/l ở

2.1.3.1 Trong công nghiệp

Sản xuất nhựa, chất tráng mỏng, keo và chất bám dính, hợp chất dùngtrong công nghiệp đúc, phủ, giấy, bảng giấy, chất kìm hãm tốc độ cháy

2.1.3.2 Trong nông nghiệp

Sản xuất phân bón, chất này được tìm thấy ở dạng chất biến đổi thuốctrừ sâu, sử dụng cho cây trồng, điều trị thú y

2.1.3.3 Ứng dụng khác

Trichloromelamine là chất được phép sử dụng làm vệ sinh thiết bị vàdụng cụ chế biến thực phẩm ngoại trừ dùng trong ngành công nghiệp sữa.Trichloromelamine có thể phân hủy thành melamine trong quá trình sử dụng

2.1.4 Nghiên cứu của thế giới về melamine và cyanuric acid trong thủy sản

2.1.4.1 Phát hiện melamine

a Ở một số quốc gia đã phát hiện melamine

Một số quốc gia người ta đã phát hiện melamine có trong bột cá và thức

ăn thủy sản ở hàm lượng melamine lớn hơn 150 mg/kg Người ta cũng phát

hiện có từ 81-210 mg/kg melamine hiện diện trong cá da trơn Melamine cũng

được phát hiện có trong cá rô phi với hàm lượng từ 0,02-177 mg/kg Người ta

cũng đã phát hiện melamine trong cá hồi thịt trắng với hàm lượng từ 34-80mg/kg và cá hồi thịt đỏ có từ 58-94 mg/kg melamine hiện diện

b Hoa Kỳ (2008)

Ở Hoa Kỳ vào năm 2008 có đến 31,4% mẫu tôm, cá da trơn, cá rô phi,

cá hồi, lươn và cá khác có melamine Trong đó có đến 9,5% mẫu có sự hiệndiện của melamine với hàm lượng từ 51-237g/kg

2.1.4.2 Phát hiện cyanuric acid

Người ta đã phát hiện trong cá hồi thịt trắng có chứa đến 5,8 mg/kg

cyanuric acid Người ta cũng phát hiện có đến 11,2 mg/kg cyanuric acid hiệndiện trong cá da trơn Cyanuric acid cũng được phát hiện có trong cá rô phivới hàm lượng lên đến 27,7 mg/kg

2.1.5 Ảnh hưởng của melamine và cyanuric acid

2.1.5.1 Động vật

Độc tính của melamine đối với động vật có vú thì thấp (FDA 11/2008)

Ở chuột, LD50 là 3.161 mg/kg

Các tác động thường gặp do melamine: giảm ăn, sụt cân, sỏi trong bàng

quang, hình thành tinh thể trong thận

Sử dụng thức ăn có melamine và cyanuric acid: tinh thể trong thận vàbàng quang

2.1.5.2 Cá hồi

Đối với cá hồi khi cho cá ăn thức ăn có chứa hàm lượng melamine lênđến 380 mg/kg thì cá sẽ chết ở ngày thứ 7 đến ngày thứ 11 Nếu cho cá ăn

thức ăn thủy sản có chứa 200 mg/kg melamine và cyanuric acid thì sau 14

ngày đào thải, dư lượng còn lại là 0,57 và 0,78 mg/kg và có tinh thể trong

thận Khi cá ăn thức ăn có chứa hỗn hợp melamine và cyanuric acid thì dư

lượng cyanuric acid trong cơ thấp hơn khi chỉ cho ăn cyanuric acid Người ta

đã phát hiện tinh thể melamine-cyanuric acid có trong thận và cơ ruột nhưng

không có trong mô thịt

2.1.5.3 Tôm

Cho ăn thức ăn có 50 hoặc 100 mg/kg melamine sau 14 ngày phát hiện

217 và 51 µg/kg

2.1.5.4 Con người

Melamine được mô tả là một chất nguy hiểm nếu được nuốt, hít thở hay

hấp thụ qua da Nếu tồn tại trong cơ thể lâu, nó có thể gây ung thư và gây ảnh

hưởng đến khả năng sinh sản Tuy nhiên khi kết hợp với axit cyanuric nó có

thể gây vấn đề vì tạo ra muối melamine cyanurat không tan Khi melamine và

axit cyanuric được hấp thụ vào trong cơ thể, chúng có thể kết hợp với nhau

trong mạch máu, sau đó kết tinh lại ở thận dưới dạng các tinh thể màu vàng vàgây rối loạn hoạt động của thận Các tinh thể kết tinh ngày càng lớn lên tạocác viên sỏi thận

(Nguồn:http://www.bme.vn/bmevn/bme/lien-nganh/ly-hoa/88)

2.1.6 Giới hạn tối đa cho phép của melamine trong thức ăn thủy sản

Quyết định 3762 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, ký banhành ngày 28/11/2008, về việc quản lý chất melaminne trong chăn nuôi vànuôi trồng thuỷ sản, nêu rõ: mức chấp nhận được coi là không có melamine

đối với nguyên liệu và thức ăn thủy sản không lớn hơn 2,5mg/kg

(Nguồn:http://niengiamnongnghiep.vn/index.php?self=article&id=5477)

Quyết định này được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa rasau khi Hội đồng Tư vấn thức ăn chăn nuôi (gồm Cục Chăn nuôi, Cục Nuôitrồng thủy sản, đại diện Bộ Y tế ) đã họp bàn và thống nhất, dựa trên quy

định tiêu chuẩn hàm lượng melamine trong thực phẩm của Mỹ, Canada, EU,Đài Loan, Hongkong

2.2 Phương pháp phân tích melamine.

Các phương pháp phân tích melamine: miễn dịch (ELISA), sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC/MS), sắc ký lỏng hai lần khốiphổ (LC/MS/MS) (Quyết định số: 3762/QĐ-BNN-CN)

2.2.1 Phương pháp thử hấp thu miễn dịch dùng m liên kết (ELISA)

Có hai dạng: dạng cạnh tranh và không cạnh tranh

2.2.1.1 Dạng cạnh tranh

Dựa vào phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Dựa trên

sự cạnh tranh giữa enzyme liên kết và dư lượng chất phân tích trong mẫu đểgắn kết với kháng thể đã cố định trong giếng

Trong tiến trình phản ứng, mẫu và enzyme liên kết được tiêm vào giếng

có chứa kháng thể đã cố định Nếu chất phân tích tồn tại trong mẫu sẽ cạnhtranh với enzyme liên kết để kết hợp với lượng kháng thể cố định trong giếng

Khi lượng chât phân tích đủ nó sẽ kết hợp hết với kháng thể Vì thế enzyme

liên kết không kết hợp được với kháng thể và không phản ứng được với chấttạo màu Đo cường độ màu để cho ra kết quả chính xác.

2.2.1.2 Dạng không cạnh tranh

Chất phân tích được gắn cố định trong giếng Khi cho mẫu và khángthể 1 vào giếng, chất phân tích có trong mẫu và chất phân tích cố định tronggiếng sẽ gắn với kháng thể 1 Chất phân tích có trong mẫu được ưu tiên gắnvới kháng thể 1 Kháng thể 1 khi còn dư sẽ gắn với chất phân tích cố địnhtrong giếng Sau khi rửa, kháng thể 1 gắn với chất phân tích có trong mẫu sẽ bịloại bỏ

Sau đó, cho kháng thể 2 (enzyme liên kết) vào nó sẽ gắn kết với kháng

thể 1 còn lại trong giếng Sau thao tác rửa 2, kháng thể 2 nào không gắn kết

được sẽ bị loại bỏ Khi cho cơ chất tạo màu vào, kháng thể 2 sẽ phản ứng với

cơ chất tạo màu Sau khi cho chất dừng phản ứng, đo cường độ màu để cho kết

- Chi phí mua chế phẩm thử nghiệm đắt

- Là phương pháp sàng lọc, khi phát hiện mẫu thử dương tính phải dùng

phương pháp khác để kiểm tra

2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS)

2.2.2.1 Nguyên tắc

Melamine trong mẫu được chiết tách bằng hỗn hợp Acetonitril và nướctheo tỉ lệ 7:3 Dịch chiết được axit hóa bằng hydrochlorid acid 1M Dung dịch

dichloromethane để loại béo, lấy lớp nước phía trên cho qua cột C18, tiếp theo

cho qua cột trao đổi cation Giải hấp melamine bằng dung dịch amoniumhydroxit 5% trong acetonitril Làm khô dung dịch rửa giải ở 500C dưới dòng

khí nitrogen, hòa tan cặn bằng 1 mL pha động Melamine trong mẫu dược xác

b Nhược điểm:

- Đòi hỏi kĩ năng phân tích cao

- Đầu tư thiết bị rất đắt tiền

- Chi phí cho bảo trì, bảo dưỡng thiết bị cao

2.3 Giới thiệu chung về quy trình vận hành cơ bản hệ thống máy Elisa/Biorad

2.3.1 Quy trình sử dụng tủ ủ

- Cấp điện nguồn cho máy

- Để máy được làm ấm trong thời gian từ 10-20 phút trước khi đưa vào

sử dụng

- Cài đặt các thông số ủ: nhiệt độ ủ,

thời gian ủ và tốc độ lắc mẫu

- Đưa tấm chứa các giếng (có chứa

các mẫu đã được chuẩn bị mẫu một cách

thích hợp tương ứng với xét nghiệm cần

làm)

- Đặt tấm chứa giếng lên khay lắc, ủ

của máy ủ và đậy nắp khoang ủ

- Nhấn phím khởi động quy trình ủ

Máy sẽ tự động thực hiện ủ theo đúng các

thông số ủ đã đặt Sau khi quy trình ủ kết

thúc Lấy tấm chứa giếng ra khỏi khoang ủ

và chuyển tới các giai đoạn tiếp theo (rửa

mẫu, đọc mẫu)

Hình 2.5: Tủ ủ có bộ phận làm mát

2.3.2 Quy trình sử dụng máy rửa

- Cấp điện nguồn cho máy

- Pha và đổ đầy dung dịch rửa

vào bình rửa Kiểm tra sự rò rỉ tại các

nắp bình rửa và bình đựng nước thải

kèm theo máy

- Cài đặt các thông số rửa cho

máy: số lần rửa, thể tích xả/hút nước

và kiểu giếng Chọn chế độ rửa: rửa tự

động theo chu trình đặt sẵn hoặc rửa

bằng tay tùy theo mục đích của người

sử dụng

Hình 2.6: Máy rửa

- Đặt tấm chứa giếng mẫu sau khi đã được ủ vào vị trí khay rửa trênmáy Kích hoạt chương trình rửa Máy sẽ tự động rửa giếng theo đúng chươngtrình đã đặt sẵn Sau khi kết thúc chu trình rửa lấy tấm chứa giếng ra khỏikhoang rửa Chuẩn bị cho chu trình đọc tiếp theo.

- Đưa tấm chứa giếng đã đi

qua quy trình rửa vào buồng đọc

Kích hoạt chương trình đọc cài sẵn

In kết quả

Hình 2.7 : Máy đọc Elisa

2.4 Các thông số kỹ thuật cơ bản của bộ chế phẩm phân tích ELISA 2.4.1 Các thông số kỹ thuật ghi sẵn trên bảng hướng dẫn sử dụng của bộ chế phẩm phân tích

2.4.1.1 Phản ứng chéo (độ đặc hiệu)

Đây là phản ứng của các kháng thể và enzyme gắn kết với các chất đặc

hiệu cần kiểm tra Thường được thiết kế đặc biệt cho melamine có liên kết là100% Các chất khác thường gặp trong thức ăn thủy sản như urea, kháng sinh,hormone có liên kết nhỏ hơn 0,5% (sai số không đáng kể) Tính đặc hiệu củachế phẩm được trình bày ở Bảng 2.1

Độ thu hồi dùng để tính được nồng độ thực sự của mẫu sau khi kiểm

nghiệm, vì tất cả các bộ chế phẩm đều giả định rằng độ thu hồi là 100% Nồng

độ thực sự được tính bằng kết quả kiểm nghiệm chia cho độ thu hồi Độ thu

hồi quan trọng nhất là phải ổn định, xoay quanh một mức nào đó, không đượcquá thấp cũng như quá cao (quá thấp dễ xảy ra trường hợp âm tính giả, quácao dễ xảy ra trường hợp dương tính giả)

Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau cũng khác nhau, cho nên độ thu

hồi còn được dùng để kiểm tra độ nhiễu nền của bộ chế phẩm dùng cho phântích melamine Kiểm soát dư lượng ở mức nào thì nên kiểm soát độ thu hồi ởmức đó

2.4.2 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng khác (không ghi kèm trong chế phẩm phân tích)

- Khả năng phát hiện: là giới hạn định lượng mà phương pháp có thểphát hiện và định lượng được với xác suất sai số là (thông thường = 5%)

- Độ lặp lại và độ chính xác: biễu diễn sự khác biệt của một giá trị xác

định qua nhiều lần phân tích

- Khả năng tái sinh: là tính chính xác trong điều kiện sử dụng bộ chếphẩm nhiều lần

- Ngoài ra còn có khả năng áp dụng, tính nhạy (tính ổn định)

Phần 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng Kiểm nghiệm Hóa - Trung tâm Chấtlượng Nông Lâm Thủy sản vùng 6 (NAFIQAD 6), địa chỉ 386C đường Cách

mạng Tháng Tám, phường Bùi Hữu Nghĩa, quận Bình Thủy, thành phố Cần

- Ống ly tâm thủy tinh 12mL.

- Cốc, bình tam giác, bình định mức các loại

- Giấy parafin

- Giấy nhôm

- Túi nhựa sạch PE

3.2.3 Hóa chất sử dụng

- Dung dịch chuẩn melamine

- Dung dịch hexane, loại tinh khiết phân tích

- Nước cất, loại dùng cho sắc ký

- 50 mL dung dịch đệm trích và rửa Pha loãng 10 lần khi sử dụng: pha

1 thể tích dung dịch đệm trích và rửa với 9 thể tích nước cất

- 50 µL enzyme liên kết độ đậm đặc 300 lần

- 12 mL dung dịch cơ chất

- 13 mL dung dịch kết thúc phản ứng

Hình 3.1 : Bộ chế phẩm Elisa Hình 3.2 : Khay phân tích 96 giếng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Các thông số cần xác định trong triển khai phương pháp

Để triển khai phương pháp, đề tài triển khai xác định một số thông số

cơ bản sau:

3.3.1.1 Xây dựng đường chuẩn.

3.3.1.2 Xác định giá trị của nền mẫu (mẫu trắng không có melamine)

3.3.1.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD)

3.3.1.4 Xác định độ thu hồi, tìm số lạc cho kết quả phân tích

3.3.1.5 Xác định độ lặp lại: cần xác định được độ lệch chuẩn (Sr), độ lệch

chuẩn tương đối (RSD) vào cùng một thời điểm

3.3.2 Qui trình phân tích melamine trên Elisa

Cân 1g mẫu cho vào ống ly tâm 15 mL

Thêm 5mL dung dịch đệm trích và rửa và 5mL hexan vào mỗi ống ly tâm

chứa mẫuLắc khoảng 1 phút, siêu âm trong bể siêu âm khoảng 30 phút

Ly tâm ở 3.500 vòng/phút trong 15 phút

Hút bỏ phần dịch lỏng hexan ở trên, lấy lớp chất lỏng giữa và pha loãng 6 lầnbằng dung dịch đệm trích và rửa (100µL mẫu + 500µL dung dịch đệm rửa)Cho100µL dung dịch melamine chuẩn vào các vi giếng thích hợp.Cho 100µL mỗi dung dịch mẫu vào các vi giếng tương ứng

Cho 50µL dung dịch Enzym liên kết đậm độ 1 lần vào mỗi giếngLắc nhẹ, ủ 50 phút ở nhiệt độ phòng (19-250C) trong tối

Rửa bằng máyLàm khô giếng, rửa lần cuốiThêm 100µL dung dịch cơ chất vào mỗi giếng chứa chuẩn

Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng trong tối

Thêm 100µL dung dịch kết thúc phản ứng vào các giếng chứa chuẩn

Đo độ hấp thu ở bước sóng 450 nm trên máy đọc Elisa

3.3.3 Cách thức tiến hành

3.3.3.1 Đồng hóa mẫu

Tiến hành đồng hóa mẫu bằng cách xay nhuyễn thức ăn thủy sản, tiếp

đó trộn thật đều (hoặc cho vào máy xay) rồi cho vào túi nilon sạch làm mẫu

1 mL dung dịch chuẩn - 100 µg melamine

V 1? (mL) - 1 µg melamine

- Thể tích cần hút để thêm chuẩn 1 mg/kg vào mẫu trắng:

) ( 10 ) ( 01 , 0 100

1 1

3.3.4 Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm nhằm xác định các thông số của phương pháp đượctrình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 : Bố trí thí nghiệm triển khai phương pháp

Bước Nội dung Phân bố thí nghiệm Kết quả thu được

1 Xây dựng

đường chuẩn

Tiến hành phân tích 6 nồng độdung dịch chuẩn (0 mg/kg; 0,01mg/kg; 0,03 mg/kg; 0,1 mg/kg;

0,3 mg/kg; 1 mg/kg) theo quitrình phân tích Mục 3.3.2

Hệ số tuyến tínhcủa đường chuẩn

R2 0,99

2 Xác định giá

trị nền mẫu

Tiến hành phân tích 7 mẫu trắng

là mẫu không nhiễm melaminetheo qui trình phân tích Mục 3.3.2

Xác định được

giá trị nền củamẫu không nhiễmmelamine

Thực hiện 3 đợt phân tích, mỗi

đợt thực hiện như sau: thêm

chuẩn vào mẫu trắng ở các mứcnồng độ 1 mg/kg, 2 mg/kg và 3mg/kg Mỗi mức nồng độ thựchiện 7 mẫu, mỗi đợt thực hiện 21mẫu Vậy tổng số mẫu phân tích

cho ba đợt là 63 mẫu

Độ thu hồi cầnđạt từ 70 – 130%

5 Xác định độ

lặp lại

Thực hiện 3 đợt phân tích, mỗi

đợt thực hiện như sau: thêm

chuẩn vào mẫu trắng ở các mứcnồng độ 1 mg/kg, 2 mg/kg và

3 mg/kg Mỗi mức nồng độ thựchiện 7 mẫu, mỗi đợt thực hiện 21mẫu Vậy tổng số mẫu phân tích

3.3.5 Phương pháp thu thập, tính toán và xử lý số liệu

3.3.5.1 Tính giá trị độ hấp thu và xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn được xây dựng từ các giá trị phần trăm (%) độ hấp thu

của chất chuẩn melamine ở các nồng độ khác nhau Các giá trị đó được đưavào một hệ tọa độ trong một đồ thị bán logarit Nồng độ tương ứng với độ hấpthu của mỗi mẫu có thể đọc từ đường chuẩn

Độ hấp thu của chuẩn (hoặc mẫu) B

X 100 = % (3.1)

Có thể tính kết quả trực tiếp từ chương trình đặc biệt trên máy vi tínhnối với máy đọc ELISA như chương trình Elisa Analysis Program in Excel.Giá trị thực là giá trị đọc được nhân với hệ số pha loãng

3.3.5.2 Các công thức tính

a Giá trị nền mẫu

n b

n

i i

x : giá trị nền mẫu xác định theo công thức (3.2)

Sr: độ lệch chuẩn xác định theo công thức (3.6)

c Độ thu hồi:

100

x là nồng độ mẫu ban đầu

x x

n

i r

x x